專利名稱：：禽流感病毒、疫苗、組合物、制劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：一^:而言，本發(fā)明涉及流感疫苗，更具體地講，涉及用于接種易感禽類的禽流感疫苗及其制劑。本發(fā)明也涉及預防或改善家禽的禽流感病毒病的l/t方法。相關(guān)技術(shù)的描述流感病毒中最著名的是曱型流感病毒和乙型流感病毒，它們是殃及全球的致病和致死的重要原因，每年都引起疾病爆發(fā)。大流行周期性、但間隔不規(guī)則地發(fā)生，引起特別高的致病率和死亡率。從歷史上看，大流行是甲型流感病毒新亞型的結(jié)果，這是由分節(jié)段基因組重配(抗原性轉(zhuǎn)變)產(chǎn)生的，同時每年的流行通常是甲型流感病毒和乙型流感病毒的表面抗原進化(抗原性漂移)的結(jié)果。人類流感病毒通常起源于禽流感病毒林，所以流感感染在此基礎上是人畜共患病。也有證據(jù)表明，豬可作為產(chǎn)生對人類具有致病性的新型禽源性毒林的中間宿主("混合渠道(mixingvessel)")(Scholtissek等，Virology1985,147:287)。1997年香港的H5N1曱型流感爆發(fā)表明，高致病性曱型流感病毒也可直接從禽類傳播到人類(Claas等，Lancet1998，351:472;Suarez等,J.Virol.1998,72:6678;Subbarao等，Science1998，279:393;Shortridge,Vaccine1999，17(增刊1):S26-S29)。在2003年，東南亞的H5N1病毒包含不同的共同流行的基因型，但是在2004年，卻僅有一種基因型(稱為"Z-基因型")占優(yōu)勢(Li等，Nature2004,430:209)。目前的證據(jù)表明，人類致死事件是由于該基因型從鳥到人的直接傳播，而且它也感染貓，由貓-貓直接傳播(Kuiken等，Science2004，306:241)。這些和其它有關(guān)該病毒宿主范圍和傳播分布發(fā)生變化的證據(jù)的出現(xiàn)，關(guān)系到H5N1病毒可能獲得允許人-人傳播的特性。人類對這樣的新型H5N1病毒沒有免疫力，所以可引起災難性的流感大流行(Fouchier等，Nature2005，435:419)。曱型流感病毒從大量的動物宿主流行毒抹中產(chǎn)生新致病性毒林的潛力表明，疾病控制需要監(jiān)測這些病毒并開發(fā)改進的抗病毒療法和疫苗。在這樣的監(jiān)測工作中，需要警惕新病毒株發(fā)展的速度，包括改進技術(shù)，用于評價疫苗對新毒抹的功效。禽流感也稱為"AI"，是雞和其它家禽的急性高感染性病毒感染。可根據(jù)血凝素(HA;也可縮寫為H)和神經(jīng)氨酸酶(NA;也可縮寫為N)分子的抗原差異，將流感病毒分為不同亞型，這兩類分子在不同季節(jié)可以"重配(reassort)"或"突變(mutate)"。因為病毒不斷突變，無法預見下一季節(jié)哪種毒抹將會出現(xiàn)，所以其疫苗難以制備。疫苗制備用毒林在生產(chǎn)條件下通常不能迅速繁殖，所以如果等待特定毒林出現(xiàn)，然后再生產(chǎn)正確疫苗用于抵抗該菌株，這樣的方案是不可行的。通常，特定毒抹的流行將會持續(xù)數(shù)月，然后可能消失數(shù)年。根據(jù)病毒的分組抗原(groupantigen)，可將流感病毒分為曱型、乙型和丙型。曱型、乙型和丙型流感病毒的區(qū)別在于病毒核殼(NP)和基質(zhì)(M)蛋白的抗原差異。根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原差異，將曱型流感病毒分為不同亞型。已經(jīng)鑒定出神經(jīng)氨酸酶NA蛋白的9種亞型(稱為NA1至NA9)和血清血凝素HA蛋白的15種不同亞型(稱為HA1至HAl》。在鳥類，已經(jīng)分離出各自攜帶不同HA(或H)和NA(或N)亞型的病毒。正粘病毒科(CW/2omjaowWcfee)中的甲型、乙型和丙型流感都具有分節(jié)段負鏈RNA基因組，可以在受感染細胞的細胞核中復制，具有組合編碼容量約13kb，并含有IO種病毒蛋白質(zhì)的遺傳信息。具體地講，流感病毒具有8條負義RNA(nsRNA)基因區(qū)段，編碼至少10種多肽，包括RNA指導的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)、核蛋白(NP)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、血凝素(HA,其經(jīng)酶切后由亞基HA1和HA2締合而成)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)(Krug等，載于TheInfluenzaViruses,R.M.Krug編著,PlenumPress,NewYork,1989,第89-152頁)。目前開發(fā)的反求遺傳學系統(tǒng)允許操縱流感病毒基因組(Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996，93:11354;Neumann和Kawaoka,Adv.VirusRes.1999,53:265;Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999,96:9345;Fodor等，J.Virol.1999，73:9679)。例如，已經(jīng)證明質(zhì)粒驅(qū)動的8個流感nsRNA自polI啟動子的表達和聚合酶復合蛋白的共表達，導致形成感染性曱型流感病毒(Hoffmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2000，97:6108)。流感病毒的病毒顆粒大小約為125nm,由與核蛋白締合的負義病毒RNA核心、圍繞脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的病毒包膜組成。病毒包膜內(nèi)層主要由基質(zhì)蛋白組成，外層含有大部分來自宿主的脂質(zhì)材料。所謂"表面蛋白，，、神經(jīng)氨酸酶(NA)和血凝素(HA)在病毒體表面呈釘狀。新流感病毒的感染性取決于特異性宿主蛋白酶對HA的切割，而NA又參與后代病毒粒子從細胞表面的釋放并能阻止新產(chǎn)生的病毒的聚集。埋在病毒包膜中的HA和NA蛋白是流感病毒的主要抗原決定簇(Air等，Structure,Function,andGenetics,1989,6:341-356;Wharton等,載于TheInfluenzaVims，R.M.Krug編著，PlenumPress,NewYork,1989，第153-174頁)。因為流感分節(jié)段基因組重酉己(reassortment)，新的HA和NA變異體不斷產(chǎn)生，新感染的生物體對它們沒有記憶的免疫應答。HA糖蛋白是中和抗體的主要抗原，參與病毒顆粒與宿主細胞受體的結(jié)合。6不同病毒抹的HA分子在核酸水平和氨基酸水平上都表現(xiàn)出明顯的序列相似性。當對不同亞型的毒林進行比較時，這種相似性水平不同，某些毒林明確表現(xiàn)出比別的毒林更高水平的相似性(Air,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981,78:7643)。一種亞型的病毒林與其它亞型的病毒抹之間氨基酸相似性水平不同(Air，Proc.Natl,Acad.Sci.USA,1981,78:7643)。這種變異足以建立起不連續(xù)的亞型和不同毒抹的進化譜系，但是使用常規(guī)生物信息學技術(shù)，仍可容易地對不同毒株的DNA序列和氨基S^f列進行比對(Air,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981,78:7643;Suzuki和Nei,Mol.Biol.Evol.2002,19:501)。KA是一種病毒表面糖蛋白，由約560個氨基酸組成，代表25%的總病毒蛋白。它主要負責感染早期的病毒顆粒粘附并穿透宿主細胞。在病毒蛋白質(zhì)中，血凝素主要經(jīng)歷翻譯后的重排。血凝素合成完成后，該分子按照宿主細胞的胞外途徑(HA即按此途徑進行折疊)，裝配成三聚體并且糖基化。最終，HA切割成兩個亞基即Hi和H2;這活化了該分子并提高病毒顆粒的感染力。對于許多禽類而言，切割位點內(nèi)堿性氨基酸序列上的差異關(guān)系到禽流感病毒產(chǎn)生局部有癥狀的感染或具有致命結(jié)果的全身感染的能力。因此提出，該特征在影響病毒的器官趨向性、宿主特異性及其致病性方面可能很重要。就病毒的致病性而言，具有多堿基位點HA的毒抹發(fā)現(xiàn)在若干細胞類型中切割HO分子(呈活性狀態(tài)的Hi和H2)的蛋白酶，因而發(fā)生多感染循環(huán)，大量產(chǎn)生感染性病毒顆粒并在短時間內(nèi)引起所有區(qū)域普遍感染(HPAI抹)。因此，感染具有急性-過急性進程，并有4艮高的死亡率。神經(jīng)氨酸酶(NA)是曱型流感病毒的第二種膜糖蛋白。NA是一種413個氨基酸的蛋白質(zhì)，由1413個核苷酸的基因編碼。NA參與破壞病毒血凝素的細胞受體，即通過將唾液酸分子與血凝素本身切割開來。據(jù)信這樣可能容易釋放病毒后代，即通過阻止新形成的病毒顆粒在細胞膜累積，以及通過促進病毒通過粘膜表面的粘液進行轉(zhuǎn)運。NA是重要的抗原決定簇，它可能經(jīng)歷抗原性變異。目前公共衛(wèi)生行政機構(gòu)批準用于美國和歐洲的流感疫苗是滅活流感疫苗以及美國的減毒FLUMIST活疫苗。在雞胚中培養(yǎng)流行病學上重要的曱型流感病毒林和乙型流感病毒抹，然后純化病毒顆粒并經(jīng)化學方法滅活，得到疫苗母液。世界衛(wèi)生組織(WHO)每年都要選擇當年最有可能流行的亞型進行疫苗開發(fā)。盡管自1940年代早期流感疫苗已用于人類接種，而且自1960年代后期用于馬的接種，但是由于存在著廣泛的動物宿主，以及能引起大流行的新流感病毒出現(xiàn)的威脅，促使人們研究對抗病毒的新療法。在過去幾年里，流感領(lǐng)域出現(xiàn)若干重要進展(有關(guān)綜述參見Cox和Subbarao，Lancet1999，354:1277-82)。例如，一種實驗性的鼻內(nèi)給藥的三價減毒活流感疫苗在保護幼童免遭曱型流感H3N2和乙型流感感染方面表現(xiàn)出高度有效性。改進目前的(死)流感病毒疫苗功效的其它方法還包括產(chǎn)生冷適應性和含有特定減毒突變的遺傳工程流感病毒(有關(guān)綜述參見Palese等，J.Infect.Dis,，1997,176增刊l:S45-9)。人們希望，這些遺傳改變的病毒(其中來自流行株的HA基因和NA基因經(jīng)重配結(jié)合)可用作安全的活流感病毒疫苗，以誘導人體長期持續(xù)的保護性免疫應答。盡管冷適應性疫苗看來對兒童和青年人有效，但對年長者而言，它們過分減毒，以至不能刺激理想的免疫應答，在美國，每年都有20000~40000人死于流感感染。容易得到的疫苗將對出現(xiàn)的大流行性流感提供最有效的工具。在1997年香港爆發(fā)H5N1之后，已有由兩種不同方法生產(chǎn)的疫苗在人群中進行過試驗。常規(guī)用A/鴨/新加^/3/97(A/duck/Singapore/3/97)生產(chǎn)的亞單位H5疫苗對人的免疫原性差，甚至對抗原性密切相關(guān)的毒株也很差，而且在多次接種后仍然很差(Nicholson等，Lancet2001,357:1937;Stephenson等，JournalofInfectiousDisease2005，191:1210)。使用佐劑MF59可增加該H5疫苗的抗體效價(St印henson等，Vaccine2003，21:1687)。用來自非致病性A/鴨/HK/836/80(H3N1)病毒的滅活"裂解"疫苗和來自A/HK/156/97(H5N1)病毒的修飾H5血凝素進行接種，僅誘導出可檢測的中和抗體效價(Takada等，JournalofVirology1999,73:8303)。因此，盡管這些H5N1疫苗都具有良好耐受性，但是它們看來免疫原性差。目前缺乏有效針對H5N1病毒林的疫苗，所以..這些病毒具有引起大流行性疾病的威脅。血清抗體效價方法是測定接種或病毒感染后的免疫保護性的可接受的替代方法。主要采用的血清抗體效價方法是病毒中和效價測定和血凝素抑制(ffl)效價測定。這些測定是根據(jù)在體外條件下人血清中的流感抗體與抗原交叉反應的能力。在特定情況下，對于各類測定，不僅要根據(jù)其提供穩(wěn)定而有用結(jié)果的能力，而且要根據(jù)其使用的簡便性和對設備的要求，來選擇測定方法。簡而言之，病毒中和測定就是檢測血清樣品中的抗體阻斷流感病毒感染培養(yǎng)細胞的能力。測定進行如下制備血清樣品的系列稀釋液(效價)，再將每種這樣的稀釋液與標準量的感染性病毒混合。然后將各稀釋混合物與特定細胞培養(yǎng)物混合，測定所得感染率。病毒中和效有用而可靠的試驗方法。然而，這依賴于專業(yè)化的細胞培養(yǎng)設備，因此無法普遍應用。其方法也是費力而耗時，因而不太適合篩選大量樣口ao血凝素抑制(HI)測定同樣也是檢測血清樣品中的抗體與標準化參考病毒結(jié)合的能力。該測定是基于這一事實流感病毒與紅細胞結(jié)合并使之凝集。在HI測定中，將血清樣品系列稀釋液與標準量的參考病毒混合，經(jīng)過設定的孵育周期后，加入到紅細胞中。然后目測參考病毒與紅細胞締合形成復合物。抑制血凝素的血清最高稀釋度就是血凝素抑制效價。盡管疫苗免疫原性不如其它測定敏感，但是HI測定因其技術(shù)和實驗室要求相對簡單而被廣泛應用。目前亞洲H5N1高致病性禽流感已經(jīng)殃及亞洲大部分地區(qū)并進入歐洲和非洲。它同時殃及許多東南亞國家的鄉(xiāng)村雞只和商品化雞只，這不同于過去在其它家禽(例如鴨和火雞)和野生水禽中致病和致死的H5禽流感。需要能預防感染和疾病并用于各種禽類的有效疫苗，供野外使用(fielduse)。在傳統(tǒng)上，對高致病性禽流感(HPAI)在家禽中爆發(fā)的重要控制策略就是通過限制運動并樸殺受感染和處于危險狀態(tài)的鳥類而根除之。然而，由于目前亞洲H5N1病毒在鄉(xiāng)村家禽(包括鴨和火雞)以及野生物種(尤其是遷徙鳥類)中廣泛存在，所以必須考慮改變控制策略，其中疫苗看來是關(guān)4定因素。目前用于禽流感的市售疫苗是油乳劑死病毒疫苗，其主要用于控制雞和火雞的流行性低致病性禽流感(LPAI)，或巴基斯坦和墨西哥的HPAI爆發(fā)。Halvorson，AvianPath.31:5-12(2002);Naeem,Proceedingsofthe她InternationalSymposiumonAvianInfluenza31-35.(Athens,Georgia,USA,1998);Swayne和Suarez，Rev.Sci.Tech.Off.Int.Epiz.19:463-482(2000)。死疫苗和重組雞痘疫苗目前都用于控制墨西哥的低致病性禽流感。同上。歐盟已經(jīng)批準使用滅活油乳劑疫苗用于意大利，只要它們能夠區(qū)分接種的鳥類和感染的鳥類。Capua等，AvianPath.32:47-55(2002)。盡管已經(jīng)證明，滅活油乳劑疫苗能夠阻斷H7N7(VanderGoot等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:18141-18146(2005))或目前的H5N1HPAI(Ellis等，AvianPath.33:405-412(2004))的傳播，但是仍然要考慮的是，這些疫苗在野外上可能沒有100%的功效而且完全不能阻止病毒釋放。另外，其使用也不能區(qū)分接種的鳥類和感染的鳥類，這干擾了對群體內(nèi)和地區(qū)內(nèi)疾病狀態(tài)的監(jiān)控；而且也不能配制或測試它們在鴨子中的接種功效。亞洲H5N1病毒在雞胚中不能培養(yǎng)至高效價，而這本是人用和禽用流感疫苗的病毒生產(chǎn)的傳統(tǒng)方法。因此，同類病毒疫苗的替代方法正在開發(fā)之中?；畹妮d體疫苗可提供額外的安全性并能區(qū)分感染的鳥類和已接種的鳥類。已經(jīng)評價了表達H5的禽痘病毒(Qiao等，AvianPath.32:25-31(2003)、傳染性喉氣管炎病毒(infectiouslaryngotracheitisvirus)(Luschow等，Vaccine19:4249-4259(2001)和腺病毒(Gao等，J.Virol.80:1959-1964(2006))的載體，顯示出具有保護性功效，能減少但不能完全消除病毒釋放。其它流感病毒抹(尤其是那些共享H5血凝素型、但具有不同神經(jīng)氨酸酶的毒林)已經(jīng)在野外顯示出具有某些功效(Ellis等，AvianPath.33:405-412(2004))，但是最有前途的方法還是使用反求遺傳學，以產(chǎn)生在遺傳背景中具有現(xiàn)有H5的流感病毒，從而能夠在雞胚中培養(yǎng)至高效價，但對禽類或哺乳動物卻僅有^氐致病性。反求遺傳學已用于產(chǎn)生流感病毒重配株，其具有來自人H5N1分離抹即A/HK/491/97(Subbarao等，Virol.305:192-200(2003》或禽H5N1分離林即A7鵝/廣東/96(A/Goose/Guangdong/96)(Tian等，Virol.341:153-162(2005)的血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因。這兩種重配抹對雞都沒有致病性，而且已經(jīng)將具有來自A/鵝/廣東/96的H5和Nl的重配病毒配制成福爾馬林滅活制劑，用于在無特定病原體(SPF)的雞、和非SPF的鵝和鴨中測試針對親本HPAIH5N1的保護性功效。這些研究證明，重配疫苗可防止死亡并減少攻擊病毒的釋方欠。重配疫苗中包含不同神經(jīng)氨酸酶亞型，允許區(qū)分感染的鳥類和已接種的鳥類。使用來自H5和H7LPAI病毒的血凝素基因和其余基因(包括來自A/WSN/33的Nl)的重配林，已證明了這一原則(Lee等，Vaccine22:3175-3181(2004》。具有這些重配林的油乳劑疫苗在SPF雞中減少了親本H5和H7LPAI抹的復制。已經(jīng)構(gòu)建了具有來自A/鵝/香港/437-4/99(A/Goose/HongKong/437-4/99)的H5和來自A/鴨/德國/1215/73(A/Duck/Germany/1215/73)的N3的重配病毒(Liu等，Virol.314:580-590(2003))。當配制成油乳劑時，疫苗能夠保護受到HPAIH5N1病毒攻擊后的SPF雞，使其免于死亡。在適當?shù)囊呙鐒┝肯?，在鳥類體內(nèi)未檢測到攻擊病毒。假設反求遺傳學流感疫苗可用于這些"DIVA"方法，其中給予ii疫苗，所迷疫苗具有的N不同于這些鳥所接種的病毒林，因而便于區(qū)分接種動物和感染鳥類。已公布的PCTWO03/086453(通過引用全部相對于從天然存在的病毒抹制備的常規(guī)疫苗而言，反求遺傳學疫苗提供大量明顯的優(yōu)勢。通過反求遺傳學技術(shù)，可將A病毒的特定基因用B病毒的相應基因替代。另外，還可修飾這些基因以降低病毒致病性，同時保留所得疫苗的保護性。迫切需要基于現(xiàn)有亞洲H5N1林并克服這些困難而用于各種家禽的疫苗，以提供根除感染群體的替代方法。對這類禽流感病毒疫苗的要求是它們(a)在接種禽類中能誘導快速免疫應答，和(b)能區(qū)分已接種的鳥類和感染的鳥類。因此，需要改進的禽流感疫苗，所述疫苗不僅誘導快速免疫應答和更高效價的反應，而且還能產(chǎn)生消殺效果(sterilizingeffect),阻止攻擊病毒的生長、釋放和向其它易感物種的傳播。發(fā)明概述本發(fā)明達到了這些和其它相關(guān)要求，即通過提供重配禽流感病毒和禽流感疫苗，提供包含一種或多種禽病毒和/或疫苗的組合物，提供其制劑，并提供本發(fā)明禽病毒和/或疫苗、組合物、和/或制劑的使用方法，其中病毒和疫苗包含來自高致病性禽流感病毒的HA基因、來自低致病性禽流感病毒的NA基因、以及包含來自低致病性禽流感病毒的其余禽流感病毒基因的病毒骨架。本文所公開的低致病性禽流感病毒和疫苗能有效預防或改善禽流感，并提供額外的益處，即它們能阻止攻擊流感病毒的生長、釋放和/或向其它物種的傳播。因此，本發(fā)明的低致病性禽流感病毒和疫苗包含來自第一種H5禽流感高致病性毒抹的HA部分；來自第二種低致病性毒株的NA部分，其中所述第二種低致病性毒^^具有與HA部分所來源的病毒不同的N亞型；以及選自低致病性病毒的其余病毒基因組，其中所述低致病性病毒與N部分所來源的病毒相同或不同。在某些實施方案中，HA部分來源于H5禽流感高致病性毒抹，其在本文中實例是H5N1亞洲株，稱為A/雞/越南/C58/04(A/chicken/Vietnam/C58/04)。在其它實施方案中，NA部分來源于第二種低致病性毒抹，其具有與HA部分所來源的病毒不同的NA亞型。通常，NA亞型來自具有N3、N5或N9亞型的歐洲或美洲譜系毒^^。本文的實例是重配H5N3禽流感病毒，其中N3基因來源于^f氐致病性H2N3禽流感病毒抹，稱為A/DK/德國/1215/73。在另一些實施方案中，其余病毒基因組選自低致病性病毒，其在本文中的實例是低致病性禽流感病毒，稱為A/波多黎各/8/34H1N1(A/PuertoRico/8/34H1N1)。因此，本文的實例是重配H5N3禽流感病毒和疫苗，所述病毒和疫苗包含HAH5基因，其來自目前致病性亞洲爆發(fā)抹A/Ck/越南/C58/04(H5N1);NAN3基因，其來自低致病性毒林A/DK/德國/1215/73(H2N3)，這便于與野生型感染(N1)區(qū)分開來；和禽流感骨架，其來自低致病性毒抹A/波多黎各/8/34(H1N1)，該毒林已充分表征并且是對人或動物無致病性的安全的病毒。在已公布的PCTWO01/083794(通過引用全部結(jié)合到本文中)詳細介紹了H5N3反求遺傳學病毒的構(gòu)建方法。本文所述的H5N3禽病毒疫苗構(gòu)建體的一個意想不到的特性是當配制成含有合適佐劑的組合物時，當致病性流感病毒攻擊已接種個體時，它可提供消殺效果，因而阻止致病性病毒在易感組織生長并流入個體所處環(huán)境中。比起本領(lǐng)域可用的現(xiàn)有疫苗而言，本發(fā)明的這一令人吃驚的特征特別有優(yōu)勢，因為它降低或消除了通過致病性病毒引起的疾病傳播，否則它可從已免疫個體傳播給未經(jīng)免疫的易感個體。因此，一方面，本發(fā)明涉及疫苗組合物，所述組合物能有效預防和/或改善禽流感，并能阻止致病性攻擊流感病毒的生長、釋》文和從感染個體向未感染個體的傳播，例如從感染的鳥類傳播給未感染的鳥類。更具體地講，本發(fā)明涉及包含反求遺傳學病毒的疫苗組合物，所述反求遺傳學病毒包含(i)HA部分，其來自第一種高致病性H5禽流感病毒抹，(ii)N部分，其來自具有與第一種高致病性H5禽流感病毒林的N亞型不同的N亞型的第二種低致病性禽流感病毒抹，和(iii)骨架禽流感病毒基因組，其來自第三種低致病性病毒。在某些實施方案中，第二種低致病性毒抹和第三種低致病性毒林都來自同一禽流感病毒分離抹。在替代實施方案中，第二種低致病性毒林和第三種低致病性毒抹來自不同禽流感病毒分離抹。本發(fā)明的其它方面提供有效預防或改善禽流感病毒感染的禽流感疫苗組合物和制劑。這樣的本發(fā)明制劑包含禽流感病毒的反求遺傳學毒株(尤其是禽流感病毒的反求遺傳學毒林的滅活形式)，并任選包含一種或多種表面活性劑(包括脫水山梨醇油酸酯)。通常，禽流感病毒疫苗包含的血凝素(HA)總量至少約為75HA/劑的疫苗制劑。有效預防或改善禽流感病毒感染的疫苗組合物包含配制在生物學上可接受的佐劑材料中的反求遺傳學病毒，所述病毒的組成如下來自H5禽流感高致病性毒株的HA部分；來自第二種低致病性毒林的N部分，其中所述第二種低致病性毒抹具有與HA部分所來源的病毒不同的N亞型；以及選自低致病性病毒的其余病毒基因組，其中所述低致病性病毒與N部分所來源的病毒相同或不同；其中血凝素(HA)總量至少為約75HA/劑、或至少約125HA/劑、或約250HA/劑的所述疫苗組合物。在某些方面，疫苗組合物和/或制劑可任選還包含一種或多種表面活性劑，例如一種或多種脫水山梨醇油酸酯和/或一種或多種環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物。在某些這樣的實施方案中，脫水山梨醇油酸酯是吐溫80(TWEEN⑧80)和/或脫水山梨醇倍半油酸酯。在其它方面，疫苗組合物和/或制劑可包含配制在油包水乳劑中的本發(fā)明禽流感病毒。本文的實例是疫苗組合物，其中骨架病毒基因組來源于H1N1禽流感病毒即A/波多黎各/8/34(akaPR8)。該低致病性毒抹在需要安全跨越兩個或更多不同物種的流感疫苗的應用中特別有優(yōu)勢。本發(fā)明還提供包含至少兩株禽流感病毒的疫苗組合物，其中HA/劑通常大于約75HA/劑，更通常大于約128HA/劑、或大于約200HA/劑、或大于約250-300HA/劑?？梢岳斫?，對用于衍生本發(fā)明反求遺傳學流感病毒疫苗的特定禽流感病毒林的選擇，取決于特定地理區(qū)域流行的特定毒株，其中給予疫苗的前提條件是(a)其HA亞型通常與流行抹或攻擊林的HA亞型相同，和(b)其NA亞型與流行林或攻擊4^的NA亞型不同，這樣就可以依靠DIVA技術(shù)。本發(fā)明的其它方面提供預防或改善禽流感病毒感染爆發(fā)的方法，所述方法包括將含有滅活反求遺傳學禽流感病毒的疫苗組合物給予家禽的步驟，其中血凝素(HA)總量至少為約75HA/劑的疫苗組合物。例如，本發(fā)明提供預防或改善禽流感病毒感染爆發(fā)的方法，所述方法包括將本文所公開的病毒或疫苗組合物給予家禽的步驟。病毒或疫苗組合物可通過例如飲用水或噴霧給藥。通常，合適劑量范圍介于約lng和約l|ig之間，或介于約5ng和約250ng之間，或介于約20ng和約125ng之間，或介于約50ng和約100ng之間。給予的有效劑量通常為約0.25ml至2.0ml/家禽?？梢詥蝿┝拷o予病毒和/或疫苗，或重復給予兩次或更多劑量。根據(jù)本文下面給出的發(fā)明詳述和所附權(quán)利要求書，本發(fā)明的這些和其它實施方案、特征和優(yōu)勢將會是顯而易見的。附圖簡述和序列標識圖1是鵝HK437H5和雞VNC58H5的比對。SEQIDNO:1是鵝HK437H5的氨基臥l^f列15(dqicigyhannsteqvdtimeknvtvthaqdilekthngklcdldgvkplilrdcsvagwllgnpmcdefiiwpewsyive!casp肌dlcypgdfiinyeelkhllsrtnhfekiqiipksswsnhdassgvssacpyhgkssffrnvvwlikknsayptikrsy皿tnqedllvlwgihhpndaaeqtklyqnpttyisvgtstlnqrlvpeiatrpkvngqsgrmeffvvtilkpndainfesngnfiapeyaykivkkgdsaimkseleygncntkcqtpmgainssmpfhnihpltigecplcyvksnrlvlatglmtpqietrglfgaiagfieggwqgnivdgwygyhhsneqgsgyaadkestqkaidgvtnkvnsiidkmntqfeavgrefiinlerrienlnkkmedgfldvwtynaellvlmenertldfhdsnaknlydkvrqlrdnakegngcfefyhkcdnecmesvkngtydypqyseearlnreeisgvklesmgtyqilsiystvasslalaimvaglshvmcsngslqcrici)。SEQIDNO:2是雞VNC58H5的氨基酸序列WMCSNGSLQCRJCI)。發(fā)明詳述本發(fā)明是根據(jù)出乎意料地發(fā)現(xiàn)反求遺傳學技術(shù)可適用于由高致病性病毒產(chǎn)生低致病性禽流感病毒，同時又保持來自高致病性病毒的保護性。本文公開的單價低致病性禽流感病毒疫苗公開提供有效保護作用，而沒有攻擊病毒釋放的證據(jù)。參考以下定義，將會更好地理解本發(fā)明。定義本文所用的術(shù)語"流感病毒"用于定義這樣的病毒物種所述病毒的致病性毒林能《I起稱為流感的疾病。術(shù)語"母林病毒，，是指提供骨架的病毒林，所述骨架用于通過本文所述的反求遺傳學方法構(gòu)建低致病性流感病毒疫苗抹。這些母抹通常給疫苗病毒提供6或7個病毒節(jié)段(PB1、PB2、PA、NP、M、NS和任選NA)。也就是說，母林病毒可任選用作NA基因的來源。就本文所述的H5N3禽流感病毒疫苗的具體情況而言，給出骨架基因的"母抹病毒"是H1N1禽病毒分離林，稱為A/波多黎各/8/34。術(shù)語"多肽"是指氨基酸多聚體，而不是指特定長度的產(chǎn)物；因此，肽、寡肽和蛋白質(zhì)都包括在多肽的定義之內(nèi)。該術(shù)語也不指或不包含翻譯后的多肽修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。本文所用的"感染性"是指病毒在細胞中復制并產(chǎn)生病毒顆粒的能力。可通過測定病毒(即病毒載量)或通過觀察動物的疾病進程，來評價感染性。本文所用的"個體"或"患者"或"動物"是指支持負鏈RNA病毒感染、尤其是流感病毒感染的脊推動物，包括但不限于烏(例如水禽和雞)和哺乳動物成員(例如狗、貓、《良、鼬(mustela)、嚙齒動物(racine和鼠等)、馬、牛、綿羊、山羊、豬和靈長類，后者包括人)。本文所用的術(shù)語"免疫原性"是指病毒或多肽能夠誘導體液或細胞免疫應答，優(yōu)選這兩種免疫應答都誘導。免疫原性的實體也是抗原性。免疫原性組合物是當給予動物時能誘導體液或細胞免疫應答或這兩者的組合物。當一種分子能夠與免疫系統(tǒng)的抗原識別分子(例如免疫球蛋白(抗體)或T細胞抗原受體)發(fā)生特異性相互作用時，該分子就具有"抗原性，，?？乖远嚯暮兄辽偌s5個、優(yōu)選至少約10個氨基酸的"表位，，。多肽的抗原性部分在本文也稱為"表位，，，它可以是對抗體或T細胞受體識別具有免疫優(yōu)勢的部分，或者它可以是用于產(chǎn)生針對該分子的抗體的部分，即通過將抗原部分與載體多肽綴合，用于免疫。沒有載體時，抗原性分子自身不一定具有免疫原性(即誘導免疫應答的能力)。本文所用的術(shù)語"氨基酸取代"是指某分子的氨基S交序列的特定位置上氨基酸的存在。相對于占據(jù)該位置的任何其它氨基酸而言都可發(fā)生氨基酸取代。來自氨基酸序列改變的多肽可包括翻譯后修飾的改變，例如糖基化、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌被嵝揎椧约鞍被崛〈?。本文所用的術(shù)語"反求遺傳學系統(tǒng)"是指產(chǎn)生流感病毒顆粒、多肽、病毒粒子或核酸的方法，即通過遺傳工程方法。這些方法包括但不限于Hoffmann在以下文獻中描述的"質(zhì)粒系統(tǒng)，，(Hoffinann等，Vaccine20:3165(2002);美國專利公布號2002/0164770A1，2002年11月7日申請，所述文獻通過引用全部結(jié)合到本文中)。通常，反求遺傳學系統(tǒng)可允許通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的遺傳工程方法來產(chǎn)生具有特定序列的病毒顆粒、多肽和/或核酸。這些系統(tǒng)在下文有更詳細的描述。本文所用的術(shù)語"受體結(jié)合位點，，是指目標受體(例如紅細胞上的唾液酸受體)結(jié)合的HA分子的部分。鵝HK437H5和雞VNC58H5的H5分子結(jié)構(gòu)在本文^Hf為SEQIDNO:1和2，并可參見圖1所示的序列差異性比對。A/鴨/新加坡(A/duck/Singapore)的H5分子結(jié)構(gòu)和該H5亞型的血凝素的受體結(jié)合位點的位置可參見IHa等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:11181(2001)。術(shù)語"診斷用參考病毒"是指具有高HA抗原性的病毒。這樣的診斷用參考病毒可用于免疫測定，例如血凝素抑制測定。術(shù)語"暴露病毒，，是指單個動物已接觸的病毒。這樣的暴露可以在日?；顒舆^程中，例如接觸感染個體，例如使人暴露給感染性流感病毒。暴露也可以因為特定的臨床攻擊，例如在有意將實驗動物暴露給病毒的實驗室試驗情況下?？梢酝ㄟ^用流感疫苗免疫接種而特意產(chǎn)生這樣的暴露。術(shù)語"藥學上可接受的，，是指當給予人時，在生理學上可耐受的并且通常不產(chǎn)生變態(tài)反應或類似不良反應(例如翻胃、頭昏等)的分子實體和組合物。優(yōu)選本文所用的術(shù)語"藥學上可接受的"是指由聯(lián)邦政府或州政府管理機構(gòu)批準的或者美國藥典或其它公認的藥典上列出的、可用于動物(尤其是人)的材料。18術(shù)語"載體"是指與化合物一起給予的稀釋劑、佐劑、賦形劑或溶媒。這類藥物載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油、動植物油或合成油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。水或含水溶液、鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液優(yōu)選用作載體，尤其是注射用溶液劑。合適的藥物載體可參見E.W.Martin編著的"Remington'sPharmaceuticalSciences",第18版。本文所用的術(shù)語"佐劑"是指提高針對抗原的免疫應答的化合物或混合物。佐劑可用作緩慢釋放抗原的組織緩釋型制劑，也可作為淋巴系統(tǒng)活化劑，非特異性增強免疫應答(Hood等，Immunology,第二版，MenloPark,CA:Benjamin/Cummings,1984,第384頁)。通常，在沒有佐劑的情況下單用抗原進行初次攻擊，將不能誘導體液或細胞免疫應答。佐劑包括但不限于完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、皂苷、礦物凝膠(例如氫氧化鋁)、表面活性劑(例如溶血卵磷脂)、復合多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳劑、匙孔蜮血藍蛋白和潛在有用的人用佐劑(例如N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺、N-乙?；邗?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺、BCG(卡介苗)和短小才奉桿菌(Cb/7"^^"en'"附/anww)。優(yōu)選的佐劑是藥學上可接受的佐劑。本文所用的術(shù)語"分離的"是指從天然環(huán)境(例如細胞或病毒)中取出相關(guān)材料。因此，分離的生物材料可不含某些或全部細胞組分，即自然存在天然材料的細胞組分(例如細胞質(zhì)組分或膜組分)。如果某材料存在于細胞提取物或上清液中，可認為該材料就是分離的。就核酸分子而言，分離的核酸包括PCR產(chǎn)物、分離的mRNA、cDNA或限制片段。在另一個實施方案中，分離的核酸優(yōu)選從發(fā)現(xiàn)其來源的染色體中切下，更優(yōu)選不再連接或鄰近其來源染色體的分離的核酸分子的非編碼區(qū)(但可以連接其天然的調(diào)節(jié)區(qū)或其部分)，或者不再連接或鄰近位于該分離核酸分子所含有基因的上游或下游的其它基因。在又一個實施方案中，分離的核酸缺乏一個或多個內(nèi)含子。分離的核酸分子包括插入到質(zhì)粒、粘粒、人工染色體等中的序列，即當它形成嵌合重組核酸構(gòu)建體的組成部分時。因此，在一個具體的實施方案中，重組核酸就是分離的核酸。分離的蛋白質(zhì)可以與締合在細胞或細胞膜上(如果是膜結(jié)合蛋白的話)的其它蛋白質(zhì)或核酸或這兩者締合。從來源生物體的解剖位置取出分離的細胞器、細胞或組織。分離的材料可以是純化的，但不一定非要純化。本文所用的術(shù)語"純化的"是指在減少或排除無關(guān)材料(即污染物)存在的條件下分離的材料，所述污染物包括來自所獲材料的天然材料。例如，純化的病毒粒子優(yōu)選基本不含宿主細胞或培養(yǎng)基組分，包括組織培養(yǎng)物或雞胚蛋白、非特異性病原體等。本文所用的術(shù)語"基本不含"操作性地用于材料的分析試驗的情況下。優(yōu)選基本不含污染物的純化材料為至少50%純度；更優(yōu)選至少90°/。純度、還更優(yōu)選至少99%純度。純度可通過色譜、凝膠電泳、免疫測定、組成分析、生物學測定和本領(lǐng)域已知的其它方法來測定。純化方法是本領(lǐng)域眾所周知的?？赏ㄟ^超濾或超離心(優(yōu)選連續(xù)離心)來純化病毒顆粒(參見Furminger,出處同上)。其它純化方法也可以并涵蓋在本發(fā)明之中。純化材料可含有小于約50%、優(yōu)選小于約75%、最優(yōu)選小于約90%的其原來所締結(jié)的細胞組分、培養(yǎng)基、蛋白質(zhì)或其它不想要的組分或雜質(zhì)(視需要而定)。術(shù)語"基本純化的"是指用本領(lǐng)域已知的常規(guī)純化技術(shù)所能達到的最高純度。在一個具體的實施方案中，術(shù)語"約，，或"近似，，是指在具有統(tǒng)計學意義的數(shù)值范圍之內(nèi)。這樣的范圍可以是在數(shù)量級的范圍內(nèi)，優(yōu)選在給定數(shù)值或范圍的50%之內(nèi)、更優(yōu)選20%之內(nèi)、還更優(yōu)選10%之內(nèi)和甚至更優(yōu)選5%之內(nèi)。術(shù)語"約，，或"近似"所涵蓋的允許誤差耳又決于研究下的特定系統(tǒng)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地理解這一,泉。反求遺傳學方法如上所述，本發(fā)明的基礎是禽流感病毒及其疫苗的產(chǎn)生，這樣的病毒及其疫苗是通過使用本文提出的工作實施例中詳述的反求遺傳學方法而產(chǎn)生的。簡而言之，通過將來自第一種高致病性禽流感病毒的HA基因和來自第二種低致病性禽流感病毒的NA基因結(jié)合到來自第二種或第三種低致病性禽流感病毒的骨架(其包含其余禽流感病毒基因)中，而構(gòu)建低致病性重配禽流感病毒。如上所述，本文公開和舉例的示例性的低致病性重配禽流感病毒的構(gòu)建如下通過將來自A/Ck/越南/C58/04分離抹(H5N1)的HA基因和來自A/DK/德國/1215/73分離抹(H2N3)的NA基因結(jié)合到A/波多黎各/8/34骨架中，產(chǎn)生H5N3病毒。目前開發(fā)的反求遺傳學系統(tǒng)已可以操縱流感病毒基因組(Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:1354(1996);Neumann和Kawaoka,Adv.VirusRes.53:265(1999);Neumann等，Proc.Natl,Acad.Sci.U.S.A.96:9345(1999);Fodor等，J.Virol.73:9679(1999);美國專利申請20040029251)。例如，已經(jīng)證明，質(zhì)粒驅(qū)動的8個流感vRNA自polI啟動子的表達和自polll啟動子的所有mRNA的表達，導致產(chǎn)生感染性曱型流感病毒(Hoffmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2000,97:6108;美國專利公布號20020164770，所述文獻中有關(guān)最小質(zhì)粒反求遺傳學系統(tǒng)和基因工程方法的描述都通過引用結(jié)合到本文中)。這些重組方法可允許在多肽氨基酸序列上具有特定改變的特定流感病毒類型的產(chǎn)生。含有所需取代的HA分子可以是重組流感病毒的組成部分。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備重組流感病毒，包括通過基因工程方法，例如M又有質(zhì)粒"系統(tǒng)(Hoffmann等,Vaccine2002，20:3165)。重組流感病毒可來源于H5N1病毒。重組病毒可具有用于疫苗開發(fā)的H1N1病毒的遺傳背景，例如A/PR/8/34病毒或任何曱型流感病毒，包括A/歹ll寧格勒/134/n/57(A/Leningrad/134/17/57)、A/列寧格勒/134/47/57和A/安阿伯/6/60(A/AnnArbor/6/60)的冷適應抹。對應于HA分子序列的核酸可從病毒中分離出來并測序。分離和修飾特定核酸和蛋白質(zhì)的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。根據(jù)本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的常規(guī)分子生物學、微生物學和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中已有充分解釋。參見例如Sambrook，F(xiàn)ritsch&Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NY:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989(本文中"Sambrook等，1989");DNACloning:APracticalApproach,第I和II巻(D.N.Glover編著，1985);OligonucleotideSynthesis(MJ.Gait編著，1984);NucleicAcidHybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins編著(1985)];TranscriptionAndTranslation[B.D.Hames&S丄Higgins編著(1984)];AnimalCellCulture[R.I.Freshney編著(1986)];ImmobilizedCellsAndEnzymes[IRLPress,(1986)];B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(1984);Ausubel,F.M.等(編著)；CurrentProtocolsinMolecularBiology-JohnWiley&Sons,Inc.,1994。這些技術(shù)包括定點誘變，使用具有改變的核香酸的寡核苷酸，用于產(chǎn)生具有突變的PCR產(chǎn)物(例如由Stratagene生產(chǎn)的"Quikchange"試劑盒)。低致病性禽流感病毒疫苗現(xiàn)有低致病性禽流感病毒疫苗在本文中的實例是重配H5N3病毒，該病毒是通過將來自高致病性亞洲爆發(fā)抹A/Ck/越南/C58/04(H5N1)的H5基因、來自低致病性禽流感病毒林A/DK/德國/1215/73(H2N3)的N3基因結(jié)合到低致病性禽流感病毒骨架A/波多黎各/8/34(H1N1;PR8)中而產(chǎn)生的。本發(fā)明的低致病性禽流感病毒確保針對另外的高致病性禽流感病毒的優(yōu)化保護性。用來自A/DK/德國/1215/73的N3基因取代來自A/波多黎各/8/34的Nl基因，以便使用DIVA程序，以測定單只鳥體內(nèi)抗神經(jīng)氨酸酶抗體效價是否是高致病性病毒感染對低致病性病毒接種的結(jié)果?？刹捎帽绢I(lǐng)域可行的技術(shù)，分離可用于衍生本發(fā)明疫苗的禽流感分離抹。例如，來自感染雞只的組織或血清可得自商業(yè)化肉用雞群(broilerflock)。然后，病毒可在組織或其它合適介質(zhì)中傳代，以建立母種(masterseed)病毒。采用可行方法，技術(shù)人員還可進一步進行表征?？刹捎每尚蟹椒?，例如加熱和化學處理，4吏病毒滅活。包含低致病性禽流感病毒疫苗的制劑本文還提供包含本發(fā)明的一種或多種低致病性禽流感病毒疫苗以及佐劑和/或乳劑制劑的疫苗制劑。與前述HA單位的濃度相比，本文公開的這類制劑在降低HA單位濃度時表現(xiàn)出改進的功效。更具體地講，在本發(fā)明的制劑中，當HA單位介于約10ng和約l嗎之間、更典型的是介于約20ng和約500ng之間、還更典型的是介于約50ng和約250ng之間、或介于約75ng和約200ng之間、最典型的是約100ng、約125ng、約150ng或約175ng時，4氏致病性禽流感病毒疫苗是有效的?？墒褂每尚屑夹g(shù)配制本發(fā)明的疫苗組合物，優(yōu)選使用藥理學上可接受的載體。例如，在一個實施方案中，包括含水制劑。這樣的制劑使用水、鹽水或磷酸緩沖液或其它合適緩沖液。在再一個實施方案中，疫苗組合物優(yōu)選為油包水或水包油乳劑。還包括雙重乳劑，其特征通常為水包油包水乳劑。油有助于穩(wěn)定制劑，還可作為佐劑或增強劑。合適的油包括但不限于白油、Drakeoil、角鯊烷或角鯊烯、以及其它動植物油或礦物油，無論是天然來源還是合成來源。如上所述，本身含有增強抗原性的HA分子的修飾病毒具有更高免疫原性，這反過來又可提供更強的免疫應答和更好的疫苗潛力。增加流感疫苗有效性的策略包括使用佐劑(Wood和Williams,出處同上)、共同給予免疫刺激分子(Salgaller和Lodge,J.Surg.Oncol.1998,68:122)和粘膜接種策略。粘膜免疫接種策略包括將病毒包裹在微膠嚢內(nèi)(美國專利號5，075，109、5,820,883和5，853，763)和使用免疫強效膜載體(WO98/0558)。另外，可通過使用紅細胞(rbc)或rbc血影細胞(美國專利號5，643,577)或通過使用藍舌抗原(美國專利號5,690,938)，增強口服給予免疫原的免疫原性。盡管這些方法對改進未來接種策略來說很有希望，但是要在特定環(huán)境下使用它們卻需要驗證和監(jiān)測，以確保疫苗有效性?？紤]到本文所述的本發(fā)明將會增強這些策略，包括通過增加檢測其免疫原性效應的能力。另外，疫苗組合物可含有本領(lǐng)域可用的其它合適佐劑。這些可包括例如氫氧化鋁和磷酸鋁、以及其它金屬鹽類。疫苗組合物中還可包含額外的賦形劑，例如表面活性劑或其它潤濕劑或制劑輔料。表面活性劑可包括脫水山梨醇單油酸酯(TWEEN⑧系列)、以及環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物(PLURONIC⑧系列)、以及本領(lǐng)域可用的其它材料。疫苗中還可包含作為穩(wěn)定劑或防腐劑的其它化合物。這些化合物包括但不限于碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精或葡萄糖等)以及防腐劑(例如福爾馬林)。疫苗組合物也可配制成基本不含外源水份的干粉劑，這樣的粉劑可在臨用前由最終的使用者重配。任選用死病毒或滅活病毒配制疫苗組合物。本發(fā)明的疫苗組合物優(yōu)選含有來自其流感病毒組分的最少共約200HA。在本發(fā)明的一個實施方案中，疫苗含有來自各毒抹的約128HA/劑，甚至更優(yōu)選來自各毒林的約192HA/劑。者將本發(fā)明的疫苗組合物與后者一起給予。例如，針對雞皰疹病毒、雞貧血病毒(CAV)、新城疫病毒和傳染性支氣管炎(IB)病毒的疫苗抗原、以及呼腸孤病毒抗原可以包含在內(nèi)，作為本發(fā)明疫苗組合物的組成部分。尤其優(yōu)選一種或多種呼腸孤病毒抗原作為本發(fā)明疫苗組合物的組成部分。24保護性免疫應答的誘導方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明也提供誘導針對禽流感病毒感染的保護性的方法。本文所公開的方法包括給予家禽動物包含上述的一種或多種低致病性禽病毒疫苗的疫苗和/或其制劑，其中所述一種或多種低致病性禽病毒疫苗含有的混合HA含量為大于約75HA/劑、更典型的是大于約125HA/劑、或大于約200HA/劑、或介于約250HA/劑和約300HA/劑之間。技術(shù)人員可選擇給藥方式，這將取決于明確的應用考慮。例如，可通過飲用水、噴霧或滴眼劑，將疫苗組合物給予孵化后的雛雞(幾天至幾周齡)。卵內(nèi)給藥也包括在本文中。例如，可以給雞胚接種，通常在約18-19天。本發(fā)明的范圍之內(nèi)也包括其它方法，所述方法按照根據(jù)預期潛在接觸致病禽流感病毒的載體的時間所確定的時間表的有效劑量，通過胃腸外、皮下、腹膜、口服、鼻內(nèi)或通過其它可行方法(優(yōu)選通過胃腸外、更優(yōu)選肌內(nèi))給予本發(fā)明的疫苗組合物。劑量的通常范圍為約0.25ml至約2.0ml/家禽動物、更優(yōu)選約0.5ml至約l.Oml/動物。因此，本文包^l舌l(xiāng)劑、2劑或多劑，其中尤其優(yōu)選劑量次數(shù)盡可能少。如前所述，本發(fā)明涉及新的禽流感疫苗組合物及其在家禽中的使用方法。術(shù)語"家禽，，包括但不限于所有商業(yè)化養(yǎng)殖的家禽動物，包括雞、鴨、鵝、火雞、孔雀、矮腳雞等。免疫測定根據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域已知用于檢測抗體與抗原的免疫特異性結(jié)合的各種方法，都可用于檢測結(jié)合和增加的抗原性。檢測抗原抗體相互作用的早期方法包括通過在凝膠中沉淀來檢測和分析復合物。檢測分析物-檢測物的抗體結(jié)合對的另一方法包括使用可與IgG(例如蛋白A)發(fā)生反應的放射性碘標記的檢測抗體或放射性碘標記的蛋白質(zhì)。這些早期方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，有關(guān)綜述參見MethodsinEnzymology1980,70:166-198。只用一種抗體檢測樣品中分析物存在的后期方法包括竟爭性結(jié)合測定。在該項技術(shù)中，使抗體(通常都會固定在固體支持物上)接觸懷疑含有分析物的樣品以及已知量的帶標記的分析物。然后，這兩種分析物(帶標記的分析物和樣品中的分析物)將會竟爭抗體上的結(jié)合位點。測定游離的帶標記分析物或結(jié)合的帶標記分析物，根據(jù)這樣的測定就可知道樣品中竟爭性分析物的量。該方法的更完整的描述可參見"BasicPrinciplesofAntigen-AntibodyReaction"(Labat，MethodsinEnzymology，70,3-70,1980)。在該實例中，帶標記的分析物可以用放射性同位素標記或者用酶標記物標記。新近的免疫測定使用雙重抗體方法，用于測定分析物的存在。這些技術(shù)的有關(guān)綜述參見以上參考文獻MethodsinEnzymology的同一巻。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，用一對針對每種待測標記的抗體就可測得一個標記的存在。所迷抗體對中的一個在本文中稱為"檢測抗體"，而所述抗體對中的另一個在本文中稱為"捕獲抗體"。因此，本發(fā)明的一個實施方案使用雙重抗體夾心方法，用于測定生物液體樣品中的分析物。在該方法中，分析物夾在;^測抗體和捕獲抗體之間，捕獲抗體是不可逆地固定在固體支持物上。^^測抗體含有可斗企測標記，以便識別抗體-分析物夾心的存在，從而識別分析物的存在。固體支持物的常用早期形式包括聚苯乙烯板、管或小珠，這些都是放射免疫測定和酶免疫測定領(lǐng)域中眾所周知的。最近，各種多孔材料例如尼龍、硝基纖維素、醋酸纖維素、玻璃纖維和其它多孔聚合物已作為固體支持物使用?？墒褂酶鞣N不同技術(shù)和相應傳感器裝置。自動化測定裝置包括連續(xù)/隨機存取測定儀。這類系統(tǒng)的實例包括PBDiagnosticSystem,Inc.的OPUSTM和AbbottLaboratories(NorthChicago,Ill)引進的IMXTM分析儀。PBDiagnosticSystems,Inc.的自動化測定儀可參見美國專利號5，051，237;5,138,868;5,141,871和5，147，609?？捎糜诒景l(fā)明實踐的免疫化學分析系統(tǒng)的更多類型是光學免疫傳感器系統(tǒng)。通常，光學免疫傳感器是利用光學原理將目標物的化學或生化濃度或活性定量轉(zhuǎn)化為電信號的裝置。這些系統(tǒng)可分為4種主要類型反射技術(shù)；表面等離子共振；光纖技術(shù)和集成光學裝置(Integratedopticdevice)。反射技術(shù)包括橢圓偏振光度法、多重積分反射光鐠(multipleintegralreflectionspectroscopy)和焚光毛細管填充裝置(fluorescentcapillaryfilldevice)。光纖技術(shù)包括倏逝場熒光(evanescentfieldfluorescence),光纖毛細管和光纖熒光傳感器。集成光學裝置包才舌平面^f務逝場熒光(planerevanescentfieldfluorescence)、專lT入分級誄禺合器免疫傳感器(inputgradingcouplerimmunosensor)、馬赫-曾德爾干涉儀(Mach-Zehnderinterferometer)、哈特曼干涉儀(Hartmaninterferometer)和示差干涉儀傳感器。當結(jié)合對的一種反應物與固定化的結(jié)合對的第二種反應物結(jié)合時，檢測到預定圖像位置上產(chǎn)生的全息圖像的存在，從而完成對結(jié)合反應的全息攝影檢測(參見美國專利號5,352,582，1994年10月4日授予Lichtenwalter等)。光學免疫傳感器實例的一般性綜述文章可參見G.A.Robins,AdvancesinBiosensors1991，1:229-256。這些裝置的更具體的描述可參見例如美國專利號4,810,658、4，978，503和5,186,897;R.A.Brady等(Phil.Trans.R.Soc.Land.B.1987,316:143-160)和G.A.Robinson等(載于SensorsandActuators,Elsevier1992)。血清學測定廣泛用于檢測流感診斷以及研究病毒林的流行病學和抗原性。具體地講，血凝素抑制(HI)測定因其實驗室要求低和使用簡便而廣泛應用。考慮到本發(fā)明將會通過增加其靈敏度而改進HI測定的實用性。HI測定也可用于顯示》務飾HA分子的抗原性，并且有助于表征修飾HA分子，因為與非修飾分子的抗原性相比有所降低或增加。HI測定可;^測血清樣品中的抗體與標準化參考結(jié)合的能力。在ffl測定中，將血清樣品系列稀釋液(效價)與標準量的紅細胞混合，目測其締合成復合物。引起可見復合物的所測血清的最低水平就是測定結(jié)果。如上所迷，本發(fā)明提供用于治療或預防流感病毒感染的疫苗的改進的生產(chǎn)方法和驗證方法。具體地講，本發(fā)明可使用反求遺傳學技術(shù)尤其是、但并不排它地講，本發(fā)明提供增強的抗體檢測方法，該方法是在個體接觸流感病毒后進行抗體檢測，因為修飾HA分子的抗原性增強。這種增強的抗原性造成用于檢測免疫應答的測定(例如ffl測定)的靈敏度提高。實施例參考以下實施例，可以更好地理解本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明。實施例1H5N3禽流感疫苗的構(gòu)建病毒流感病毒A/PR/8/34(H1N1)、A/雞/越南/C58/04(A/Chicken/Vietnam/C58/04)(H5N1)和A/DK7德國/1215〃3(A/DK/Germany/1215/73)(H2N3)可得自St.JudeChildren'sResearchHospital的保藏機構(gòu)。A/番鴨/越南/453/2004(A/MuscovyDuck/Vietnam/453/2004)H5N1可得自越南胡志明市地區(qū)動物健康中心(RegionalAnimalHealthCentre,HoChiMinhCity,Vietnam)。RT-PCR和質(zhì)粒構(gòu)建用Rneasy試劑盒(Qiagen),自A/雞/越南/c58/04(H5N1)、A/PR/8/34(H1N1)和A/DK,德國/1215〃3(H2N3)流感病毒分離RNA。用Uni12-引物(AGCAAAAGCAGG;SEQIDNO:3),將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后，按照Hoffmann等(2001)Arch.Virol.146:2275-2289所述(通過引用結(jié)合到本文中)，用節(jié)段特異性引物，擴增所得cDNA。具體地講，按照下表l所描述的，可使用節(jié)段特異性引物:表l可用于擴增流感病毒節(jié)段的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>基因正向引物反向引物NPBm-NP-l:TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTASEgiDNO:14Bm-NP-1565R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTSEQTDNO:15NABa-NA-l:TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTSEQIDNO:16Ba-NA-1413R:ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTSEqIDNO:17MBm-M-l:TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAGSEQIDNO:18Bm-M-〗027R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTSEQIDNO:19NSBm-NS-l:TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTGSEQIDNO:20Bm-NS-890R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTSEQIDNO:21引物5'端具有限制性核酸內(nèi)切酶BsmBI(Bm)或Bsal(Ba)的識別序列?？梢园凑誋offmann等(2002)Vaccine20:3165-3170所述(通過引用結(jié)合到本文中)，構(gòu)建編碼曱型流感/PR/8/34的PB1、PB2、PA、NP、M和NS基因的質(zhì)粒。具體地講，可用表l所列的引物，自A/PR/8/34(H1N1)cDNA擴增PB2、PB1、PA、NP、M和NS的流感基因。用BsmBI(PB1、PA、NP、M和NS)或Bsal(PB2)消化PCR片段，并將它們連接到克隆載體pHW2000(也用BsmBI或Bsal切割)上，從而克隆PB1、PB2、PA、NP、M和NS基因。這些質(zhì)粒稱為pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW195-NP、pHWl97-M和PHW198-NS。自A/DK/德國/1215/73(H2N3)cDNA擴增NA基因。用表1所列的NA特異性引物(SEQIDNO:16和SEQIDNO:17),通過PCR擴增NA基因。用Bsal消化PCR片段并連接到載體pHW2000上。通過PCR，用表1所列的HA特異性引物(SEQIDNO:10和SEQIDNO:11)，自A/雞/越南/c58/04(H5N1)cDNA擴增HA基因。用BsmBI消化PCR片段并連接到載體pHW2000上。然后通過HA1與HA2之間的切割位點上的多堿性M酸區(qū)的缺失，修飾來自A/雞/越南/C58/04(H5N1)的HA基因。通過編碼未修飾HA的質(zhì)粒的兩個片段的PCR擴增，得到含有修飾HA基因的質(zhì)粒。用于兩個片段擴增的引物見表1(SEQIDNO:10和SEQIDNO:12;SEQIDNO:13和SEQIDNO:11)。用BsmBI消化片段并通過三片^殳連接反應連接到pHW2000-BsmBI上。為了確?；蛏蠜]有不想要的突變，對克隆病毒cDNA進行測序。重組病毒的產(chǎn)生按照Hoffman等(2002)Vaccine20:3165-3170所述(通過引用結(jié)合到本文中)，通過DNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組病毒。具體地講，可以共培養(yǎng)293T和MDCK細胞(各細胞系含0.2-1x106細胞)并用于轉(zhuǎn)染實,險。用含有各lpg質(zhì)粒、18ul轉(zhuǎn)化(transit)LT1(Panvera,WI)的終體積為1mlOPTIMEM-I(Gibco，NY)的DNA-脂質(zhì)復合物轉(zhuǎn)染共培養(yǎng)的細胞。轉(zhuǎn)染可進行6小時，此時可除去DNA-脂質(zhì)復合物并更換為新鮮培養(yǎng)基。將細胞再孵育額外的24小時，加入0.5|ag/mlTPCK處理的月灸蛋白酶(Worthington)。72小時后，將上清液從細胞液中取出，將lOOul注射到10日齡含胚雞蛋中。疫苗的制備在10至11日齡含胚雞蛋的尿嚢腔中，在攝氏35度，使病毒繁殖48小時。收獲尿嚢液，加入比例為1:2000(體積比)的(3-丙內(nèi)酯(BPL)，讓尿嚢液在室溫下維持4小時，然后在攝氏4度維持24小時，以滅活病毒。將處理過的尿嚢液在含胚雞蛋中盲傳兩代后均未檢出感染性，證實已經(jīng)滅活。通過Amicon超濾進4亍病毒濃縮在5000rpm離心15分鐘，使尿嚢液中的滅活病毒澄清。上清尿嚢液通過使用Amicon濃縮超濾裝置濃縮至原體積的1/10。病毒的純化濃縮的病毒可通過25%和70。/。蔗糖墊超速離心，沉淀再以27，000rpm于4對聶氏度離心1小時，而得以純化。將沉淀重懸于STE緩沖液中，超聲處理2分鐘，然后在25%-70%蔗糖連續(xù)梯度中，用SW28轉(zhuǎn)子以24,000rpm離心2.5小時。用注射器取出病毒帶，在STE中稀釋，然后如上所述地沉淀。將沉淀重懸于合適體積的STE并進行超聲處理，加入疊氮化鈉，終濃度為200ppm。疫苗的標準化通過Wood等(19S5)AvianDis.29:867-872所述的單輻射免疫擴散技術(shù)(通過引用結(jié)合到本文中)，可以使尿嚢液、Amicon濃縮的疫苗和純化疫苗中的血凝素蛋白含量標準化。實施例2滅活H5N3禽流感疫苗在SPF雞中的功效疫苗組合物試驗了不同劑量的滅活禽流感H5N3疫苗的功效?；旧习凑諏嵤├?所述來制備禽流感H5N3疫苗。制備了4種疫苗，其一是安慰劑疫苗，含有無病毒尿嚢液。其余3種疫苗含有滅活禽流感病毒母液，得到的最終制劑含有1.2)igHA蛋白(307HAU)/0.6ml體積的劑量、0.5|agHA蛋白(128HAU)/0.5ml體積的劑量或0.25jagHA蛋白(64HAU)/0.5ml體積的劑量的抗原，這些劑量是根據(jù)輻射免疫擴散(或血凝抑制)測定所配制的病毒母液而得出的。按照血凝單位(HAU)，疫苗相關(guān)劑量水平分別是64、128和307HAU/劑。在構(gòu)建重配病毒期間在非洲綠猴腎細胞(Verocell)中傳代一次，接著經(jīng)過6次SPF雞胚傳代，制備滅活抗原母液。用礦物油作為載體，吐溫80和司盤83作為乳化劑，將疫苗配制成油包水乳劑(60:40的油:水比例)。吐溫和抗原組分與Drakeol和司盤83分開混合，并將水相緩慢加入油相，同時攪拌以形成預制乳劑。然后用固定頭SilversonL4R勻漿器對該預制乳劑進行機械勻漿。疫苗接種疫苗經(jīng)M^內(nèi)在胸月幾給予25只為一組的SPF白來亨雞(Ga/Zustfowe^cw;來自CharlesRiver/SPAFAS)。表2概括了接種方案。第1-3組用0.5ml疫苗接種，而第4組用0.6ml疫苗接種(參見表2)，使用帶20號1/2，，-W，針頭的3ml無菌一次性注射器。第5組的雞只在第2周和第5周齡不接種。無抗原的安慰劑疫苗同樣經(jīng)肌內(nèi)給予一組25只同窩孵化雞(hatchmate)，另外的25只同窩孵化雞作為未接種的對照。當雞在2周齡時進行初次接種，在5周齡時以同樣方式進行加強接種。表2處理表處理組疫苗采血攻擊(8周齡)病毒釋放(N=25)1安慰劑在2、5和H5N1亞型在J丈擊后3、5、J(生產(chǎn)批號2073-14)8周齡7、10和14天20.25嗎/64HAU(生產(chǎn)批號2073-11)用氣管拭子和泄殖腔拭子30.5嗎/128HAU(生>批號2073-12)41.2嗎/307HAU(生產(chǎn)批號2073-13)5未接種恰好在首次接種之前和在接種之后3周，采集雞的血樣，用于通過血凝抑制(HI)測定來檢測禽流感抗體效價。采血前的血清樣品都呈陰性。攻擊和采樣當雞只達到8周齡時進行攻擊。給予雞只攻擊病毒A/雞/越南/c58/04,稀釋度為1:1054，以達到30CLDso/雞，經(jīng)鼻內(nèi)/氣管內(nèi)滴注給予l,Oml體積。在攻擊后14天內(nèi)每天，見察所有雞只的死亡率。在2、5、8和10-11周齡時采集所有雞只的血樣。將血樣在37攝氏度放置30分鐘，然后移至4攝氏度過夜，讓其凝血。將血清無菌地移入單個無菌管，用于通過血凝抑制測定進行血清學分析。將血清樣品貯存于-30攝氏度或更低溫度待才企。在攻擊后3、5、7、10和14天，將采自活雞氣管和泄殖腔的拭子在SPF雞胚中進行病毒重分離。將拭子放入裝有l(wèi)ml病毒轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基(由1:1的PBS/甘油混合物與2xl()S單位/L青霉素、2xl(^單位/L多粘菌素B、250mg/L慶大霉素、0.5xl(^單位/L制霉菌素、60mg/L氧氟沙星HC1和0.2gm/L磺胺甲噁唑組成)的試管中。將拭子凍存于-70攝氏度或更低溫度待檢。血清學血清學試驗結(jié)果報告見下表3。表3通過血凝抑制測定，對接種前、初次接種后和加強接種后的血清進4亍血清學分析<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>*雞(#6,Pen9)因錯誤接種而排除在考慮之外通過血凝抑制測定，接種前從所有雞只采集的血清樣品都不含可檢出的禽流感特異性抗體。在初次接種后21天，接種安慰劑的對照雞(第1組)和未接種雞(第5組)仍然沒有抗體，而接種滅活原型的各組(第24組)的幾何平均效價水平分別為2M、3:20和446。在第二次接種后21天，未接種對照雞(第5組)仍然沒有可檢測的針對禽流感的抗體。發(fā)現(xiàn)安慰劑接種組中有一只雞(#6,Pen9)的效價為1280，而所有其它安慰劑接種雞都仍然是血清學陰性。因為該雞(//6)的未接種的同欄雞只(pen-mate)都仍然是血清學陰性，所以將不適當暴露給禽流感的該欄雞只排除在外。該雞(#6)抗體反應的唯一可能的解釋是在加強接種期間，它錯誤接受了一劑滅活原型疫苗，而不是安慰劑疫苗。這樣的話，最適當?shù)木褪窃谟嬎阊鍖W或攻擊結(jié)果時，將該雞排除在考慮之外。所有接受滅活原型疫苗的各組雞只反應的幾何平均效價分別為3671、4101和4335。針對死亡的保護作用攻擊后的死亡率數(shù)據(jù)概述于下表4。表4用A/雞/越南/c58/04攻擊后的死亡率處理組死亡^t/攻擊數(shù)死亡率(％)/保護率(％)l承24/24*100/0*20/250/1000/250/10040/25o膽525/25100/0*雞(#6，Pen9)因錯誤接種而排除在考慮之外未接種對照組的所有雞只在攻擊后3天全部死亡。安慰劑接種組的所有雞只(除一只以外)在攻擊后4天全部死亡。在攻擊中存活的這只雞(雞翼標記為第6號(#6,Pen9))如上所述是排除在考慮之外的，未接種組和安慰劑接種組全都是100%死亡。這滿足了針對對照組而建立的驗證標準，即在攻擊后需要死亡率至少為90%。在攻擊后，所有3組接種組的所有雞只全部存活。保護率認為是100%(95%CI86,100)。這滿足了要求保護的針對死亡的保護作用的標準，即至少70%疫苗功效。病毒重分離病毒重分離數(shù)據(jù)概述于下表5(氣管拭子)和下表6(泄殖腔拭子)。用A/雞/越南/c58/04攻擊后從氣管進行病毒重分離<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>*雞(#6,Pen9)因錯誤接種而排除在考慮之外表6用A/雞/越南/c58/04攻擊后從泄殖腔進行病毒重分離<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>*雞(#6，Pen9)因錯-誤接種而排除在考慮之外在未接種對照組中，在攻擊后3天、第一次采樣前，所有雞只都死亡，因此該組不可能有病毒重分離數(shù)據(jù)。對于安慰劑接種組，第一個采樣日之前，所有雞只(除了2只以外)死亡。如上所述，第6號雞(#6,Pen9)4晉誤接種了一劑試驗疫苗，所以在攻擊中呈抗體陽性，因此能存活。在攻擊后的任何時間在采自該雞氣管或泄殖腔的拭子中都不能重新分離到病毒。在攻擊后3天，死亡前一天，從另一只安慰劑接種的雞(弁113,PenIO)的氣管和泄殖月空重新分離出病毒。對于第2組，給予研究中所測的最低抗原水平的疫苗(0.25)ig,64HAU/劑)，在攻擊后3天和5天，從25只雞中的一只的氣管重新分離出病毒。此后，對于第2組的所有其它雞只，直到研究結(jié)束都沒有從氣管或泄殖腔拭子中重新分離出病毒。對于第3組，給予配制成含有中等抗原水平的疫苗(0.5嗎，128HAU/劑)，從25只所測雞只中的2只的氣管中重新分離到病毒，其各在一個采樣點(一只在攻擊后3天，另一只在攻擊后5天)。采自這兩只雞的所有其它樣品、以及采自第3組中所有其它雞只的所有樣品，都對病毒重分離呈陰性。對于第4組，給予配制成研究中所測的最高抗原水平的疫苗(1.2嗎，307HAU/劑)，在任何時間所有所測25只雞中的任一只的氣管或泄殖腔都未重新分離出病毒。因為未接種組和安慰劑對照組在采樣前幾乎全部死亡，所以這些組缺乏重分離數(shù)據(jù)，因此對重分離率就無法進行統(tǒng)計推斷。疫苗功效在2周齡和5周齡用試驗原型接種SPF雞之后，通過血凝抑制測定才企測高水平抗體，觀察針對攻擊死亡率的保護作用。從攻擊后的接種雞中重新分離出極少病毒，所以就不能說與對照相比，重分離率有顯著下降(因為在這些組中可以評價所有在重分離前死亡的對照)，顯而易見，疫苗能導致釋放的顯著減少。對于這樣明顯的證據(jù)，有必要修改攻擊方案，使未接種雞或安慰劑接種雞在攻擊后不會馬上死亡。這樣做是很困難的，因為H5N1攻擊林對雞具有超強致病性。測定了這類全病毒滅活疫苗的3種不同抗原水平。所有3種抗原水平的結(jié)果基本相同，所以在該項研究中沒有測定最〗氐保護劑量。用配制成含有小于0.25(ig(64HAU)/劑的抗原的疫苗作進一步研究，這對確定最低劑量是必要的。目前，可以得出的結(jié)論是，用含有不小于0.25pg(64HAU)/劑的H5N3重配病毒的含佐劑油包水乳劑進行兩次接種，對防止由越南H5N1強毒性野外分離抹(vimlentfieldisolate)引起的死亡是高度有效的，而且對防止強毒性H5N1的釋放也有效。疫苗提供針對死亡的100%的保護性。在不同時間點自所有活雞氣管拭子和泄殖腔拭子重新分離的攻擊病毒都是最少的。結(jié)論是用含有不小于0.25pg(64HAU)/劑H5N3重配病毒的含佐劑的油包水乳劑進行兩次接種，對防止由越南H5N1(H5N1Vietnam)強毒性野外分離林誘導的死亡是高度有效的，而且對防止強毒性H5N1的釋放也有效。實施例3在SPF雞的滅活H5N3禽流感疫苗基本上按照實施例1所述來制備5種疫苗。將疫苗配制成含有下表7(處理表)所列出的病毒含量/劑。HAU和EID50測定中所用的病毒濃度是根據(jù)滅活前病毒母液效價。所示H5蛋白抗原濃度(嗎)是根據(jù)采些母液抗原和所配制的％抗原液的測定，計算出每劑的所示抗原量。用礦物油作為載體，吐溫80和司盤83作為乳化劑，將疫苗配制成油包水乳劑(60:40的油:水比例)。吐溫和抗原組分與Drakeol和司盤83分開混合，并將水相緩慢加入油相，同時攪拌以形成預制乳劑。然后用固定頭SilversonL4R勻漿器對該預制乳劑進行機械勻漿。處理表<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>接種對于每種疫苗，給25只雞經(jīng)皮下接種一次，總體積為0.5ml。將25只同窩孵化雞作為未接種對照。所有雞只都各自加有腿箍并同欄混合銅養(yǎng)，直至采血和結(jié)束或送去進行攻擊。在接種后3周，采集所有雞只的血樣。攻擊對于第i_4組和第6組，每組任選20只雞，用高致病性禽曱型流感/雞/越南/c58/04毒林(H5N1型)進行攻擊。通過鼻內(nèi)/氣管內(nèi)滴注，將30雞致死劑量(CLD)的病毒給予每只雞。如實施例2所述，該病毒劑量先前已證明在未接種的對照雞中能有效引起死亡率為100%。在攻擊后觀察雞只的死亡率，共觀察14天。另外，在攻擊后4天，對采自所有存活雞只的氣管拭子和泄殖腔拭子進行病毒重分離。血清學反應對H5N3抗原母'^/稀釋液進行反滴定，用于ffl測定，證實使用8HA單位的抗原/50uL。建立同源H5N3血清合并液用作陽性對照樣品，證明HI活性在1:320或1:640的稀釋度。PBS對照孔沒有ffl活性，而25個未接種的對照血清在1:10稀釋度時沒有HI活性。根據(jù)SO#309所列出的標準，這些結(jié)果表明，就一般情況而言，HI測定和效力試驗已妥當?shù)赝瓿?。通過有效的HI測定，接種實驗性原型疫苗的各組(和未接種的對照組)的抗體反應概述于下表8，各雞只的結(jié)果報告見下表9-14。表8經(jīng)血凝抑制測定，接種滅活原型H5N3疫苗的血清學反應的概述處理組抗原/劑#血清#血清%血清GMT21:40<1:40>1:40所有除去無反應的*1(2285-26)64HAU1070EID500.09嗎H5187721091952(2285-21)128HAU1073EID500.18嗎H5196761745333(2250-55)256HAU1076EIDso0,35嗎H5205801994034(2250-56)512HAU107'9EID500.71(igH5241965276405(2250-57)1024HAU108.2EID501.42嗎H5223883286406(N/A)Nonvac02505N/A-H5N3(BPL滅活)抗原母液2228-卯-15FEB05用于所有HAI測定*除去無反應者表9給予系列2285-26(64HAU/107'0EID5n/0.09ugH5/劑)的各雞的血清學反應和針對死亡的保護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表IO給予系列2285-21(128HAU/107'3EID^/0.18ugH5/劑)的各雞的血清學反應和針對死亡的保護作用雞編號#HI效價死亡(+/-)重分離226320—_2272640—_228320-_229160一—2302640—231>640—232<10+n.d.233<10n.d.234<10+n.d.2352640n.d,n.d.236>640-一237<10n.d.n.d.2382640—239>640--240<10—一12412640n.d.n.d.2422640一+2432640一-244<10+n.d.2452:640n.d.2462640一—2472640一-2482640一2492640——250320--n.d.=未測定，雞只未攻擊或在采4式子之前死亡表11給予系列2250-55(256HAU/107'6EIDgj/0.35貼H5/劑)的各雞的血清學反應和針對死亡的保護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>n.d.=未測定，雞只未攻擊或在采4式子之前死亡表12給予系列2250-56(512HAU/107'9EID^/0.71ugH5/劑)的各雞只的血清學反應和針對死亡的保護作用雞編號#HI效價死亡(+/-)重分離2762640_—277>640-—2782640-一2792640n.d.n.d.280>640—-281>640_—2822640—一2832640--284<10+n.d.2852640n.d.n.d.286》640一一2872640一-2882640一一289>640一一290>640n.d.n.d.2912640—一292》640一一293>640n.d.n.d.2942640--295》640--296>640—-2972640一-2982640n.d.n.d.299>640--3002640一-n.d.-未測定，雞只未攻擊或在采拭子之前死亡表13給予系列2250-57G024HAU/108'2EID^/1.42ugH5/劑)的各雞只的血清學反應和針對死亡的保護作用雞編號#HI效價死亡(+/-)重分離2012640n.d.n.d.2022640n.d.n.d.203>640n.d.n.d.2042640n.d.n,d.2052640n.d.n.d.2062640n.d.n.d.207>640n.d.n.d.2082640n.d.n.d.209》640n.d.n.d.210<10n.d.n.d.211<10n.d.n.d.2122640n.d.n.d.213>640n.d.n.d.214>640n.d,n.d.2152640n.d.n.d.2162640n.d.n.d.2172640n.d.n.d.2182640n.d.n.d.2192640n.d.n.d.2202640n.d,n.d.221<10n.d.n.d.2222640n.d.n.d.2232640n.d.n.d.2242640n.d.n.d.2252640n,d.n.d.n.d.=未測定，雞只未攻擊或在采杏戈子之前死亡表14未接種對照組的各雞對攻擊誘導死亡的易感性和缺乏血清學反應<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>n,d，=未測定，雞只未攻擊或在采拭子之前死亡接種滅活原型的各組(第1-5組)反應的幾何平均效價水平分別為109、174、199、527和328，當考慮所測各雞的結(jié)果時。大量雞只沒有可檢測的反應，表明對它們進行了錯誤接種或者它們就是對接種無反應。如果這些雞只排除在考慮之外，則第1-5組的幾何平均效價分別為195、533、403、640和640。注意在幾何平均效價的計算中，一只雞沒有可檢測的反應(<1:10，所測的最低稀釋度)，就認為效價為5。對于反應記錄為640(所測最高稀釋度)的雞只而言，實際終點必定比進行的試驗更高，但這些雞仍然算作效價為640。因此，幾何平均效價是評價疫苗效果的極限值。至于血清學反應，第1-5組接種增加的劑量水平，分別為18/25(72%)、19/25(76%)、20/25(80%)、24/25(96%)和22/25(88%),其反應的歲丈^介為1:40或更大。因此，在各雞的基礎上進一步評價血清學試驗結(jié)果，觀察到一些雞沒有可檢測的接種后抗體效價。考慮到先前效力研究的結(jié)果，其中試驗同樣的疫苗并發(fā)現(xiàn)能夠引起可靠的抗體反應，這4艮可能是這些雞的錯誤接種是一個顯著性的因素。在隨后的攻擊結(jié)果討論中提供了進一步解釋。攻擊保護性認為該研究的結(jié)果證明了針對由強毒性H5-型禽流感攻擊所弓)起的死亡的功效。正如下表15所示的匯總數(shù)據(jù)明確表示的那樣，高致病性禽流感病毒株A/雞/越南/c58/04(H5N1型)在攻擊后2天內(nèi)引起未接種對照雞100%死亡。同時，所有接種組在同樣的攻擊后都具有針對死亡的保護性，保護水平為80%或更高。然而，在該項研究中認為效力不滿意的兩種疫苗也具有針對攻擊的保護性。認為這表明效力試驗方法是嚴格的，所述方法對在試驗條件下證實各批提供保護性的能力上具有保守標準。表15用滅活rgH5N3疫苗預防由曱型禽流感/雞/越南/c58/04(H5N1型)引起的死亡<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>注意第5處理組未受攻擊攻擊后4天，對采自存活雞氣管和泄殖腔的拭子也進行了病毒重分離。同先前所見到的一樣，未接種雞在攻擊后的死亡率為100%，這樣就無法測定對照組的重分離，因此也就無法進行針對重分離的保護性的統(tǒng)計學評價。因為每只雞都有腿箍標識，所以每只雞都可以追蹤到血清學反應和保護性反應，如表9-14所報告。特別令人感興趣的是經(jīng)標準化效力試驗測定的HAI效價以及病毒攻擊后的死亡率和重分離之間的比較。如表16所示，對于陰性抗體反應(<10)的雞只而言，攻擊后的死亡率實際上是確定的。對于具有低抗體反應(10-40)的雞只而言，完全阻止了死亡，但卻沒能阻止病毒釋放。對于抗體反應為80或更高的雞而言，基本阻止了死亡和從氣管和/或泄殖腔的釋放。表16不考慮疫苗劑量，在接種后受到攻擊的雞中，效力試驗效價(HAI)與針對高毒性H5N1禽流感的保護性之間的關(guān)系效價組效價組中的雞數(shù)目死亡率重分離陽性率<101312/130/110-4050/54/5>40620/621/62與不具有可檢測效價(<1:10)的雞相比，具有可檢測效價(21:10)的雞死亡的預防率為100%(95%CI94.6，100)。與效價<1:10的雞相比，效價>1:40的雞死亡的預防率為100%(95%CI94.2,100)。中等效價水平(1:10-1:40)的雞只數(shù)量不夠多，對這樣的效價的保護性無法進行統(tǒng)計推斷。另外，在接種/血清學釋放測定中，l:40或更大的闊值看來是適當?shù)奈恢?，以確^f呆對批效力的適當i正實。這些結(jié)果指出，適當?shù)囊呙缃o予方式是至關(guān)重要的。甚至是最好的疫苗，如果給藥方式不佳而使雞得到低于最佳的抗體反應，這也會使存活的雞釋放病毒。如果只是因為這一點，對于不僅希望能預防接觸高致病性H5N1禽流感的雞只死亡、而且要減少病毒釋^:的接種程序而言，應認真考慮一下雙劑量方案。因此，在有條件許可(conditionallicense)支持下進行的野外安全性研究(fieldsafetystudy)將會包括使用兩次接種。結(jié)論對于含有劑量為64HAU/107GEID5Q/0.09ngH5/劑或更高劑量的H5N3林的滅活疫苗而言，已經(jīng)證明了針對由高致病性H5-型禽流感引起死亡的功效。實施例4H5N3滅活流感疫苗對鴨子的功效疫苗制備了幾種疫苗，其一是安慰劑疫苗，含無病毒尿嚢液。所有其它疫苗都含基本上按照實施例1和表17所述而制備的滅活禽流感病毒母液。在構(gòu)建重配病毒期間在非洲綠猴腎細胞(Verocell)中傳代一次，接著經(jīng)過6次SPF雞胚傳代，制備滅活抗原母液。用礦物油作為載體，吐溫80和司盤83作為乳化劑，將疫苗配制成油包水乳劑(60:40的油:水比例)。吐溫和抗原組分與Drakeol和司盤83分開混合，并將水相緩慢加入油相，同時攪拌以形成預制乳劑。然后用固定頭SilversonL4R勻漿器對該預制乳劑進行機械勻漿。表17所用的疫苗疫苗系列禽流感抗原含量/劑用于實驗叱H5HAU2073-110.25641,2,32073-120.501281,32073-131.203071,32073-14001,2,32228-450.125322,32228-460.0625162,32228-510.031383接種接種前，給鴨(JwM;/鄉(xiāng)咖/zos;來自IdealPoultry,Cameron,Texas)套上腿箍，其上有治療組和分欄的記錄。按照下表18-20所示給鴨接種。實驗1的鴨在鴨胸經(jīng)肌內(nèi)接種0.5ml(組l-"或0.6ml(組4)，使用帶20號1/2，，-3/4，，針頭的3ml無菌一次性注射器。第5組的鴨未接種。當鴨在2周齡時進行初次接種，在5周齡時以同樣方式進行加強接種。實驗2的鴨在鴨胸經(jīng)肌內(nèi)接種0.5ml,使用帶20號1/2、3/4，，針頭的3ml無菌一次性注射器。當鴨在2周齡時進行初次接種，在5周齡時以同樣方式進行加強接種。實驗3的鴨同樣在鴨胸經(jīng)肌內(nèi)接種0.5ml,除了第8組接受0.25ml系列#2228-51之外。當鴨在l周齡時進行接種，未給予加強接種。表18處理表-#1<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表19處理表-#2<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表20處理表-#3<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>攻擊在實驗1中(參見表18)，當鴨達到8周齡時進行攻擊。將攻擊病毒A/雞/越南/c58/04(30CLD50(104'5EIDs。)/鴨)經(jīng)鼻內(nèi)滴注給予鴨，體積為l.Oml。在攻擊后至少14天內(nèi)每天觀察所有鴨的死亡情況。在實驗2中(參見表19)。當鴨達到8周齡時進行攻擊。將攻擊病毒A/雞/越南/c58/04(30CLD50(IO45EID5。)/鴨)經(jīng)鼻內(nèi)滴注給予鴨，體積為l.Oml。在攻擊后至少14天內(nèi)每天觀察所有鴨的死亡情況。在實驗3中(參見表20),當鴨達到8-9周齡(59天)時進行攻擊。將攻擊病毒A/鴨/泰國/D4AT/04(A/duck/Thailand/D4AT/04)(100DLD5o(10"EID5o)/鴨)經(jīng)鼻內(nèi)滴注給予鴨，體積為l.Oml。在攻擊后至少14天內(nèi)每天觀察所有鴨的死亡情況。采樣在接種后和攻擊后的不同時間點采集所有鴨的血樣。將血樣在37攝氏度放置30分鐘，然后移至4攝氏度過夜，讓其凝血。將血清無菌地移入單個無菌管，用于通過血凝抑制測定進行血清學分析。將血清樣品貯存于-30攝氏度或更低溫度待檢。在攻擊后不同時間點，將采自活鴨氣管和泄殖腔的拭子在SPF雞胚中進行病毒重分離。將拭子放入裝有l(wèi)ml病毒轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基(由1:1的PBS/甘油混合物與2xl()S單位/L青霉素、2xl(^單位/L多粘菌素B、250mg/L慶大霉素、0.5xl()S單位/L制霉菌素、60mg/L氧氟沙星HC1和0.2gm/L磺胺曱噁唑組成)的試管中。將拭子凍存于-70攝氏度或更低溫度待檢。實驗l的疫苗功效實驗1的結(jié)果概述見下表21。表21滅活H5N3流感疫苗對鴨子的功效(實驗1)處理疫血清學(HIGMT)氣管重分離泄殖腔重分離攻擊苗劑量212125351017351017后死dpvdpbdpcdpcdpcdpcdpcdpcdpcdpcdpc亡率1.2嗎522202090/130/130/130/130/130/130/130/130/130.5叫451511420/120/120/120/120/120/120/120/120/120.25叫722901771/140/140/140/140/140/141/140/140/14安慰劑<10<1012712/133/130/120/1211/132/130/120/121/13dpv^妄種后的天數(shù)dpb^加強接種后的天數(shù)dpc=攻擊后的天數(shù)通過HI測定，各種劑量的疫苗(1.2嗎、0.5lag和0.25jLig)誘導可檢測水平的抗體；初次接種后21天的幾何平均效價分別為52、45和72。再次接種后，效價分別升至220、151和290。同時，安慰劑組在初次或再次接種后都沒有可檢測的抗體。攻擊后，安慰劑-接種組的抗體效價上升很多，而抗原接種組的抗體效價不變。在用A/雞/越南/C58/04(HSN1)病毒攻擊的安慰劑(或接種)的鴨子中，沒有死亡或疾病征兆。然而，在攻擊后3天，從安慰劑接種組的所有鴨子中都重新分離到病毒，而從接種組的任一只中都未重新分離到病毒。對于0.25、0.5和1.2的疫苗劑量而言，阻止自氣管拭子分離出病毒的疫苗功效分別為100%(95%CI，76.43%-100%)、100%(95%CI，73.06%-100%)和100%(95%CI，74.86%-100%)。對于0,25、0.5和1.2的疫苗劑量而言，阻止自泄殖腔拭子分離出病毒的疫苗功效分別為100%(95%CI，75.07%-100%)、100%(95%CI,71.47%-100%)和100%(95%CI，73.39%-100%)。實驗2的疫苗功效實驗2的結(jié)果概述見下表22。表22滅活H5N3流感疫苗對鴨子的功效(實驗2)處理疫苗血清學(HIGMT)氣管重分離泄殖腔重分離攻擊劑量2121213571135711后死dpvdpbdpcdpcdpcdpcdpcdpcdpcdpcdpc亡率0.25貼(a)374352531/100/100/100/100/100/100/100/100/100.25ng(b)353673670/100/100/100/100/100/100/100/100/100.125嗎152111711/100/100/100/100/100/101/100/100/100.0625)ig212391490/100/100/100/100/100/100/100/100/100.0313|ig<10921210/100/100/100/100/100/100/100/100/10安慰劑<10<103459/103/90/100/109/102/91/90/91/10dpv—妾種后的天數(shù)dpb-加強接種后的天數(shù)dpc-攻擊后的天數(shù)在該實驗中，接受比第一次實驗更低抗原含量(0.0313、0.0625和0.125pgHA)的疫苗制劑的鴨子，其幾何平均HI效價分別為〈0、21和15。在初次接種后，最低劑量的疫苗(0.0313)僅在IO只鴨子中的5只體內(nèi)誘導出可檢測的HI反應。用0.0625或0.125嗎HA接種后，各組有8/10的鴨子具有可4企測的HI抗體。在0.25嗎組，所有10只鴨子對初次接種都有反應。一旦再次接種，所有組的HI效價都顯著增加，范圍為92(0.0313)至435(0.25)，而安慰劑接種組仍呈陰性。攻擊后，安慰劑-接種組的抗體效價上升很多，而抗原接種組的抗體效價基本上不變。攻擊后，攻擊病毒僅在未接種對照組的10/10只鴨子中發(fā)生復制。在接受兩個劑量的0.0313或0.0625pgHA的鴨子中未纟企測到病毒復制。相比之下，在0.125ng組中有2/10的鴨子、在0.25ng組中有1/20的鴨子釋放最低檢測水平的病毒達1天。與對照相比，在兩個劑量的0.0313至0.0625fig之后，阻止氣管釋》文的疫苗功效為100%(95%CI,68.05%-100%)，而在兩個劑量的0.25pg之后，阻止氣管釋放的疫苗功效為94.44%(95%CI，73.5%-9.82%)。與同欄混養(yǎng)的對照鴨相比，兩個劑量的0.125fig之后，阻止氣管釋放的疫苗功效為88.89%(95%CI，51.87%-99.65%)。實驗3的疫苗功效最初兩次實驗采用初次-加強免疫方案，所測的所有抗原水平都誘導出針對病毒釋放的保護作用。因此，在第三次實驗，測試了用更低抗原含量的疫苗的單次接種。55表23滅活H5N3流感疫苗對鴨的功效(實驗3)<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>dpc=攻擊后的天數(shù)攻擊前的抗體效價范圍為^0(0.015)ugHA)至101(0.5|^gHA)。在接種組鴨中，在攻擊后，針對攻擊病毒的HI抗體效價沒有增加，但在安慰劑-對照組中卻有所增加，這表明攻擊病毒在接種鴨體內(nèi)未復制。在任何接種鴨中都未^r出死亡或疾病征兆。相比之下，安慰劑組中有8/12死亡，其余都具有嚴重病征，包括神經(jīng)異常和/或眼混濁。將鴨子按欄劃分到治療組，使得在所測疫苗提供的保護性差異上的統(tǒng)計學評價中不會排除分欄影響。盡管如此，還是根據(jù)各鴨只來進行保護性的統(tǒng)計學分析，用Bonferroni調(diào)整計算出p值。在這種情況下，與對照欄的鴨子相比，接種1.2、0,0625、0.03B或0.015昭疫苗劑量的鴨欄，其死亡率有明顯的預防效果(p-0.0329),這些組的疫苗功效為100%(95%CI,34.94%-1000/o)。與對照欄相比，接種0.125、0.5和0.25pg疫苗劑量的各欄鴨只之間的死亡率差異沒有統(tǒng)計學顯著性(p=0.0897)。這可能反映了研究的低統(tǒng)計率，這是因為在BSL3+設施中可飼養(yǎng)的鴨子數(shù)量有限，而且疫苗在這些劑量上不一定有功效。與對照相比，在一妻受0.125|Lig和0.25|ag疫苗劑量的鴨欄中疫苗預防死亡率的功效為100%(95%CI，38.63%-100%)。與對照相比，在接受0.5pg的疫苗劑量的鴨欄中疫苗預防死亡率的功效為100%(95°/。CI，22.03%-100%)。結(jié)論無論是從預防死亡和/或防止病毒從氣管或泄殖腔釋放方面看，所有所測劑量水平和/或接種方案都誘導保護性反應。對于配制，證明使用基于礦物油的佐劑體系(用司盤83和吐溫80作為乳化劑，提供60/40的油:水比例的乳劑)對鴨特別有效。同樣，在用于雞和相關(guān)滅活雙價禽流感產(chǎn)品(Poulvaci-AIH5N9,H7N1,由荷蘭FDAH生產(chǎn))的制劑上也證明該乳劑是非常有效的。在實驗1中，所有劑量水平在兩次接種后都具有保護性，而實驗2評價了使用更低劑量水平來界定保護所需的最低劑量。然而，甚至用更低抗原含量的疫苗進行兩次接種，對于攻擊后的病毒釋放具有完全的保護性。由此產(chǎn)生了實驗3的研究設計，在其中評價了單劑量疫苗(包括一種更低抗原含量的疫苗)，用已知能引起鴨只死亡的泰國分離抹進行了攻擊。因此，實驗3代表了所進行的最嚴格的試驗，其中鴨只在一周齡接受單劑量疫苗，在8-9周齡用對水禽具有高致病性的分離抹進行攻擊。在該模型中，證明單次接種4HAU的禽流感抗原(l/2體積的系列2228-51的劑量)，能有效預防死亡并預防病毒自氣管和泄殖腔釋^:。該實驗也證明在給予單劑量疫苗后免疫力的持續(xù)時間為至少7周。綜上所述，這3次實驗表明疫苗在兩種不同情況下對鴨子的有效性。前兩次實驗證明疫苗能預防鴨的攜帶狀態(tài)，因為接種的鴨在用不能虧J起水禽的明顯臨床癥狀或死亡、但對雞具有高致病性的分離林攻擊后，不釋放病毒。第三次實驗證明，疫苗能夠預防鴨只在用已知的水禽致病性分離4朱攻擊后的臨床癥狀、死亡和病毒釋放。對于該疫苗，所推薦的接種方案將會結(jié)合在CSIRO/AAHL(Australia)進行的實驗的結(jié)果報告，以及對禽流感的流行病學和鴨的商品化生產(chǎn)的常規(guī)飼養(yǎng)方法的適當考慮。所推薦的方案為含有256HAU/0.5ml的疫苗(抗原含量大于在現(xiàn)有報告中證明具有保護性的抗原含量，并且遠遠小于在安全性研究中所用的抗原含量)，經(jīng)皮下給予較少體積的日齡(day-of-age)劑量，然后在3周齡給予全體積的加強劑量(在參考CSIRO研究中證明有效的一種方案)。根據(jù)該方案，鴨可得到早期接種的益處，所給予的加強接種以轉(zhuǎn)變在日齡(dayofage)錯誤接種的任何鳥類和/或4吏免疫應答加強到非常高的水平。實施例4商品化鴨免疫前和滅活禽流感疫苗對高致病性禽流感病毒攻擊的效應評價疫苗制備將感染的尿嚢液(在SPF雞蛋中傳代2次)在無菌PBSA中稀釋，得到每0.5ml約為IO"鴨感染劑量so(DID5。)或10"雞感染劑量50(EID5。)的劑量。SPF雞蛋中接種物的反滴定證實了攻擊中的病毒效價。接種將60日齡商品化小鴨(北京鴨)隨機分為3組，每組各20只。免疫接種前用c-ELISA對10只小鴨進行禽流感抗體篩選。所測各小鴨均為禽流感抗體陰性。如下處置3組A組在1日齡和3周齡接種(滅活H5疫苗Poulvaci-AIH5N9,H7N1),然后在6周齡通過鼻內(nèi)(0.2ml)、目艮內(nèi)(0.1ml)和口服(0.2ml)途徑，用0.5m病毒懸液H5N1(含1015DID5。(1047EIDs。))進行攻擊。B組在1日齡和3周齡接種(滅活H5疫苗Poulvaci-AIH5N3)，然后在6周齡通過鼻內(nèi)(0.2ml)、眼內(nèi)(0.1ml)和口服(0.2ml)途徑，用0.5ml病毒懸液H5N1(含101'5DID5()(104'7EID5?！愤M行攻擊。C組在6周齡通過鼻內(nèi)(0.2ml)、眼內(nèi)(0.1ml)和口服(0.2ml)途徑，用0,5ml病毒懸液H5N1(含1015DID5q(1047eid5q))進行攻擊。曰齡接種在頸上部經(jīng)皮下給予0.2ml劑量。在3周齡在頸上部經(jīng)皮下再次接種0.5ml劑量。攻擊前，將各組數(shù)量降至15只/組(14只對照)，所有鴨只都各自用帶編號的腿箍作為標識。就在攻擊之前，自各鴨采血樣用于血清學研究，然后在攻擊后11天和14天，自各存活鴨采血樣用于血清學研究。用lml刻度注射器進行攻擊。將接種物通過一個或兩個鼻孔小心加入到崢開的雙眼和口中。在整個研究過程中每日觀察鴨子的臨床癥狀，在急性期每日兩次觀察鴨子的臨床癥狀。為了監(jiān)測攻擊后的病毒釋放，在攻擊后的4、5、6和7天，自各受攻擊鴨子采集氣管拭子和泄殖腔拭子。然后所選樣品用于在SPF雞蛋或商品化蛋(如果SPF蛋不可行的話)中進行病毒分離。死亡率和發(fā)病率攻擊后4天，所有對照鴨(C組)都不活躍和食欲不振，并伴有綠色腹瀉和明顯的體重減輕。在第10天，4只對照鴨死亡而沒有臨床癥狀，另有5只具有神經(jīng)學癥狀(顫搐、歪頭、甩頭、翅膀麻痹)，該組的14只中還剩5只。在兩組接種組(A組和B組)的每組中，所有15只在整個研究期間在臨床上都表現(xiàn)良好。血清學通過頸靜脈或翅脈穿刺，采集足夠進行所有血清學實驗的血液。收獲血清并貯存于-20攝氏度或更低溫度待檢。所有未接種鴨在用H5N1病毒攻擊前都對越南H5抗原呈HI活性陰性。有趣的是，兩個接種組之間在接種后、攻擊前的HI效價有差異，其中與給予雙價疫59苗的A組(11=15)(陰性至l:8)相比,B組H5N3的鴨只(『15)具有更高效價(1:8至1:64)。顯然，C組中的5只存活對照鴨的血清轉(zhuǎn)變成針對攻擊，第11天的效價范圍為1:32至1:256,而第14天范圍為1:64至1:128。A組(雙價疫苗)中大部分鴨的血清在攻擊前沒有轉(zhuǎn)變成針對越南H5，但是其中6只在第11天發(fā)生血清轉(zhuǎn)變，在第14天大部分都發(fā)生了血清轉(zhuǎn)變(1:32和1:128)。2只具有可檢測的攻擊前HI效價的鴨到第14天仍是單加倍稀釋脫離血清轉(zhuǎn)化(Twobirdswhichhaddetectablepre-challengeHItitreswereonedoublingdilutionawayfromseroconversionbyday14)。這表明這2只鴨體內(nèi)病毒復制可能受到比同組其它成員略大程度的抑制，比起未免疫鴨而言，這2只鴨的血清轉(zhuǎn)變可能會晚幾天才發(fā)生。在攻擊后稍后時間里有必要進行血清學研究以證實這一點。在B組(反求遺傳學疫苗)中，所有鴨的血清在攻擊前都轉(zhuǎn)變成針對越南H5。然而，在攻擊后沒有鴨子表現(xiàn)出效價上升，表明該組鴨體內(nèi)沒有建立起病毒感染。病毒釋放在攻擊后4、5、6和7天，從各攻擊鴨采集氣管拭子和泄殖腔拭子。采集氣管樣品和泄殖腔樣品之后，將樣品放入含抗生素的等滲磷酸緩沖鹽(PBS,pH7.0-7.4)中。在接種蛋之前，將懸液貯存于-80攝氏度。除非另有說明，否則在SPF含胚禽蛋中進行病毒分離。將攻擊后4天和7天采集的樣品的上清液接種到經(jīng)9-11天孵育的至少3個含胚禽蛋的尿嚢中。將蛋在35-37攝氏度孵育至多5天。測定來自含已死或?qū)⑺琅咛サ牡啊⒁约霸诜跤┢谒猩写娴暗哪驀耙旱难?HA)活性。認為具有血凝活性的所有尿嚢液都對所給予的AI病毒呈陽性。C組在攻擊后4天或7天，對采自各對照鴨的氣管拭子進行禽流感病毒重新分離，并且在第4天，對采自這些鴨子中的2只的泄殖腔拭子進行禽流感病毒重新分離。這些觀察結(jié)果與在先前效價研究中給予同樣攻擊劑量的鴨子中所觀察到的結(jié)果一致。A組在第4天自2只接種雙價疫苗的鴨的氣管、在第4天自這些鴨中的1只的泄殖腔拭子，進行禽流感病毒的重新分離。在攻擊后7天，從該組的任何鴨子中沒有重新分離到病毒。B組在攻擊后4天或7天，從采自接種反求遺傳學H5N3疫苗的任何鴨子的氣管拭子和泄殖腔拭子中，都沒有重新分離到禽流感病毒。結(jié)論在對照組鴨中觀察到高水平的發(fā)病率(100%)和死亡率(65%)。綜合病毒釋放和存活者的血清轉(zhuǎn)變的結(jié)果來看，這表明當將攻擊病毒給予從未接觸過攻擊病毒的商品化鴨時，能夠感染和引起疾病。用雙價滅活H5疫苗Poulvaci-AIH5N9,H7N1接種，不會導致該組大部分鴨的血清轉(zhuǎn)變?yōu)獒槍υ侥螲5，但是卻可以保護鴨，以免產(chǎn)生禽流感疾病癥狀。在攻擊后，大多數(shù)鴨的血清轉(zhuǎn)變成針對H5,這表明該組鴨中發(fā)生了病毒復制。從這些鴨中重新分離到AI病毒，支持了這樣的血清學解釋。用滅活H5疫苗Poulvaci-AIH5N3接種，導致所有鴨的血清都轉(zhuǎn)化成針對越南H5，并在用H5N1病毒攻擊后具有保護性，以免發(fā)病。該組鴨在病毒攻擊后沒有血清轉(zhuǎn)化，表明在這些鴨中病毒復制受到抑制。從采自第4天或第7天的氣管拭子或泄殖腔拭子中沒有重新分離得到AI病毒，支持了這一點。實施例5疫苗組合物根據(jù)已充分了解的礦物油乳劑的免疫刺激效應，選擇佐劑，配制成油包水(W/0)乳劑。制劑中可以使用藥用級的輕質(zhì)礦物油(NF)Drakeoil5。為了得到穩(wěn)定的油包水乳劑(W/0),可使用表面活性劑。選擇表面活性劑脫水山梨醇倍半油酸酯(植物)、疏水型表面活性劑和聚山梨酯80(植物)、親水型表面活性劑，是因為它們具有乳化性。目前已經(jīng)知道使用這些表面活性劑的組合可以得到穩(wěn)定的乳劑。司盤83V(Arlacel83V)=脫水山梨醇倍半油酸酯，一種單酯和二酯的等摩爾混合物；CAS編號=8007-43-9，用于制備乳膏劑、乳劑和軟膏劑。吐溫80V(Tween80V)=聚山梨酯80=聚氧乙烯20山梨醇酐單油酸酯；CAS編號=9005-65-6,用于制備穩(wěn)定的水包油乳劑。脫水山梨醇S旨(例如司盤83V)產(chǎn)生穩(wěn)定的W/0乳劑，但是經(jīng)常與不同比例的聚山梨酯(例如吐溫80V)組合使用，以產(chǎn)生W/O乳劑。用于配制產(chǎn)品的司盤83V和吐溫80V都來源于才直物。根據(jù)已充分了解的礦物油乳劑的免疫刺激效應，選擇佐劑，配制成油包水(W/0)乳劑。制劑中可以使用藥用級的輕質(zhì)礦物油(NF)Drakeoil5。為了得到穩(wěn)定的油包水乳劑(wvo)，有必要使用表面活性劑。選擇表面活性劑脫水山梨醇倍半油酸酯(植物)、疏水型表面活性劑和聚山梨酯80(植物)、親水型表面活性劑，是因為它們具有乳化性。目前已經(jīng)知道使用這些表面活性劑的組合可以得到穩(wěn)定的乳劑。司盤83V(Arlacel83V)=脫水山梨醇倍半油酸酯，一種單酯和二酯的等摩爾混合物；CAS編號=8007-43-9,用于制備乳膏劑、乳劑和軟膏劑。吐溫80V(Tween80V)=聚山梨酯80==聚氧乙烯20山梨醇酐單油酸酯；CAS編號=9005-65-6,用于制備穩(wěn)、定的水包油乳劑。脫水山梨醇西旨(例如司盤83V)產(chǎn)生穩(wěn)定的W/0乳劑，但是經(jīng)常與不同比例的聚山梨酯(例如吐溫80V)組合使用，以產(chǎn)生W/O乳劑。用于配制產(chǎn)品的司盤83V和吐溫80V都來源于植物。劑量體積o.5ml通常用于家禽業(yè)。表24產(chǎn)品組成(每劑)配料名稱數(shù)量功能活性成分滅活禽流感病毒H5N3RG2128HA活性成分佐劑組成輕質(zhì)礦物油230mg佐劑脫水山梨醇倍半油酸酯(植物)22.5mg乳化劑聚山梨酯80(植物)4.3mg乳化劑輔料組成硫杉卩汞0.02mg防腐劑磷酸緩沖鹽溶液加入到0.5ml稀釋劑實施例6試驗了不同劑量的滅活禽流感疫苗的功效。將福爾馬林滅活的重配H5N3病毒配制成原型油包水乳劑，其含有0.25嗎血凝素(HA)蛋白/劑、0.5昭HA蛋白/劑或1.2ngHA蛋白/劑。按照血凝單位(HAU)，這些疫苗相關(guān)劑量水平分別是64、128和307HAU/劑。在2周齡和5周齡，將疫苗原型經(jīng)肌內(nèi)給予各組的25只SPF白來亨雞。無抗原的安慰劑疫苗同樣經(jīng)肌內(nèi)給予一組25只同窩孵化雞，另外的25只同窩孵化雞作為未接種的對照。恰好在首次接種之前和接種之后3周，采集雞的血樣，用于通過血凝抑制(ffl)測定來檢測禽流感抗體效價。采血前的血清樣品都呈陰63性。在初次接種后21天和加強接種后21天，所有接種組的血清樣品都含有高水平的抗體。在加強接種后3周，用從越南分離的高致病性H5N1禽流感病毒攻擊雞。疫苗提供針對死亡的100%保護率。在攻擊后的不同時間點采集自所有活雞的氣管拭子和泄殖腔拭子中，重新分離到的攻擊病毒最少。接種前給雞翼加上標記，雞翼標記隨機分到治療組并分欄。在雞胸經(jīng)肌內(nèi)接種。在雞為2周齡時初次接種，在雞為5周齡時以同樣方式給予加強接種。當雞只達到8周齡時進行攻擊。給予雞只攻擊病毒A/雞/越南/c58/04，經(jīng)鼻內(nèi)/氣管內(nèi)滴注1,Oml體積。在2、5、8和10-11周齡時采集所有雞只的血樣。在攻擊后3、5、7、10和14天，采自活雞的氣管拭子和泄殖腔拭子用于在SPF蛋中進行病毒重分離。血清抗體定量和病毒重分離方法是標準方法。對于聲稱的預防死亡，原先設計的研究是用于評價死亡率的基本結(jié)果，測試各組間死亡率無差異的無效假說。用普適評價方程模型比較各組的死亡率，其中死亡率(O或l)作為二元因變量，所包含的處理作為自變量。必要時，可包括分欄的位置作為模型的共變量(covariate)。因為未接種組的死亡率為100%，而接種組沒有死亡，所以卡方分析用于計算預防率及其相關(guān)置信區(qū)間。對于聲稱的預防病毒釋放，設計的研究是用于評價病毒分離率的基本結(jié)果，測試各組間病毒分離率無差異的無效假說。如下所述，未接種組和安慰劑接種對照組的總死亡率，使得對重分離結(jié)果進行統(tǒng)計學分析是不可能的，因此就沒有進行。用試驗原型接種2周齡和5周齡的SPF雞后，通過血凝抑制測定檢測到高水平抗體，觀察到針對攻擊死亡的完全保護性。在攻擊后，從接種雞中重分離到的病毒最少，盡管不能就此認為，與對照相比，重分離率有顯著下降(因為在這些組中可以評價重分離前死亡的所有對照)，顯然，疫苗能使病毒釋放顯著減少。為了明確證據(jù),有必要修改攻擊方案，使得未接種的雞或安慰劑接種雞在攻擊后不會立即死掉。這證明很難，因為H5N1攻擊抹對雞有超強致病性。測試了這類全病毒滅活疫苗的3種不同抗原水平。所有3種抗原水平的結(jié)果基本相同，使得在該研究中不能確定最低保護劑量。有必要用配制成含有小于0.25ng(64HAU)/劑的抗原的疫苗作進一步研究，以確定最低量。目前的結(jié)論是，用含有不小于0.25嗎(64HAU)/劑的H5N3重配病毒的含佐劑油包水乳劑進行兩次接種，對防止由越南H5N1強毒性野外分離林引起的死亡是高度有效的，而且對防止強毒性H5N1的釋放也有效。盡管在各種實施方案中已經(jīng)介紹了本發(fā)明，但是希望在不違背本說明書中描述的和所附權(quán)利要求書中具體要求保護的本發(fā)明的真實精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解對其進行的某些修改。本文所述的具體實施方案并不是對本發(fā)明范圍的限制。的確，根據(jù)本說明書及其附圖，除本文描述的那些修改之外，對本發(fā)明的各種修改是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。這樣的修改將會落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。還應理解的是，所有數(shù)值都是近似值，提供這些數(shù)值是為了進行描述。本文所引用的所有專利和專利申請都通過引用全部結(jié)合到本文中。權(quán)利要求1.一種疫苗組合物，所述組合物能有效預防或改善禽流感，并能阻止攻擊流感病毒的生長、釋放和向其它物種傳播；所述組合物包含配制在生物學上可接受的佐劑材料中的反求遺傳學病毒，所述病毒的組成如下來自H5禽流感高致病性毒株的HA部分；來自第二種低致病性毒株的N部分，其中所述第二種低致病性毒株具有與HA部分所來源的病毒不同的N亞型；以及選自低致病性病毒的其余病毒基因組，其中所述低致病性病毒與N部分所來源的病毒相同或不同。2.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述來自H5禽流感高致病性毒抹的HA部分來源于H5N1亞洲林。3.權(quán)利要求2的疫苗組合物，其中所述H5N1亞洲抹是A/雞/越南/C58/05H5N1。4.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述來自具有與HA部分所來源的病毒不同的N亞型的第二種低致病性毒林的N部分來源于具有N3、N5或N9亞型的歐洲或美洲譜系毒株。5.權(quán)利要求4的疫苗組合物，其中所述來自具有與HA部分所來源的病毒不同的N亞型的第二種低致病性毒抹的N部分來源于A/DK/德國/1215〃3H2N3。6.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述選自低致病性病毒的其余病毒基因組來源于A/波多黎各/8/34HlNl。7.權(quán)利要求l的疫苗組合物，其中所述病毒是滅活病毒。8.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述病毒配制在油包水乳劑中。9.權(quán)利要求8的疫苗組合物，其中所述乳劑包含至少兩種表面活性劑，選自脫水山梨醇油酸酯和環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物。10.權(quán)利要求8的疫苗組合物，其中所述脫水山梨醇油酸酯是吐溫80和脫水山梨醇倍半油酸酯。11.一種預防或改善禽流感病毒感染爆發(fā)的方法，所述方法包括給予家禽權(quán)利要求1-10中任一項的疫苗組合物。12.權(quán)利要求11的方法，其中所迷疫苗組合物通過飲用水或噴霧給予。13.權(quán)利要求11的方法，其中所述劑量范圍在約0.25ml/家禽至2.0ml/家禽。14.權(quán)利要求13的方法，其中給予不止一個劑量的所述疫苗。15.—種用于有效預防或改善禽流感病毒感染的疫苗組合物，所述組合物包含配制在生物學上可接受的佐劑材料中的反求遺傳學病毒，所述病毒的組成如下來自H5禽流感高致病性毒林的HA部分；來自第二種低致病性毒林的N部分，其中所述第二種低致病性毒株具有與HA部分所來源的病毒不同的N亞型；以及選自低致病性病毒的其余病毒基因組，其中所述低致病性病毒與N部分所來源的病毒相同或不同；其中血凝素(HA)總量至少為約250HA/劑的所述疫苗組合物，而且其中所述組合物含有兩種基本由脫水山梨醇油酸酯組成的表面活性劑。16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述表面活性劑是吐溫80和脫水山梨醇倍半油酸酯。17.權(quán)利要求15的組合物，其中所述來自H5禽流感高致病性毒林的HA部分來源于H5N1亞洲抹。18.權(quán)利要求15的組合物，其中所述H5N1亞洲株是A/番鴨/越南/453/2004H5N1。19.權(quán)利要求15的組合物，其中所述反求遺傳學病毒是滅活病毒。20.權(quán)利要求15的組合物，所述組合物還包含至少一種額外的家禽抗原。全文摘要本發(fā)明公開了用于有效預防或改善禽流感病毒感染的疫苗組合物和方法。所述疫苗含有至少兩種滅活禽流感病毒株，其中混合血凝素(HA)總量至少約為200HA/劑的疫苗組合物，并且其中每一毒株都至少約為128HA/劑，而且其中一種毒株具有與攻擊病毒相同的HA亞型，其中至少一種毒株具有與攻擊病毒不同的NA亞型。文檔編號A61K39/00GK101448520SQ200780017831公開日2009年6月3日申請日期2007年4月23日優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日發(fā)明者E·霍夫曼,M·庫馬,R·G·韋布斯特,R·J·維比,S·L·克勞斯申請人:惠氏公司