本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物的制備方法，同時還涉及一種土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物的用途。
背景技術(shù)：
：目前在國內(nèi)的促進傷口愈合的藥物有限，且主要以抗炎、止血、保護創(chuàng)面為主,但這些作用只對創(chuàng)傷早期有效，而對真正體現(xiàn)傷口愈合速度的各種組織細胞的增殖作用較少，且大多都有副作用。開發(fā)一種多功能的安全、環(huán)保、副作用小且療效顯著的含有天然活性成分的新型藥物具有深遠的意義。皰疹性口炎是由人類單純皰疹病毒導(dǎo)致的急性炎癥性皮膚黏膜病，由1型單純皰疹病毒引起，感染該病毒的患者出現(xiàn)口腔黏膜、口腔周圍、顏面部皮膚和咽喉部皰疹，還可能感染鼻翼、生殖器等部位，部分患者出現(xiàn)眼部皰疹性角膜炎。該病臨床癥狀帶來生活上不便，產(chǎn)生痛苦，且無特效方法治療，容易復(fù)發(fā)，嚴重者可留色素和輕度疤痕，影響美觀。發(fā)明者從事分枝桿菌研究近30年，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：分枝桿菌，戈登氏菌的細胞壁有著特殊的結(jié)構(gòu)，那就是分枝桿菌多糖(MSP)。它具有明顯的免疫調(diào)節(jié)功能，尤其調(diào)節(jié)細胞的免疫應(yīng)答。本發(fā)明即土生戈登氏菌的全細胞植物油提取物中其氨基酸含量豐富、類胡蘿卜素特別是β-胡蘿卜素含量高，還含有甲基萘醌、黃酮、多糖和豐富的維生素等天然生物活性物質(zhì)，賦予了該提取物促進傷口愈合和抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種功能。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供了一種土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物的制備方法，方法簡單，易行，易于大規(guī)模生產(chǎn)，該細胞提取物具備促進傷口愈合、對皰疹性口炎具有顯著療效的作用。所述的土生戈登氏菌sq-5(Gordonaterraesq-5)保存于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號為CCTCCNO:M2012390。該菌為專利菌種，專利號為:ZL201310016059.5。本發(fā)明的最后一個目的在于提供了一種土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物在制備治療或預(yù)防(促進)傷口愈合、燒傷、燙傷和/或治療皰疹性口炎等藥物中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用包括但不限于用于制備促進傷口愈合和/或治療皰疹性口炎等的藥物。該提取物其氨基酸含量豐富、類胡蘿卜素特別是β-胡蘿卜素含量高，還含有甲基萘醌、黃酮、多糖和豐富的維生素等天然生物活性物質(zhì)，能有效促進傷口愈合,對皰疹性口炎具有明顯的治療效果。本發(fā)明綠色環(huán)保,基本沒有副作用。為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：一種土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物，包括以土生戈登氏菌sq-5為原料，利用本領(lǐng)域的常規(guī)方式，用植物油對土生戈登氏菌sq-5進行浸提獲得的上清。一種土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物的制備方法，其步驟是：A、菌種培養(yǎng)：斜面種子培養(yǎng)基察氏培養(yǎng)基，將凍干種子sq-5(專利號為:ZL201310016059.5)接種于茄子瓶斜面，28－32℃培養(yǎng)3天。檢查無雜菌，生長健壯，均勻，用無菌水轉(zhuǎn)入接種瓶。B、種子罐培養(yǎng)：將上述A中接種瓶種子轉(zhuǎn)入種子罐，培養(yǎng)溫度28－32℃，通氣量1:0.6－0.8，自動流加泡敵，培養(yǎng)30－35h，取樣鏡檢，合格后備用。C、發(fā)酵罐培養(yǎng)：以5－10％的接種量將上述B中培養(yǎng)好的種子罐種子液打入發(fā)酵罐，通氣量1:0.8，自動流加泡敵，28－32℃培養(yǎng)48－52h，菌體單個球桿狀，菌數(shù)108－1010個/ml，停止發(fā)酵。D、將上述C中培養(yǎng)好的發(fā)酵液100℃煮沸滅活后濃縮，濃縮物108－112℃烘干收集菌體，粉碎過篩(120目)，得到土生戈登氏菌全細胞菌粉。E、植物油浸提：將上述D中收集的土生戈登氏菌全細胞菌粉1－3份，植物油(大豆油或芝麻油)98－102份于80℃浸提4－5h，浸提完后于6500r/min離心10min收集上清液獲得土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物。所述的種子罐和發(fā)酵罐發(fā)酵用培養(yǎng)基配方：一種土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物在制備治療或預(yù)防(促進)傷口愈合、燒傷、燙傷和/或治療皰疹性口炎等藥物中的應(yīng)用，其步驟是：A、將上述土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物無菌罐裝制成油劑用于治療皰疹性口炎的藥物。B、將上述土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物無菌罐裝制成油劑用于治療創(chuàng)傷(包括手術(shù)傷口、燒傷和燙傷等)的藥物。C、將上述土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物作為藥品原料用于制成包括但不限于治療創(chuàng)傷和皰疹性口炎的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果：分枝桿菌，戈登氏菌的細胞壁有著特殊的結(jié)構(gòu)，那就是分枝桿菌多糖(MSP)，本發(fā)明涉及的土生戈登氏菌的脂多糖含有50個碳原子的不飽和脂肪酸使其生理活性更強，其包含有阿拉伯糖和半乳糖，二者以3:1形式連接，而阿拉伯糖的呋喃糖殘基則是免疫決定簇，因而賦予了這類菌特殊的免疫調(diào)節(jié)功能和非特異性抗感染功能。有資料證明氨基酸在傷口愈合中起著重要的作用；維生素A在傷口愈合的炎癥期有積極的作用,促進或有助于膠原的形成、血管再生和上皮的形成,增強傷口和吻合口愈合的張力；黃酮類物質(zhì)有抑制炎性生物酶的滲出，可以增進傷口愈合和止痛，由于具有強抗組織胺性，可用于各類敏感癥。本發(fā)明為土生戈登氏菌全細胞植物油提取物，其提取物中含有豐富的脂溶性復(fù)合氨基酸和以β-胡蘿卜素為主的類胡蘿卜素，β-胡蘿卜素為維生素A的前體物質(zhì)，且提取物還含有黃酮、甲基萘醌、多糖、維生素等多種天然抗氧化因子賦予該提取物很好的皮膚營養(yǎng)、生肌、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等功能，而且脂溶性物質(zhì)具有其自身的優(yōu)點：1、脂溶性物質(zhì)更容易透過皮膚被皮膚吸收而發(fā)揮生理作用。2、油脂不容易污染無需添加防腐劑更安全，無刺激性。3、油脂本身可以隔離空氣可減少傷口及炎癥的進一步感染。土生戈登氏菌全細胞植物油提取物中營養(yǎng)全面，多種生理活性因子有機和諧地在一個生命體系之中通過協(xié)同作用有利于機體對營養(yǎng)物的吸收和生理效應(yīng)的發(fā)揮，而培養(yǎng)物中維生素都以微量或超微量形式存在更加有效的發(fā)揮其生理活性而無副作用。土生戈登氏菌全細胞培養(yǎng)物經(jīng)急性毒性試驗為無毒級類物質(zhì)，三項致突變試驗(小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗，小鼠精子畸形試驗，Ames試驗)結(jié)果均為陰性。本發(fā)明的原料來源廣泛，工藝簡單易操作適合大規(guī)模生產(chǎn)，本發(fā)明產(chǎn)品原料安全性高且環(huán)保幾乎無污染。具體實施方式本發(fā)明的實施例中的實驗方法或條件，如未特別說明均為常規(guī)方案。實施例1：一種土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物的制備方法，其步驟是：A、菌種培養(yǎng)：斜面種子培養(yǎng)基察氏培養(yǎng)基，將凍干種子sq-5(專利號為:ZL201310016059.5)接種于茄子瓶斜面，28或29或30或31或32℃培養(yǎng)3天。檢查無雜菌，生長健壯，均勻，用無菌水轉(zhuǎn)入接種瓶。B、種子罐培養(yǎng)：將上述A中接種瓶種子轉(zhuǎn)入種子罐，培養(yǎng)溫度28或29或30或31或32℃，通氣量1:0.6或0.7或0.8，自動流加泡敵，培養(yǎng)30或32或34或35h，取樣鏡檢，合格后備用。C、發(fā)酵罐培養(yǎng)：以5％或7％或9％或10％的接種量將上述B中培養(yǎng)好的種子罐種子液打入發(fā)酵罐，通氣量1:0.8，自動流加泡敵，28或29或30或31或32℃培養(yǎng)48或50或52h，菌體單個球桿狀，菌數(shù)108或109或1010個/ml，停止發(fā)酵。D、將上述C中培養(yǎng)好的發(fā)酵液100℃煮沸滅活后濃縮，濃縮物108或109或110或111或112℃烘干收集菌體，粉碎過篩(120目)，得到土生戈登氏菌全細胞菌粉。E、植物油浸提：將上述D中收集的土生戈登氏菌全細胞菌粉1或2或3份，植物油(大豆油或芝麻油)98或99或100或101或102份于80℃浸提4或5h，浸提完后于6500r/min離心10min收集上清液獲得土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物。所述的土生戈登氏菌sq-5保存于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號為CCTCCNO:M2012390。該菌為專利菌種，專利號為:ZL201310016059.5。所述的種子罐和發(fā)酵罐發(fā)酵用培養(yǎng)基配方：實施例2：一種土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物在制備治療或預(yù)防(促進)傷口愈合、燒傷、燙傷和/或治療皰疹性口炎等藥物中的應(yīng)用，其步驟是：A、將上述土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物無菌罐裝制成油劑用于治療皰疹性口炎的藥物。B、將上述土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物無菌罐裝制成油劑用于治療創(chuàng)傷(包括手術(shù)傷口、燒傷和燙傷等)的藥物。C、將上述土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物作為藥品原料用于制成治療但不限于創(chuàng)傷和皰疹性口炎的藥物。實施例3：土生戈登氏菌sq-5全細胞菌粉抗氧化功能的實驗：實驗動物：12月齡的昆明種雄性小鼠40只，體重為18-20g，對照組20只，實驗組20只，CK組用蒸餾水灌胃，實驗組用土生戈登氏菌sq-5全細胞菌粉0.01g/kg灌胃，連續(xù)喂養(yǎng)30日后用動物眼球取血分離血清，處死動物取肝臟作勻漿，制備1％肝勻漿作SOD酶的測定(每組有5個平行實驗)采用羥胺法(試劑盒為南京建成生物工程公司)。實驗結(jié)果見表1、表2。表1土生戈登氏菌sq-5細胞菌粉顯著增加小鼠血清SOD酶活性(u/ml)。12345CK組86.9103.1131.5152.1129.6實驗組203.4217.4227.6257.2266.15個實驗組與CK組比P<0.01，表明該菌粉具有明顯的抗氧化功能。表2土生戈登氏菌sq-5細胞菌粉顯著增加小鼠1％肝勻漿SOD酶活性(u/ml)12345CK組138.0160.1196.7210.9233.5實驗組331.6369.5389.7432.2483.85個實驗組與CK組比P<0.01，表明該菌粉具有明顯的抗氧化功能。實施例4：土生戈登氏菌sq-5全細胞培養(yǎng)物毒理學(xué)實驗，其步驟是1、小鼠急性毒性試驗：試驗動物：昆明種小鼠18-20只，雌雄各10只。實驗方法：取受試物0.2ml/10g.BW經(jīng)口灌胃，灌胃前停食16hr，連續(xù)觀察一周，并記錄動物中毒癥狀及死亡情況。結(jié)果見表3。表3小鼠急性毒性試驗結(jié)果結(jié)論：一周內(nèi)動物未見明顯中毒癥狀及死亡發(fā)生，一次灌胃濃度達20ml/Kg.BW，按急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，該受試物屬于無毒級類物質(zhì)。2、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗：試驗動物：昆明種小鼠25-27g，雌雄各30只。試驗方法：受試物配制同急性毒性試驗，動物按體重隨機分成6組，A組為陰性對照組；F組為環(huán)磷酰胺陽性對照組；B、C、D、E組為受試物組，受試物劑量分別為5.0、10.0、15.0、20.0g/Kg.BW。每只動物經(jīng)口灌胃0.1ml/10g.BW，陰性對照組給予蒸餾水，兩次灌胃間隔24hr，第二次灌胃6hr后，處死動物，取胸骨骨髓涂片，Giemsa染色。每只動物油鏡下觀察1000個嗜多染紅細胞，記錄出現(xiàn)微核的嗜多染紅細胞數(shù)，結(jié)果見表4。表4骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結(jié)果結(jié)論：受試物各劑量組雌雄性別微核率與陰性對照組比較，均在本實驗室測定值正常范圍內(nèi)，且無顯著性差異(P＞0.05)，表明該受試物骨髓微核試驗結(jié)果為陰性。3、小鼠精子畸形試驗：試驗動物：昆明種雄性小鼠，23-25g，共30只。試驗方法：按體重隨機分成5組，A組為陰性對照組；E組為環(huán)磷酰胺陽性對照組，B、C、D組為受試物組，受試物劑量分別為10.0、15.0、20.0ml/Kg.BW，陰性對照組給予蒸餾水，連續(xù)5天經(jīng)口給予，再繼續(xù)喂養(yǎng)30天，處死動物，取兩側(cè)副睪涂片，伊紅染色。每只動物高倍鏡下觀察1000個精子，記錄畸形精子數(shù)。結(jié)果見表5。表5小鼠精子畸形試驗結(jié)果結(jié)論：受試物各劑量組與陰性對照組結(jié)果比較差異無顯著性(P>0.05)，表明該受試物精子畸形試驗結(jié)果為陰性。4、Ames試驗：試驗菌株采用經(jīng)鑒定符合生物要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株菌株進行試驗。采用多氯聯(lián)苯(PCB)誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿作為體外活化系統(tǒng)(+S9)。受試物分為三個劑量組，原液稀釋1000倍為低劑量組，原液稀釋100倍為中劑量組，原液稀釋10倍為高劑量組，121℃、20min滅菌處理，每皿加入量為0.5ml。同時設(shè)置空白及陽性對照組。采用平板摻入法記錄二次重復(fù)的平行樣品結(jié)果。結(jié)果見表6。表6Ames試驗結(jié)果(個/皿，)注：-S9陽性對照組為2、4、7-TNFone加入量為0.3ug/皿+S9陽性對照組為2-AF加入量為20ug/皿結(jié)論：受試物各組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變數(shù)2倍，且無劑量反應(yīng)關(guān)系，故Ames試驗結(jié)果為陰性。實施例5：土生戈登氏菌sq-5全細胞菌粉對小鼠免疫功能影響，其步驟是：實驗動物為昆明種雄性小鼠62只，體重為20±2g，隨機分成四組，蒸餾水+飼料組(CK)20只，分別在飼料中加土生戈登氏菌粉0.0001g，0.001g，0.01g各14只，連續(xù)喂養(yǎng)14天，于第15天進行脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-2、TNF及胸腺重量的實驗，其結(jié)果見表7和表8。表7土生戈登氏菌sq-5菌粉對脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化影響組別小鼠個數(shù)N生理鹽水conA誘導(dǎo)CK203800±43711258±17130.0001148343±40218307±31430.0011411286±231724532±43150.011412688±130229563±2811三個計量組與CK組比P＜0.01，顯著增加小鼠的脾淋巴細胞的轉(zhuǎn)化。表8土生戈登氏菌sq-5對小鼠IL-2、TNF及胸腺重量的影響各劑量組與CK組比P＜0.01由此說明土生戈登氏菌粉明顯提高脾淋巴細胞的轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生IL-2水平得以提高顯著，并能顯著提高腹腔巨噬細胞誘導(dǎo)TNF的能力，明顯增加小鼠胸腺的重量，也就是說該藥劑可以提高小鼠的免疫功能。實施例6：土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物治療皰疹性口炎的實驗，其步驟是：采用上述實施的生物藥油，在市級以上醫(yī)院選出診斷為口腔皰疹的患者20例，其中男8例，女12例進行試驗。給予對照組患者皮損處3％阿洛昔韋軟膏每日6次涂抹，1次/2h，連續(xù)涂抹1周；給予實驗組患者皮損處土生戈登氏菌全細胞植物油提取物涂抹，每日3次。連續(xù)涂抹1周。所有患者在治療期間禁止內(nèi)服或外敷任何其他抗病毒藥物。其結(jié)果見表9.表9兩組口腔皰疹患者不同藥物治療療效統(tǒng)計表組別例組止皰/d結(jié)痂/d脫痂/d總病程/d試驗組101.5±0.352.5±0.55.5±0.355.8±0.5對照組103.03±0.255.10±1.136.22±1.206.7±1.35試驗組在止皰、結(jié)痂、脫痂、總病程都優(yōu)于對照組。實施例7：土生戈登氏菌sq-5的全細胞植物油提取物治療手術(shù)傷口的實驗，其步驟是：采用上述實施的生物藥油，在市級以上醫(yī)院應(yīng)用土生戈登氏菌全細胞植物油提取物進行促進傷口愈合試驗，隨機選取50例剛做完手術(shù)縫完針的手術(shù)患者，觀察組25例，對照組25例。觀察組：在常規(guī)縫合切口后應(yīng)用土生戈登氏菌全細胞植物油提取物抹切口上，每日兩次，隔天觀察；對照組：常規(guī)治療。觀察結(jié)果見表10。表10兩組患者愈合不良率比較(例，％)觀察組愈合不良率4.00％少于對照組愈合不良率12.00％，且在試驗過程中發(fā)現(xiàn)試驗組的傷口愈合速度優(yōu)于對照組。當(dāng)前第1頁1 2 3