一種東方馬腦脊髓炎病毒pcr-dhplc檢測引物及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種東方馬腦脊髓炎病毒PCR-DHPLC檢測引物。
【背景技術(shù)】
[0002]東方馬腦脊髓炎病毒(Easternequine encephalitis virus, EEEV)屬于披膜病毒科甲病毒屬，是引起東方馬腦脊髓炎的病原體。該病毒主要通過蚊蟲傳播[1]，而且含有病毒的氣溶膠可以通過呼吸道感染人類。東方馬腦脊髓炎是傳染性和致死率很高的人畜共患病，馬屬動物死亡率約20%-30%，個別年份和地區(qū)高達(dá)70%?80%[2 5]，人感染EEEV的死亡率為30%?40%[6]。因本病最初在美國東方馬群中流行，并在馬腦中被分離出來，因此得名[7]。
[0003]東方馬腦脊髓炎在我國雖有報(bào)道，但少有發(fā)生。隨著我國馬術(shù)運(yùn)動的發(fā)展，國際馬術(shù)比賽的日益頻繁，我國進(jìn)出境馬匹的數(shù)量也在不斷增加。為保障我國養(yǎng)馬業(yè)的健康發(fā)展，保證國際賽事的順利進(jìn)行，建立快速、敏感、特異的檢測方法十分必要。本文采用核酸擴(kuò)增與變性DHPLC分析相結(jié)合的技術(shù)原理，建立一種快速檢測EEEV的PCR-DHPLC檢測分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一種東方馬腦脊髓炎病毒PCR-DHPLC檢測引物。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
首先，本發(fā)明提供的一種東方馬腦脊髓炎病毒PCR-DHPLC檢測引物，引物序列如下: EEE-DHPF: 5-GCGACACTGTGCGACCAGAT-3 ；
EEE-DHPR: 5-GTATTTGTGTTACGTTGTGT-3。
[0006]利用上述引物，本發(fā)明還提供一種東方馬腦脊髓炎病毒PCR-DHPLC檢測方法，包括下列步驟:
(1)樣品中病毒RNA的提取及特異性片段的擴(kuò)增；
(2)PCR-DHPLC 分析。
[0007]樣品中病毒RNA的提取及EEEV特異性片段的擴(kuò)增的具體步驟是:
樣品中病毒RNA的提取:對樣品或滅活毒株進(jìn)行模板RNA的提取，使用Qiagen公司提供的一步法試劑盒提取RNA保存?zhèn)溆?，具體方法按RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，RT-PCR反應(yīng)采用Qiagen公司的一步法RT-PCR試劑盒對WEEV及用于特異性試驗(yàn)的病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；
EEEV特異性片段的擴(kuò)增:取5uL已制備的RNA，加入適量EEE-DHPF、EEE-DHPR ；5XRT-PCR buffer ； dNTP和Enzyme mix進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為 50°C 30min ；94°C15min ；94°C 30s,55°C 30s,72°C 30s，40 個循環(huán)；72°C lOmin。
[0008]DHPLC分析條件為: 色譜柱:PS-DVB & C18 DNASep 色譜柱(4.6mmX50mm,粒度 3 μπι);柱溫:61.3°C ;流動相:0.0min, 59.5%緩沖溶液A，40.5%緩沖溶液B ；0.5min, 54.5%緩沖溶液A，45.5%緩沖溶液B ;5.0min, 45.5%緩沖溶液A, 54.5%緩沖溶液B ;5.lmin，0%緩沖溶液A, 100%緩沖溶液B ;5.6min, 0%緩沖溶液A，100%緩沖溶液B ；5.7min, 59.5%緩沖溶液A，40.5%緩沖溶液B ；6.6min, 59.5%緩沖溶液A，40.5%緩沖溶液B ;流速:0.9mL/min ;檢測器:熒光檢測器(光源:150W Xenon燈；激發(fā)譜帶寬:15nm ;發(fā)射譜帶寬:15.3nm ;檢測靈敏度:在波長350nm積分2s);上樣量:PCR產(chǎn)物5yL。在變性分析模式下，采用雙鏈DNA單片段(double-strandedsingle fragment)分析模式，清洗模式采用normal，分析檢測過程儀器梯度由Navigatorsoftware分析軟件控制設(shè)定。
[0009]緩沖溶液A為:0.1M的TEAA，緩沖溶液B為:0.1M的TEAA+25%的乙腈。
[0010]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明利用PCR結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)(Denaturing high-performance liquidchromatography, DHPLC)，針對東方馬腦脊髓炎病毒(Eastern equine encephalitisvirus, EEEV)建立PCR-DHPLC快速診斷方法。通過對GenBank已報(bào)道的EEEV的基因進(jìn)行序列分析比對，設(shè)計(jì)擴(kuò)增特異性引物，通過優(yōu)化試驗(yàn)條件建立核酸擴(kuò)增體系，對核酸擴(kuò)增產(chǎn)物采用DHPLC進(jìn)行檢測分析，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物形成DHPLC特征峰圖。對其他六種常見馬病病毒進(jìn)行特異性檢測試驗(yàn)；對梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板進(jìn)行靈敏度測試；對臨床樣品進(jìn)行檢測，并與熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行比較以驗(yàn)證臨床檢測效果。建立的EEEV PCR-DHPLC方法在檢測其他馬病病毒時相互之間無交叉反應(yīng)，未檢測到其他馬病病毒的陽性吸收峰；對EEEV不同模板濃度進(jìn)行檢測，檢測極限可達(dá)到10拷貝/yL。所建立的方法對送檢的馬血樣進(jìn)行檢測，結(jié)果與熒光RT-PCR的符合率達(dá)100%。
【附圖說明】
[0011]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0012]圖 1 cRNA 的 RT-PCR 鑒定結(jié)果。1.DL2000 DNA Marker ；2~4.cRNA RT-PCR 鑒定產(chǎn)物。
[0013]圖2 PCR-DHPLC檢測EEEV的特異性。1.EEEV ；2.馬鼻肺炎1型；3.馬動脈炎病毒；4.馬流感病毒(H3N8);5.西方馬腦脊髓炎病毒；6.委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒；7.西尼羅病毒；8.空白對照。
[0014]圖3 PCR-DHPLC 檢測 EEEV 的特異性。1.1.0X106 拷貝 / μ L ;2.1.ΟΧ 105拷貝/yL ；3.1.0X104 拷貝/yL ;4.1.0X 10 3 拷貝 / μ L ;5.1.0Χ 10 2 拷貝 / μ L ;6.10 拷貝/nL；7.1.0拷貝/^匕
[0015]圖4 EEEV熒光定量RT-PCR檢測方法敏感性分析。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1東方馬腦脊髓炎病毒PCR-DHPLC檢測方法的建立
1.材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗(yàn)毒株、核酸馬鼻肺炎病毒(EHV-1 )、馬動脈炎病毒(EAV)、馬流感病毒(H3N8)、西尼羅病毒RNA(WNV)、EEEV RNA、西方馬腦脊髓炎(WEEEV) RNA和委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎(VEEV) RNA由本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0017]1.1.2主要試劑
RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒購自Qiagen公司；三乙胺乙酸鹽(TEAA，色譜純)購自Transgenomic公司；乙腈(色譜純)購自TEDIA公司；引物由上海Invitrogen生物技術(shù)公司合成；胰化蛋白胨、酵母抽提物；瓊脂糖、氨節(jié)青霉素、等均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。DNA純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA Marker DL2000，均購自大連寶生物有限公司。其它常規(guī)化學(xué)試劑購均為分析純。
[0018]1.1.3主要儀器設(shè)備及生物學(xué)軟件
變性高效液相色譜儀器(Transgenomic Wave 4500),為北京環(huán)球基因公司產(chǎn)品；AllegraTM21R高速冷凍離心機(jī)，BeckmanCoulter公司產(chǎn)品；Sigmal_15普通離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；DNAStar7.1軟件(包含MegAlign程序和Editseq程序)；Premer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件。
[0019]1.2方法
1.2.1引物設(shè)計(jì)引物序列如下:
EEE-DHPF: 5-GCGACACTGTGCGACCAGAT-3 ；
EEE-DHPR: 5-GTATTTGTGTTACGTTGTGT-3。
[0020]1.2.2病毒RNA的提取及EEEV特異性片段的擴(kuò)增
對滅活毒株進(jìn)行模板RNA的提取，使用Qiagen公司提供的一步法試劑盒提取RNA保存?zhèn)溆?，具體方法按RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。RT-PCR反應(yīng)采用Qiagen公司的一步法RT-PCR試劑盒對EEEV及用于特異性試驗(yàn)的病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取5uL已制備的RNA，加入適量 EEE-DHPF、EEE-DHPR ;5 X RT-PCR buffer ； dNTP 和 Enzyme mix 進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為 50°C 30min ；94°C 15min ；94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，40個循環(huán)；72°C10mino
[0021]1.2.3標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備
用EE