一種用于檢測(cè)bk病毒的引物、探針和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)BK病毒的引物、探針和試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] BK 病毒（BK virus，BKV)是多瘤病毒（polyomaviruses，PV)的一種。BK 病毒為無(wú) 被膜環(huán)狀雙鏈病毒，呈全球性分布。流行病學(xué)表明90%以上健康成人既往有BK病毒感染 史，患者免疫功能低下時(shí)BK病毒重新激活，可出現(xiàn)BK病毒尿癥。據(jù)報(bào)道，約45%腎臟移植 受者出現(xiàn)病毒激活，的腎移植患者出現(xiàn)BK病毒相關(guān)性腎?。˙K virus associated n印hropaty，BKVAN)，其中60% -70%會(huì)導(dǎo)致移植腎喪失功能。除此之外，BK病毒的感染還 與骨髓移植患者的出血性膀胱炎、輸尿管狹窄、進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病、肺部疾病、腫瘤、自 身免疫性疾病等有關(guān)。BK病毒往往潛伏在腎臟中，在免疫抑制狀態(tài)下機(jī)體才可能會(huì)發(fā)病， 如獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired Immuno-deficiency Syndrome，AIDS)、先天性免疫功 能缺陷和接受化療的惡性腫瘤患者以及應(yīng)用免疫抑制劑治療的實(shí)體器官移植及骨髓移植 受者。對(duì)于接受免疫抑制治療的人特別是腎移植后的患者，BK病毒容易再次激活且大量復(fù) 制，導(dǎo)致疾病。由于目前缺乏有效針對(duì)BK病毒的抗病毒治療手段，使得持續(xù)、有效地對(duì)BK 病毒感染進(jìn)行監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。
[0003] 在目前BK病毒感染的檢測(cè)中采用病毒血清學(xué)檢測(cè)法，具體采用酶免疫分析法 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測(cè)BK病毒的抗體滴度，但此方法檢測(cè)速 度慢且特異性不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)BK病毒的速度慢且特異性不高的問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例 提供了一種用于檢測(cè)BK病毒的引物、探針和試劑盒。所述技術(shù)方案如下：
[0005] -方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測(cè)BK病毒的引物和探針，所述引物和探 針包括：用于檢測(cè)BK病毒的正向引物、用于檢測(cè)BK病毒的反向引物和用于檢測(cè)BK病毒的 探針，其中，
[0006] 所述用于檢測(cè)BK病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示；
[0007] 所述用于檢測(cè)BK病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示；
[0008] 所述用于檢測(cè)BK病毒的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示；
[0009] 所述探針的5'端連接有熒光基團(tuán)FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3或Cy5,所述 探針的 3' 端連接有淬滅基團(tuán) TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
[0010] 另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測(cè)BK病毒的試劑盒，所述試劑盒包括 上述引物和探針。
[0011] 具體地，所述試劑盒還包括：核酸釋放劑、PCR反應(yīng)液、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控 品、陰性質(zhì)控品和工作標(biāo)準(zhǔn)品。
[0012] 具體地，所述工作標(biāo)準(zhǔn)品包括：工作標(biāo)準(zhǔn)品1、工作標(biāo)準(zhǔn)品2、工作標(biāo)準(zhǔn)品3和工作 標(biāo)準(zhǔn)品4,其中，
[0013] 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品1為1 x 107拷貝/mL的所述BK病毒的基因片段；
[0014] 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品2為1 X 106拷貝/mL的所述BK病毒的基因片段；
[0015] 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品3為1 X 105拷貝/mL的所述BK病毒的基因片段；
[0016] 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品4為1 X 104拷貝/mL的所述BK病毒的基因片段。
[0017] 具體地，所述陽(yáng)性質(zhì)控品為1. OX 106拷貝/mL的所述BK病毒的基因片段。
[0018] 具體地，所述正向引物和所述反向引物的終濃度均為0. 05-0. 9 yM，所述探針的終 濃度為 0.05-0. 9 yM。
[0019] 具體地，所述PCR反應(yīng)液各組分在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中包括：終濃度為0.01U/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、終濃度為0. 2~0. 6mM的dNTPs、10XPCR緩沖液和終濃度為 1. 5~5. OmM的含Mg離子的溶液。
[0020] 具體地，所述核酸釋放劑包括無(wú)菌水、終濃度為0. 03-0. 3 %的聚乙二醇辛基苯基 醚、終濃度為0. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH值為8. 3的終濃度為0. 01-0. 1M 的三（羥甲基）氨基甲烷。
[0021] 具體地，所述臨界陽(yáng)性質(zhì)控品為1. ox 104拷貝/mL的所述BK病毒的基因片段。
[0022] 具體地，所述陰性質(zhì)控品為濃度0. 8%的生理鹽水。
[0023] 本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是：本發(fā)明實(shí)施例提供的用于檢測(cè) BK病毒的引物和探針，具有靈敏度高的特性，使得本發(fā)明實(shí)施例提供的用于檢測(cè)BK病毒的 試劑盒，具有靈敏度高的特性，采用儀器收集熒光信號(hào)，避免了肉眼判斷的主觀性，其檢測(cè) 結(jié)果可靠，提高了檢測(cè)的靈敏度，即使僅存在單拷貝的目的片段該試劑盒也可以進(jìn)行有效 的檢測(cè)；檢測(cè)速度快，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程共僅需2~3小時(shí)。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他 的附圖。
[0025] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例2提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0026] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例3提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0027] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例4提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0028] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例5提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0029] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例5提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0030] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例5提供的由圖4得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，圖6橫坐標(biāo)為L(zhǎng)og Starting Quantity copy number，縱坐標(biāo)為 Threshold Cycle。
[0031] 圖中：Cycles 為循環(huán)數(shù)，RFU 為焚光值，Log Starting Quantity copy number 為 水痘帶狀皰瘆病毒起始濃度的對(duì)數(shù)值，Ct (Threshold Cycle)值為循環(huán)數(shù)；la-實(shí)施例2中 樣品1，4a-實(shí)施例2中樣品4, 5a-實(shí)施例2中樣品5,6a-實(shí)施例2中樣品6, 7a-實(shí)施例2 中樣品7。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方 式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中所用試劑和探針主要購(gòu)自寶生物工程（大連）有限 公司。
[0033] 實(shí)施例1. 一種用于BK病毒核酸定量檢測(cè)的引物和熒光探針
[0034] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測(cè)BK病毒的引物和探針，引物和探針包括：用于 檢測(cè)BK病毒的正向引物、用于檢測(cè)BK病毒的反向引物和用于檢測(cè)BK病毒的探針，其中，
[0035] 用于檢測(cè)BK病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示；
[0036] 用于檢測(cè)BK病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示
[0037] 用于檢測(cè)BK病毒的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示；
[0038] 探針的5'端連接有熒光基團(tuán)？411、冊(cè)乂、了￡1\1(^、￥1(：、1?(?、〇73或〇75，探針的3' 端連接有淬滅基團(tuán)TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本發(fā)明實(shí)施例中，探針 的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，F(xiàn)AM的激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，接收波長(zhǎng)為527nm ;淬滅基團(tuán)為Eclipse。 純化方式可選自：HAP、PAGE和HPLC純化方式，具體地引物和探針如下表：
[0039] 表1.BK病毒引物和探針
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)BK病毒的引物和探針，其特征在于，所述引物和探針包括：用于檢測(cè) BK病毒的正向引物、用于檢測(cè)BK病毒的反向引物和用于檢測(cè)BK病毒的探針，其中， 所述用于檢測(cè)BK病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示； 所述用于檢測(cè)BK病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示； 所述用于檢測(cè)BK病毒的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示； 所述探針的5'端連接有熒光基團(tuán)FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述探針 的 3' 端連接有淬滅基團(tuán) TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
2. -種用于檢測(cè)BK病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1所述的 引物和探針。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：核酸釋放劑、PCR反 應(yīng)液、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和工作標(biāo)準(zhǔn)品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述工作標(biāo)準(zhǔn)品包括：工作標(biāo)準(zhǔn)品1、工 作標(biāo)準(zhǔn)品2、工作標(biāo)準(zhǔn)品3和工作標(biāo)準(zhǔn)品4,其中， 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品1為I X IO7拷貝/mL的所述BK病毒的基因片段； 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品2為I X IO6拷貝/mL的所述BK病毒的基因片段； 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品3為I X IO5拷貝/mL的所述BK病毒的基因片段； 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品4為I X IO4拷貝/mL的所述BK病毒的基因片段。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陽(yáng)性質(zhì)控品為1.0 X 10 6拷貝/mL 的所述BK病毒的基因片段。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的終濃 度均為0. 05-0. 9 y M，所述探針的終濃度為0. 05-0. 9 y M。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液各組分在PCR擴(kuò)增反應(yīng) 體系中包括：終濃度為0.0 lU/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、終濃度為0. 2~0. 6mM的dNTPs、 10XPCR緩沖液和終濃度為1. 5~5. OmM的含Mg離子的溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸釋放劑包括無(wú)菌水、終濃度為 0.03-0. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚、終濃度為0.04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH 值為8. 3的終濃度為0? 01-0.1 M的三（羥甲基）氨基甲烷。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述臨界陽(yáng)性質(zhì)控品為1.0 X 10 4拷貝 AiL的所述BK病毒的基因片段。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性質(zhì)控品為濃度0. 8%的生理 鹽水。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)BK病毒的引物、探針和試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述引物和探針包括：用于檢測(cè)BK病毒的正向引物、用于檢測(cè)BK病毒的反向引物和用于檢測(cè)BK病毒的探針。所述試劑盒包括上述的引物和探針。所述引物、探針和試劑盒，具有靈敏度高的特性，且檢測(cè)速度快，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程共僅需2～3小時(shí)。
【IPC分類】C12Q1-68, C12R1-93, C12Q1-70, C12N15-11
【公開(kāi)號(hào)】CN104745723
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510050835
【發(fā)明人】劉茹, 桑筱筱
【申請(qǐng)人】湖北永邦醫(yī)療科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年1月30日