可用于診斷人腸道病毒71型感染的試劑盒及診斷方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明主要涉及診斷試劑盒及診斷方法。具體而言，本發(fā)明涉及可用于診斷人腸 道病毒71型感染的試劑盒及診斷方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道病毒EV71型感染是由人腸道病毒71型（EV71)引起的疾病的總稱，臨床上主 要表現(xiàn)為手足口病，手足口病多在嬰幼兒中爆發(fā)流行，部分EV71感染患兒表現(xiàn)為皰疹性咽 峽炎，重癥患者出現(xiàn)病毒性腦炎、病毒性腦脊髓膜炎、肺水腫、肺出血等。引起手足口病的病 原，最常見的是柯薩奇病毒A16和腸道病毒71型；由腸道病毒71型感染引起的疾病發(fā)生重 癥感染的比例較大，病死率也較高，重癥病例病死率可達(dá)10% -25%，因此病原學(xué)診斷意義 重大。
[0003] 腸道病毒71型（EV71)基因組為含有大約7. 5Kb的單股正鏈RNA，包括5'端非編 碼區(qū)、3'端非編碼區(qū)和由P1，P2，P3所組成的多蛋白，共編碼11種蛋白，其中4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白 VP1, VP2, VP3, VP4, 7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D。其中 VP1, VP2, VP3 暴露于病毒 外殼的表面，為EV71主要的抗原變異位置；VP4包埋在病毒外殼的內(nèi)側(cè)與內(nèi)部的RNA結(jié)合， 其功能類似病毒外殼的錨，用以穩(wěn)定病毒蛋白的結(jié)構(gòu)。非結(jié)構(gòu)蛋白2A為分裂初期先驅(qū)蛋 白質(zhì)，也與終止宿主細(xì)胞合成其本身所需蛋白有關(guān)；3C則參與大部分的蛋白裂解反應(yīng)；3D 為RNA聚合酶，在病毒RNA復(fù)制時(shí)主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄及復(fù)制反應(yīng)；2B，2C，3A，3B等四種蛋白則與病毒 RNA的復(fù)制有關(guān)。
[0004] 腸道病毒EV71的臨床診斷主要依據(jù)三個(gè)方面：一是臨床表現(xiàn)，二是血清學(xué)證據(jù)， 三是病原學(xué)證據(jù)。由于腸道病毒EV71型感染臨床表現(xiàn)多，因此腸道病毒EV71的血清學(xué)檢 測(cè)和病原學(xué)檢測(cè)是目前最主要的依據(jù)。EV71感染產(chǎn)生免疫保護(hù)，感染后可檢出IgM和IgG 抗體。
[0005] 腸道病毒71型抗體（IgM)的檢測(cè)已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，基本上是以腸道病毒71 型的病毒培養(yǎng)物作為包被抗原的間接ELISA，試劑盒在特異性、靈敏度和穩(wěn)定性方面尚存 諸多不足之處；并且，由于病毒培養(yǎng)成本高，效率低，無法大量供應(yīng)市場(chǎng)。中國發(fā)明專利 CN102243232A，公開日2011年11月16公開了一種腸道病毒71型抗體（IgM)的酶聯(lián)免疫 測(cè)定試劑盒（酶聯(lián)免疫法），技術(shù)方案是首先將血清加入到微孔板中，其中的IgM抗體被預(yù) 包被在微孔板上的抗μ鏈捕獲，然后，加入酶標(biāo)記物，被捕獲的IgM中的EV71-IgM會(huì)與HRP 標(biāo)記的EV71重組抗原特異性結(jié)合，洗滌后，HRP會(huì)和后續(xù)加入的底物反應(yīng)，最終達(dá)到檢測(cè) EV71-IgM抗體的目的，但是這種方法所需（如血清的體積）大、消耗的試劑等耗材量也大， 且該方法僅限用于IgM檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)病人體內(nèi)IgG則不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供新的可用于診斷人腸道病毒71型感染的試劑盒及診斷方 法。
[0007] 本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以SEQ ID NO :1所示的多肽和SEQ ID NO :2所示的 多肽對(duì)受試者來源的血液樣本中的IgM有響應(yīng)、和/或SEQ ID NO :1所示的多肽對(duì)受試者 來源的血液樣本中的IgG有響應(yīng)作為判定受試者是否已被人腸道病毒71型感染的指標(biāo)的 情況下，可以以90 %以上的靈敏度診斷人腸道病毒71型感染，這是目前我們知道的任何僅 使用2個(gè)以下的診斷分子的診斷試劑盒均未達(dá)到的高靈敏度。
[0008] 因此，本發(fā)明包括：
[0009] 1. -種診斷試劑盒，其包括一個(gè)或多個(gè)固體載體，所述固體載體包括彼此分離的 I區(qū)和II區(qū)；
[0010] 所述I區(qū)包括獨(dú)立地連接于所述固體載體上的多肽集合I，所述多肽集合1包含獨(dú) 立的下述多肽：
[0011] SEQ ID N0 :1所示的多肽；和
[0012] SEQ ID N0 :2 所示的多肽；
[0013] 所述II區(qū)包括獨(dú)立地連接于所述固體載體上的多肽集合II，所述多肽集合II包 含獨(dú)立的SEQ ID N0 :1所示的多肽。
[0014] 2.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑盒，其中，所述多肽集合I中的全部多肽獨(dú)立地連接于同一 固體載體上。
[0015] 3.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑盒，其中，所述多肽集合II中的全部多肽獨(dú)立地連接于同 一固體載體上。
[0016] 4.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑盒，其中，所述I區(qū)和II區(qū)位于不同固體載體上。
[0017] 5.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑盒，其用于診斷人腸道病毒71型感染。
[0018] 6.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑盒，其中，所述多肽集合I還包含獨(dú)立的下述多肽：
[0019] SEQ ID N0 :3 所示的多肽。
[0020] 7.根據(jù)項(xiàng)1所述的試劑盒，其中，所述多肽集合II還包含獨(dú)立的下述多肽：
[0021] SEQ ID N0 :3所示的多肽；和/或
[0022] SEQ ID N0 :4所示的多肽；和/或
[0023] SEQ ID N0 :5 所示的多肽。
[0024] 8. -種診斷受試者是否為人腸道病毒71型感染的方法，該方法包括：
[0025] 使用項(xiàng)1~7中任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)所述多肽集合I中的多肽對(duì)受試者來源 的血液樣本中的IgM是否有響應(yīng)、以及所述多肽集合II中的多肽對(duì)受試者來源的血液樣本 中的IgG是否有響應(yīng)；
[0026] 當(dāng)檢測(cè)到所述多肽集合I中的任一個(gè)或一個(gè)以上多肽對(duì)受試者來源的血液樣本 中的IgM有響應(yīng)、和/或所述多肽集合II中的任一個(gè)或一個(gè)以上多肽對(duì)受試者來源的血液 樣本中的IgG有響應(yīng)時(shí)，判定該受試者為人腸道病毒71型感染。
[0027] 9.根據(jù)項(xiàng)8所述的方法，其中，所述血液樣本為全血、血漿或血清。
[0028] 10.根據(jù)項(xiàng)8所述的方法，其中，所述受試者為具有手足口病臨床癥狀的受試者。
[0029] 發(fā)明的【具體實(shí)施方式】
[0030] 多肽集合
[0031] 本說明書中，多肽集合I是指位于I區(qū)的全部多肽，該多肽集合I包含SEQ ID N0: 1所示的多肽和/或SEQ ID NO :2所示的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽集合I還可 以包含SEQ ID NO :3所示的多肽。
[0032] 本說明書中，多肽集合II是指位于II區(qū)的全部多肽，該多肽集合II包含SEQ ID NO :1所示的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽集合II還可以包含SEQ ID NO :3所示的 多肽；和/或SEQ ID NO :4所示的多肽；和/或SEQ ID NO :5所示的多肽。
[0033] 其中，SEQ ID NO :1 所示的多肽序列為 APTGQNTQVSSHRLDTGKVP ;
[0034] SEQ ID N0 :2 所示的多肽序列 SHRLDTGKVPALQAAEIGAS ;
[0035] SEQ ID N0 :3 所示的多肽序列為 DKFANPVKDIFTEMAAPLKS ;
[0036] SEQ ID N0 :4 所示的多肽序列為 AAAQKNFTMKLCKDASDILQ ;
[0037] SEQ ID N0 :5 所示的多肽序列為 LDLPYSTYVKDELRSIDKIK。
[0038] 所述多肽可以適宜采用（1)化學(xué)合成方法、或（2)酶反應(yīng)合成方法等公知方法來 獲得，其中化學(xué)合成更為簡(jiǎn)便。在化學(xué)合成本發(fā)明的多肽情況下，通過使用肽合成儀合成或 者半合成該多肽來進(jìn)行。作為化學(xué)合成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成 的肽可以采用常規(guī)手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進(jìn)行純化。這樣 的肽固相合成方法以及其后的肽純化都是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。
[0039] 此外，在通過酶反應(yīng)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的情況下，可以采用例如國際公開小冊(cè)子 W02004/011653號(hào)所述的方法。即，可以這樣來生產(chǎn)：將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被 酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態(tài)的氨基酸（例如羧基保護(hù)的 氨基酸）在肽合成酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出： 具有生成肽的能力的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體 處理物、或該微生物來源的肽合成酶。
[0040] 特別是多肽的化學(xué)合成已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，可以通過委托專業(yè)的多肽合成公司來 合成所述多肽。
[0041 ] 試劑盒
[0042] 本發(fā)明提供一種診斷試劑盒（本發(fā)明的試劑盒），其包括一個(gè)或多個(gè)固體載體，所 述固體載體包括彼此分離的I區(qū)和II區(qū)；
[0043] 所述I區(qū)包括連接于所述固體載體上的多肽集合I，所述多肽集合I包含獨(dú)立的 SEQ ID N0 :1所示的