專利名稱：一種含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產(chǎn)肉量上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)魚類育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產(chǎn)肉量上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，獲得較快生長速度的鯉魚依然是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求，因此，選育出生長速度快，品質(zhì)優(yōu)良的鯉魚品種，尤其是選擇優(yōu)良的候選基因及適當(dāng)?shù)奶幚矸椒ㄔ谔岣啧庺~生長速度的同時不影響其他性狀的表達(dá)，具有重要的意義。傳統(tǒng)的原核內(nèi)顯微注射法、精子載體法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、反轉(zhuǎn)錄病毒載體法、細(xì)胞核移植方法等改善動物品種性能的方法皆因成本高、效率低或者插入片段小等缺點(diǎn)而無法廣泛應(yīng)用。含有鯉IGF2b基因的慢病毒是一種用人工分離和修飾的方法獲得的病毒液，即根據(jù)鯉魚RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再設(shè)計相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用相應(yīng)內(nèi)切酶切割獲得含有 IGF2b的基因片段，最終用此基因片段與載體pLenti6. 3-IRES-EGFP相連接從而獲得含有鯉IGF2b基因的慢病毒；其具體制備方式見專利申請?zhí)枮?01110356210. O的專利申請文件中所述。用此含有鯉IGF2b基因的慢病毒處理鯉魚來感染鯉特定組織中非分裂期和分裂期細(xì)胞，從而影響特定組織靶基因的表達(dá)以致其生長狀況發(fā)生變化。此種育種方法應(yīng)用于魚類可在短期內(nèi)確定具有目的基因的品系，提高鯉魚產(chǎn)肉量，從而縮短魚類育種時間，并且能使整合于靶細(xì)胞基因組的目的基因長期、穩(wěn)定的表達(dá)，此類研究至今未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產(chǎn)肉量上的應(yīng)用。技術(shù)方案具體處理步驟如下(I)用人工分離和修飾的方法獲得含有鯉IGF2b基因的慢病毒；(2)讓鯉魚感染所述慢病毒，即在鯉魚體內(nèi)注射所述慢病毒；(3)用綠色熒光來確定感染是否成功感染48h后，通過熒光顯微鏡觀測法觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)狀況，如有綠色熒光蛋白的表達(dá)，則表明所述鯉魚已感染上所述慢病作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟(2)中所述慢病毒的感染在幼魚階段完成。作為本發(fā)明的更進(jìn)一步改進(jìn)，步驟(2)中，在所述鯉魚體重為5g時注射所述慢病毒。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟(2)中鯉魚注射部位為背部肌肉。
作為本發(fā)明的更進(jìn)一步優(yōu)選方案，步驟(2)中鯉魚注射部位為背鰭最前端定點(diǎn)到側(cè)線垂直距離的中間點(diǎn)。本發(fā)明還包括觀測由于感染而引起鯉魚性狀的變化的步驟(4) :3個月后，驗證鯉魚生長狀況和血液指標(biāo)狀況。有益效果3個月后，驗證被感染鯉魚的生長狀況和血液指標(biāo)狀況，其驗證方法為根據(jù)陰性對照、陽性對照，對比不同注射劑量的鯉魚的體重變化狀況及血液指標(biāo)的變化狀況。結(jié)果顯示，用已檢測的含有鯉IGF2b基因的慢病毒感染鯉魚幼體，感染組相比對照組，鯉魚體重獲得了顯著增加的效果，且劑量較大時效果更好，同時對鯉魚血液指標(biāo)沒有影響，安全性好。此種育種方法應(yīng)用于魚類可在短期內(nèi)確定具有目的基因的品系，縮短魚類育種時間，并且能使整合于靶細(xì)胞基因組的目的基因長期、穩(wěn)定的表達(dá)，由于未對血液指標(biāo)造成影響，所以安全性好。


圖I為熒光顯微鏡檢測到慢病毒注射48h后魚體綠色熒光蛋白的表達(dá)，通過此表達(dá)可以顯示被慢病毒感染的鯉魚背部肌肉的生長效果，有綠色熒光顯示說明已被感染圖2養(yǎng)殖3個月后不同實(shí)驗組魚的體重性狀的差異
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I為了控制試驗誤差，所有注射工作由一個人完成，所有實(shí)驗組都在同一塘中養(yǎng)殖， 所有的養(yǎng)殖管理均由一個人進(jìn)行。(I)含有鯉IGF2b基因的慢病毒來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心鯉復(fù)合育種課題組，其制備方法參看專利申請?zhí)枮?01110356210.0的專利申請文件，250尾鯉取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院無錫淡水漁業(yè)研究中心南泉養(yǎng)殖基地，共設(shè)立5個實(shí)驗組一個是不做任何處理的陰性對照組；一個是注射不含鯉IGF2b基因的慢病毒稀釋液的陽性對照組，注射量為20μ L，總計約含I. IXlO5個病毒；另外三個是按照低、中、高三個不同濃度梯度注射含鯉IGF2b基因慢病毒稀釋液的慢病毒感染組，其注射劑量分別為10 μ L，20 μ L和40 μ L，分別對應(yīng)含病毒個數(shù)為
5.54X IO4個病毒，1.1X IO5個病毒，2. 22 X IO5個病毒。(2) 48h后，隨機(jī)選取陰性對照組、陽性對照組和各劑量感染組魚各2尾，進(jìn)行綠色熒光蛋白(GFP)熒光檢測。結(jié)果顯示，各劑量感染組魚均已感染鯉IGF2b基因慢病毒，見圖 I ;(3)在⑵的基礎(chǔ)上，養(yǎng)殖3個月后，測量體重，計算不同實(shí)驗組魚之間的生長表現(xiàn)。結(jié)果顯示，感染鯉IGF2b基因慢病毒的鯉魚比未感染此病毒的鯉魚體重明顯大，且最高感染劑量40uL組的體重最大，見圖2。(4)在(3)的基礎(chǔ)上，測量了不同實(shí)驗組魚的血液指標(biāo)，包括腎臟、肝臟、以及IGF2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑上的蛋白共9個指標(biāo)，測定樣本量為20尾魚，結(jié)果見下表。
權(quán)利要求
1.一種含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產(chǎn)肉量上的應(yīng)用，按如下步驟實(shí)現(xiàn)(1)用人工分離和修飾的方法獲得含有鯉IGF2b基因的慢病毒；(2)鯉魚感染所述慢病毒在鯉魚體內(nèi)注射所述慢病毒；(3)用綠色熒光來確定感染是否成功感染48h后，通過熒光顯微鏡觀測法觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)狀況，成功感染慢病毒的鯉魚體內(nèi)有綠色熒光蛋白的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產(chǎn)肉量上的應(yīng)用，其特征為步驟(2)中所述慢病毒的感染在幼魚階段完成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產(chǎn)肉量上的應(yīng)用，其特征為步驟(2)中，在鯉魚體重為5g時注射所述慢病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產(chǎn)肉量上的應(yīng)用，其特征為步驟(2)中鯉魚注射部位為背部肌肉。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產(chǎn)肉量上的應(yīng)用，其特征為步驟(2)中鯉魚注射部位為背鰭最前端定點(diǎn)到側(cè)線垂直距離的中間
6.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產(chǎn)肉量上的應(yīng)用，其特征為還包括步驟(4):觀測由于感染而引起鯉魚性狀的變化在鯉魚感染所述慢病毒3個月后，驗證鯉魚的生長狀況和血液指標(biāo)狀況。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產(chǎn)肉量上的應(yīng)用，采用含有鯉IGF2b基因的慢病毒來感染鯉特定組織中非分裂期和分裂期細(xì)胞，從而影響特定組織靶基因的表達(dá)以致其生長狀況發(fā)生變化，結(jié)果顯示用已檢測的含有鯉IGF2b基因的慢病毒感染鯉魚幼體，3個月后，感染組相比對照組，鯉體重獲得了顯著增加，同時鯉魚血液各項指標(biāo)沒有影響，安全性好。
文檔編號C12N7/01GK102604897SQ20121008762
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者張寧, 徐跑, 蘇勝彥, 董在杰, 袁新華 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心