用于檢測(cè)辣椒斑駁病毒的引物組合物及其應(yīng)用、由其組成的試劑盒及試劑盒的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測(cè)辣椒斑駁病毒的引物組合物及其應(yīng)用、由其組成的試劑盒及試劑盒的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]辣椒斑駁病毒(/tefloerPepMoV)是辣椒上一種危害嚴(yán)重的病毒病，PepMoV是一種(+ )單鏈RNA病毒，是馬鈴薯Y病毒屬Q(mào)Potyvirus),馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)的確定種。該病毒通過(guò)蚊蟲(chóng)以非持久性傳播，主要侵染包括辣椒、西紅柿等重要茄科作物。PepMoV的田間癥狀主要表現(xiàn)為植株矮縮，葉片花葉、斑點(diǎn)、萎縮，果實(shí)畸形，造成減產(chǎn)，以及更為嚴(yán)重的是造成果實(shí)的商品性降低，從而帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病毒最先在美國(guó)報(bào)道，隨后在韓國(guó)、墨西哥、日本等地相繼有危害的報(bào)道，對(duì)當(dāng)?shù)氐那芽谱魑锏纳a(chǎn)造成嚴(yán)重影響。2011年在我國(guó)臺(tái)灣省報(bào)道有該病毒病的發(fā)生，而我國(guó)內(nèi)陸尚無(wú)P印MoV發(fā)生危害的報(bào)道。2015年湖南省植物保護(hù)研究所從湖南和福建等省采集的辣椒上檢測(cè)到該病毒，為進(jìn)一步了解該病毒的分布情況及其危害范圍，建立一套快速檢測(cè)辣椒斑駁病毒的方法刻不容緩。
[0003]目前針對(duì)P印MoV的檢測(cè)方法主要有電鏡觀察法，RT-PCR和qRT_PCR法，但這些方法都需要繁瑣的操作和昂貴的儀器，同時(shí)檢測(cè)過(guò)程需要長(zhǎng)時(shí)間的擴(kuò)增過(guò)程，以及繁瑣的電泳紫外觀察過(guò)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可特異性檢測(cè)檢測(cè)辣椒斑駁病毒的檢測(cè)試劑盒，還提供了該檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用方法，該應(yīng)用方法可應(yīng)用于辣椒斑駁病毒的快速診斷和鑒別，靈敏度高、特異性強(qiáng)，檢測(cè)方法方便快捷。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供了一種用于檢測(cè)辣椒斑駁病毒的引物組合物，包括外引物和內(nèi)引物，所述外弓I物包括外引物F3和外引物B3，所述外引物F3的DNA序列為SEQ IDN0.1所述的DNA序列，所述外引物B3的DNA序列為SEQ ID N0.2所述的DNA序列；所述內(nèi)引物包括內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP，所述內(nèi)引物FIP的DNA序列為SEQ ID N0.3所述的DNA序列，所述內(nèi)引物BIP的DNA序列為SEQ ID N0.4所述的DNA序列。
[0006]上述的引物組合物，優(yōu)選的，所述外引物F3的濃度為5 μΜ?10 μM ;進(jìn)一步優(yōu)選為ΙΟμΜ。所述外引物Β3的濃度為5μΜ?ΙΟμΜ ;進(jìn)一步優(yōu)選為10 μ Μ。
[0007]上述的引物組合物，優(yōu)選的，所述內(nèi)引物FIP的濃度為20 μ M?40 μ M ;進(jìn)一步有選為40 μ Μ。所述內(nèi)引物BIP的濃度為20 μΜ?40 μΜ;進(jìn)一步有選為40 μ Μ。
[0008]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了上述引物組合物作為L(zhǎng)AMP檢測(cè)的引物檢測(cè)辣椒斑駁病毒中的應(yīng)用。
[0009]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，優(yōu)選的，所述試劑盒包括上述引物組合物，還包括DNA聚合酶。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。
[0010]上述的試劑盒，優(yōu)選的，所述外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、外引物BIP、DNA聚合酶、cDNA 的體積比為:0.5: 0.5:1:1:1: 2。
[0011]上述的試劑盒，優(yōu)選的，所述檢測(cè)試劑盒還包括RM反應(yīng)緩沖液和DEPC水。
[0012]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述的檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)辣椒斑駁病毒中應(yīng)用。
[0013]上述的檢測(cè)試劑盒，優(yōu)選的，所述應(yīng)用方法為:
(O提取待測(cè)樣品的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為CDNA ;
(2)以步驟(I)中的cDNA為模板，采用所述的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行LAMP反應(yīng)得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
(3)將所述步驟(2)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物按照以下A、B中的一種或兩種方法進(jìn)行檢測(cè): A JpASYBR Green I顯色；如果變成綠色，則證明待測(cè)樣品中含有辣椒斑駁病毒，如果顏色為橙色，則證明待測(cè)樣品中不含辣椒斑駁病毒；
B:取擴(kuò)增產(chǎn)物于進(jìn)行電泳檢測(cè)，如果電泳結(jié)果顯示梯狀條帶，表明待測(cè)樣品中含有辣椒斑駁病毒，如果不顯示梯狀條帶，則待測(cè)樣品中不含有辣椒斑駁病毒。
[0014]上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述步驟(2)中所述LAMP反應(yīng)的溫度為60°C?64°C。
[0015]上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述步驟(2)中所述LAMP反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間為45 min?120
mino
[0016]上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述步驟(3)中所述電泳檢測(cè)為0.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
(I)本發(fā)明提供了一種可用于檢測(cè)辣椒斑駁病毒的引物，該引物根據(jù)辣椒斑駁病毒的核苷酸序列，選擇該序列中相對(duì)保守且特異區(qū)域4180?4378bp，利用LN832375上的對(duì)應(yīng)區(qū)域通過(guò)在線引物設(shè)計(jì)軟件 primerExplorer V4 (http: //primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)引物。本發(fā)明的引物3’端或5’端穩(wěn)定性高，及引物二聚體等參數(shù)優(yōu)于其他引物。
[0018](2)本發(fā)明提供了一種可用于檢測(cè)辣椒斑駁病毒的檢測(cè)試劑盒，可快速檢測(cè)辣椒斑駁病毒，靈敏度高、特異性強(qiáng)，檢測(cè)方法方便快捷。
[0019](3)本發(fā)明提供了一種采用檢測(cè)試劑盒檢測(cè)辣椒斑駁病毒的應(yīng)用方法，采用環(huán)介導(dǎo)等恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplicat1n, LAMP)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)便，靈敏度高。LAMP技術(shù)是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的一種新型的DNA擴(kuò)增技術(shù)，該方法不需要如qRT-PCR的復(fù)雜操作和昂貴的實(shí)時(shí)定量PCR儀器，也不需要如RT-PCR長(zhǎng)時(shí)間的擴(kuò)增過(guò)程以及繁瑣的電泳紫外觀察過(guò)程。LAMP方法從采樣到得出結(jié)果的全過(guò)程僅需lh，并且靈敏度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法；更重要的是，可用目測(cè)比色直接判斷反應(yīng)結(jié)果。LAMP技術(shù)在恒溫下即可直接進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，不需要長(zhǎng)時(shí)間的溫度循環(huán)；且擴(kuò)增反應(yīng)特異性高、效率尚O
【附圖說(shuō)明】
[0020]為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。
[0021]圖1為采用熒光染料檢測(cè)實(shí)施例2中的擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有PepMoV的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0022]圖2為采用實(shí)施例2中RT-LAMP方法檢測(cè)P印MoV的效果圖，圖中，I為0.147 μ g/μ I ；2 為 0.147 X 10 1 μ g/ μ I ;3 為 0.147 X 10 2 μ g/ μ I ;4 為 0.147 X 10 3 μ g/ μ I ;5 為 0.147X10 Vg/μ I ;6 為 0.147 X 10 5 μ g/μ I ;7 為 0.147X10 Vg/ μ I ;8 為0.147X 10 7 μ g/μ I ;9 為 0.147X10 Vg/μ I cDNA ;10 為陰性對(duì)照。
[0023]圖3為采用對(duì)比例I中RT-PCR方法檢測(cè)P印MoV的效果圖，圖中，I為0.147 μ g/μ I ；2 為 0.147 X 10 1 μ g/ μ I ;3 為 0.147 X 10 2 μ g/ μ I ;4 為 0.147 X 10 3 μ g/ μ I ;5 為 0.147X10 Vg/μ I ;6 為 0.147 X 10 5 μ g/μ I ;7 為 0.147X10 Vg/ μ I ;8 為0.147X 10 7 μ g/μ I ;9 為 0.147X10 Vg/μ I cDNA ;10 為陰性對(duì)照。
[0024]圖4為不同反應(yīng)溫度條件對(duì)RT-LAMP反應(yīng)效果的電泳圖，圖中M為標(biāo)準(zhǔn)分子量；1為 60°C ；2 為 61 °C ；3 為 62°C ；4 為 63°C ；5 為 64°C ；6 為 65°C ；7 為 66°C ；8 為陰性對(duì)照。
[0025]圖5為不同反應(yīng)時(shí)間條件對(duì)RT-LAMP反應(yīng)效果的電泳圖，圖中M為標(biāo)準(zhǔn)分子量；1為 30min ；2 為 45min ；3 為 60min ；4 為 75min ；5 為 90min ；6 為 120min。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例
[0027]以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。
[0028]實(shí)施例1
根據(jù)辣椒斑駁病毒的核苷酸序列，選擇該序列中相對(duì)保守且特異區(qū)域4180?4378bp，利用LN832375上的對(duì)應(yīng)區(qū)域通過(guò)在線引物設(shè)計(jì)軟件primerExplorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html)設(shè)計(jì)引物，通過(guò)比對(duì)引物相應(yīng)的3’端或5’端穩(wěn)定性及引物二聚體等參數(shù)，最終選取一組最合適的引物，具體為外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP。
[0029]其中，外引物F3的DNA序列為SEQ ID N0.1所述的DNA序列，具體為:CTTCAATGGCATTTAGAAGCT。
[0030]外引物B3的DNA序列為SEQ ID N0.2所述的DNA序列，具體為:CCGTATTGGATCATGTCACAA。
[0031 ] 內(nèi)引物FIP的DNA序列為SEQ ID N0.3所述的DNA序列，具體為:GTGAACTCCACCTCTCTGCC-ACACTAATTGTAAGGTTTTGAAGG。
[0032]內(nèi)引物BIP的DNA序列為SEQ ID N0.4所述的DNA序列，具體為:ACACAATTCCCAGTGAAATTAGTGG-TTGCTACCTGTGCCTTGA。
[0033]實(shí)施例2:
一種檢測(cè)試劑盒，包括:
外引物F3 (濃度ΙΟμΜ):0.5μ1 ;
外引物Β3 (濃度ΙΟμΜ):0.5μ1 ; 內(nèi)引物FIP (濃度40μΜ):1 μ I ;
內(nèi)引物BIP (濃度40μΜ):1 μ I ;
2 X RM反應(yīng)緩沖液:12.5 μι ；
Bst DNA 聚合酶:1 μ I。
[0034]補(bǔ)充DEPC 水至:25 μ I。
[0035]一種本實(shí)施例中檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用方法，具體包括以下步驟:
Cl)提取植株總RNA:從福建、湖南等地采集病株，運(yùn)用RT-PCR篩選出的辣椒斑駁病毒樣品，參照TRIzo1-A+ Reagents (TIANGEN)使用說(shuō)明，提取辣椒斑駁病毒樣品中的總RNA，參照 Hiscript?II 1st strand cDNA synthesis Kit (Vazyme)使用說(shuō)明，使用 Randomhexamers將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0036]