錦鯉皰疹病毒的rt-lamp檢測引物組、試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的檢測方法，具體涉及一種錦 鯉皰疫病毒（KHV)的RT-LAMP(Real-TimeLoop-mediatedIsothermalAmplification， 恒溫實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增反應(yīng)）檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 錦鯉皰疹病毒病是由錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus, KHV)引起的錦鯉 (Cyprinus carpio koi )和鯉魚（Cyprinus carpio carpio)的一種高致病性疾病。該病 多發(fā)生在水溫為18~28°C的春秋季節(jié)，具有高度傳染性，發(fā)病率和死亡率均可高達(dá)80%~ 100%。由于缺乏相關(guān)的檢疫制度，所以錦鯉和鯉魚的國際貿(mào)易促進(jìn)了該病在世界范圍內(nèi)的 暴發(fā)性流行，給錦鯉和鯉魚養(yǎng)殖業(yè)造成了破壞性影響。該病最初在德國報(bào)道，后主要在歐洲 的錦鯉養(yǎng)殖中廣泛傳播，是國際動(dòng)物衛(wèi)生組織（0IE)規(guī)定需要向0IE申報(bào)的疾病之一。在 我國也被列為《中華人民共和國動(dòng)物防疫法》第十條規(guī)定中的二類動(dòng)物疫病。
[0003] KHV屬于皰疹病毒科，為直徑100~110nm的二十面體，有囊膜，KHV是線形雙股DNA 病毒，是魚類皰疫病毒，屬中基因組最大的病毒?；蚪M大小為295kb，全部核苷酸的GC含 量為59. 2%。目前，已分離到4株病毒，即歐洲株、美國株（KHV-U)、亞洲株（KHV-J)和以色 列株（KHV-I)。。KHV在22°C左右的池塘水中至少存活4 h，并且在魚的分泌物或池塘底泥中 可能存活更長時(shí)間。病毒對溫度和酸堿度都比較敏感，在35°C 2天或60°C 30min以及pH 低于3或高于11的條件下，病毒失去感染力。氯仿、250mL/ L的乙醚或lg/L的TritonX-100 可迅速滅活病毒。感染KHV的魚典型臨床癥狀是反應(yīng)遲鈍、食欲不振、呼吸困難、共濟(jì)失調(diào)； 鰓出血壞死，眼睛凹陷，皮膚有灰白色斑點(diǎn)，黏液分泌增多；感染后第7~10天開始出現(xiàn)死 亡,2~3周后死亡率可達(dá)100%。
[0004] 目前，采取細(xì)胞培養(yǎng)錦鯉皰疹病毒一般需要15天以上才能得出結(jié)果，檢測周期太 長，采取PCR檢測方法需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)的操作水平，因此建立一種快速、準(zhǔn)確、高通 量且對儀器要求不高的的檢測試劑盒及檢測方法成為目前急需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測引物組。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測方法。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測引物組，包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引 物，其核苷酸序列分別如下所示： 外引物： KHV-F3 ：AGTCACCAAAGCTCAACTG (SEQ ID N0:1)； KHV-B3 ：GATTCCGATGCCGATGAA (SEQ ID N0:2)； 內(nèi)引物： KHV-FIP ：TTGAATCGCTCAGCGTCTACGCCTGATGAACAAGGTGCC (SEQ ID NO:3)； KHV-BIP ：CCGCTGACGATGGGCATTTGAGATCAAAGTTGGGATCG (SEQ ID N0:4)； 環(huán)引物： KHV-LF ：CTTGACGAGGAGCTTGCT (SEQ ID NO:5)； KHV-LB ：GCACGCCATGTACTCCAA (SEQ ID NO:6)〇
[0009] 一種錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括上述所述的檢測引 物組。
[0010] 進(jìn)一步的，上述檢測試劑盒包含上述所述的引物組、DNA聚合酶、RT-LAMP反應(yīng)液、 陽性對照和陰性對照。
[0011] 進(jìn)一步的，上述外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為1 :8 :4。
[0012] 進(jìn)一步的，上述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。
[0013] 進(jìn)一步的，上述RT-LAMP反應(yīng)液含有10mM dNTP、10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、 150mM MgSCVK溶液和 10XSYT0-9 溶液。
[0014] 進(jìn)一步的，上述陽性對照為含有目的基因片段的質(zhì)粒DNA，陰性對照為DEPC水。
[0015] 一種錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測方法，包括如下步驟： 1) 待檢樣品DNA的提取； 2) 恒溫實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增反應(yīng)：配制25111反應(yīng)體系，含有1(狀43 0.211|1，1(狀-83 0? 2 ii M，KHV-FIP 1. 6 ii M，KHV-BIP 1. 6 ii M，KHV-LF 0? 8 ii M，KHV-LB 0? 8 ii M，RT-LAMP 反應(yīng) 液13. 0iil，DNA聚合酶8U，待檢DNA l~100ng，用DEPC水補(bǔ)齊到25iil ;然后于63~65°C 反應(yīng)60~90min ; 3) 結(jié)果分析：根據(jù)有無S型擴(kuò)增曲線來判斷檢測結(jié)果； 上述所用到的所有試劑均來自權(quán)利要求2~7任一所述的檢測試劑盒； 上述檢測方法用于非疾病檢測或診斷。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明具有高特異性、高靈敏度、快速高效、操作簡便、結(jié)果易讀等有益效果： 1) 高特異性： 本發(fā)明根據(jù)錦鯉皰疹病毒（KHV)的主要包膜蛋白基因（mr基因，GenBank登錄號(hào)為 AB195965. 1)設(shè)計(jì)了六條特異性引物，應(yīng)用上述六條引物，擴(kuò)增靶序列的6個(gè)區(qū)域，6個(gè)區(qū)域 中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故其特異性極高，且非常穩(wěn)定，形成引物二 聚體概率低，保證了反應(yīng)的順利進(jìn)行； 2) 高靈敏度：最低檢測極限可達(dá)到lpg /ul KHV DNA ; 3) 快速高效：整個(gè)擴(kuò)增只用60~90min即可完成，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)109~10 1(1個(gè)拷貝； 4) 操作簡便：不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性等 繁瑣步驟，只需要恒溫?zé)晒鈾z測儀器，條件比較溫和； 5) 結(jié)果易讀：通過便捷式的恒溫?zé)晒鈾z測儀器即可判讀檢測結(jié)果，無需電泳等其他任 何分析步驟，適合非專業(yè)人士的現(xiàn)場檢測。
【附圖說明】
[0017] 圖1是實(shí)施例3特異性的檢測結(jié)果圖（1、2 :DEPC水對照；3、4 :KHV DNA ;5、6 :CW DNA ;7、8 :CyHV-l DNA ;9、10 :CyHV-2 DNA); 圖2是實(shí)施例4靈敏度的檢測結(jié)果圖（KHV DNA，1 :100ng/ul DNA(KHV) ;2 :10ng/ul DNA(KHV) ；3：lng/ul DNA(KHV) ；4 ：100pg/ul DNA(KHV) ；5 ：10pg/ul DNA(KHV) ；6 ：lpg/ul DNA(KHV) ;7:100fg/ul DNA(KHV) ;8:DEPC 水對照）。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0019] 實(shí)施例1錦鯉皰疹病毒RT-LAMP檢測試劑盒的建立 錦鯉皰疫病毒的 RT-LAMP (Real -Time Loop-mediated Isothermal Amplification， 恒溫實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增反應(yīng)）檢測試劑盒，包括RT-LAMP引物組、RT-LAMP反應(yīng)液、聚合 酶、陽性對照和陰性對照。
[0020] (1) RT-LAMP引物設(shè)計(jì)：以錦鯉皰疹病毒（KHV)的主要包膜蛋白基因（mr基因， GenBank登錄號(hào)為AB195965. 1)為靶基因，利用在線設(shè)計(jì)KHV特異性RT-LAMP引物。引物 序列見表1。
[0021] 表1. KHV特異性的RT-LAMP弓丨物序列表
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測引物組，包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán) 引物，其核苷酸序列分別如下所示： 外引物： KHV-F3 ：AGTCACCAAAGCTCAACTG (SEQ ID N0:1)； KHV-B3 ：GATTCCGATGCCGATGAA (SEQ ID N0:2)； 內(nèi)引物： KHV-FIP ：TTGAATCGCTCAGCGTCTACGCCTGATGAACAAGGTGCC (SEQ ID NO:3)； KHV-BIP ：CCGCTGACGATGGGCATTTGAGATCAAAGTTGGGATCG (SEQ ID N0:4)； 環(huán)引物： KHV-LF ：CTTGACGAGGAGCTTGCT (SEQ ID NO:5)； KHV-LB ：GCACGCCATGTACTCCAA (SEQ ID N0:6)〇
2. -種錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于：該檢測試劑盒包括權(quán)利要 求1所述的檢測引物組。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于：該檢測 試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物組、DNA聚合酶、RT-LAMP反應(yīng)液、陽性對照和陰性對照。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于：外引物、 內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為1 :8 :4。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA 聚合酶為Bst DNA聚合酶。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于：所 述RT-LAMP反應(yīng)液含有10mM dNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgSOyK溶液和 10XSYT0-9 溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于：所述陽 性對照為含有目的基因片段的質(zhì)粒DNA，陰性對照為DEPC水。
8. -種錦鯉皰疹病毒的RT-LAMP檢測方法，其特征在于：包括如下步驟： 1) 待檢樣品DNA的提取； 2) 恒溫實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增反應(yīng)：配制25iil反應(yīng)體系，含有KHV-F3 0. 2iiM，KHV-B3 0? 2 ii M，KHV-FIP 1. 6 ii M，KHV-BIP 1. 6 ii M，KHV-LF 0? 8 ii M，KHV-LB 0? 8 ii M，RT-LAMP 反應(yīng) 液13. 0iil，DNA聚合酶8U，待檢DNA l~100ng，用DEPC水補(bǔ)齊到25iil ;然后于63~65°C 反應(yīng)60~90min ; 3) 結(jié)果分析：根據(jù)有無S型擴(kuò)增曲線來判斷檢測結(jié)果； 上述所用到的所有試劑均來自權(quán)利要求2~7任一所述的檢測試劑盒； 上述檢測方法用于非疾病檢測或診斷。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種錦鯉皰疹病毒RT-LAMP的檢測引物組、檢測試劑盒和檢測方法。檢測的引物組包括一對外引物、一對環(huán)引物、一對內(nèi)引物；檢測試劑盒包括引物組、RT-LAMP反應(yīng)液、BstDNA聚合酶和陰陽性對照。其檢測方法是通過提取待檢病毒DNA，采用六條特異性引物及一種具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在63～65℃對樣品DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，通過便捷儀器恒溫?zé)晒鈾z測儀器觀察是否有無S型擴(kuò)增曲線，確定待檢樣品中是否含有錦鯉皰疹病毒（KHV）DNA。本發(fā)明具有高特異性、高靈敏度、快速高效、操作簡便、結(jié)果易讀等優(yōu)點(diǎn)，適于在各級(jí)檢測單位和水產(chǎn)養(yǎng)殖用戶中進(jìn)行推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11, C12R1-93, C12Q1-70
【公開號(hào)】CN104673934
【申請?zhí)枴緾N201510073315
【發(fā)明人】劉助紅, 邱德義, 張璜, 陳洵, 石磊
【申請人】中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 廣州迪澳生物科技有限公司
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月10日