一種遺傳性視錐細(xì)胞營養(yǎng)不良疾病的致病突變及其檢測試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種遺傳性視錐細(xì)胞營養(yǎng)不良疾病的致病突變及 其檢測試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 視錐細(xì)胞營養(yǎng)不良（cone dystrophy ;⑶）是一組由遺傳缺陷引起的進(jìn)行性視網(wǎng) 膜退行性疾病，這類疾病以視錐細(xì)胞的不可逆性凋亡為主要病理特征，疾病晚期部分患者 可合并有視桿細(xì)胞的損害。CD患者的臨床表現(xiàn)為幼年發(fā)生的中心視力的進(jìn)行性下降，嚴(yán)重 者可致盲。CD是臨床上常見且危害較為嚴(yán)重的一類遺傳性致盲疾病，是嚴(yán)重危害世界范圍 內(nèi)工作年齡人群的一大類致盲眼病，CD在我國乃至世界范圍內(nèi)均有較高的發(fā)病率。我國是 CD遺傳資源大國，但目前CD相關(guān)的遺傳學(xué)信息多來自西方國家，因此對我國CD患者進(jìn)行深 入的遺傳學(xué)研宄，探尋潛在的CD相關(guān)的新致病基因及致病突變顯得尤為重要。
[0003] CD多為單基因遺傳病，具有顯著的臨床及遺傳異質(zhì)性。CD的遺傳異質(zhì)性表現(xiàn)在眾 多基因缺陷均可致病，其常見的遺傳模式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及X連 鎖隱性遺傳。迄今，全世界已鑒定出28個⑶相關(guān)致病基因和32個連鎖位點(diǎn)（www. RetNet. org)，且隨著研宄深入，該數(shù)目正逐年遞增。與此同時，攜帶有相同致病基因突變甚至是相 同致病突變的患者，其臨床表現(xiàn)亦可能存在較大差異，即顯著的臨床異質(zhì)性。目前仍有40% 到50% (西方國家統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我國比率更高）CD患者的致病基因尚未找到，提示存在大量 CD的新致病基因有待挖掘。
[0004] 針對⑶的分子遺傳學(xué)研宄必須建立在一定的分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)上。研宄⑶ 致病基因的一個重要目的是進(jìn)行CD的分子診斷，鑒于其顯著的遺傳異質(zhì)性，如何檢測眾多 致病基因突變是目前的難題之一?；谶B鎖分析的定位克隆策略是鑒定單基因遺傳病致病 基因的經(jīng)典方法，但是同時也面臨一些困難：①通常需要多代家系，難以分析小家系和散發(fā) 病例。②有時多代家系也不能定位致病位點(diǎn)。③難以在連鎖區(qū)域內(nèi)篩選出正確的致病基因。 因此，鑒于CD疾病本身的性質(zhì)及傳統(tǒng)分析技術(shù)的局限性，尋求一種全新的CD致病基因的研 宄方法顯得尤為迫切。
[0005] Leber congenital amaurosis 5 (LCA5 ;MIM 611408)基因位于 6 號染色體長臂 6ql4. 1位置，該基因含有9個外顯子，其編碼的LCA5蛋白是一種高度保守、廣泛表達(dá)的纖 毛蛋白。現(xiàn)有研宄表明，LCA5基因突變可以引起雷伯氏先天性黑朦（Leber congenital amaurosis ;LCA)、視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa ;RP)及早發(fā)視網(wǎng)膜萎縮 (early-onset retinal dystrophy ;E0RD)，然而LCA5基因突變與⑶間的關(guān)系卻從未被報 道或得到證實(shí)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對上述缺陷，提供一種遺傳性視錐細(xì)胞營養(yǎng)不良疾病的致病突 變。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供該致病突變的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的又一目的是提供該致病突變的檢測試劑。
[0009] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] 一種用于檢測遺傳性視錐細(xì)胞營養(yǎng)不良疾病的突變的LCA5基因，突變的LCA5基 因?yàn)殡p等位基因雜合突變LCA5 p. [Ala212Pro] ;[Tyr441Cys]。
[0011] 野生型LCA5基因在Ensemble數(shù)據(jù)庫中的基因編號為：ENSG00000135338,所述的 突變的LCA5基因在物理位置為8022301的堿基由G突變?yōu)镃，在物理位置為80197493的堿 基由A突變?yōu)镚，其他部分與野生型相同。
[0012] 一種突變的LCA5蛋白，野生型LCA5蛋白在Ensemble數(shù)據(jù)庫中的基因轉(zhuǎn)錄本編號 為：ENST00000392959,突變的LCA5蛋白在該野生型蛋白的第212位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)?脯氨酸，第441位氨基酸由酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔渌糠峙c野生型相同。
[0013] 本發(fā)明所述的突變的LCA5基因或者所述的突變的LCA5蛋白在制備遺傳性視錐細(xì) 胞營養(yǎng)不良疾病檢測試劑或檢測設(shè)備中的應(yīng)用。
[0014] 其中所述的檢測試劑優(yōu)選自：引物或引物對、探針、抗體、或核酸芯片中的一種或 多種。
[0015] 所述的檢測設(shè)備優(yōu)選包括含有檢測突變的LCA5基因的基因芯片的檢測平臺。
[0016] -種檢測遺傳性視錐細(xì)胞營養(yǎng)不良疾病的試劑盒，所述的試劑盒包括：
[0017] (a)檢測LCA5基因物理位置為80223015和80197493核苷酸位點(diǎn)的試劑；或檢測 LCA5蛋白第212位或第441位氨基酸位點(diǎn)的試劑；
[0018] (b)說明書。
[0019] 其中，所述的試劑優(yōu)選選自引物或引物對、探針、抗體、或核酸芯片中的一種或多 種。
[0020] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的試劑為基于深度測序?yàn)槠脚_的基因芯片雜交探 針。
[0021] 檢測80223015核苷酸位點(diǎn)的雜交探針序列優(yōu)選為chr6|80222784-80223585， 序列如SEQ ID NO. 7所示；檢測80197493核苷酸位點(diǎn)的雜交探針序列優(yōu)選為 chr6 |80196291-80198213,序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
[0022] 作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選，所述的試劑為檢測80223015核苷酸位點(diǎn)和80197493 核苷酸位點(diǎn)的引物對。
[0023] 檢測80223015核苷酸位點(diǎn)的正向引物序列為SEQ ID NO. 11，反向引物序列為SEQ ID NO. 12;檢測80197493核苷酸位點(diǎn)的正向引物序列為SEQ ID NO. 13,反向引物序列為SEQ ID NO. 14。
[0024] 一種以深度測序?yàn)槠脚_篩查⑶患者中LCA5基因突變的方法，包括以下步驟：
[0025] (1)建立CD患者家系臨床與遺傳資源庫，收集CD家系的臨床資料及血液標(biāo)本，提 取基因組DNA ;
[0026] (2)設(shè)計(jì)SEQIDNO. 1~SEQIDNO. 10所示的用于檢測LCA5基因突變的雜交探 針，并將其整合到基因芯片上；
[0027] (3)利用制備的基因芯片捕獲目標(biāo)區(qū)域并進(jìn)行深度測序；
[0028] (4)對測序結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化的生物信息學(xué)分析，篩選到一個新的CD新的致病突變?yōu)?雙等位基因雜合突變 LCA5p. [Ala212Pro] ;[Tyr441Cys]。突變 LCA5p.Ala212Pro 位于 6 號 染色體，物理位置為80223015 (Ensemble數(shù)據(jù)庫）的堿基由G突變?yōu)镃 ;RNA水平：LCA5基 因編碼RNA第634位堿基由G突變?yōu)镃 ;蛋白水平：LCA5基因編碼蛋白第212位氨基酸由丙 氨酸突變?yōu)楦彼?；突變LCA5 Tyr441Cys位于6號染色體，物理位置為80197493 (Ensemble 數(shù)據(jù)庫）的堿基由A突變?yōu)镚 ;RNA水平：LCA5基因編碼RNA第1322位堿基由A突變?yōu)镚 ; 蛋白水平：LCA5基因編碼蛋白第441位氨基酸由酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼?br>[0029] 步驟（2)所述的基因芯片優(yōu)選Roche Nimblegen公司生產(chǎn)的基因芯片。
[0030] 步驟（3)所述的利用制備的基因芯片捕獲目標(biāo)區(qū)域并進(jìn)行深度測序優(yōu)選利用美 國Illumina公司的Hi_seq2000儀器完成。
[0031] 步驟（3)所述的利用制備的基因芯片捕獲目標(biāo)區(qū)域并進(jìn)行深度測序優(yōu)選流程為： 將基因組DNA片段化，在DNA末端標(biāo)記"A"并與Illumina PE接頭-寡核苷酸混合物相連 接；連接產(chǎn)物經(jīng)PCR富集，獲得DNA文庫，并將DNA文庫與已知致病基因捕獲芯片雜交、洗 脫、純化，獲得編碼序列；創(chuàng)建配對末端，在Illumina HiSeqTM 2000平臺上對目標(biāo)序列進(jìn) 行測序。
[0032] 有益效果
[0033] 1.CD是常見的、嚴(yán)重的遺傳性致盲疾病，在我國發(fā)病率較高，嚴(yán)重危害了國民健 康。挖掘CD的新致病突變和新致病基因有利于進(jìn)一步探索CD的分子遺傳學(xué)病因，是充分 利用我國的眼科遺傳病資源，造福CD患者的現(xiàn)實(shí)需要，是后基因組時代最重要的研宄方向 之一。本專利旨在探索CD的遺傳學(xué)病因，從而幫助了解發(fā)病機(jī)制、輔助臨床診斷、產(chǎn)前診斷 和轉(zhuǎn)基因治療。
[0034] 2.大量研宄證實(shí)，LCA5基因的功能異常能夠引起LCA、RP及E0RD，但是目前并沒 有研宄指出LCA5基因突變與CD間的關(guān)系，因此，針對LCA5基因與CD的相關(guān)研宄顯得尤為 必要。本專利的選擇LCA5基因作為CD的候選基因，是由申請人在多年從事臨床醫(yī)療、遺傳 學(xué)研宄的基礎(chǔ)上所篩選出的，通過本發(fā)明方法進(jìn)一步明確了 LCA5基因與CD的關(guān)系。
[0035] 3. -個基因可以對應(yīng)多個不同的轉(zhuǎn)錄本，且不同轉(zhuǎn)錄本所編碼的RNA及蛋白有所 不同。