H10n8亞型禽流感病毒二重rt-pcr檢測(cè)引物組、試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于禽類病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種H10N8亞型禽流感病毒二重 RT-PCR檢測(cè)引物組、試劑盒，化及鑒定化0亞型禽流感病毒、N8亞型禽流感病毒的引物對(duì)或 引物對(duì)組及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感病毒（AvianInfluenzaVi;rus，AIV)根據(jù)表面糖蛋白化emagglutinin，HA) 和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase,ΝΑ)抗原性差異分為不同的亞型，目前已發(fā)現(xiàn)有18種HA亞 型化1-H18)和11種NA亞型（N1-N11)。AIV是一種有包膜、單股負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒， 病毒基因組由8個(gè)分節(jié)段負(fù)鏈RNA組成。AIV基因組的分節(jié)段特性使得兩種或兩種W上不 同亞型流感病毒共同感染一個(gè)細(xì)胞時(shí)，子代病毒在裝配時(shí)其核酸片段可能W同源交換的形 式發(fā)生基因重排而導(dǎo)致抗原轉(zhuǎn)變，從而產(chǎn)生能引起大流行的新流行株。
[0003] 2013年12月6日，江西省南昌市一名73歲女子罹患H10N8亞型禽流感，因呼吸衰 竭、休克死亡，運(yùn)是全球首例人類感染H10N8的死亡案例。2014年1月25日，也是在南昌， 又確診一例H10N8亞型禽流感。
[0004] 目前，急需建立一種快速檢測(cè)H10N8禽流感病毒的方法及開(kāi)發(fā)相應(yīng)試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種H10N8亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)引 物組、試劑盒及其應(yīng)用。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0007] 一種用于鑒定化0N8亞型禽流感病毒的引物組，包括2對(duì)特異性引物，分別是引物 對(duì)H10-1和H10-2、引物對(duì)N8-1和N8-2,其分別具有如沈QIDNo. 1至沈QIDNo. 4所示 的序列。
[0008] 一種用于鑒定H10亞型禽流感病毒的引物對(duì)，包括特異性引物H10-1和化0-2,它 們分別具有序列表SEQIDNo. 1至SEQIDNo. 2的堿基序列。
[0009] -種用于鑒定N8亞型禽流感病毒的引物對(duì)，包括特異性引物N8-1和N8-2,它們分 別具有序列表SEQIDNo. 3至SEQIDNo. 4的堿基序列。
[0010] 一種H10N8亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄試劑、PCR試劑、 DEPC水和無(wú)RNA酶的超純水，所述的PCR試劑中含有2對(duì)特異性引物，其分別具有如SEQID No. 1至沈QIDNo. 4所示的序列。
[0011] 作為優(yōu)選，所述的特異性引物H10-1和化0-2,N8-1和N8-2在所述的PCR試劑中 的終濃度為0. 1-0. 8μM。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的反轉(zhuǎn)錄試劑每管16μL其中SXReverseTranscriptase Buffer10μL、50pmol9merRandomPrimer2μL、10mMdNTPMixture2μL、40U RibonucleaseInhibitor1μL、5U/μLAMVReverseTranscriptaselμL。
[0013] 作為優(yōu)選，所述的PCR試劑的體積為26. 2μL/管，其中包含2XEasy化qTMPCR SuperMix25μL，50μΜHlO-1 和HlO-2 引物各 0. 2μL、50μΜN8-1 和N8-2 引物各 0. 4μL。
[0014] 本發(fā)明還提供了所述的用于鑒定H10N8亞型禽流感病毒的引物組、所述的引物對(duì) 或所述的H10N8亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒在鑒別H10N8亞型禽流感病毒、 H10亞型禽流感病毒和N8亞型禽流感病毒中的應(yīng)用。 陽(yáng)015] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0016] 1.發(fā)明人專口針對(duì)化0亞型禽流感病毒HA基因、N8亞型禽流感病毒NA基因設(shè)計(jì) 了 2對(duì)特異性引物，組合成H10N8亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，一管檢測(cè)即可 確定是否為H10N8亞型禽流感病毒、H10亞型禽流感病毒和N8亞型禽流感病毒的感染。利 用本發(fā)明的引物對(duì)、引物對(duì)組或試劑盒，可W檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有H10N8亞型禽流感 病毒、H10亞型禽流感病毒和N8亞型禽流感病毒感染。本發(fā)明建立了一次RT-PCR反應(yīng)就 能同時(shí)檢測(cè)和鑒別H10亞型禽流感病毒、N8亞型禽流感病毒、H10N8亞型禽流感病毒的二 重RT-PCR檢測(cè)試劑盒。通過(guò)擴(kuò)增條件優(yōu)化、特異性和敏感性試驗(yàn)，建立H10亞型禽流感病 毒和N8亞型禽流感病毒的二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、低 成本、高效率等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床檢測(cè)H10N8亞型禽流感病毒。
[0017] 2.由于本發(fā)明在引物設(shè)計(jì)上利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的不同直接判定擴(kuò)增結(jié)果，使得該 法在結(jié)果判定時(shí)更簡(jiǎn)便、直觀和實(shí)用。實(shí)驗(yàn)證明，該法對(duì)同一樣品中的H10亞型禽流感病毒 和N8亞型禽流感病毒模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均得到與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的267bp化10亞型禽流感 病毒）、464bp(N8亞型禽流感病毒）的特異性擴(kuò)增條帶，對(duì)新城疫、傳染性支氣管炎和傳染 性喉氣管炎常見(jiàn)禽病的檢測(cè)全為陰性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該法最低能檢測(cè)到1〇3拷貝/ μL的H10亞型禽流感病毒、N8亞型禽流感病毒。
[0018] 3.本發(fā)明可為Η10亞型、Ν8亞型、Η10Ν8亞型禽流感病毒的發(fā)病早期提供準(zhǔn)確的 診斷結(jié)果，對(duì)切斷其傳播途徑有重要意義，可及時(shí)隔離與處理，對(duì)Η10Ν8亞型禽流感的有效 防控具有重要意義，應(yīng)用前景廣闊，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)可持續(xù)發(fā)展也有重要現(xiàn)實(shí)意義。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明所建立Η10Ν8亞型AIV二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒的特異性試驗(yàn)結(jié)果 圖；
[0020] 其中：M-DLlOOOMarker;1-H10+N8 ;2-H10N7 ;3-冊(cè)N8 ;4-HlNl;5-H2N3 ;6-冊(cè)N2 ; 7-H4N6 ;8-H5Nl;9-H7N2 ;10-冊(cè)N4 ;11-朋N2 ;13-H12N5 ;14-H13N6 ;15-H14N5 ; 16-H15N9 ;17-NDV;18-IBV;19-ILTV;20-空白對(duì)照。 陽(yáng)02U 圖2為本發(fā)明所建立H10N8亞型AIV二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒的敏感性試驗(yàn)結(jié)果 圖；
[0022]其中：M-DLlOOOMarker;1-1〇8拷貝/μL;2-1〇7拷貝/μL;3-1〇6拷貝/μL;4-1〇5 拷貝 /μL;5-1〇4拷貝 /μL;6-10 3拷貝 /μL;7-100 拷貝 /μL;8-10 拷貝 /μL;9-空白對(duì) 照。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不 局限于實(shí)施例表示的范圍。運(yùn)些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此 夕F，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可W對(duì)本發(fā)明作各種修改，運(yùn)些等價(jià)變化同 樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
[0024] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所 使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。 陽(yáng)0巧]AIV毒株化3N8、冊(cè)N8、H1N1、冊(cè)N2、H4N6、H9N2 和H11)、NDV、IBV和ILTV由廣西獸 醫(yī)研究所分離鑒定保存；AIV毒株化2N3、冊(cè)M、H10N3、H12N5)由香港大學(xué)惠贈(zèng)；AIV毒株 的RNA化10N7、冊(cè)Nl、H7N2、H13N6、H14N5和H15N9)由美國(guó)康涅狄格州大學(xué)惠贈(zèng)。Minibest viralRNA/DNAextractionkitver. 4.0和反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自大連寶生物公司；膠回收試劑 盒購(gòu)自Axygen公司；PCRSuperMix購(gòu)自北京全氏金生物公司。
[0026] 連施例1:禽流威病毒二電RT-PCR引物設(shè)計(jì)及試劑盒的制備
[0027] (1)引物的設(shè)計(jì)
[0028] 根據(jù)GenBank中H10、N8亞型AIVHA和NA基因，用DNAStar軟件比對(duì)序列找出保 守區(qū)域，用Primer5.0軟件分析引物的擴(kuò)增條件，通過(guò)NCBIBlast驗(yàn)證，設(shè)計(jì)并合成了 2 對(duì)特異性引物（見(jiàn)表1)，用于H10亞型禽流感病毒和N8亞型禽流感病毒的檢測(cè)。 W29] 表1引物信息
[0030]
[0031] 注：AIVH10-1和H10-2引物對(duì)用來(lái)檢測(cè)是否含有化0