專利名稱：用于治療性應用的經(jīng)遺傳改變的細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及經(jīng)遺傳修飾的細胞，尤其涉及經(jīng)遺傳修飾的細胞在治療性應用中的用途。
背景技術：
急性心肌梗塞(MI)在西方社會仍是致病和死亡的主要原因。最近的治療進展普遍關注于在梗塞相關動脈內(nèi)恢復順行灌注，但其效果顯示存在“上限”。Topol，E.J.Lancet 357，1905-1914(2001)。很大一部分急性心肌梗塞(MI)患者最終發(fā)展為充血性心力衰竭(CHF)，主要原因為左心室(LV)重塑，其過程包括心肌的變細、擴張、功能下降并最終導致死亡。Robbins，M.A.& O’Connell，J.B.，pp.3-13(Lippincott-Raven，Philadelphia，1998)。Pfeffer，J.M.，Pfeffer，M.A.，F(xiàn)letcher，P.J.&Braunwald，E.Am.J.Physiol 260，H1406-H1414(1991)。Pfeffer，M.A.&Braunwald，E.Circulation 81，1161-1172(1990)。
一種治療心肌梗塞之后的這一過程的方法涉及細胞療法。Penn，M.S.et al.Prog.Cardiovasc.Dis.45，21-32(2002)。細胞療法重在使用不同的細胞類型，包括已分化的細胞，如骨骼成肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞以及成纖維細胞，或骨髓源性細胞。Koh，G.Y.，Klug，M.G.，Soonpaa，M.H.& Field，L.J.J.Clin.Invest 92，1548-1554(1993)。Taylor，D.A.et al.Nat.Med.4，929-933(1998)。Jain，M.et al.Circulation 103，1920-1927(2001)。Li，R.K.et al.Ann.Thorac.Surg.62，654-660(1996)。Etzion，S.et al.J.Mol.Cell Cardiol.33，1321-1330(2001)。Li，R.K.，Jia，Z.Q.，Weisel，R.D.，Merante，F(xiàn).& Mickle，D.A.J.Mol.Cell Cardiol.31，513-522(1999)。Yoo，K.J.et al.Yonsei Med.J.43，296-303(2002)。Sakai，T.et al.Ann.Thorac.Surg.68，2074-2080(1999)。Sakai，T.et al.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.118，715-724(1999)。Orlic，D.et al.Nature410，701-705(2001)。Tomita，S.et al.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.123，1132-1140(2002)。
日益增多的文獻證明，干細胞被動員至心臟和分化為心肌細胞為自然發(fā)生的過程。Jackson，K.A.et al.J.Clin.Invest 107，1395-1402(2001)。Quaini，F(xiàn).et al.N.Engl.J Med.346，5-15(2002)。而這一過程發(fā)生的速率不足以令心肌梗塞后的左心室功能有實質(zhì)性恢復。最近，研究已證明通過向血流中直接注入干細胞，或通過在心肌梗塞之前從骨髓中化學動員干細胞，有可能使受損心肌再生。這些研究證明干細胞能夠在圍梗塞期(peri-infarct period)歸集(home)至梗塞區(qū)域，以及隨后這些細胞能夠分化為心肌細胞。Kocher，A.A.et al.Nat.Med.7，430-436(2001)。Orlic，D.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98，10344-10349(2001)。Peled，A.et al.Blood 95，3289-3296(2000)。Yong，K.et al.Br.J.Haematol.107，441-449(1999)。至今，所有研究專注于干細胞在心肌梗塞后48小時內(nèi)使心肌再生的能力。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細胞(MSCs)、多潛能成體祖細胞(MAPCs)和/或其它能夠分化為組織或器官系統(tǒng)(例如包括心肌細胞和血管在內(nèi)的心臟結(jié)構)中特化或部分特化的細胞類型的干細胞。依據(jù)本發(fā)明，MSCs，MAPCs和/或其它干細胞經(jīng)遺傳改變或修飾，以便過量表達趨化因子和/或趨化因子受體，其能夠大大改善經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它(例如用于心肌再生的目的)干細胞的存活能力以及壽命，以及潛在地改善其中被引入經(jīng)遺傳修飾的干細胞的組織的存活能力。因治療性應用和/或細胞療法(例如在充血性心力衰竭和/或急性心肌梗塞中，使心肌組織再生、恢復心肌功能或保護心功能)而將經(jīng)遺傳修飾的干細胞引入哺乳動物個體時，過量表達的趨化因子和/或趨化因子受體能夠減緩經(jīng)遺傳修飾的干細胞的凋亡。過量表達的趨化因子和/或趨化因子受體也可潛在地減緩以經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它(例如用于心肌再生的)干細胞治療的哺乳動物個體的組織中的凋亡。
在本發(fā)明的一方面，干細胞可經(jīng)遺傳修飾而過量表達CXC趨化因子受體4(CXCR4)。過量表達CXCR4的干細胞可被直接注射進心肌組織或經(jīng)靜脈或動脈輸注，以治療近期心肌梗塞或充血性心力衰竭。由MSCs、MAPCs和/或其它干細胞過量表達CXCR4可潛在地提高心肌組織內(nèi)MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的存活能力，以及促進MSCs、MAPCs和/或其它干細胞如造血干細胞歸集至SDF-1和/或表達SDF-1的細胞。
依據(jù)本發(fā)明的另一方面，MSCs、MAPCs和/或其它(例如用于心肌再生的)干細胞可經(jīng)遺傳修飾而過量表達SDF-1。過量表達SDF-1的干細胞可被直接注射進心肌組織或經(jīng)靜脈或動脈輸注，以治療近期心肌梗塞或充血性心力衰竭。由干細胞表達的SDF-1可潛在地誘導外周血中的干細胞歸集至梗塞的心肌。此外，SDF-1的過量表達還能大大提高MSCs、MAPCs和/或其它(例如用于心肌再生的)干細胞以及類似于MSCs和/或MAPCs的其它細胞的存活能力。
在本發(fā)明的另一方面，MSCs、MAPCs和/或其它干細胞可經(jīng)遺傳修飾同時過量表達CXCR4和SDF-1。同時過量表達CXCR4和SDF-1的干細胞可被直接注射進心肌組織或經(jīng)靜脈或動脈輸注，以治療近期心肌梗塞或充血性心力衰竭。由干細胞表達的CXCR4和SDF-1可潛在地誘導外周血中的干細胞歸集至梗塞的心肌。此外，CXCR4和SDF-1的過量表達還能夠大大提高MSCs、MAPCs和/或其它用于心肌再生的干細胞以及類似于干細胞的其它細胞的存活能力。
附圖簡要說明在參考附圖閱讀以下說明后，本發(fā)明所屬領域的技術人員可清楚了解本發(fā)明的前述以及其它方面。


圖1為解釋使用本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾以過量表達CXCR4和SDF-1的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的臨床策略的示意框圖。
圖2為顯示大鼠注入MSCs和經(jīng)遺傳修飾的MSCs 3天后，梗塞區(qū)域單位面積內(nèi)MSCs和經(jīng)遺傳修飾以表達CXCR4的MSCs的數(shù)量的圖。
圖3為western印跡分析，顯示經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以表達CXCR4或SDF-1的大鼠MSCs的AKT比未轉(zhuǎn)染的MSCs的AKT易于磷酸化。
圖4A為照片，顯示注入對照MSCs和表達SDF-1或CXCR4的MSCs 3天后相應大鼠的梗塞區(qū)域的代表性切片。
圖4B為比較注入3天后梗塞區(qū)域單位面積內(nèi)對照MSCs的數(shù)量和經(jīng)遺傳修飾以表達CXCR4或SDF-1的MSCs的數(shù)量的圖。
圖5為心肌梗塞4天后以對照MSCs和表達SDF-1的MSCs治療的大鼠的相應梗塞區(qū)域的照片。
圖6顯示心肌梗塞14天后，注入無機鹽、心臟成纖維細胞、對照MSCs、表達SDF-1的MSCs以及表達CXCR4的MSCs的大鼠的LV功能的改善狀況。
詳細說明除非另有說明，此處用到的所有技術術語的含義與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員所通常理解的含義相同。分子生物學術語的通用定義可以例如參見Rieger et al.，Glossary of GeneticsClassical andMolecular(經(jīng)典與分子遺傳學詞典)，5th edition，Springer-VerlagNewYork，1991；以及Lewin，Genes V(基因V)，Oxford University PressNew York，1994。
此處描述的方法包括傳統(tǒng)分子生物學技術在內(nèi)。這些技術在本領域內(nèi)已被廣泛了解，其詳細描述可參見方法學論著，如MolecularCloningA Laboratory Manual(分子克隆實驗室手冊)，2nd ed.，vol.1-3，ed.Sarnbrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989；以及Current Protocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學規(guī)程)，ed.Ausubel et al.，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York，1992(有定期更新)。核酸化學的合成方法的論述可參見如Beaucage and Carmthers，Tetra.Letts.221859-1862，1981，以及Matteucci et al.，J.Am.Chem.Soc.1033185，1981。核酸的化學合成可由例如商品化的自動寡核苷酸合成儀來完成。免疫學方法(如抗原特異性抗體的制備、免疫沉淀和免疫印跡)的描述可參見如Current Protocols in Immunology(現(xiàn)代免疫學規(guī)程)，ed.Coligan et al.，John Wiley & Sons，New York，1991；以及Methods of ImmunologicalAnalysis(免疫學分析方法)，ed.Masseyeff et al.，John Wiley & Sons，New York，1992。常規(guī)的基因轉(zhuǎn)移和基因治療方法也適于在本發(fā)明中使用。例如參見，Gene TherapyPrinciples and Applications(基因治療原理與應用)，ed.T.Blackenstein，Springer Verlag，1999；Gene TherapyProtocols(Methods in Molecular Medicine)(基因治療規(guī)程(分子醫(yī)學方法))，ed.P.D.Robbins，Humana Press，1997；以及Retro-vectors forHuman Gene Therapy(用于人類基因治療的逆轉(zhuǎn)錄載體)，ed.C.P.Hodgson，Springer Verlag，1996。
本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細胞(MSCs)、多潛能成體祖細胞(MAPCs)和/或其它能夠分化為組織或器官系統(tǒng)中特化或部分特化的細胞類型的(例如用于使包括心肌細胞和血管在內(nèi)的心肌結(jié)構再生的)干細胞。MSCs、MAPCs和/或其它干細胞經(jīng)過遺傳改變或遺傳修飾，以過量表達趨化因子和/或趨化因子受體，這些趨化因子和/或趨化因子受體能大大改善這些經(jīng)遺傳修飾的干細胞的存活能力及壽命，并能潛在地改善被引入經(jīng)遺傳修飾的干細胞的組織的存活能力。因治療性應用和/或細胞治療而將經(jīng)遺傳修飾的干細胞引入哺乳動物個體時(例如在充血性心力衰竭和/或急性心急梗塞中，使心肌組織再生、恢復心肌功能或保護心功能)，過量表達的趨化因子和/或趨化因子受體能夠減緩經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它(例如用于使心肌結(jié)構再生的)干細胞的凋亡。過量表達的趨化因子和/或趨化因子受體也能潛在地減緩被遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞治療的哺乳動物個體的組織中的凋亡。
哺乳動物個體可包括任何哺乳動物，如人、大鼠、小鼠、貓、狗、山羊、綿羊、馬、猴、猿、兔、牛等。哺乳動物個體可處于發(fā)育的任意階段，包括成體、年幼動物、新生兒。哺乳動物個體還可包括處于胎兒發(fā)育期的個體。
依據(jù)本發(fā)明，MSCs為形成性多能性胚細胞或胚胎細胞，能分化為特定類型的結(jié)締組織(即體內(nèi)支持特化元件的組織，尤其包括脂肪組織、骨組織、軟骨組織、彈性組織、肌肉組織以及纖維結(jié)締組織，取決于體內(nèi)或體外各種環(huán)境的影響)。這些細胞存在于骨髓、血液、真皮以及骨膜中，并可采用多種熟知的方法分離及純化，如在授予Caplan和Haynesworth的第5,197,985號美國專利(在此并入本文作為參考)以及眾多其它參考文獻中所公開的方法其它。
依據(jù)本發(fā)明，MAPCs包括成體祖細胞或干細胞，它們能夠分化為它們通常所駐留的組織之外的細胞類型(即表現(xiàn)出可塑性)。MAPCs的實例可包括成體MSCs以及造血祖細胞。MAPCs的來源可包括骨髓、血液、眼組織、真皮、肝臟以及骨骼肌。舉例來說，包括造血祖細胞在內(nèi)的MAPCs可采用在第5,061,620號美國專利(在此并入本文作為參考)以及眾多其它參考文獻中所公開的方法分離及純化其它。
依據(jù)本發(fā)明，其它干細胞類型包括成體祖細胞或干細胞，其能夠分化為組織或器官系統(tǒng)內(nèi)特化或部分特化的細胞。在本發(fā)明的一方面，其它干細胞類型可包括成體祖細胞或干細胞，這些細胞能夠分化為心肌細胞或包括血管在內(nèi)的其它心肌結(jié)構，且其中CXCR4和/或SDF-1的過量表達可導致(i)提高干細胞的存活能力，(ii)增強被修飾的干細胞向梗塞的心肌的歸集和/或植入，(iii)提高移入干細胞的周圍組織的存活能力或減緩其凋亡，和/或(iv)促進內(nèi)源性循環(huán)干細胞歸集至梗塞心肌。
CXCR4的過量表達在本發(fā)明的一方面，MSCs、MAPCs和/或其它干細胞可經(jīng)遺傳修飾而過量表達CXC趨化因子受體4(CXCR4)。CXCR4，又名CD 184、白細胞衍生的7次跨膜結(jié)構域受體(LESTR)、神經(jīng)肽Y受體Y3(NPY3R)、HM89以及FB22，是G蛋白偶聯(lián)受體，對單一CXC-基序趨化因子即基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF1)具有選擇性。CXCR4在成熟血細胞以及造血祖細胞中介導趨化性，并與其配體SDF1一起為B淋巴細胞形成和骨髓形成所必需。除造血作用外，CXCR4還負責心室隔膜的形成、胃腸道的血管形成以及小腦顆粒細胞的發(fā)育。
現(xiàn)已知包括人、小鼠和大鼠在內(nèi)的多種不同哺乳動物的CXCR4多肽(或蛋白質(zhì))的氨基酸序列。這些多肽通常包含352個氨基酸。依據(jù)本發(fā)明，過量表達的CXCR4多肽可具有與上述哺乳動物的CXCR4多肽中的一種大致相同的氨基酸序列。舉例來說，過量表達的CXCR4可具有與SEQ ID No1大致相同的序列。SEQ ID No1包含人CXCR4的氨基酸序列，并被鑒定為GenBank登錄號P61073。過量表達的CXCR4也可具有與SEQ ID No2大致相同的序列。SEQ ID No2包含小鼠CXCR4的氨基酸序列，并被鑒定為GenBank登錄號O08565。
依據(jù)本發(fā)明，過量表達的CXCR4也可為哺乳動物CXCR4的變體(variant)，如哺乳動物CXCR4的片段、類似物和衍生物。這些CXCR4變體例如包括由天然CXCR4基因(即天然存在的核酸，編碼天然存在的哺乳動物CXCR4多肽)自然產(chǎn)生的等位基因變體編碼的多肽、由天然CXCR4基因的可變剪接(alternative splice)形式編碼的多肽、由天然CXCR4基因的同源基因(homolog)或直系同源基因(ortholog)編碼的多肽，以及由天然CXCR基因的非自然產(chǎn)生的變體編碼的多肽。
CXCR4變體的多肽序列與天然CXCR4多肽之間有一個或多個氨基酸的不同。這些變體的多肽序列可以CXCR4變體的一個或多個氨基酸的缺失、增加或置換為特征。氨基酸的插入優(yōu)選為1-4個鄰接的氨基酸，而缺失優(yōu)選為1-10個鄰接的氨基酸。CXCR4多肽變體基本保留有天然CXCR4的功能活性。本發(fā)明中優(yōu)選的CXCR4多肽變體可通過表達核酸分子而產(chǎn)生，其以沉默變異或保守性變異為特征。
對應于一種或多種特定基序和/或結(jié)構域或?qū)谌我忾L度的CXCR4多肽片段都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。分離的CXCR4肽段可通過篩選由編碼此多肽的核酸上的對應片段經(jīng)重組產(chǎn)生的多肽而得到。舉例來說，本發(fā)明中的CXCR4多肽可被任意分割為所需長度的片段且片段間無重疊，或優(yōu)選地分割為所需長度的有重疊的片段。這些片段可以重組方式制備，并經(jīng)檢測以鑒定那些具有天然CXCR4多肽激動劑功能的肽段。
CXCR4多肽的變體也可包括CXCR4多肽的重組體形式。除CXCR4多肽之外，本發(fā)明優(yōu)選的重組多肽由與編碼哺乳動物CXCR4多肽的基因核酸序列有至少約70％的序列一致性的核酸來編碼。
CXCR4多肽變體可包括蛋白的激動形式，其組成型地表現(xiàn)天然CXCR4多肽的功能活性。其它CXCR4多肽變體可包括抗蛋白水解的變體，例如，其由于突變而改變了蛋白酶的靶序列。通過檢測變體的天然CXCR4多肽功能活性，可方便地確定多肽氨基酸序列的改變是否產(chǎn)生了具有天然CXCR4多肽的一種或多種功能活性的變體。
依據(jù)本發(fā)明，MSCs、MAPCs和/或其它干細胞可被編碼CXCR4或CXCR4變體的核酸其它遺傳修飾。核酸可以為天然或非天然核酸，為RNA形式或DNA(如cDNA、基因組DNA和合成的DNA)形式。該DNA可為雙鏈或單鏈，若為單鏈則可為編碼鏈(有義鏈)或非編碼鏈(反義鏈)。編碼CXCR4多肽的核酸編碼序列可與CXCR4基因的核苷酸序列大致相同，如SEQ ID No3和SEQ ID No4中現(xiàn)示的核苷酸序列。SEQ ID No3和SEQ ID No4分別包含人CXCR4與大鼠CXCR4的核酸序列，并且與GenBank登錄號BC020968和GenBank登錄號BC031655的核酸序列大致相同。CXCR4的核酸編碼序列也可為不同的編碼序列，其由于遺傳密碼的冗余性或簡并性，可編碼與SEQ IDNo3和SEQ ID No4相同的多肽。
本發(fā)明中其它編碼CXCR4的核酸分子為天然CXCR4基因的變體，如編碼天然CXCR4多肽的片段、類似物和衍生物的核酸分子。這些變體例如可能是天然CXCR4基因的自然產(chǎn)生的等位基因變體、天然CXCR4基因的同源基因或直系同源基因、以及天然CXCR4基因的非自然產(chǎn)生的變體。這些變體具有與天然CXCR4基因相差一個或多個堿基的核苷酸序列。例如，這些變體的核苷酸序列可以天然CXCR4基因的一個或多個核苷酸的缺失、增加或置換為特征。核酸插入優(yōu)選為1-10個鄰接的核苷酸，缺失優(yōu)選為1-10個鄰接的核苷酸。
在其它應用中，在結(jié)構上顯示實質(zhì)改變的CXCR4多肽變體可通過不至于導致被編碼多肽發(fā)生保守改變的核苷酸置換來產(chǎn)生。這類核苷酸置換的實例會導致(a)多肽主鏈結(jié)構的改變；(b)多肽電荷或疏水性的改變；或(c)氨基酸側(cè)鏈大小的改變。一般預期使蛋白質(zhì)性能產(chǎn)生最大改變的核苷酸置換會在密碼子中產(chǎn)生非保守性改變?？赡軐е露嚯慕Y(jié)構重大改變的密碼子改變的實例為(a)導致親水基(如絲氨酸或蘇氨酸)置換疏水性殘基(如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸)，或相反；(b)導致半胱氨酸或脯氨酸置換其它殘基，或相反；(c)導致具有帶正電荷側(cè)鏈的殘基(如賴氨酸、精氨酸或組氨酸)置換帶負電荷的殘基(如谷氨酰胺，天冬酰胺(aspartine))，或相反；(d)導致具有大側(cè)鏈的殘基(如苯丙氨酸)取代無側(cè)鏈的殘基(如甘氨酸)，或相反。
本發(fā)明中天然CXCR4基因自然產(chǎn)生的等位基因變體是分離自哺乳動物組織的核酸，其與天然CXCR4基因有至少約70％的序列一致性，并編碼與天然CXCR4多肽具有結(jié)構相似性的多肽。本發(fā)明中天然CXCR4基因的同源基因是分離自其它物種的核酸，其與天然基因有至少約70％的序列一致性，并編碼與天然CXCR4多肽具有結(jié)構相似性的多肽?？伤阉鞴埠?或私有的核酸數(shù)據(jù)庫，以鑒別其它與天然CXCR4基因有較高(如70％或以上)序列一致性的核酸分子。
非天然產(chǎn)生的CXCR4基因變體是不存在于自然界中的核酸(如人工制備的)，與天然CXCR4基因有至少約70％的序列一致性，并編碼與天然CXCR4多肽具有結(jié)構相似性的多肽。非天然產(chǎn)生的CXCR4基因變體的實例為編碼天然CXCR4蛋白質(zhì)的片段的變體、在嚴緊條件下與天然CXCR4基因或天然CXCR4基因的互補鏈雜交的變體，以及與天然CXCR4基因或天然CXCR4基因的互補鏈有至少65％的序列一致性的變體。
本發(fā)明中編碼天然CXCR4基因片段的核酸為編碼天然CXCR4多肽的氨基酸殘基的核酸。編碼編碼天然CXCR4多肽片段的核酸或與編碼天然CXCR4多肽片段的核酸雜交的較短的寡核苷酸可被用作探針、引物、或反義分子。編碼編碼天然CXCR4多肽片段或與編碼天然CXCR4多肽片段的核酸雜交的較長的多核苷酸也可被用于本發(fā)明的多個方面。編碼天然CXCR4片段的核酸可通過對全長天然CXCR4基因或其變體的酶消化(例如，用限制性內(nèi)切酶)或化學降解而制得。
在嚴緊條件下可與前述核酸之一雜交的核酸也可在本發(fā)明中使用。例如，在低嚴緊條件、中嚴緊條件或高嚴緊條件下與前述核酸之一雜交的這些核酸處于本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明也可使用編碼CXCR4融合蛋白的核酸分子。此核酸可通過制備在被引入合適的靶細胞時表達CXCR4融合蛋白的構建體(如表達載體)而制得。例如，此構建體可通過將編碼CXCR4蛋白的第一多核苷酸與編碼其它蛋白的第二多核苷酸同框(in frame)融合連接而制得，從而當處于適宜的表達系統(tǒng)中時此構建體的表達能產(chǎn)生融合蛋白。
用于過量表達CXCR4的核酸可在諸如堿基部分、糖基部分或磷酸主鏈上被修飾，以增強分子的穩(wěn)定性、促進雜交等。本發(fā)明中的核酸還可能另含其它附屬基團，例如肽(例如為了在體內(nèi)靶向靶細胞受體)，或利于跨細胞膜轉(zhuǎn)運以及雜交觸發(fā)的裂解的試劑。為此，核酸可偶聯(lián)至其它分子(例如肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運試劑、雜交觸發(fā)的裂解試劑等。
CXCR4可由MSCs、MAPCs和/或其它干細胞過量表達，例如這可通過在MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的培養(yǎng)期內(nèi)向干細胞中引入提高CXCR4表達的試劑來實現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明以及以上所述，此試劑可包括天然或合成的核酸(如外源遺傳物質(zhì))，其被并入重組核酸構建體(典型的為DNA構建體)，此構建體可被引入細胞并在細胞內(nèi)復制。此構建體優(yōu)選包括復制系統(tǒng)以及能夠在給定的靶細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯多肽編碼序列的序列。
其它試劑也可被引入MSCs、MAPCs和/或其它干細胞以促進干細胞對CXCR4的表達。例如，促進CXCR4編碼基因轉(zhuǎn)錄的試劑、促進編碼CXCR4的mRNA的翻譯的試劑，和/或減少編碼CXCR4的mRNA降解的試劑可被用于提高CXCR4的水平。提高細胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄速率可通過在CXCR4編碼基因的上游引入外源啟動子來實現(xiàn)。促進異源基因表達的增強子元件也可被用到。
將試劑引入MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的優(yōu)選方法包括使用基因療法?；虔煼ㄖ富蜣D(zhuǎn)移以在體內(nèi)或體外從細胞表達治療性產(chǎn)物。依據(jù)本發(fā)明，基因療法可被用于在體內(nèi)、離體和/或體外從MSCs、MAPCs和/或其它干細胞表達CXCR4。
基因療法的一種方法使用包含編碼CXCR4的核苷酸的載體?！拜d體”(常稱為基因遞送或基因轉(zhuǎn)移的“交通工具”)指待遞送至靶細胞的包含多核苷酸的高分子或分子復合體，無論是在體外還是體內(nèi)。待引入的多核苷酸可包含在基因療法中有益的編碼序列。載體例如包括病毒載體(如腺病毒(‘Ad’)、腺相關病毒(AAV)、慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)、脂質(zhì)體及其它含脂復合體，以及其它能夠介導多核苷酸向靶細胞(即MSCs、MAPCs和/或其它干細胞)遞送的高分子復合體。
載體也可包含其它進一步調(diào)節(jié)基因遞送和/或基因表達，或者使靶細胞獲得有益性能的組分或功能性。這些其它組分包括例如影響結(jié)合或靶向細胞的的組分(包括介導對細胞類型或組織特異性結(jié)合的組分)；影響細胞對載體核酸吸收的組分；影響多核苷酸被吸收后在細胞內(nèi)定位的組分(如介導核定位的試劑)；以及影響多核苷酸表達的組分。這些組分也可包括標記物，例如可檢測和/或可選擇的標記物，其可被用于檢測或選擇已經(jīng)吸收并開始表達被載體遞送的核酸的細胞。這些組分可作為載體的天然特征而被提供(如使用特定的病毒載體，其具有介導結(jié)合和吸收的組分或功能性)，或者載體可經(jīng)修飾而提供這些功能性。
選擇性標記物可為陽性、陰性或雙功能的。陽性可選擇標記物使帶有標記物的細胞被選擇，而陰性可選擇標記物使帶有標記物的細胞被選擇性排除。多種這樣的標記物基因已被描述，包括雙功能性的(即陽性/陰性)標記物(參見，諸如Lupton，S.，WO 92/08796，1992年5月29日公布；以及Lupton，S.，WO 94/28143，1994年12月8日公布)。這些標記物基因可在基因治療前后提供有利的額外控制措施。在本領域已知有多種這樣的載體被廣泛使用。
可用在本發(fā)明中的載體包括病毒載體、基于脂質(zhì)的載體以及其它能夠?qū)⒈景l(fā)明的核苷酸遞送至MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的載體。載體可為靶向載體(targeted vector)，尤其是優(yōu)先與MSCs、MAPCs和/或其它干細胞結(jié)合的靶向載體。本發(fā)明優(yōu)選使用的病毒載體為對靶細胞呈現(xiàn)低毒性且能誘導產(chǎn)生治療有益量的CXCR4的病毒載體。
可用于遺傳修飾MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的病毒載體的一個實例為逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒在遺傳修飾MSCs中的使用已在第5,591,625號美國專利中公開。逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構和生命周期使其成為適于基因轉(zhuǎn)移的理想媒介，因為(i)大部分編碼其結(jié)構基因的序列被刪除并被目的基因取代，后者在逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(LTR)區(qū)內(nèi)的調(diào)控序列的控制下被轉(zhuǎn)錄；(ii)它們通過整合入宿主基因組的DNA中間體復制。盡管在宿主基因組中的整合位點呈現(xiàn)隨機性，但前病毒(provirus)以低拷貝數(shù)整合于限定的結(jié)構。
逆轉(zhuǎn)錄病毒可為RNA病毒，即病毒基因組為RNA。但是，這種基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA中間體，其高效地整合入被感染細胞的染色體DNA中。這種整合的DNA中間體被稱為前病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組和前病毒DNA有三個基因gag、pol和env，兩側(cè)為兩個長末端重復(LTR)序列。gag基因編碼內(nèi)部結(jié)構(核衣殼)蛋白，pol基因編碼RNA指導的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)；而env基因編碼病毒的包膜糖蛋白。5’端和3’端的LTR負責啟動病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和多聚腺苷酸化。
5’端LTR附近為基因組逆轉(zhuǎn)錄(tRNA引物的結(jié)合位點)以及病毒RNA被高效包裹形成病毒粒子(Psi位點)所必需的序列。Mulligan，R.C.，InExperimental Manipulation of Gene Expression(基因表達實驗操作)，M.Inouye(ed).Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S.A.816349-6353(1984)。
為產(chǎn)生包含重組基因組的病毒粒子，有必要培養(yǎng)提供包裝“協(xié)助”的細胞系。為此，編碼諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構基因gag、pol和env的質(zhì)粒經(jīng)常規(guī)磷酸鈣介導的DNA轉(zhuǎn)染法(Wigler，et al.，Cell 11223(1977))被引入其它未經(jīng)轉(zhuǎn)化的組織細胞系。含有這種質(zhì)粒的細胞被稱為“包裝細胞系(packaging cell line)”。含有這些質(zhì)粒的包裝細胞系可被如此維持，或者復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可被引入這些細胞的基因組。在后一種情況中，載體構建體產(chǎn)生的基因組RNA與包裝細胞系內(nèi)組成型表達的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構基因結(jié)合，導致逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子釋放至培養(yǎng)基中。包含逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構基因序列的穩(wěn)定細胞系是逆轉(zhuǎn)錄病毒的“生產(chǎn)者細胞系(producer cell line)”。
由于基因可經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入MSCs、MAPCs和/或其它干細胞，它們可“處于”(受制于)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的控制；在此情況中，目的基因從逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子開始轉(zhuǎn)錄。啟動子是一段特殊的核苷酸序列，能被啟動RNA合成的RNA聚合酶分子識別。或者，可使用具有負責轉(zhuǎn)錄目的遺傳物質(zhì)的額外啟動子元件(除了并入重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子之外)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。例如，可使用受外部的因子或信號調(diào)控的額外啟動子的構建體，使得能通過刺激外部信號因子從而控制MSCs、MAPCs和/或其它干細胞產(chǎn)生多肽的水平。例如，編碼熱休克蛋白的基因的啟動子受溫度調(diào)控。金屬硫蛋白(metallothionine)為含金屬的蛋白質(zhì)，其編碼基因的啟動子對鎘離子(Cd++)有響應。將受外部信號影響的這種或其它啟動子并入，也使得對工程化的祖細胞產(chǎn)生多肽加以調(diào)控成為可能。
除逆轉(zhuǎn)錄病毒之外，其它可用于遺傳改變或遺傳修飾MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的載體實例可來自腺病毒(Ad)或腺相關病毒(AAV)。人及非人病毒載體都可使用，但優(yōu)選在人體內(nèi)復制缺陷型的重組病毒載體。當載體為腺病毒時，優(yōu)選包含具有可操作地連接CXCR4編碼基因的啟動子的多核苷酸，并在人體內(nèi)為復制缺陷型。
腺病毒載體能夠使基因在靶細胞中高效表達，并能容納相對大量的異源(非病毒的)DNA。重組腺病毒的優(yōu)選形式為“無腸的(gutless)”、“高容量的”或者“依賴協(xié)助的”腺病毒載體。這樣的載體具有諸如以下的特征(1)缺失全部或大部分病毒編碼序列(編碼病毒蛋白的序列)，(2)病毒DNA復制所需的病毒反向末端重復(ITRs)序列，(3)高達28-32kb的“外源”或“異源”序列(如CXCR4的編碼序列)，以及(4)將病毒基因組包入傳染性衣殼所需的病毒DNA包裝序列。特別對于心肌細胞，優(yōu)選的此重組腺病毒載體的變體包含組織特異性的(如MSCs、MAPCs和/或其它干細胞)，可操作地與CXCR4基因連接的增強子和啟動子。
基于腺相關病毒的載體是有利的，由于其對靶細胞有極高的轉(zhuǎn)導效率，并能以位點特異性的方式整合入靶基因組。重組AAV載體的使用在Tal，J.，J.Biomed.Sci.7279-291，2000和Monahan and Samulski，Gene Therapy 724-30，2000中有詳細討論。優(yōu)選的AAV載體包含一對AAV反向末端重復，其位于至少一個表達盒(cassette)的兩側(cè)，該表達盒包含可操作地連接到CXCR4核酸的組織或細胞特異性啟動子。包含ITRs、啟動子和CXCR4基因的AAV載體的DNA序列可整合入靶基因組。
依據(jù)本發(fā)明可用的其它病毒載體包括基于單純皰疹病毒(HSV)的載體。缺失一個或多個中早期基因(IE)的HSV載體是有利的，由于其通常無細胞毒性，在靶細胞中保持近似潛伏的狀態(tài)，以及提供高效的靶細胞轉(zhuǎn)導。重組HSV載體可容納近30kb的異源核酸。優(yōu)選的HSV載體應滿足(1)從I型HSV工程化，(2)其IE基因缺失，以及(3)包含可操作地連接到SDF-1核酸的組織特異性(例如心肌的)啟動子。HSV擴增子載體也可在本發(fā)明的多種方法中用到。典型地，HSV擴增子載體長度約為15kb，并具有病毒復制起點及包裝序列。
基于α病毒的載體，例如由圣利基森林病毒(semliki forest virus，SFV)和辛德畢斯病毒(Sindbis virus，SIN)制得的載體，也可在本發(fā)明中使用。α病毒的使用在Lundstrom，K.，Intervirology 43247-257，2000和Perri et al.，Journal of Virology 749802-9807，2000中有描述。α病毒載體典型地以復制子的形式構建。復制子可包含(1)RNA復制所需的α病毒基因元件，和(2)異源的核酸，如編碼CXCR4的核酸。在α病毒復制子內(nèi)，異源核酸可與組織特異性的啟動子或增強子可操作地連接。
重組的復制缺陷型α病毒載體是有利的，由于其能夠高水平地表達異源(治療性的)基因，以及其能轉(zhuǎn)染廣譜的靶細胞。α病毒復制子可通過在其病毒粒子表面展示功能性異源配體或結(jié)合結(jié)構域，使得能與表達相關結(jié)合伙伴(cognate binding partner)的靶細胞選擇性結(jié)合，從而被定向于特定靶細胞類型(如MSCs、MAPCs和/或其它干細胞)。α病毒復制子可處于潛伏狀態(tài)，并因此使得靶細胞內(nèi)異源核酸能長期表達。復制子也可在靶細胞內(nèi)表現(xiàn)瞬時異源核酸表達。優(yōu)選的α病毒載體或α病毒復制子為非細胞致病性的。
在許多適用于本發(fā)明方法的病毒載體中，多于一個啟動子可被包含于載體中以允許多于一個異源基因被載體表達。此外，載體也可包含編碼信號肽或其它部分的序列，其有利于靶細胞對CXCR4基因產(chǎn)物的表達。
為將這兩種病毒載體系統(tǒng)的優(yōu)勢屬性結(jié)合起來，可使用雜交病毒載體將CXCR4核酸遞送至MSCs、MAPCs和/或其它干細胞。構建雜交載體的標準技術為本領域技術人員所熟知。此技術可在諸如Sambrook，et al.，In Molecular CloningA laboratory manual(分子克隆實驗室手冊).Cold Spring Harbor，N.Y.或任一論述重組DNA技術的實驗室手冊中找到。腺病毒衣殼內(nèi)包含AAV和腺病毒ITRs結(jié)合體的雙鏈AAV基因組可被用于對細胞的轉(zhuǎn)導。在另一變化形式中，AAV載體可被置于“無腸的”，“依賴協(xié)助的”或“高容量的”腺病毒載體內(nèi)。腺病毒/AAV雜交載體在Lieber et al.，J.Virol.739314-9324，1999中有論述。逆轉(zhuǎn)錄病毒/腺病毒雜交載體在Zheng et al.，Nature Biotechnol.18176-86，2000中有所論述。包含在腺病毒內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可整合入靶細胞基因組，并實現(xiàn)穩(wěn)定的CXCR4基因表達。
進一步考慮了其它有利于CXCR4基因表達及有利于載體克隆的核苷酸序列元件。舉例來說，啟動子上游的增強子或例如編碼區(qū)下游的終止子的存在可對表達有利。
除以病毒載體為基礎的方法之外，非病毒方法也可被用于將CXCR4基因引入靶細胞。關于基因遞送的非病毒方法在Nishikawa andHuang，Human Gene Ther.12861-870，2001中提供了綜述。依據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的非病毒基因遞送方法使用質(zhì)粒DNA將CXCR4核酸引入細胞。基于質(zhì)粒的基因遞送方法為本領域內(nèi)所共知。
合成的基因轉(zhuǎn)移分子可被設計為與質(zhì)粒DNA形成多分子集合體。這些集合體可被設計為與MSCs、MAPCs和/或其它干細胞結(jié)合。
陽離子兩性分子，包括脂多胺(lipopolyamine)和陽離子脂質(zhì)可被用于使CXCR4核酸向MSCs、MAPCs和/或其它干細胞內(nèi)不依賴受體的轉(zhuǎn)移。此外，預制的陽離子脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì)可與質(zhì)粒DNA混合，以生成細胞轉(zhuǎn)染復合體。有關陽離子脂質(zhì)配制的方法綜述在Felgner etal.，Ann.N.Y.Acad.Sci.772126-139，1995和Lasic and Templeton，Adv.Drug Delivery Rev.20221-266，1996中。為了基因遞送，DNA也可與兩性的陽離子肽結(jié)合(Fominaya et al.，J.Gene Med.2455-464，2000)。
依據(jù)本發(fā)明可使用同時包含病毒成分和非病毒成分的方法。舉例來說，用于治療性基因遞送的基于EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)的質(zhì)粒在Cui et al.，Gene Therapy 81508-1513，2001中有描述。另外，涉及與腺病毒結(jié)合的DNA/配體/聚陽離子附屬物的方法在Curiel，D.T.，Nat.Immun.13141-164，1994中有描述。
包含有編碼表達CXCR4的核酸的載體可通過直接注射入培養(yǎng)基而被引入離體或體外培養(yǎng)的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞中?？勺⑸涞闹苿┛稍谛枰獣r包含藥物可接受的載體，如生理鹽水。依據(jù)本發(fā)明也可使用其它藥物載體、制劑和劑量。
經(jīng)遺傳修飾以過量表達CXCR4的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞，當其因治療性應用和/或細胞療法而被引入哺乳動物個體時，相比于未經(jīng)遺傳修飾以過量表達CXCR4的MSCs其它來說，具有更強的存活能力以及更長的壽命。由遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞過量表達的CXCR4可與接受治療的組織中存在的趨化因子SDF-1結(jié)合。SDF-1與CXCR4的結(jié)合可誘導蛋白激酶AKT的磷酸化，繼而減緩MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的凋亡并大大增強其存活能力。
SDF-1的過量表達依據(jù)本發(fā)明的另一方面，MSCs、MAPCs和/或其它干細胞可經(jīng)遺傳修飾而過量表達基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)。SDF-1，又名CXC趨化因子L12，是CXC家族趨化因子中的一員，并被認為是CXCR4的天然配體。SDF-1在功能上不同于其它趨化因子，因據(jù)報告其基本功能為負責骨髓祖細胞的運輸、輸出及歸集。SDF-1在結(jié)構上也不同于其它CXC趨化因子，因其與它們僅有22％的氨基酸序列一致性。SDF-1序列在種間的高度保守性暗示了SDF-1的重要生理功能。在體外，SDF-1激發(fā)包括單核細胞和骨髓起源的祖細胞在內(nèi)的廣泛的細胞的趨化性。
已知包括人、小鼠以及大鼠在內(nèi)的許多不同哺乳動物的SDF-1的氨基酸序列。人與大鼠的SDF-1氨基酸序列具有約92％的一致性。SDF-1可包含兩種異構型，SDF-1α和SDF-1β，它們在本文中除另加鑒別外都被稱為SDF-1。
過量表達的SDF-1可具有與SEQ ID NO5大致相同的氨基酸序列。過量表達的SDF-1也可具有與前述哺乳動物的SDF-1大致相同的氨基酸序列。例如，過量表達的SDF-1可具有與SEQ ID NO6大致相同的氨基酸序列?；旧习琒EQ ID NO5的SEQ ID NO6是人SDF的氨基酸序列，并被鑒定為GenBank登錄號NP954637。過量表達的SDF-1也可具有與SEQ ID NO7大致相同的氨基酸序列。也基本上包含SEQ ID NO5的SEQ ID NO7包含大鼠SDF的氨基酸序列，被鑒定為GenBank登錄號AAF01066。
依據(jù)本發(fā)明，過量表達的SDF-1多肽也可為哺乳動物SDF-1的變體，如哺乳動物SDF-1的片段、類似物和衍生物。這些SDF-1變體例如包括由天然SDF-1基因(即天然產(chǎn)生的核酸，其編碼天然產(chǎn)生的哺乳動物SDF-1多肽)自然產(chǎn)生的等位基因變體編碼的多肽、由天然SDF-1基因的可變剪接形式編碼的多肽、由天然SDF-1基因的同源基因或直系同源基因編碼的多肽，以及由天然SDF-1基因的非自然產(chǎn)生的變體編碼的多肽。
SDF-1變體的多肽序列與天然SDF-1多肽之間有一個或多個氨基酸的差異。這些變體的多肽序列可以SDF-1變體的一個或多個氨基酸的缺失、增加或置換為特征。氨基酸的插入優(yōu)選為1-4個鄰接的氨基酸，而其缺失優(yōu)選為1-10個鄰接的氨基酸。SDF-1多肽變體基本保留有天然SDF-1的功能活性。本發(fā)明中優(yōu)選的SDF-1多肽變體可通過表達核酸分子而產(chǎn)生，其以沉默變異或保守性變異為特征。
對應于一種或多種基序和/或結(jié)構域或?qū)谌我忾L度的SDF-1多肽片段都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。分離的SDF-1肽段可通過篩選由編碼該多肽的核酸上對應片段重組生成的多肽而得到。例如，本發(fā)明中的SDF-1多肽可被任意分割為所需長度的無重疊的片段，或優(yōu)選分割為所需長度的有重疊的片段。這些片段可以重組方式制備，并經(jīng)檢測以鑒別那些具有天然CXCR4多肽激動劑功能的肽段。
SDF-1多肽的變體也可包括SDF-1多肽的重組體形式。除SDF-1多肽之外，本發(fā)明優(yōu)選的重組多肽由與編碼哺乳動物SDF-1多肽的基因核酸序列有至少70％的序列一致性的核酸來編碼。
SDF-1變體可包括蛋白的激動形式，其組成型地表現(xiàn)天然SDF-1的功能活性。其它SDF-1變體可包括抗蛋白水解的變體，例如由于突變而改變了蛋白酶的靶序列。通過檢測變體的天然SDF-1多肽功能活性，可以方便地確定多肽氨基酸序列的改變是否產(chǎn)生了具有天然SDF-1多肽的一種或多種功能活性的變體。
依據(jù)本發(fā)明，MSCs、MAPCs和/或其它干細胞可以用編碼SDF-1或SDF-1變體的核酸其它遺傳修飾。核酸可為天然或非天然核酸，為RNA形式或DNA(如cDNA、基因組DNA和合成DNA)形式。該DNA可為單鏈或雙鏈，若為單鏈則可為編碼鏈(有義鏈)或非編碼鏈(反義鏈)。編碼SDF-1的核酸編碼序列可與SDF-1基因的核苷酸序列大致相同，如SEQ ID No8和SEQ ID No9中顯示的核苷酸序列。SEQ IDNo8和SEQ ID No9分別包含人SDF-1和大鼠SDF-1的核酸序列，并與GenBank登錄號NM199168和GenBank登錄號AF189724的核酸序列大致相同。SDF-1序列的編碼核酸也可為不同的編碼序列，其由于遺傳密碼的冗余性和簡并性，編碼與SEQ ID No5、SEQ ID No6以及SEQ ID No7相同的多肽。
本發(fā)明中其它編碼SDF-1的核酸分子為天然SDF-1的變體，如編碼天然SDF-1多肽的片段、類似物和衍生物的核酸分子。這些變體可能例如是天然SDF-1基因的自然產(chǎn)生的等位基因變體、天然SDF-1基因的同源基因或直系同源基因、或天然SDF-1基因的非自然產(chǎn)生的變體。這些變體具有與天然SDF-1基因有一個或多個堿基差異的核苷酸序列。例如，這些變體的核苷酸序列可以天然SDF-1基因的一個或多個核苷酸的缺失、增加或置換為特征。核酸插入優(yōu)選為約1-10個鄰接的核苷酸，缺失優(yōu)選為約1-10個鄰接的核苷酸。
在其它應用中，在結(jié)構上顯示實質(zhì)改變的SDF-1多肽變體可通過不至于導致被編碼的多肽發(fā)生保守性改變的核苷酸置換來產(chǎn)生。這類核苷酸置換的實例會導致(a)多肽主鏈結(jié)構的改變；(b)多肽電荷或疏水性的改變；或(c)氨基酸側(cè)鏈大小的改變。一般預期會使蛋白屬性產(chǎn)生最大改變的核苷酸置換會使得密碼子發(fā)生非保守性改變?？赡軐е碌鞍捉Y(jié)構重大改變的密碼子改變的實例為(a)導致親水殘基(如絲氨酸或蘇氨酸)置換疏水殘基(如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸)，或相反；(b)導致半胱氨酸或脯氨酸置換任何其它殘基，或相反；(c)導致具有帶正電荷側(cè)鏈的殘基(如賴氨酸、精氨酸或組氨酸)置換帶負電荷的殘基(如谷氨酰胺，阿斯巴甜)，或相反；或(d)導致具有大體積側(cè)鏈的殘基(如苯丙氨酸)取代無側(cè)鏈的殘基(如甘氨酸)，或相反。
本發(fā)明中天然SDF-1基因的自然產(chǎn)生的等位基因變體是分離自哺乳動物組織的核酸，其與天然SDF-1基因有至少70％的序列一致性，并編碼與天然SDF-1多肽具有結(jié)構相似性的多肽。本發(fā)明中天然SDF-1基因的同源基因是分離自其它物種的核酸，其與天然基因有至少70％的序列一致性，并編碼與天然SDF-1多肽具有結(jié)構相似性的多肽。可搜索公共和/或私有的核酸數(shù)據(jù)庫，以鑒別其它與天然SDF-1基因有較高(如70％或以上)序列一致性的核酸分子。
非自然產(chǎn)生的SDF-1基因變體是不存在于自然界中的核酸(如人工制備的)，與天然SDF-1基因有至少約70％的序列一致性，并編碼與天然SDF-1多肽具有結(jié)構相似性的多肽。非自然產(chǎn)生的SDF-1基因變體的實例為可編碼天然SDF-1蛋白質(zhì)的片段的變體、在嚴緊條件下與天然CXCR4基因或天然SDF-1基因的互補鏈雜交的變體，以及與天然SDF-1基因或天然SDF-1基因的互補鏈享有至少65％序列一致性的變體。
本發(fā)明中編碼天然SDF-1基因片段的核酸即編碼天然SDF-1多肽的氨基酸殘基的核酸。編碼編碼天然SDF-1片段的核酸或與編碼天然SDF-1片段的核酸雜交的較短的寡核苷酸可被用作探針、引物、或反義分子。編碼編碼天然SDF-1片段的核酸或與編碼天然SDF-1片段的核酸雜交的較長的多核苷酸也可被用于本發(fā)明的多個方面。編碼天然SDF-1片段的核酸可通過對全長天然SDF-1基因或其變體的酶消化(例如，用限制性內(nèi)切酶)或化學降解而制得。
在嚴緊條件下可與前述核酸之一雜交的核酸也可在本發(fā)明中使用。例如，這些核酸是可在低嚴緊條件、中嚴緊條件或高嚴緊條件下與前述核酸之一雜交的核酸，這些核酸在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明也可使用編碼SDF-1融合蛋白的核酸分子。這種核酸可通過制備在被引入合適的靶細胞中時表達SDF-1融合蛋白的構建體(如表達載體)而制得。舉例來說，這種構建體可通過將編碼SDF-1蛋白的第一多核苷酸與編碼其它蛋白的第二多核苷酸同框融合連接而制得，從而在適宜的表達系統(tǒng)中該構建體的表達能產(chǎn)生融合蛋白。
用于過量表達SDF-1的核酸可在例如堿基部分、糖基部分或磷酸基骨架上被修飾，以增強分子的穩(wěn)定性、促進雜交等。本發(fā)明中的核酸還可另外包含其它附屬基團，如肽(例如為了在體內(nèi)靶向靶細胞受體)，或利于跨細胞膜轉(zhuǎn)運、雜交觸發(fā)的裂解的試劑。為此，核酸與其它分子(例如，肽)、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運試劑、雜交觸發(fā)的裂解試劑等結(jié)合。
SDF-1可由MSCs、MAPCs和/或其它干細胞過量表達，這可通過向干細胞中引入提高SDF-1表達的試劑來實現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明以及以上所述，該試劑可包括天然或合成的核酸，它們被并入重組核酸構建體(典型地為DNA構建體)，該構建體可被引入細胞并在細胞內(nèi)復制。該構建體優(yōu)選包括復制系統(tǒng)以及能夠在給定的靶細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯多肽編碼序列的序列。
其它試劑也可被引入MSCs、MAPCs和/或其它干細胞以提高干細胞對SDF-1的表達。例如，增強SDF-1編碼基因轉(zhuǎn)錄的試劑、增強編碼SDF-1的mRNA的翻譯的試劑，和/或減少編碼SDF-1的mRNA的降解的試劑可被用于提高SDF-1蛋白質(zhì)的水平。提高細胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄速率可通過在編碼SDF-1的基因上游引入外源啟動子來實現(xiàn)。可促進異源基因表達的增強子元件也可被使用。
將所述試劑引入MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的優(yōu)選方法涉及使用基因療法?；虔煼ǖ囊环N方法使用包含編碼SDF-1的核苷酸的載體。載體例如包括病毒載體(如腺病毒(‘Ad’)、腺相關病毒(AAV)以及逆轉(zhuǎn)錄病毒)、脂質(zhì)體和其它含脂復合體，以及其它能夠介導多核苷酸向靶細胞(即MSCs、MAPCs和/或其它干細胞)的遞送的高分子復合體。
載體也可包含其它進一步調(diào)節(jié)基因遞送和/或基因表達，或者使靶細胞獲得有益性能的組分或功能性。這些其它組分包括例如影響結(jié)合或靶向細胞的的組分(包括介導對細胞類型或組織特異性結(jié)合的組分)；影響細胞對載體核酸吸收的組分；影響多核苷酸被吸收后在細胞內(nèi)定位的組分(如介導核定位的試劑)；以及影響多核苷酸表達的組分。這些組分也可包括標記物，例如可檢測和/或可選擇的標記物，其可被用于檢測或選擇已經(jīng)吸收并開始表達被載體遞送的核酸的細胞。這些組分可作為載體的天然特征而被提供(如使用特定的病毒載體，其具有介導結(jié)合和吸收的組分或功能性)，或者載體可經(jīng)修飾而提供這些功能性。
選擇性標記物可為陽性、陰性或雙功能的。陽性可選擇標記物使帶有標記物的細胞被選擇，而陰性可選擇標記物使帶有標記物的細胞被選擇性排除。多種這樣的標記物基因已被描述，包括雙功能性的(即陽性/陰性)標記物(參見，諸如Lupton，S.，WO 92/08796，1992年5月29日公布；以及Lupton，S.，WO 94/28143，1994年12月8日公布)。這些標記物基因可在基因治療前后提供有利的額外控制措施。在本領域已知有多種這樣的載體被廣泛使用。
可于本發(fā)明的載體包括病毒載體、基于脂質(zhì)的載體以及其它能夠?qū)⒈景l(fā)明的核苷酸遞送至MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的載體。載體可為靶向載體(targeted vector)，尤其是優(yōu)先與MSCs、MAPCs和/或其它干細胞結(jié)合的靶向載體。本發(fā)明優(yōu)選使用的病毒載體為對靶細胞呈現(xiàn)低毒性且能誘導產(chǎn)生治療有益量的SDF-1的病毒載體。
可用于遺傳修飾用于使心肌結(jié)構再生的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的病毒載體的一個實例為逆轉(zhuǎn)錄病毒。也可用于遺傳改變或遺傳修飾干細胞的載體的其它實例可源自腺病毒(Ad)或腺相關病毒(AAV)。其它為本領域所熟知并在前文中有描述的病毒載體及非病毒載體也可使用。
經(jīng)遺傳修飾以過量表達SDF-1的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞，當因治療性應用和/或細胞療法而被引入哺乳動物個體時，相比于未經(jīng)遺傳修飾以過量表達SDF-1的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞，具有更強的存活能力以及更長的壽命。由經(jīng)過遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞過量表達的SDF-1可與MSCs、MAPCs和/或其它干細胞中存在的CXCR4以及接受治療的組織中存在的CXCR4結(jié)合。SDF-1與CXCR4的結(jié)合可誘導蛋白激酶AKT發(fā)生磷酸化，繼而可減緩MSCs、MAPCs和/或其它干細胞以及接受治療的組織的凋亡并大大增強其存活能力。此外，SDF-1的過量表達可促進用于使心肌結(jié)構再生的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞以及哺乳動物個體內(nèi)其它祖細胞或干細胞歸集至接受治療的組織。
CXCR4和SDF-1的過量表達依據(jù)本發(fā)明的另一方面，MSCs、MAPCs和/或其它干細胞可經(jīng)遺傳修飾而同時過量表達CXCR4和SDF-1。依據(jù)本發(fā)明過量表達的CXCR4多肽可具有與哺乳動物CXCR4多肽的氨基酸序列大致相同的氨基酸序列。例如，過量表達的CXCR4可具有與SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2大致相同的氨基酸序列。過量表達的SDF-1可具有與哺乳動物SDF-1的氨基酸序列大致相同的氨基酸序列。例如，過量表達的SDF-1可具有與SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和/或SEQ ID NO7大致相同的氨基酸序列。
依據(jù)本發(fā)明過量表達的CXCR4和SDF-1也可分別為哺乳動物CXCR4和哺乳動物SDF-1的變體，例如哺乳動物CXCR4和哺乳動物SDF-1的片段、類似物和衍生物。這些變體例如包括由天然CXCR4基因(即天然產(chǎn)生的核酸，其編碼天然產(chǎn)生的哺乳動物CXCR4多肽)自然產(chǎn)生的等位基因變體編碼的多肽、由天然SDF-1基因自然產(chǎn)生的等位基因變體編碼的多肽、由天然CXCR4基因的可變剪接形式編碼的多肽、由天然SDF-1基因的可變剪接形式編碼的多肽、由天然CXCR4基因的同源基因或直系同源基因編碼的多肽、由天然SDF-1基因的同源基因或直系同源基因編碼的多肽、由天然CXCR4基因的非自然產(chǎn)生的變體編碼的多肽和/或由天然SDF-1基因的非自然產(chǎn)生的變體編碼的多肽。
CXCR4變體和SDF-1變體的多肽序列與天然CXCR4和SDF-1之間有一個或多個氨基酸的差異。這些變體的肽序列可以CXCR4變體和/或SDF-1變體的一個或多個氨基酸的缺失、增加或置換為特征。氨基酸的插入優(yōu)選為1-4個鄰接的氨基酸，而缺失優(yōu)選為1-10個鄰接的氨基酸。CXCR4多肽變體基本上保留有天然CXCR4的功能活性，而SDF-1多肽變體基本上保留有天然SDF-1的功能活性。
對應于一個或多個特定基序和/或結(jié)構域或?qū)谌我忾L度的CXCR4和SDF-1多肽片段都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。CXCR4和SDF-1多肽變體也可包擴CXCR4和SDF-1多肽的重組體形式。本發(fā)明所優(yōu)選的重組體多肽分別由與編碼哺乳動物CXCR4和哺乳動物SDF-1的基因核酸序列有至少70％的序列一致性的核酸來編碼。
CXCR4變體和SDF-1變體可包括組成型地表現(xiàn)天然CXCR4和SDF-1的功能活性的蛋白質(zhì)激動形式。其它CXCR4和SDF-1變體可包括抗蛋白水解的變體，例如由于突變而改變了蛋白酶的靶序列。
用于使心肌結(jié)構再生的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞對CXCR4和SDF-1的過量表達可通過以編碼CXCR4(或CXCR4的變體)和SDF-1(或SDF-1的變體)的核酸對以上干細胞遺傳修飾來實現(xiàn)。該核酸可為天然或非天然核酸，為RNA形式或DNA(如cDNA、基因組DNA和合成DNA)形式。其DNA可為單鏈或雙鏈，若為單鏈則可為編碼鏈(有義鏈)或非編碼鏈(反義鏈)。
編碼CXCR4多肽的核酸編碼序列可與SEQ ID NO3和SEQ IDNO4中顯示的核苷酸序列大致相同。編碼CXCR4的核酸編碼序列也可為不同的編碼序列，但由于遺傳密碼的冗余性或簡并性而編碼與SEQ ID NO3和SEQ ID NO4相同的多肽。
編碼SDF-1的核酸編碼序列可與SEQ ID NO8和SEQ ID NO9中顯示的核苷酸序列大致相同。SDF-1的核酸編碼序列也可為不同的編碼序列，但由于遺傳密碼的冗余性或簡并性而編碼與SEQ ID NO5、SEQ ID NO6以及SEQ ID NO7相同的多肽。
本發(fā)明中其它編碼CXCR4和SDF-1的核酸分子分別為天然CXCR4和天然SDF-1的變體，例如編碼天然CXCR4和天然SDF-1的片段、類似物以及衍生物的核酸分子。這些變體可分別具有與天然CXCR4基因和SDF-1基因在一個或多個堿基上有差異的核苷酸序列。
在其它應用中，在結(jié)構上顯示實質(zhì)改變的CXCR4變體和SDF-1變體可通過進行不至于導致被編碼的多肽發(fā)生保守性改變的核苷酸置換來產(chǎn)生。本發(fā)明中天然CXCR4基因和天然SDF-1基因自然產(chǎn)生的等位基因變體是分離自哺乳動物組織的核酸，其與天然CXCR4基因和天然SDF-1基因分別有至少約70％的序列一致性，并編碼與CXCR4多肽和天然SDF-1多肽具有結(jié)構相似性的多肽。
在嚴緊條件下與前述核酸之一雜交的核酸也可在本發(fā)明中使用。例如，那些可在低嚴緊條件、中嚴緊條件或高嚴緊條件下與前述核酸之一雜交的核酸也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
編碼CXCR4和SDF-1融合蛋白質(zhì)的核酸分子也可在本發(fā)明中使用。這類核酸可通過制備當其被引入適合的靶細胞時表達CXCR4和SDF-1融合蛋白質(zhì)的構建體(如表達載體)來制得。
用于過量表達CXCR4和SDF-1的核酸可例如在堿基基團、糖基基團或磷酸主鏈上被修飾，以增強分子的穩(wěn)定性，促進雜交等。本發(fā)明中的核酸還可能另外包含其它的附屬基團，例如肽(例如為了在體內(nèi)靶向靶細胞受體)，或利于跨細胞膜轉(zhuǎn)運、雜交觸發(fā)的裂解的試劑。為此，核酸可偶聯(lián)到另一分子，例如肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運試劑、雜交觸發(fā)的裂解試劑等。
可通過向MSCs、MAPCs和/或其它干細胞中引入至少一種促進CXCR4和SDF-1表達的試劑而使MSCs、MAPCs和/或其它干細胞過量表達CXCR4和SDF-1。依據(jù)本發(fā)明以及以上所述，該試劑可包括天然或合成的核酸，其被并入能引入細胞并在細胞內(nèi)復制的重組核酸構建體，典型地為DNA構建體。這種構建體優(yōu)選包括復制系統(tǒng)以及能夠在給定的靶細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯多肽編碼序列的序列。
其它試劑也可被引入MSCs、MAPCs和/或其它干細胞以促進干細胞對CXCR4和SDF-1的表達。例如，增強編碼CXCR4和SDF-1的基因的轉(zhuǎn)錄的試劑，增強編碼CXCR4和SDF-1的mRNA的翻譯的試劑和/或減弱編碼CXCR4和SDF-1的mRNA的降解的試劑可被用于過量表達CXCR4和SDF-1。提高細胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄速率可通過在編碼CXCR4的基因和編碼SDF-1的基因的上游引入外源啟動子來實現(xiàn)。可促進異源基因表達的增強子元件也可被用到。
將所述試劑引入MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的優(yōu)選方法涉及使用基因療法?；虔煼ǖ囊环N方法使用包含編碼CXCR4的核苷酸的載體和包含編碼SDF-1的核苷酸的載體。另一種方法使用同時編碼CXCR4和SDF-1的載體。載體例如包括病毒載體(如腺病毒(‘Ad’)、腺相關病毒(AAV)，以及逆轉(zhuǎn)錄病毒)、脂質(zhì)體和其它含脂復合體，以及其它能夠介導多核苷酸向靶細胞(即MSCs、MAPCs和/或其它干細胞)的遞送的高分子復合體。
載體也可包含其它進一步調(diào)節(jié)基因遞送和/或基因表達，或者為靶細胞提供有益性能的組分或功能性。這些其它組分例如包括影響結(jié)合或靶向細胞的組分(包括介導細胞類型或組織特異性結(jié)合的組分)；影響細胞對載體核酸的攝取的組分；影響多核苷酸被攝取后在細胞內(nèi)的定位的組分(例如介導核定位的試劑)；以及影響多核苷酸表達的組分。這些組分也可包括標記物，例如可檢測和/或可選擇的標記物，它們可被用于檢測或選擇已經(jīng)吸收并表達被載體遞送的核酸的細胞。這些組分可作為載體的天然特性而提供(如帶有介導結(jié)合和吸收的組分或功能性的某些病毒載體的使用)，或者載體可經(jīng)修飾而提供這些功能性。
可選擇標記物可為陽性、陰性或雙功能性。陽性可選擇標記物使得能選擇帶有該標記物的細胞，而陰性可選擇標記物使得帶有標記物的細胞被選擇性排除。多種這樣的標記物基因已被表述，包括雙功能性(即陽性/陰性)標記物(參見，例如，Lupton，S.，WO 92/08796，1992年5月29日公布；以及Lupton，S.，WO 94/28143，1994年12月8日公布)。這些標記物基因可在基因治療前后提供有利的額外控制措施。在本領域已知有多種這樣的載體被廣泛使用。
本發(fā)明中使用的載體包括病毒載體、基于脂質(zhì)得載體以及其它能夠?qū)⒈景l(fā)明得核苷酸遞送至MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的載體。載體可為靶向載體，尤其是優(yōu)先與MSCs、MAPCs和/或其它干細胞結(jié)合的靶向載體。用在本發(fā)明中的優(yōu)選病毒載體為對靶細胞呈現(xiàn)低毒性且能誘導產(chǎn)生治療有益量得CXCR4和SDF-1的病毒載體。
可用于遺傳修飾MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的病毒載體的一個實例為逆轉(zhuǎn)錄病毒。其它的也可用于遺傳改變或修飾干細胞的載體實例可源自腺病毒(Ad)或腺相關病毒(AAV)。其它在本領域內(nèi)廣為人知并在前文中有描述的病毒載體及非病毒載體也可使用。
經(jīng)遺傳修飾以同時過量表達CXCR4和SDF-1的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞，當其因治療性應用和/或細胞療法而被引入哺乳動物體個體內(nèi)時，相比于未經(jīng)遺傳修飾以過量表達CXCR4和/或SDF-1的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞，具有改善的存活能力以及更長的壽命。由用于使心肌結(jié)構再生的、經(jīng)過遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞過量表達的CXCR4和SDF-1可在干細胞中結(jié)合到一起|以及與存在于待治療的組織中的CXCR4和SDF-1結(jié)合。如前所述，SDF-1與CXCR4的結(jié)合可誘導蛋白激酶AKT發(fā)生磷酸化，繼而減緩MSCs、MAPCs和/或其它干細胞以及待治療的組織的凋亡并大大改善其存活能力。此外，CXCR4和SDF-1的過量表達可促進用于使心肌結(jié)構再生的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞以及哺乳動物個體內(nèi)其它祖細胞或干細胞歸集至接受治療的組織。
治療性應用經(jīng)遺傳修飾以過量表達CXCR4、SDF-1或同時過量表達CXCR4和SDF-1的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞可潛在地被用于任何需要擴展、再定居(repopulate)、維持和/或再生組織和/或器官系統(tǒng)的細胞療法或治療性應用。依據(jù)本發(fā)明的一方面，經(jīng)遺傳修飾以過量表達CXCR4的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞可被用于治療患有近期心肌梗塞或充血性心力衰竭的患者?；加薪谛募」Ｈ虺溲孕牧λソ叩幕颊呖赏ㄟ^將遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞遞送至梗塞心肌組織和/或梗塞心肌組織的鄰近組織而得到治療。被遞送至梗塞心肌組織的遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞可分化為能夠再定居(即植入)并部分或全部恢復梗塞心肌的正常功能的細胞。
可通過將所用的經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞直接注射入梗塞心肌組織或鄰近梗塞區(qū)的心肌組織，將用于使心肌結(jié)構再生的經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞遞送至梗塞心肌?？墒褂美缃Y(jié)核菌素注射器完成經(jīng)遺傳修飾的干細胞的直接注射。將遺傳修飾的干細胞直接注射入梗塞心肌組織可上調(diào)梗塞心肌組織對SDF-1的表達。梗塞心肌組織內(nèi)SDF-1表達的上調(diào)自MSCs、MAPCs和/或其它干細胞被移植入心肌后約1小時至移植后不到7天時被觀察到。SDF-1的這種上調(diào)可潛在地促使外圍血液中的多能性干細胞歸集于梗塞心肌。MSCs、MAPCs和/或其它干細胞對CXCR4和/或SDF-1的過量表達增強了遺傳修飾的干細胞的存活能力，從而增強治療效果。
或者，可通過將遺傳修飾的干細胞經(jīng)靜脈或動脈注入待治療的哺乳動物個體，將用于使心肌結(jié)構再生的經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞遞送至梗塞心肌組織。對用于使心肌結(jié)構再生并過量表達SDF-1和/或CXCR4的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的輸注可在心肌梗塞后不久(如約1天)施行。心肌梗塞引起梗塞心肌組織內(nèi)SDF-1表達的短暫上調(diào)。這種SDF-1表達的上調(diào)可潛在地促使被注入哺乳動物外周血中的用于使心肌結(jié)構再生的經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞歸集至梗塞心肌組織。用于使心肌結(jié)構再生的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞對CXCR4和SDF-1的過量表達增強了經(jīng)遺傳修飾的干細胞的存活能力，這使治療效果的得到增強。
用于使心肌結(jié)構再生的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞一旦被遞送至待治療的組織，可在任意合適的時長內(nèi)表達CXCR4和/或SDF-1，包括瞬時表達和穩(wěn)定、長期表達。在優(yōu)選的實施方案中，CXCR4和/或SDF-1在合適和確定的時長內(nèi)以治療量表達。
治療量為能夠在接受治療的動物或人體內(nèi)產(chǎn)生醫(yī)療所需效果的量。如醫(yī)學領域內(nèi)所熟知的，任一動物或人體的所需劑量取決于許多因素，包括體型大小、身體表面積、年齡、給藥的具體成分、性別、給藥時間和給藥途徑、綜合健康狀態(tài)，以及同時給藥的其它藥物。蛋白質(zhì)、核酸或小分子的具體劑量可容易地由本領域技術人員使用下文所描述的實驗方法來確定。
用于使心肌結(jié)構再生的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞對CXCR4和/或SDF-1的長期表達是有利的，因為其使得能在遠離遞送用于使心肌結(jié)構再生的經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的時間點(如心肌梗塞后約2至3天)給予動員劑。給予動員劑可誘導其它干細胞從組織(如骨髓)動員至個體的外周血，使外周血中干細胞濃度增加。在動員劑為粒細胞集落刺激因子(G-CSF)時，中性白細胞數(shù)目顯著增多，這在圍手術期引起副作用，而不是幾天或幾周之后。此外，CXCR4和/或SDF-1的長期或慢性過量表達導致干細胞自外周血向梗塞心肌組織的長期歸集，而無需干細胞動員。
應理解的是，還有多種其它的動員劑為已知的并可用在本發(fā)明中。這些動員劑可包括細胞因子，如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-7、IL-3、IL-12、干細胞因子(SCF)和flt-3配體；趨化因子，如IL-8、Mip-1α和Groβ；以及環(huán)磷酰胺(cylcophosamide，Cy)和太平洋紫杉醇(paclitaxel)等化療劑。這些動員劑在實現(xiàn)干細胞動員的時間范圍(time frame)、動員的干細胞類型以及效率等方面有所不同。本領域技術人員應理解還可以其它動員劑給藥。
可通過將動員劑直接注射入個體而給藥。盡管動員劑典型地在用于使心肌結(jié)構再生的經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞被遞送(例如直接注射或輸注)至待治療組織之后給藥，但動員劑也可在經(jīng)遺傳修飾的干細胞遞送之前給藥。
舉例而言，圖1解釋了使用MSCs、MAPCs和/或其它干細胞治療急性心急梗塞患者的臨床策略，其中MSCs、MAPCs和/或其它干細胞經(jīng)遺傳修飾以過量表達CXCR4和SDF-1，用于使心肌結(jié)構再生。在該治療策略中，患有急性心肌梗塞的患者首先經(jīng)血管成形術治療。心肌梗塞約1天后，將經(jīng)遺傳修飾以過量表達CXCR4和SDF-1的用于使心肌結(jié)構再生的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞經(jīng)動脈或靜脈輸注至患者體內(nèi)。用于使心肌結(jié)構再生的經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞可為接受治療的患者自體的和/或異體的，并可如前文所述被采集、培養(yǎng)以及被遺傳修飾。被注入用于使心肌結(jié)構再生的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的數(shù)量可包括例如200萬個干細胞。這一數(shù)量可依據(jù)具體應用而調(diào)高或調(diào)低。
用于使心肌結(jié)構再生的經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的輸注可增加SDF-1在梗塞心肌中的表達。增加的SDF-1表達可提高MSCs和/或MAPCs在梗塞心肌內(nèi)的存活能力以及促進外周血內(nèi)其它祖細胞和干細胞向梗塞心肌的歸集。
在心肌梗塞約2至3天后，以GCS-F對患者給藥約5天。GCS-F可將另外的多潛能祖細胞或干細胞從諸如骨髓等組織中動員至患者的血液供應。由用于使心肌結(jié)構再生的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞表達的SDF-1/或CXCR4誘導這些外周血中的祖細胞或干細胞進入梗塞心肌。用于使心肌結(jié)構再生的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞以及受動員被誘導進入梗塞心肌的的祖細胞或干細胞可有助于心肌再生，并對左心室功能有實質(zhì)性改善。
應理解，盡管經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞最初被描述為用于治療急性心肌梗塞或充血性心力衰竭，但依據(jù)本發(fā)明，這些經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞也可用于其它治療性應用。例如，本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的MSCs、MAPCs和/或其它干細胞可被用于肝細胞的再生以替換受損肝組織并恢復肝功能，可與骨髓移植結(jié)合用于化療和/或放療致使骨髓消融后的骨髓再生，用于骨和/或軟骨的重建，用于糾正肌肉障礙(如肌營養(yǎng)不良)，以及其它使組織再生，或典型利用MSCs、MAPCs和/或其它干細胞的治療性應用。
實施例下面一系列實施例對本發(fā)明進行進一步闡述。提供這些實施例以闡述本發(fā)明，而決不應被理解為對本發(fā)明范圍或內(nèi)容的限制。
CXCR4表達對MSC歸集以及存活能力的影響為確定遺傳修飾MSCs以表達CXCR4是否影響MSCs的存活能力以及向梗塞心肌的歸集，將200萬個MSCs和經(jīng)遺傳修飾以表達CXCR4的MSCs經(jīng)靜脈注入通過左側(cè)上行動脈結(jié)扎誘發(fā)心肌梗塞1天后的大鼠。圖2顯示了在注入MSCs和遺傳修飾的MSCs 3天后，梗塞區(qū)域單位面積內(nèi)MSCs和經(jīng)遺傳修飾以表達CXCR4的MSCs的數(shù)量。
單位面積內(nèi)經(jīng)遺傳修飾的MSCs的數(shù)量顯著多于未經(jīng)遺傳修飾的MSCs的數(shù)量。這表明表達CXCR4的MSCs相比于未經(jīng)遺傳修飾的MSCs具有改善的存活能力和歸集。
CXCR4:SDF-1軸抗凋亡對MSCs或經(jīng)CXCR4或SDF-1轉(zhuǎn)染的MSCs進行AKT和磷酸化AKT的Western印跡分析，以確定使MSCs表達CXCR4或SDF-1的遺傳修飾對于梗塞心肌內(nèi)的MSCs是否具有抗凋亡效果(即減緩或抑制MSCs的凋亡)。圖3顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染以穩(wěn)定表達CXCR4或SDF-1的大鼠MSCs的AKT比未被轉(zhuǎn)染的MSCs的AKT更易于磷酸化。AKT的磷酸化已被發(fā)現(xiàn)能夠抑制MSCs的凋亡。
SDF-1或CXCR4的表達對MSC歸集及存活能力的影響為評價遺傳修飾MSCs以表達CXCR4是否影響MSCs向梗塞心肌的歸集以及存活能力，將MSCs和經(jīng)遺傳修飾以表達CXCR4或SDF-1的MSCs分別經(jīng)靜脈注入通過LAD結(jié)扎誘發(fā)心肌梗塞后的各只大鼠。
圖4A所示照片顯示了注入對照MSCs和表達SDF-1和CXCR4的MSCs 3天后，對應大鼠梗塞區(qū)域的代表性切片。
圖4B比較注射后3天梗塞區(qū)域單位面積內(nèi)對照MSCs的數(shù)量和經(jīng)遺傳修飾以表達CXCR4或SDF-1的MSCs的數(shù)量。
如圖4A和4B所示，單位面積內(nèi)經(jīng)遺傳修飾的MSCs的數(shù)量顯著多于對照MSCs的數(shù)量。這表明表達CXCR4或SDF-1的MSCs比未經(jīng)遺傳修飾的MSCs具有改善的歸集及存活能力。
SDF-1的表達也會降低存活的心肌組織內(nèi)的凋亡對以對照MSCs和表達SDF-1的MSCs處理的相應大鼠的梗塞區(qū)域進行檢查。
圖5所示為心肌梗塞4天后各梗塞區(qū)域的照片。照片表明表達SDF-1的MSCs減緩了存活的心肌組織內(nèi)的調(diào)亡。
表達CXCR4或SDF-1的MSC對缺血性心肌病的作用為評價遺傳修飾MSCs以表達CXCR是否影響MSC向梗塞心肌的歸集以及存活能力，將MSCs和經(jīng)遺傳修飾以表達CXCR4或SDF-1的MSCs被分別經(jīng)靜脈注入LAD結(jié)扎誘發(fā)心肌梗塞1天后的各只大鼠。
圖6比較了輸入鹽水、心臟成纖維細胞、對照MSCs、表達SDF-1的MSCs以及表達CXCR4的MSCs的大鼠心肌梗塞14天后LV功能的改善狀況。以縮短分數(shù)(shortening fraction)衡量，經(jīng)表達SDF-1或CXCR4的MSCs處理的梗塞心肌表現(xiàn)出顯著增強的LV功能。在輸入對照MSCs、心臟成纖維細胞以及鹽水的處理方式之間則未觀察到縮短分數(shù)的顯著差異。
從本發(fā)明的以上描述，本領域技術人員能預見其改進、變化和修飾。這些在本領域技術內(nèi)的改進、變化和修飾被所附的權利要求書所涵蓋。
序列表<110>馬克·佩恩(Penn，Marc)<120>用于治療性應用的經(jīng)遺傳改變的細胞<130>CCF-7019<160>9<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>352<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met1 5 10 15Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu20 25 30Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile35 40 45Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly50 55 60Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu65 70 75 80Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val85 90 95Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val100 105 110His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala115 120 125Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser130 135 140Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val145 150 155 160
Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn165 170 175Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro Asn180 185 190Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu195 200 205Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser210 215 220Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr225 230 235 240Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr245 250 255Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln260 265 270Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu275 280 285Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe290 295 300Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val305 310 315 320Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly325 330 335His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser340 345 350
<210>2<211>349<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>2Met Glu Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Ser Glu Glu Val Gly Ser Gly1 5 10 15Asp Tyr Asp Ser Asn Lys Glu Pro Cys Phe Arg Asp Glu Asn Glu Asn20 25 30Phe Asn Arg Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Phe Ile Ile Phe Leu Thr35 40 45Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly Tyr Gln Lys50 55 60Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu Ser Val Ala65 70 75 80Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp Ala Met85 90 95Ala Asp Trp Tyr Phe Gly Lys Phe Leu Cys Lys Ala Val His Ile Ile100 105 110Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala Phe Ile Ser115 120 125Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser Gln Ser Ala130 135 140Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Ala Val Tyr Val Gly Val Trp Ile Pro145 150 155 160Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Ile Ile Phe Ala Asp Val Ser Gln165 170 175Gly Asp Gly Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Leu Tyr Pro Asp Ser Leu Trp180 185 190Met Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu Ile Leu Pro195 200 205
Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser Lys Leu Ser210 215 220His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr Thr Val Ile225 230 235 240Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr Val Gly Ile245 250 255Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Val Ile Lys Gln Gly Cys Glu260 265 270Phe Glu Ser Val Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu Ala Leu Ala275 280 285Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ala290 295 300Lys Phe Lys Ser Ser Ala Gln His Ala Leu Asn Ser Met Ser Arg Gly305 310 315 320Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly His Ser Ser325 330 335Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser340 345<210>3<211>1662<212>RNA<213>Homo sapiens<400>3ccgagggcct gagtgctcca gtagccaccg catctggaga accagcggtt accatggagg60ggatcagtat atacacttca gataactaca ccgaggaaat gggctcaggg gactatgact120ccatgaagga accctgtttc cgtgaagaaa atgctaattt caataaaatc ttcctgccca180ccatctactc catcatcttc ttaactggca ttgtgggcaa tggattggtc atcctggtca240tgggttacca gaagaaactg agaagcatga cggacaagta caggctgcac ctgtcagtgg300ccgacctcct ctttgtcatc acgcttccct tctgggcagt tgatgccgtg gcaaactggt360actttgggaa cttcctatgc aaggcagtcc atgtcatcta cacagtcaac ctctacagca420gtgtcctcat cctggccttc atcagtctgg accgctacct ggccatcgtc cacgccacca480
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1.分離的干細胞，其被遺傳修飾以表達CXCR4、SDF-1或其變體中的至少一種。
2.如權利要求1所述的分離的干細胞，其被遺傳修飾以表達蛋白質(zhì)或多肽，所述蛋白質(zhì)或多肽具有對應于SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或其變體中的至少一種的氨基酸序列。
3.如權利要求1所述的分離的干細胞，其被外源遺傳物質(zhì)遺傳修飾，所述外源遺傳物質(zhì)包含對應于CXCR4基因、SDF-1基因或其變體的至少一部分的核酸。
4.如權利要求3所述的分離的干細胞，所述核酸對應于SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或其變體。
5.如權利要求1所述的分離的干細胞，其選自間充質(zhì)干細胞或多潛能成體祖細胞。
6.如權利要求1所述的分離的干細胞，其被遺傳修飾以表達CXCR4和SDF-1，或CXCR4和SDF-1的變體。
7.被外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染的分離的干細胞，所述外源遺傳物質(zhì)包含對應于CXCR4基因、SDF-1基因或其變體的至少一部分的核酸。
8.如權利要求7所述的分離的干細胞，所述核酸對應于SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或其變體。
9.如權利要求8所述的分離的干細胞，其表達CXCR4、SDF-1或其變體中的至少一種。
10.如權利要求9所述的分離的干細胞，其表達蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有對應于SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7或其變體中的至少一種的氨基酸序列。
11.如權利要求7所述的分離的干細胞，其選自間充質(zhì)干細胞或多潛能成體祖細胞。
12.治療性應用，包括以干細胞向接受治療的個體給藥，所述干細胞被遺傳修飾以表達CXCR4、SDF-1或其變體中的至少一種。
13.如權利要求12所述的治療性應用，所述干細胞表達蛋白質(zhì)或多肽，所述蛋白質(zhì)或多肽具有對應于SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或其變體中的至少一種的氨基酸序列。
14.如權利要求12所述的治療性應用，被用于治療心肌梗塞，通過使所述干細胞遞送至梗塞心肌組織而以所述干細胞給藥。
15.如權利要求14所述的治療性應用，所述干細胞包括間充質(zhì)干細胞或多潛能成體祖細胞中的至少一種。
16.如權利要求15所述的治療性應用，所述干細胞通過選自直接注射、靜脈輸注和動脈輸注的方法來給藥。
17.如權利要求16所述的治療性應用，包括對所述接受治療的個體進行動員劑給藥，所述動員劑誘導其它干細胞從所述接受治療的個體的組織動員至外周血。
18.如權利要求17所述的治療性應用，所述動員劑給藥在所述干細胞給藥之后。
19.如權利要求17所述的治療性應用，所述動員劑包括粒細胞集落刺激因子。
全文摘要
分離的間充質(zhì)干細胞、多潛能成體祖細胞或其它干細胞被遺傳修飾以表達CXCR4、SDF－1或其變體中的至少一種。
文檔編號C12N15/09GK101065400SQ200580024164
公開日2007年10月31日 申請日期2005年5月17日 優(yōu)先權日2004年5月19日
發(fā)明者馬克·S·佩恩, 馬修·凱德羅夫斯基 申請人:克里夫蘭診所基金會