本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于同步檢測pcv2和prv混合感染的引物序列及方法。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒2型(porcinecircovirustype2，pcv2)和豬偽狂犬病毒(porcinepseudorabiesvirus，prv)感染是當(dāng)前我國養(yǎng)豬生產(chǎn)中普遍存在且危害嚴(yán)重的dna病毒病。其中，pcv2爆發(fā)時(shí)死亡率可達(dá)50％以上，因此其已成為當(dāng)前我國養(yǎng)豬業(yè)中最重要的傳染病。prv屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，其感染會引起成年妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊、新生仔豬急性死亡以及三周齡以內(nèi)的仔豬表現(xiàn)神經(jīng)癥狀和高死亡率；據(jù)調(diào)查目前我國規(guī)模豬場偽狂犬病的血清陽性率達(dá)70％以上，危害嚴(yán)重。以上2種病原在臨床上較為常見，并且常?；旌细腥?，其引發(fā)的疾病已經(jīng)給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

傳統(tǒng)的pcv2感染和prv感染的檢測方法有病毒分離、實(shí)驗(yàn)動物接種和血清學(xué)試驗(yàn)等方法，這些方法操作繁瑣、檢測周期長、有的存在非特異性反應(yīng)和敏感度低等缺點(diǎn)，已經(jīng)不能滿足養(yǎng)殖業(yè)的防病需求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，pcr檢測方法可以快速、高效地對病原體進(jìn)行檢測。

聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)是體外酶促合成特異dna片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的dna得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、檢測周期短等特點(diǎn)，不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷。

常規(guī)pcr操作簡單，技術(shù)要求低，但對于多種病毒混合感染需要進(jìn)行多次pcr檢測，進(jìn)而延長了檢測周期，增加了檢測成本。復(fù)合pcr是指在同一pcr反應(yīng)體系中加入多對引物，同時(shí)對多個(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法；利用該方法同時(shí)檢測多個(gè)目的基因省時(shí)省力省成本，但反應(yīng)體系中存在的引物很容易形成復(fù)雜的引物二聚體，進(jìn)而影響檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，因此復(fù)合pcr的成功關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物的特異性、反應(yīng)體系和程序的優(yōu)化。

現(xiàn)有技術(shù)中有通過多重rt-pcr對豬的多種病毒進(jìn)行檢測的方法，但其對rna濃度、質(zhì)量要求較高，檢測過程中極易受到基因組dna和rna酶的污染，因此，其對操作人員技術(shù)要求較高，不利于廣泛推廣應(yīng)用。此外，也存在多重?zé)晒鈖cr的檢測方法，但其探針?biāo)鶚?biāo)記不同發(fā)光波長的熒光基團(tuán)之間很容易互相干擾，進(jìn)而影響特異性檢測。

由此可見，對于pcv2和prv感染進(jìn)行同步檢測的方法仍存在很大的發(fā)展空間，本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待設(shè)計(jì)一種操作簡便、技術(shù)要求低、特異性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好的pcv2、prv同步檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種能夠同時(shí)檢測pcv2和prv混合感染的方法。

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案是：

一種同步檢測pcv2和prv感染的引物序列，其特征在于：包括pcv2病毒引物序列和prv病毒引物序列；其中，所述pcv2病毒引物序列包括上游引物pcv2-f1和下游引物pcv2-f2；所述prv病毒引物序列包括上游引物prv-f3和下游引物prv-f4；所述pcv2-f1、pcv2-f2、prv-f3和prv-f4的核苷酸序列分別如序列表seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示。

一種同步檢測pcv2和prv感染的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)根據(jù)genbank中登錄的pcv2orf2基因和prvgh基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)如權(quán)利要求1所示的兩對特異性引物；

(2)使用所述兩對特異性引物對待測樣本進(jìn)行復(fù)合pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；若出現(xiàn)470bp大小的條帶，則待測樣品中含有pcv2病毒；若出現(xiàn)298bp大小的條帶，則待測樣品中含有prv病毒。

進(jìn)一步地，所述復(fù)合pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50.0μl，其中：10×buffer5.0μl、2.0mmmgcl24.0μl、200μmdntps5.0μl、0.1μmpcv2-f11.0μl、0.1μmpcv2-f21.0μl、0.2μmprv-f32.0μl、0.2μmprv-f42.0μl、rtaqdnapolymerase0.5μl、dna模板2.0μl、ddh2o27.5μl。

進(jìn)一步地，所述復(fù)合pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?5℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

有益效果：本發(fā)明提供了用于pcv2和prv同步檢測的兩對特異性引物和復(fù)合pcr檢測方法。通過比對genbank數(shù)據(jù)庫中15種pcv2病毒株、18種prv病毒株的基因共有特征及pcv2orf1、prvgh基因的核苷酸序列，應(yīng)用primerpremier軟件分別設(shè)計(jì)了兩對特異性引物，其gc含量相當(dāng)，退火溫度相近，特異性強(qiáng)，不會產(chǎn)生引物二聚體，并且擴(kuò)增出的pcv2和prv片段大小適當(dāng)，可在瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行明確區(qū)分，便于直觀地觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本發(fā)明通過復(fù)合pcr各技術(shù)參數(shù)的合理設(shè)置，同步檢測pcv2和prv，操作簡單、方便、可公式化，技術(shù)要求低，成本低廉，省時(shí)省力，并且保證了良好的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性，適于臨床推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1所示為本發(fā)明復(fù)合pcr擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果；圖中m為puc19dna/mspιmarker，1為pcv2dna擴(kuò)增產(chǎn)物；2為prvdna擴(kuò)增產(chǎn)物；pcv2dna與prvdna混合模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2所示為本發(fā)明復(fù)合pcr的特異性試驗(yàn)結(jié)果；圖中m為puc19dna/mspιmarker，1為pcv2dna與prvdna混合模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；2為ppvdna擴(kuò)增產(chǎn)物；3為etecdna擴(kuò)增產(chǎn)物；4為appdna擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖3所示為本發(fā)明復(fù)合pcr的敏感性試驗(yàn)結(jié)果；圖中m為puc19dna/mspιmarker，1-8為pcv2dna與prvdna混合模板10^-1-10^-8稀釋倍數(shù)下擴(kuò)增產(chǎn)物。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳述：

實(shí)施例1

(1)引物的設(shè)計(jì)與合成

通過比對genbank數(shù)據(jù)庫中15種pcv2病毒株、18種prv病毒株的基因共有特征及pcv2orf1(seqidno.5)、prvgh(seqidno.6)基因的核苷酸序列，應(yīng)用primerpremier軟件分別設(shè)計(jì)了兩對特異性引物，包括pcv2病毒引物和prv病毒引物。

其中，pcv2病毒引物包括上游引物pcv2-f1和下游引物pcv2-f2；prv病毒引物包括上游引物prv-f3和下游引物prv-f4；pcv2-f1、pcv2-f2、prv-f3和prv-f4的核苷酸序列分別如表1所示。引物由上海生工生物工程有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為470bp和298bp。

表1

(2)病毒基因組dna的提取

分別取pcv2、prv陽性病料各0.1克，置于eppendorf管中，加入te緩沖液1ml，用捻磨棒捻成勻漿，-70℃凍融三次，離心取上清0.2ml，再用病毒dna提取試劑盒提取病毒dna，最后洗脫于50μlte緩沖液中，于-20℃保存。

(3)復(fù)合pcr檢測；

以pcv2dna或prvdna或pcv2dna與prvdna1：1混合作為dna模板，進(jìn)行復(fù)合pcr擴(kuò)增，復(fù)合pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50.0μl，其中：10×buffer5.0μl、2.0mmmgcl24.0μl、200μmdntps5.0μl、0.1μmpcv2-f11.0μl、0.1μmpcv2-f21.0μl、0.2μmprv-f32.0μl、0.2μmprv-f42.0μl、rtaqdnapolymerase0.5μl、dna模板2.0μl、ddh2o27.5μl。

復(fù)合pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?5℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

反應(yīng)結(jié)束后，對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示。1號泳道中擴(kuò)增出一條清晰的目的條帶，約470bp，與預(yù)期大小相當(dāng)；將pcr產(chǎn)物純化回收后，連接到pgem-t載體中克隆、轉(zhuǎn)化、測序，序列分析表明，所克隆的目的dna片段大小為470bp，為預(yù)期擴(kuò)增的目的dna片段，證明樣品中含有pcv2。

2號泳道中擴(kuò)增出一條清晰的目的條帶，約298bp，與預(yù)期大小相當(dāng)；將pcr產(chǎn)物純化回收后，連接到pgem-t載體中克隆、轉(zhuǎn)化、測序，序列分析表明，所克隆的目的dna片段大小為298bp，為預(yù)期擴(kuò)增的目的dna片段，證明待測樣品中含有prv。

3號泳道中同時(shí)擴(kuò)增出兩條清晰的目的條帶，分別約為470bp和298bp，與預(yù)期大小相當(dāng)；將pcr產(chǎn)物純化回收后，連接到pgem-t載體中克隆、轉(zhuǎn)化、測序，序列分析表明，所克隆的目的dna片段大小分別為470bp和298bp，為預(yù)期擴(kuò)增的目的dna片段，證明待測樣品中同時(shí)含有pcv2和prv。

由上可知，本發(fā)明復(fù)合pcr兩對特異性引物gc含量相當(dāng)，引物間交叉反應(yīng)弱，退火溫度均在56℃左右，均可擴(kuò)增出預(yù)期目的片段，特異性強(qiáng)；擴(kuò)增出的pcv2和prv片段大小適當(dāng)，可在瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行明確區(qū)分，便于直觀地觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果；mgcl2、dntps、rtaqdnapolymerase及引物濃度均是綜合考慮擴(kuò)增效率、靈敏度、特異性、穩(wěn)定性等眾多因素設(shè)計(jì)的，可有效檢出pcv2和prv。

實(shí)施例2

用病毒基因組dna試劑盒分別提取豬細(xì)小病毒(ppv)、豬大腸桿菌(etec)、豬胸膜肺炎放線桿菌(app)基因組dna，應(yīng)用實(shí)施例1中所述的復(fù)合pcr引物及方法進(jìn)行擴(kuò)增、電泳，以檢測復(fù)合pcr的特異性。

檢測結(jié)果如圖2所示，pcv2與prv的混合dna能擴(kuò)增出特異性片段，而ppv、etec、app均未擴(kuò)增出片段，由此證實(shí)了復(fù)合pcr擴(kuò)增的特異性。

實(shí)施例3

用紫外分光光度計(jì)測定pcv2dna和prvdna混合模板的濃度，混合dna模板濃度約為1μg/μl，用te緩沖液將混合模板作1:10系列稀釋，每個(gè)稀釋度取2μl作為模板，應(yīng)用實(shí)施例1中所述的復(fù)合pcr引物及方法進(jìn)行復(fù)合pcr擴(kuò)增，電泳，以檢測復(fù)合pcr的敏感性。

檢測結(jié)果如圖3所示，10^-3稀釋倍數(shù)時(shí)仍能擴(kuò)增出470bp和298bp兩條帶，10^-5稀釋時(shí)僅能擴(kuò)增出470bp一條帶。說明復(fù)合pcr能檢測到1ng的prv和0.01ng的pcv2。

實(shí)施例4

將pcv2和prv陽性病料于-70℃保存；兩對特異性引物混合，酶試劑、mgcl2及dntps混合，于-20℃保存。每隔1個(gè)月，將-70℃保存的pcv2和prv陽性病料重新提取dna，取出-20℃保存的復(fù)合pcr反應(yīng)體系的各種混合試劑進(jìn)行pcr擴(kuò)增，共檢測3個(gè)月，以驗(yàn)證復(fù)合pcr的穩(wěn)定性。

3個(gè)月的檢測結(jié)果顯示：每次均能擴(kuò)增出預(yù)期目的片段，且眼觀濃度相當(dāng)，證明了復(fù)合pcr反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。

實(shí)施例5

對浙江省不同地區(qū)的73份臨床疑似病料進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該方法不僅大大節(jié)約檢測時(shí)間而且消耗試劑少，降低污染機(jī)會，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，適于推廣應(yīng)用。檢測中pcv2的陽性檢出率高，達(dá)到57.5％，該陽性檢出率與pcv2的實(shí)際感染率符合程度較高；另外，pcv2與prv混合感染陽性檢出率為6.8％，與實(shí)際的混合感染率相符；由此可見，利于本發(fā)明可有效篩選出豬群中的感染個(gè)體，進(jìn)而及時(shí)防止病毒感染的擴(kuò)散，提高pcv2與prv的病毒防控力度。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限制于本文所示的實(shí)施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干修改和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>杭州師范大學(xué)

<120>一種同步檢測pcv2和prv感染的引物序列及方法

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

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<213>豬圓環(huán)病毒2型

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cc3422