一次性檢測肺癌多重基因的引物、探針、檢測體系和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及肺癌多重基因的引物、探針及檢測體系。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是惡性腫瘤中發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)占肺癌的85%左右。隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制及其生物學(xué)行為研宄的不斷深入，人們 越來越多的把焦點(diǎn)聚向特異性高、不良反應(yīng)輕為特點(diǎn)的分子革G向治療。近幾年，在肺癌分 子靶向治療領(lǐng)域，研宄熱點(diǎn)主要集中在EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF等靶點(diǎn)上，這些基因的 突變或融合狀態(tài)與靶向藥物的療效相關(guān)，多基因的聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高預(yù)測預(yù)后的準(zhǔn)確 性。然而，目前大多每次只能檢測一個(gè)突變或一段基因的突變，檢測通量低，只能逐個(gè)篩查， 耗時(shí)長。同時(shí)，由于晚期患者取材較難，樣本量較少，往往不能滿足逐個(gè)篩查的需要，且臨床 上尚無能夠同時(shí)、一次性完成對此9個(gè)熱點(diǎn)基因進(jìn)行檢測的試劑盒。
[0003] 本發(fā)明提供一種高靈敏度和高特異性的用于一次性檢測多重肺癌基因的引物、探 針、試劑盒及引物分配方式。該檢測試劑盒利用DNA樣本進(jìn)行基因突變和RNA樣本進(jìn)行基因 融合的檢測，特異性和靈敏度高，檢測結(jié)果重復(fù)性好，而且引入了熒光檢測技術(shù)，克服了傳 統(tǒng)PCR產(chǎn)物遺留污染的問題，操作簡便快捷，為臨床EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、BRAF、NRAS、 HER2、PIK3CA9種基因突變/融合的檢測提供了一種快速可靠的檢測方法。該方法可以實(shí) 現(xiàn)一次性檢測肺癌的多重基因，大大縮短了檢測的時(shí)間，提高了肺癌基因檢測的靈敏度和 準(zhǔn)確率，從而實(shí)現(xiàn)指導(dǎo)肺癌臨床治療方案制定及化療預(yù)后。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于一次性檢測多重肺癌基因的引物、探針，包括 已6卩1?、8狀?、1(狀5、4〇(和1?051等熱點(diǎn)基因的引物、探針及分配方式，其序列如表1 :
[0005] 表1引物、探針以及序列號(hào)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種試劑盒中引物和探針的分布方法，其特征在于：采用12聯(lián)管或8聯(lián)管，將引物 和探針序列分組，分裝于12聯(lián)管或8聯(lián)管中，其中，（1)同組引物之間不會(huì)引起引物二聚體 方面的互相干擾；（2)同組引物共用上游或下游引物；（3)所有組的引物和探針擴(kuò)增程序一 致、操作一致；(4)不同組的探針中，至少具有雙色染料，以提供至少雙色檢測通道。
2. -次性檢測肺癌多重基因的引物和探針，包括如下115條序列，且所述的序列分為 12組，具體如下：


3. -次性檢測肺癌基因檢測的反應(yīng)體系，包括 ①融合基因 DEPC H2O
其中，所述的引物和探針如權(quán)利要求1所示。
4. 如權(quán)利要求3所述一次性檢測肺癌基因檢測的反應(yīng)體系，其特征在于，加入的LMG混 合酶A的組成為Hs-taq酶0? 26 y L、UNG酶0? 03 y L、逆轉(zhuǎn)錄酶0? 5 y L ;LMG混合酶B的組 成為 Hs-taq 酶 0? 20 y L、UNG 酶 0? 05 y L。
5. -種試劑盒，包括權(quán)利要求2所述的12組序列，這12組序列分別裝入12聯(lián)管內(nèi)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測肺癌多重基因的引物、探針、檢測體系及試劑盒，其中包括用于檢測肺癌EGFR基因25種突變、KRAS基因7種突變和BRAF 6種基因突變、NRAS 9種基因突變、HER2 5種基因突變，PIK3CA 2種基因突變以及ALK 5種融合基因、ROS1 13種融合基因和RET 6種融合基因的引物、探針及其分配方式。本發(fā)明的檢測試劑盒采用12聯(lián)PCR反應(yīng)條設(shè)計(jì)，每一個(gè)12聯(lián)PCR條檢測一個(gè)樣品的多重基因，12聯(lián)條的1-4號(hào)管內(nèi)裝有相應(yīng)的融合檢測試劑和內(nèi)控試劑。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)一次性檢測肺癌的24種融合和54種突變，大大縮短了檢測的時(shí)間，靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡便快捷，可為臨床醫(yī)生對肺癌患者選擇腫瘤靶向藥物治療提供參考。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104818320
【申請?zhí)枴緾N201410727044
【發(fā)明人】江風(fēng)閣, 林清華, 黃蛤目, 施偉杰, 宋慶濤, 阮力
【申請人】廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2014年12月3日