專利名稱：甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速、準(zhǔn)確、操作簡單的甘蔗宿根矮化病菌檢測方法，屬 植物保護(hù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘蔗宿根矮化病RSD是普遍存在于所有植蔗地區(qū)的一種世界性的重要病害。 自1944 1945年在澳大利亞昆士蘭首次發(fā)現(xiàn)以來，己有美國、南非、毛里求斯、 印度、巴西等47個國家和地區(qū)報道了該病的發(fā)生，遍布世界各蔗區(qū)。我國臺灣 省于1945年最先報道此病的發(fā)生，在大陸1986確診存在甘蔗宿根矮化病，之后 廣東、福建、廣西、云南曾對全省蔗區(qū)進(jìn)行普查，結(jié)果表明均存在此病。此病由 一種棒桿菌屬細(xì)菌寄生于蔗株的維管束中引起，主要通過帶病蔗種和收獲、砍種 刀具等傳播蔓延，且傳播性極強(qiáng)。蔗株染病后變矮，蔗莖變細(xì)，生長遲滯，宿根 發(fā)株少，在干旱地區(qū)和種植感病品種的蔗區(qū)所造成的損失尤其重要，病害造成損 失的程度隨宿根年數(shù)的增加而增加， 一般減產(chǎn)10 30%，干旱缺水時可達(dá)60%以 上，還可導(dǎo)致品種退化。RSD無明顯的外部和內(nèi)部癥狀，病原菌難以分離和培養(yǎng)， 傳統(tǒng)診斷方法極其困難，因而迫切需要建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確、實(shí)用的檢測 方法，以期為該病害的診斷和防治、脫毒種苗的生產(chǎn)、對外甘蔗品種/材料交換 檢疫檢測提供技術(shù)支撐。
目前，對甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法主要有剖莖檢測法、相差顯微鏡檢 測法和PCR法。但剖莖檢測法和相差顯微鏡檢測法準(zhǔn)確性差、操作繁瑣、檢測靈 敏低，PCR法檢測體系不易穩(wěn)定，因此不適合田間大批量樣品的快速檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法，該方法克服了現(xiàn) 有檢測方法中的不足，簡便、快速、準(zhǔn)確、操作簡單、適合田間大批量樣品檢
本發(fā)明包括以下步驟
1 、將待測樣品印在硝酸纖維素膜上獲得印跡斑；
2、把硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移至含O. 1%甘蔗宿根矮化病菌特異性抗血清的封閉緩 沖液中孵育；
3、 把硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移至含O. 01%堿性磷酸酶標(biāo)記抗體、1。/。脫脂奶粉的TBST 緩沖液中孵育；
4、 把硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)入底物/緩沖液中顯色；
5、 結(jié)果判別硝酸纖維素膜顯色后組織斑上呈紫紅色即可確定檢測樣品中 有甘蔗宿根矮化病菌存在，組織斑不顯色則檢測樣品中沒有甘蔗宿根矮化病菌。
本發(fā)明的有益效果是能快速準(zhǔn)確的檢測甘蔗宿根矮化病菌，檢測結(jié)果易于 目測判斷，且操作簡單，取樣少，節(jié)省勞力，結(jié)果可靠，不易受污染，不需特 殊儀器，也不需特殊條件，適合于田間大批量樣品檢測。
具體實(shí)施例方式
1、 制樣和組織印跡取待測甘蔗樣品中下部莖節(jié)，用砍刀切成9 llcm長， 用轉(zhuǎn)子鉆出中間部分后再用鋒利刀片將其橫切成平面，用力將橫切面在硝酸纖
維素膜上垂直點(diǎn)壓10 15秒，獲得印跡斑；
2、 封閉將封閉緩沖液倒入裝有硝酸纖維素膜的培養(yǎng)皿里，37"C下孵育 45min;
3、 TBST緩沖液快速洗膜1次倒去培養(yǎng)皿里封閉緩沖液，加入TBST緩沖 液，使硝酸纖維素膜浸入其中，輕輕轉(zhuǎn)動幾下，再棄去TBST緩沖液。
4、 加抗體把硝酸纖維素膜浸入含0. 1%甘蔗宿根矮化病菌特異性抗血清和 1%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，37"下孵育2h， TBST緩沖液洗膜3次，每次 3min;
5、 加酶標(biāo)抗體把硝酸纖維素膜浸入含0. 01%堿性磷酸酶標(biāo)記抗體和1%脫 脂奶粉的TBST緩沖液中，37。C下孵育2h， TBST緩沖液洗膜4次，每次3min;
6、 加底物顯色把硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)入底物/緩沖液BCIP/NBT 二片加20ml 雙蒸水溶解中顯色5 10min，取出后用蒸餾水沖洗，自然干燥；
7、 結(jié)果判別肉眼觀察或顯微鏡觀察判別，感染甘蔗宿根矮化病菌的樣品 組織斑上呈紫紅色，不感染的組織斑上不顯色。
上述的TBST緩沖液由PH8. 0的Tris-HC16. 05g+NaCl 2. 92g+1000ml雙蒸水， 再按重量計加入0. 5mlTween20組成。
封閉緩沖液為TBST中按重量計加入5%脫脂奶粉。 所用的酶標(biāo)抗體為羊抗兔堿性磷酸酶標(biāo)記抗體Goat Anti Robbit。 所用的底物BCIP/ NBT是5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮藍(lán)四唑。
權(quán)利要求
1、一種甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行1)、制樣和組織印跡取甘蔗中下部莖節(jié)，切成9～11cm長，取中間部分將其橫切成平面，將切面在硝酸纖維素膜上垂直點(diǎn)壓10～15秒，獲得印跡斑；2)、封閉將封閉緩沖液倒入裝有硝酸纖維素膜的培養(yǎng)皿里，37℃下孵育45min，倒去培養(yǎng)皿里封閉緩沖液，加入TBST緩沖液，使硝酸纖維素膜浸入其中，輕輕轉(zhuǎn)動幾下，再棄去TBST緩沖液；3)、加抗體把硝酸纖維素膜浸入含0.1％甘蔗宿根矮化病特異性抗血清和1％脫脂奶粉的TBST緩沖液中，37℃下孵育2h，再用TBST緩沖液洗膜3次，每次3min；4)加酶標(biāo)抗體把硝酸纖維素膜浸入含0.01％堿性磷酸酶標(biāo)記抗體和1％脫脂奶粉的TBST緩沖液中，37℃下孵育2h，用TBST緩沖液洗膜4次，每次3min；5)加底物顯色把硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)入底物/緩沖液BCIP/NBT二片加20ml雙蒸水溶解中顯色5～10min，取出后用蒸餾水沖洗，自然干燥；6)結(jié)果判別肉眼觀察或顯微鏡觀察判別，感染甘蔗宿根矮化病菌的樣品組織斑上呈紫紅色，不感染的組織斑上不顯色。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法，其特征在于TBST 緩沖液由PH8.0的Tris-HC16. 05g+NaCl 2. 92g+1000ml雙蒸水，再按重量計加 入0.5mlTween20。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法，其特征在于封閉 緩沖液為TBST中按重量計加入5%脫脂奶粉。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌檢測方法，其特征在于所用的 酶標(biāo)抗體為羊抗兔堿性磷酸酶標(biāo)記抗體Goat Anti Robbit。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法，其特征在于所用 的底物BCIP/ NBT是5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮藍(lán)四唑。
全文摘要
一種甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法，1.將待測樣本組織斑印在硝酸纖維素膜上；2.分別依次把硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移至含0.1％甘蔗宿根矮化病特異性抗血清的封閉緩沖液中孵育；3.把硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移至含0.01％堿性磷酸酶標(biāo)記抗體、1％脫脂奶粉的TBST緩沖液中孵育；4.把硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)入底物/緩沖液中顯色；5.結(jié)果判別硝酸纖維素膜顯色后組織斑上呈紫紅色即可確定檢測樣本中有甘蔗宿根矮化病菌存在，組織斑不顯色則檢測樣本中沒有甘蔗宿根矮化病菌；該方法能快速準(zhǔn)確的檢測甘蔗宿根矮化病菌，檢測結(jié)果易于目測判斷，且操作簡單，取樣少，節(jié)省勞力，結(jié)果可靠，不易受污染，不需特殊儀器，也不需特殊條件，適合于田間大批量樣品檢測。
文檔編號G01N21/77GK101363852SQ200810058999
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日
發(fā)明者盧文潔, 吳才文, 李文鳳, 羅志明, 黃應(yīng)昆 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所