白木香的雙重pcr鑒定方法、引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及木材材種鑒定的生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說涉及對白木香的DNA鑒定方法及其專用的引物和探針。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]白木香(sinensis(Lour.))，又稱土沉香，是瑞香科沉香屬雙子葉常綠喬木，國家二級重點(diǎn)野生保護(hù)植物。白木香不僅是珍貴的藥用植物而且還有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著人們對沉香需求量的正價(jià)，沉香價(jià)格不斷攀升，市場上出現(xiàn)了大量的偽品，嚴(yán)重?cái)_亂了市場秩序。但迄今為止，對白木香的鑒定依然采用傳統(tǒng)的木材鑒定手段，即解剖切片觀察木材的構(gòu)造以及形態(tài)特征從而得出判定結(jié)果。
[0004]所謂傳統(tǒng)的木材鑒定識別方法是利用人工經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行識別，主要通過對木材截面進(jìn)行人工觀察的方式完成。對白木香的鑒定目前采用的也是傳統(tǒng)的鑒定方法。所謂的傳統(tǒng)鑒定方法主要依賴宏觀識別，而微觀識別則需要使用光學(xué)顯微鏡觀察其內(nèi)部的解剖結(jié)構(gòu)特征，也就是觀察構(gòu)成木材的各類細(xì)胞與組織的形態(tài)及排列特征，該方法涉及的識別特征較多，鑒定相對準(zhǔn)確，但對于鑒定工作者的要求很高，要對此做出準(zhǔn)確的鑒定，必須具有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。近年來研究工作者開發(fā)了基于數(shù)字圖像處理的木材圖像識別技術(shù)，大大提高了木材識別的準(zhǔn)確性，推動(dòng)了木材識別技術(shù)的發(fā)展。但是，無論是基于識別者經(jīng)驗(yàn)的傳統(tǒng)識別技術(shù)還是基于計(jì)算機(jī)圖像檢索的識別技術(shù)，都沒有脫離木材本身的形態(tài)結(jié)構(gòu)及特征，鑒定識別工作都必須建立在所檢木材有完整易辨識的形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，這就為木材識別工作帶來了一定的局限性，同時(shí)，相近種屬木材易出現(xiàn)材質(zhì)結(jié)構(gòu)的相似，為木材識別的準(zhǔn)確性帶來困難。
[0005]若能建立起以木材基因多樣性的分子鑒定技術(shù)，一方面可以杜絕木材制品的摻假造假行為，對于保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，提高品牌價(jià)值，規(guī)范木材市場；另一方面，為檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)林、工商的快速篩查和鑒定提供技術(shù)方法，促進(jìn)物種資源的保護(hù)和利用，提高進(jìn)出口的檢驗(yàn)檢疫的準(zhǔn)確性。
[0006]因此建立起白木香的DNA鑒定方法，實(shí)現(xiàn)白木香的簡單、快速、準(zhǔn)確、客觀的鑒定是目前急需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種白木香鑒定的雙重PCR引物和探針，所述引物和探針序列包括: 第一輪PCR擴(kuò)增的引物和探針分別為:
HH Primer-F:5’- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3’
HH Primer-R:5’- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3’
HH Primer Probe:5' -VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3’。
[0008]第二輪PCR擴(kuò)增的引物和探針分別為:BMX Primer-F:5’- GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT -3’
BMX Primer-R:5’- GCGAACGGGAATTGACAGAA -3’
BMX Primer Probe:5’-FAM- AAAGTCGTCCCTTCGA -MGB-3’。
[0009]進(jìn)一步地，所述引物和探針的PCR反應(yīng)條件為95°C，10min ;95°C 15s，60°C lmin，共40個(gè)循環(huán)。
[0010]進(jìn)一步地，所述引物和探針的使用濃度比為:JZHT Primer-F: JZHTPrimer-R:JZHT Primer Probe= 900nM:900nM:250nM。
[0011]本發(fā)明還提供了白木香鑒定的雙重PCR，包括如下步驟:
(1)木材樣本的預(yù)處理；
(2)提取經(jīng)(I)處理后的木材樣本中的DNA;
(3)利用引物HH Primer-F 和 HH Primer-R,以及探針 HH Primer Probe 對(2)中提取的DNA進(jìn)行第一輪的PCR擴(kuò)增；
(4)根據(jù)(3)的第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果，利用BMXPrimer-F和BMX Primer-R,以及探針BMX Primer Probe對(3)有擴(kuò)增曲線的樣本進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；
(5)根據(jù)(4)的結(jié)果確定木材種類；
其特征在于，所述引物和探針序列包括:
HH Primer-F:5’- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3’
HH Primer-R:5’- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3’
HH Primer Probe:5' -VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3’
BMX Primer-F:5’- GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT -3’
BMX Primer-R:5’- GCGAACGGGAATTGACAGAA -3’
BMX Primer Probe:5’-FAM- AAAGTCGTCCCTTCGA -MGB-3’ 。
[0012]進(jìn)一步地，所述的熒光PCR 擴(kuò)增條件為:95°C，10min ;95°C 15s，60°C lmins，共 40個(gè)循環(huán)。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:本發(fā)明在對白木香大量基因信息進(jìn)行分析比較的基礎(chǔ)上，根據(jù)序列位點(diǎn)多態(tài)性，設(shè)計(jì)出白木香種屬一對特異性擴(kuò)增引物及MGB探針建立了白木香特異性的熒光定量PCR鑒定檢測方法。該方法對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，條件依賴少，不用比對復(fù)雜的測序圖譜，直接根據(jù)擴(kuò)增曲線即可做出分析該位點(diǎn)基因型，對結(jié)果的分析非常直觀。本發(fā)明所采用的熒光定量PCR法(MGB探針)檢測周期短，在三個(gè)小時(shí)內(nèi)即可得出結(jié)果，而且相對于DNA測序法來說檢測靈敏度大大提高，使用MGB探針還能極大地降低本底信號的干擾。
[0014]本發(fā)明并不需要木材有完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)，只需從木料上取極少量木材樣本，即可滿足檢測要求，操作簡單。并且通過木材特有的DNA信息做出判斷，鑒定過程客觀、準(zhǔn)確。克服了傳統(tǒng)鑒定方法主要依賴于形態(tài)鑒定方法，并必須建立在木材有完整易辨識的形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上的技術(shù)局限性。本發(fā)明很好地滿足各相關(guān)部門對白木香快速篩查和鑒定的要求，能有效杜絕白木香制品的摻假造假行為，對于保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，提高品牌價(jià)值，規(guī)范市場，促進(jìn)物種資源的保護(hù)和利用具有重要的意義。
【附圖說明】
[0015]圖1是白木香和對照組樹種DNA提取效果實(shí)驗(yàn)。
[0016]圖2A和圖2B是特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0017]圖3是本發(fā)明方法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0018]圖4是取自針對經(jīng)不同處理方式得到的木材樣本的檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但并不因此將本發(fā)明限制在所述的具體實(shí)施例中。實(shí)施例中未說明的條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照商品說明書建議的步驟和條件。
[0020]實(shí)施例1檢測白木香的引物、探針和檢測試劑盒
利用NCBI等資源信息，篩選出一對特異性擴(kuò)增引物對(HH Primer-F和HHPrimer-R)，并在該引物對的擴(kuò)增區(qū)域設(shè)定了一條特異性的探針(HH Primer Probe)。利用 HH Primer-F、HH Primer-R 和 HH Primer Probe 將白木香(A.sinensis)和云南沉香(A.yunnanensis)與其他物種區(qū)分開來。所述擴(kuò)增引物對和探針序列分別是:
HH Primer-F:5’- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3’
HH Primer-R:5’- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3’
HH Primer Probe:5' -VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3’。
[0021]設(shè)計(jì)一對特異性擴(kuò)增引物對(BMX Primer-F和BMX Primer-R)和一條特異性的探針(BMX Primer Probe)。利用 BMX Primer_F、BMX Primer-R 和 BMX Primer Probe 鑒定出白木香(A.sinensis)。
[0022]BMX Primer-F:5’- GAGTAAGGAATACCCATTTGAATGATT -3’
BMX Primer-R:5’- GCGAACGGGAATTGACAGAA -3’
BMX Primer Probe:5’-FAM- AAAGTCGTCCCTTCGA -MGB-3’ 。
[0023]一種檢測白木香的試劑盒，所述試劑盒包括樣品DNA抽提試劑、qPCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。
[0024]其中所述用于將白木香(A.sinensis)和云南沉香(A.yunnanensis)與其他物種區(qū)分開的第一輪qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:20μ1的體系包括:
Taqman getyping master mix (2X ) 10μ1 HH Primer Probe終濃度(250nM)
HH Primer-F (20μΜ)終濃度(9OOnM)
HH Primer-R (20μΜ)終濃度(9OOnM)
DNA樣品模板l~20ng
其中所述引物和探針序列分別為:
HH Primer-F:5’- CCCGTTCGCTACTTTGACTTTG -3’
HH Primer-R:5’- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3’
HH Primer Probe:5' -VIC- TGACATAGACACAAGTC -MGB-3’。
[0025]其中所述用于鑒定出白木香(A.sinensis)的第二輪qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:20μ1的體系包括:Taqman getyping master mix (2X ) ΙΟμΙ
BMX Primer Probe終濃度(250nM)
BMX Primer-F (20μΜ)終濃度(900nM)
BMX Primer-R (20μΜ)終濃度(900nM)