專利名稱：一個新型阿拉伯糖苷酶基因的表達(dá)及優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、酶學(xué)、生物信息學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域。具體涉及對一個α-阿拉伯糖苷酶基因高效表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
半纖維素在自然界中含量之豐富，僅次于纖維素，如在秸稈中半纖維素的含量占其干重的25％～50％(Glazer AN，Nikaido H Microbial Biotechnology NewYorkFreomanGmpany，1995)。木聚糖類半纖維素是一類可再生資源，經(jīng)一系列酶水解成為寡糖或單糖，被用作雙歧因子或發(fā)酵原料。近幾年來木聚糖的酶法水解和開發(fā)利用問題已發(fā)展為一個研究熱點。木聚糖的酶法水解所面臨的技術(shù)挑戰(zhàn)之一是需要高性能的木聚糖降解酶，包括水解主鏈的木聚糖酶、木糖苷酶和分解側(cè)枝的阿拉伯糖苷酶、葡萄糖醛酸酶。
阿拉伯糖殘基在木聚糖中大量存在。阿拉伯糖殘基單體或低聚體以α-1，3或α-1，2鍵連接在木糖的主鏈上(Sunna A，Autranikian G，Crital Revieasin Biotechnology，1997，17(1)39～6)形成側(cè)枝。側(cè)枝的存在會降低木聚糖酶將高聚合度的木聚糖降解為寡糖的反應(yīng)速度，并阻止木糖苷酶將帶有側(cè)枝的寡糖徹底水解為單糖。阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.55)能夠?qū)⒗莻?cè)枝從主鏈上除去，能夠與木糖苷酶及木聚糖酶發(fā)生協(xié)同作用，是木聚糖的徹底水解所必須的酶之一。同時，阿拉伯糖苷酶能夠釋放以糖苷鍵連接的非揮發(fā)的單萜類物質(zhì)而使酒或果汁的香味增加，它的應(yīng)用潛力正受到越來越多的關(guān)注(Clinche F L，F(xiàn)rancisco P，Danie R，etal.J Agric Chem，1997，452379～2383)。
不同的阿拉伯糖苷酶對阿拉伯糖側(cè)枝的水解有不同的底物偏好性，有的酶只對低聚木糖上的側(cè)枝有較高的活力，而有的酶對高度聚合的木聚糖上的側(cè)枝也有較高的活力。只有對長鏈木聚糖具有高活力的阿拉伯糖苷酶才能與木聚糖酶發(fā)生協(xié)同作用，從而加速木聚糖主鏈的降解。雖然已有很多種阿拉伯糖苷酶被純化或克隆，但是多數(shù)酶偏好低聚木糖類底物，其它酶的底物偏好性沒有得到研究。
不同來源的阿拉伯糖苷酶還具有不同的穩(wěn)定性，如果不需要終止催化反應(yīng)，酶的半衰期長就意味著效率高，來源于嗜熱微生物的酶通常有更好的穩(wěn)定性。但是，來源于嗜熱微生物的基因在大腸桿菌等常溫菌中進(jìn)行表達(dá)時通常表達(dá)水平較低，需要通過定點誘變或定向進(jìn)化提高表達(dá)水平，從而降低生產(chǎn)成本，產(chǎn)生商品化價值。
在研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)了一種由嗜熱性芽孢桿菌分泌的、對高度聚合的木聚糖具有較高脫側(cè)枝活力的熱穩(wěn)定性阿拉伯糖苷酶。我們克隆了編碼該酶的全基因，并遞交至GenBank，獲得的登陸號為DQ324528。該基因名為araB，全長為1479個堿基，編碼492個氨基酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種阿拉伯糖苷酶基因的表達(dá)方法，解決目前阿拉伯糖苷酶種類單一、生產(chǎn)水平低、利用率差等瓶頸問題。
本發(fā)明所說的阿拉伯糖苷酶基因的表達(dá)方法，是將編碼阿拉伯糖苷酶的基因插入載體pHsh，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞構(gòu)建成重組菌；再將重組菌培養(yǎng)至OD600為0.5-1.2，通過熱激誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組阿拉伯糖苷酶。
所說的編碼阿拉伯糖苷酶的基因是araB，其全長為1479個堿基，GenBank的登陸號為DQ324528。將araB或它的成熟肽基因克隆到表達(dá)載體pHsh中構(gòu)建成重組質(zhì)粒pHsh-araB和不帶信號肽的pHsh-ara。但是其自然基因araB在大腸桿菌中的表達(dá)水平不夠高，通過對重組質(zhì)粒的分析發(fā)現(xiàn)在翻譯起始區(qū)可能形成二級結(jié)構(gòu)，并且基因的編碼區(qū)含有一些大腸桿菌的非優(yōu)勢密碼子，為了提高阿拉伯糖苷酶的基因的表達(dá)水平，本發(fā)明提供了進(jìn)一步的技術(shù)方案，通過基因誘變改變密碼子偏好性和優(yōu)化mRNA的二級結(jié)構(gòu)，提高其在大腸桿菌中的表達(dá)水平。其具體方法是1.將araB或它的成熟肽基因克隆到表達(dá)載體pHsh中構(gòu)建成pHsh-araB和不帶信號肽的pHsh-ara；2.分析pHsh-ara中的密碼子及可能產(chǎn)生的mRNA二級結(jié)構(gòu)，設(shè)計誘變引物，并在pHsh-ara中進(jìn)行原位誘變，獲得含突變基因的重組質(zhì)粒。
3、將含突變基因的重組質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，獲得重組阿拉伯糖苷酶。
本發(fā)明更具體的方案是設(shè)計誘變引物為引物15’-ATGAA CGGCA CTGTT AAAGTTAACG AAGTG ATTGG ACGCA TTTCT AAAC-3’；引物25’-TTTTA TATCT CCTTCTTGTC GACGG TTA-3’；獲得pHsh-araU。根據(jù)該方案得到的阿拉伯糖苷酶突變基因命名為araU，其堿基序列如SEQ ID NO1所示。
本發(fā)明用pHsh系統(tǒng)對阿拉伯糖苷酶進(jìn)行表達(dá)，并利用定向改造方法對基因進(jìn)行改造，進(jìn)一步提高了表達(dá)水平，使熱穩(wěn)定性阿拉伯糖苷酶的重組蛋白的表達(dá)量占總蛋白的15％以上。通過本發(fā)明得到的重組阿拉伯糖苷酶對環(huán)境因子具有較強的抗性，Sr2+，Li2+，Mg2+，Ca2+，Ni2+，Zn2+，Cu2+，Co2+和EDTA對它影響不大；具有較廣的溫度和pH適應(yīng)性，在pH 4.8-7.6，40℃-75℃的范圍內(nèi)顯示較高的活性；能降解高度聚合的木聚糖的阿拉伯糖側(cè)枝。


圖1示為重組質(zhì)粒pHsh-araU示意圖。
圖2示為重組菌表達(dá)水平SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；其中1空白對照E.coli/pHsh 2重組菌E.coli/pHsh-ara 3重組菌E.coli/pHsh-araU圖3示為重組阿拉伯糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)測定圖。
A最適反應(yīng)pH圖；B最適反應(yīng)溫度圖；CpH穩(wěn)定性圖；D溫度穩(wěn)定性圖；60℃(◆)，65℃(■)，70℃(▲)，75℃(×)。
圖4示為重組阿拉伯糖苷酶降解試驗層析圖，其中1阿拉伯糖；2本發(fā)明方法表達(dá)的阿拉伯糖苷酶處理的木聚糖(2％，wt/vol)；3木聚糖(2％，wt/vol)具體實施方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。發(fā)下實施例中所說的阿拉伯糖苷酶基因araB由本實驗室克隆和保存。
實施例一阿拉伯糖苷酶基因的定向誘變1.阿拉伯糖苷酶基因的亞克隆根據(jù)阿拉伯糖苷酶基因(GenBank登陸號DQ324528)序列設(shè)計引物，上游5’-CCCCTGCAGA GAATGG CACGG TCAAA GTC-3’前面加入Pst I位點；下游5’-CCCAA GCTTATTAAG CCAGA TCGAC GTCAA AC-3’引入Hind III位點。加入兩個終止密碼子UAA、UAA來加強翻譯終止。以基因araB為模板，用合成的引物進(jìn)行PCR擴增，擴增的條件是95℃，5min；暫停計時，加入DNA聚合酶Pyrobest，加40μL石蠟油密封；35次循環(huán)(94℃，50s；51℃，90s；72℃，3min)；72℃，10min；反應(yīng)停止，4℃保溫。擴增產(chǎn)物經(jīng)Pst I和Hind III雙酶切，與用同樣的酶雙酶切的表達(dá)載體pHsh連結(jié)，得到重組質(zhì)粒pHsh-ara。
2.酶基因的定點誘變對pHsh-ara的翻譯起始區(qū)的密碼子的偏好性和二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并對其進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計引物對其進(jìn)行改造。引物15’-ATGAA CGGCA CTGTT AAAGT TAACG AAGTGATTGG ACGCA TTTCT AAAC-3’；引物25’-TTTTA TATCT CCTTC TTGTC GACGGTTA-3’。其中黑體表示用優(yōu)勢密碼子進(jìn)行了替換，斜體表示為二級結(jié)構(gòu)優(yōu)化而進(jìn)行的定點突變。堿基的改變不改變氨基酸序列。以pHsh-ara為模板，用內(nèi)部定點突變引物進(jìn)行PCR擴增，擴增的條件是95℃，5min；暫停計時，加高保真性DNA聚合酶Pyrobest(Takara)，加40μL石蠟油密封；35次循環(huán)(94℃，30s；56℃，90s；72℃，3min)；72℃，10min；反應(yīng)停止，4℃保溫。PCR產(chǎn)物是含有pHsh和突變基因araU的線性DNA，Pyrobest酶擴增產(chǎn)生平端片段，經(jīng)DNA激酶磷酸化和T4DNA連接酶連接后，產(chǎn)生含突變基因araU的重組質(zhì)粒pHsh-araU(如圖1)。經(jīng)測序，araU的序列如其堿基序列如SEQ ID NO1所示。
實施例二阿拉伯糖苷酶基因及其突變體的表達(dá)重組菌的培養(yǎng)重組質(zhì)粒pHsh-araB、pHsh-ara、pHsh-araU；用電穿孔法(electroporation)將分別將pHsh-araB、pHsh-ara、pHsh-araU質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株JM109，挑選出的轉(zhuǎn)化子接入20ml含有100μg ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，在37℃搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，以2％的接種量轉(zhuǎn)接到300ml含有100μg ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，在200rpm 30℃搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)至OD6000.6左右再42℃熱激誘導(dǎo)8小時，離心收獲細(xì)胞。
重組阿拉伯糖苷酶的制備將細(xì)胞懸浮于磷酸緩沖液，通過高壓細(xì)胞破碎儀使細(xì)胞裂解；將細(xì)胞裂解液用50％-80％硫酸銨分級沉淀，獲得接近電泳純的阿拉伯糖苷酶。pHsh-araU在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)量高于araB和ara(圖2)。
實施例三重組阿拉伯糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)及降解試驗對實施例二中araB、ara和araU的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶學(xué)分析，其酶學(xué)性質(zhì)相同。
最適pH的測定將重組酶純酶分別在pH 44-8.0的50mmol L咪唑-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(IP緩沖液)，60℃下測定酶活。計算相對酶活確定最適pH。結(jié)果酶的最適pH為6.4(圖3A)。
最適反應(yīng)溫度的測定將重組酶分別在45℃-80℃，在pH 60(IP緩沖液)下測定酶活，計算相對酶活確定最適反應(yīng)溫度。結(jié)果顯示最適反應(yīng)溫度為60℃，但在45℃-75℃范圍內(nèi)酶保持相對較高的酶活(圖3B)。
溫度穩(wěn)定性測定將重組酶在pH 64(IP緩沖液)，分別在60℃、65℃、70℃和75℃保溫10min、20min、40min、60min、90min和120min，然后在60℃，pH 60下測定酶活，以保存于冰浴中(未保溫)的酶活力為100％。計算相對酶活，制作溫度穩(wěn)定性曲線，發(fā)現(xiàn)重組酶在70℃下的半衰期為1小時(圖3C)。
pH穩(wěn)定性測定將重組酶置于不同pH值(4.8-8.0)的IP緩沖液中，在60℃保溫60min，再加入底物測定殘留活力，冰浴保存的酶樣在相對應(yīng)pH條件下的活力為100％，比較酶在不同pH條件下的穩(wěn)定性，分析發(fā)現(xiàn)重組酶在pH 4.8-7.6都保持較高的穩(wěn)定性(圖3D)。
二價離子和螯合劑對重組酶的影響將重組酶在60℃pH 64(IP緩沖液)下，分別與1mM的Sr2+，Mn2+，Li2+，Mg2+，Cu2+，Ca2+，Ni2+，Co2+，Zn2+，Hg2+和EDTA混合孵育10min，然后在60℃，pH 60下測定酶活，以未加離子或螯合劑的酶活力為100％。計算相對酶活，發(fā)現(xiàn)Sr2+，Li2+，Mg2+，Ca2+，Ni2+，Zn2+和EDTA對重組酶沒有影響，Cu2+和Co2+對重組酶有輕微的抑制作用。
重組酶對高聚合度的木聚糖阿拉伯糖側(cè)支的降解在200μl的反應(yīng)體系含重組阿拉伯糖苷酶(0.2U)，2％(wt/vol)xylan(Oat spelts，Sigma)溶解于IP緩沖液，pH 64。在55℃反應(yīng)12小時。反應(yīng)液在沸水中煮5min終止反應(yīng)，樣品11,000g離心10min，取上清液進(jìn)行薄層層析(silica gel 60 F254，Merck Co)，流動相(正丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1)。顯色劑為100mL硫酸甲醇溶液(硫酸∶甲醇＝2∶8)中加入100mg 5-甲基-13苯二酚，顯色條件是60℃，20min。結(jié)果如圖4，顯示高聚合度的木聚糖上的阿拉伯糖側(cè)枝被重組酶水解，在薄層層析板上產(chǎn)生新斑點。
SEQUENCE LISTING<110>南京師范大學(xué)<120>一個新型阿拉伯糖苷酶基因的表達(dá)及優(yōu)化方法<160>1<210>1<211>1479<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(1479)<223>對阿拉伯糖苷酶基因ara進(jìn)行密碼子替換<400>1atgaacggca ctgttaaagt taacgaagtg attggacgca tttctaaaca catctatgga 60cactttcaag agcatttagg aagaggaatt tatgacggca tttgggtagg gaaagattca 120gagattgatc atgttgaagg gattcgtact gatgtgctaa aggcccttca agcattacat 180atcccggtgc ttaggtggcc gggtggctgt tttgcagacg agtatcattg ggcaaacggc 240gtcggtgatc tgagtgaacg aaagccgatg gtgaatactc attggggtgg caccgttgaa 300tcaaatgcgt ttggtacaca tgaatttatg agactgtgtg aattacttga atgtgagcct 360tatatttgtg gaaacgttgg aagcggctct gtacaagaat tagcagaatg gattgaatat 420atcacatttc ctaaagggac acctatgtcg gattggcgca ttcaaaatgg aaaacaagaa 480ccgtgggagc tgacgtatgt tggtgtaggt aatgaaagct ggggatgcgg tggaaatatg 540acaccagagt attatgcaga cttatataaa cgctaccaaa cgtatgtgag agaatttgct 600ggtcagcgca tttacaaaat tgcatgcggt gcgaattcaa atgatgtgaa ttggacaaaa 660gtattaatgg agcgtgcagc gccttggatg gatgggctca gtttgcatta ctatacggtc 720
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權(quán)利要求
1.一種阿拉伯糖苷酶基因的表達(dá)方法，是將編碼阿拉伯糖苷酶的基因插入載體pHsh，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞構(gòu)建成重組菌；再將重組菌培養(yǎng)至OD600為0.5-1.2，通過熱激誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組阿拉伯糖苷酶。
2.如權(quán)利要求1所說的的表達(dá)方法，其特征在于，所說的編碼阿拉伯糖苷酶的基因是araB，將araB或它的成熟肽基因ara克隆到表達(dá)載體pHsh，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pHsh-araB和不帶信號肽的重組質(zhì)粒pHsh-ara，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞構(gòu)建成重組菌；再將重組菌培養(yǎng)至OD600為0.5-1.2，通過熱激誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組阿拉伯糖苷酶。
3.如權(quán)利要求2所說的的表達(dá)方法，其特征在于分析pHsh-ara中的密碼子及可能產(chǎn)生的mRNA二級結(jié)構(gòu)，設(shè)計誘變引物，并在pHsh-ara中進(jìn)行原位誘變，獲得含突變基因的重組質(zhì)粒；將含突變基因的重組質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，獲得重組阿拉伯糖苷酶。
4.如權(quán)利要求3所說的的表達(dá)方法，其特征在于其中所說的誘變引物為引物15’-ATGAA CGGCA CTGTT AAAGT TAACG AAGTG ATTGG ACGCATTTCT AAAC-3’；引物25’-TTTTA TATCT CCTTC TTGTC GACGG TTA-3’；獲得含突變基因的重組質(zhì)粒pHsh-araU，其中araU的堿基序列如SEQ ID NO1所示。
全文摘要
一種阿拉伯糖苷酶基因高效表達(dá)方法，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種阿拉伯糖苷酶的基因表達(dá)方法，具體是將編碼阿拉伯糖苷酶的基因插入載體pHsh，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞構(gòu)建成重組菌；再將重組菌培養(yǎng)至OD
文檔編號C12N1/21GK1928093SQ20061009630
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月19日
發(fā)明者邵蔚藍(lán), 裴建軍 申請人:南京師范大學(xué)