專利名稱：一種克隆新基因的試劑盒及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)、基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)更具體地說(shuō)，涉及一種新型基因克隆試劑盒，以及用這種試劑盒克隆新基因的方法。
背景技術(shù)：
新基因克隆的傳統(tǒng)方法是探針雜交法，通常需要構(gòu)建基因文庫(kù)并從文庫(kù)篩選陽(yáng)性克隆，是一項(xiàng)耗時(shí)繁瑣的工作，成功幾率很低。這種經(jīng)典的基因克隆法首先涉及探針的標(biāo)記，Southern雜交確定合適的限制性內(nèi)切酶，基因組酶解和連接轉(zhuǎn)化來(lái)構(gòu)建基因文庫(kù)，接著還需要從成千上萬(wàn)個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選出甚至只有一個(gè)的陽(yáng)性克隆，假如沒(méi)有合適的篩子就只能依賴繁瑣的菌落雜交，耗時(shí)費(fèi)力。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)被用于染色體步移是基因克隆技術(shù)的一大突破。PCR方法不需要構(gòu)建基因文庫(kù)和后續(xù)繁瑣的篩選工作，省時(shí)省力。PCR克隆最成功的應(yīng)用就是cDNA的克隆，即逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcriptance PCR，RT-PCR)。PCR技術(shù)的關(guān)鍵是要設(shè)計(jì)和模板基因完全配對(duì)的兩條寡核苷酸即引物，合成介于兩條引物位置之間的基因片段。這個(gè)要求極大程度上限制了PCR技術(shù)在克隆未知基因中的應(yīng)用，因?yàn)槿藗兩踔翛](méi)有足夠的序列信息來(lái)設(shè)計(jì)引物。RT-PCR的成功最主要的因素是有一條能和mRNA的尾部polyA完全配對(duì)的通用引物oligo-T，因此只需要另外設(shè)計(jì)一條特異性引物，往往可以通過(guò)保守序列或僅有的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。
近年來(lái)，各種克隆未知基因的PCR技術(shù)發(fā)展迅速，技術(shù)焦點(diǎn)集中于在序列未知的情況下設(shè)計(jì)一條可靠、高效的通用引物?，F(xiàn)有的PCR技術(shù)根據(jù)原理可分為三大類反相PCR(inversePCR，iPCR)，介于連接反應(yīng)的PCR(ligation-mediate PCR，LM-PCR)和隨機(jī)引物PCR(randomprimer PCR，RP-PCR)。
反相PCR反相PCR是歷史最早的染色體步移法。操作過(guò)程是將基因組DNA先用合適的限制性內(nèi)切酶徹底酶解，自身環(huán)化，然后從已知序列兩頭設(shè)計(jì)相向引物，反相擴(kuò)增，這要求有足夠的明確的DNA序列，所以不適用于根據(jù)氨基端或保守性氨基酸序列克隆新基因。
介于連接反應(yīng)的PCR包括載體連接法(single-specific-primer PCR，SSP-PCR)和各種接頭法(adaptor ligation PCR)。載體連接法將酶切后的基因組片段和線性載體連接后，利用載體上的引物和基因內(nèi)部的特異性引物擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。接頭法的原理是利用和目標(biāo)片段連接的一個(gè)寡核苷酸接頭序列來(lái)設(shè)計(jì)步移引物。寡核苷酸接頭主要有雙鏈接頭、單鏈接頭、不完全單鏈接頭、氣泡接頭。
隨機(jī)引物PCR利用特異性引物和隨機(jī)引物的直接PCR法。包括targeted gene walking PCR(TGW-PCR)，TAIL-PCR，SiteFinding-PCR等。
前兩類PCR技術(shù)依賴于限制性內(nèi)切酶的作用，涉及連接，存在的問(wèn)題是a)擴(kuò)增的成敗很大程度取決于目標(biāo)基因在基因組中的豐度，含有目標(biāo)基因的酶切片段的大小，以及酶切和連接效率。為選擇合適的限制性內(nèi)切酶，通常需要多次嘗試，甚至需要先做Southern雜交分析；或用識(shí)別4個(gè)堿基的限制性內(nèi)切酶部分酶切，回收大小合適的片段作連接。因此對(duì)于復(fù)雜的真核生物成功率極低。
b)某些基因組很難被限制性內(nèi)切酶充分酶解，這種情況下需要改用它法。
隨機(jī)引物PCR技術(shù)在極大程度上改進(jìn)了前兩種依賴于酶切連接的染色體步移法，步驟簡(jiǎn)單，擴(kuò)增成功率高。TAIL-PCR是該技術(shù)的代表。TAIL-PCR使用三條特異性嵌套引物和一系列較短的隨機(jī)引物，設(shè)計(jì)嚴(yán)緊退火和松弛退火交替進(jìn)行的固定程序來(lái)保證特異性和擴(kuò)增效率。新報(bào)道的SiteFinding-PCR利用兩條隨機(jī)引物(SiteFinders)一輪非嚴(yán)謹(jǐn)退火后，通過(guò)SiteFinder序列中5’端的部分序列設(shè)計(jì)的短鏈引物和上游特異性引物引物擴(kuò)增，然后用特異性嵌套引物擴(kuò)增，最后利用隨機(jī)引物上的NotI位點(diǎn)和另一端的平端進(jìn)行克隆測(cè)序。但是現(xiàn)有隨機(jī)引物PCR法受其隨機(jī)性的影響，其選擇性都需要嵌套特異性引物來(lái)保證。這樣就限制了該法在序列信息有限的未知基因克隆中的應(yīng)用，比如只有一段氨基酸序列或者保守序列，根據(jù)這些信息只能設(shè)計(jì)一條簡(jiǎn)并引物，無(wú)法設(shè)計(jì)嵌套引物。因此，人們還在繼續(xù)使用傳統(tǒng)的探針雜交法克隆新基因。
總體而言，目前的新基因克隆技術(shù)或步驟繁瑣，或不具備通用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的試劑盒，以及利用該試劑盒克隆新基因的方法。
所說(shuō)的試劑盒主要包括以下單元PCR魔術(shù)緩沖、PCR緩沖、T-載體、Taq酶和多種通用引物。其中，PCR魔術(shù)緩沖含隨機(jī)寡聚核苷酸混合物、Tris緩沖液、dNTP、MgCl2、甲酰銨、二甲基亞砜、甘油、氯化四甲基銨、谷氨酸鉀、硫酸銨、離子化除垢劑及非離子化除垢劑；通用引物是能與任意模板上隨機(jī)分布的通用位點(diǎn)有效退火的人工合成的長(zhǎng)度為10-20bp的簡(jiǎn)并引物，例如ATGCATNNNNNN---，或其它通用引物。
用新試劑盒克隆新基因的方法有兩個(gè)主要特征(1)PCR魔術(shù)緩沖與特異性引物在嚴(yán)緊條件下擴(kuò)增；(2)通用引物與特異性引物配對(duì)在嚴(yán)緊條件下擴(kuò)增。其主要步驟如下1)根據(jù)目標(biāo)基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，Tm≈44℃；2)以基因組DNA為模板，使用步驟1)中的特異性引物、PCR魔術(shù)緩沖及其它PCR反應(yīng)成分組成PCR反應(yīng)體系，3)擴(kuò)增得DNA片段；4)以步驟3)得到的DNA片段為模板，使用步驟1)中的特異性引物、PCR緩沖、一種與特異性引物配對(duì)的通用引物及其它PCR反應(yīng)成分組成PCR反應(yīng)體系；5)擴(kuò)增得到一至多條DNA片斷。
6)選擇特異性最好的條帶作為目標(biāo)條帶割膠回收；用T4 DNA連接酶連接目標(biāo)條帶與T-載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌；培養(yǎng)重組菌。
使用本發(fā)明的新型基因克隆試劑盒，特異性引物可以是簡(jiǎn)并引物，可以在僅有一段氨基酸序列或者保守序列已知的情況下獲得完整基因，對(duì)于基因組簡(jiǎn)單的原核生物和復(fù)雜的真核生物都適用。該試劑盒適用于根據(jù)NH2-端氨基酸序列或保守序列設(shè)計(jì)引物克隆新基因；克隆分泌型蛋白的信號(hào)肽；克隆基因的上游調(diào)控序列；研究操縱子或基因簇的結(jié)構(gòu)。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
圖1是實(shí)施例1的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳2是實(shí)施例2的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳3是實(shí)施例3的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖具體實(shí)施方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)的附圖進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
實(shí)施例1海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)的乙酸激酶(acetate kinase，ak)的克隆試劑盒的組成為魔術(shù)PCR緩沖、PCR緩沖液(含dNTP)、Taq酶、通用引物和T-載體。
使用上述試劑盒克隆海棲熱袍菌乙酸激酶的方法如下1)據(jù)乙酸激酶保守序列設(shè)計(jì)合成特異性引物AK5’GCGTTGAATCTTTCC 3’；2)用基因組DNA為模板制備PCR體系
Taq酶 0.5μlPCR魔術(shù)緩沖5μl模板DNA0.5-3μg特異性引物 0.02-1μM(視引物簡(jiǎn)并度而定)滅菌蒸餾水 共50μl3)5℃，5min；(94℃，30s；54℃，30s；72℃，2min)×40；72℃，10min；4℃保溫；擴(kuò)增得新模板；4)用新模板制備PCR體系Taq酶 0.5μlPCR緩沖5μl步驟3產(chǎn)生的新模板 0.5μl特異性引物 0.2-4μM(視引物簡(jiǎn)并度而定)一種通用引物 5μl滅菌蒸餾水 共50μl5)目標(biāo)DNA的擴(kuò)增95℃，5min；(94℃，30s；50℃，30s；72℃，2min)×35；72℃，10min；4℃保溫。
6)PCR產(chǎn)物分析和目標(biāo)條帶的回收對(duì)步驟5產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選擇特異性最好的條帶作為目標(biāo)條帶割膠回收(如圖1所示，其中箭頭所指條帶割膠回收)。
7)目標(biāo)條帶與T-載體的連接10×T4 DNA連接酶緩沖 1μlT-載體(2.3kb) 1μl(0.04pmol)割膠回收產(chǎn)物 和載體的摩爾比為2∶1-10∶1滅菌蒸餾水 共10μl16℃連接，過(guò)夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌；培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證提取轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒；用M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證插入片段的大??；用M13引物進(jìn)行堿基序列測(cè)定。測(cè)序分析結(jié)果和理論序列(NC_000853)一致。
實(shí)施例2人類基因組的膽汁激活型酯酶(bile-stimulated lipase，cel)的克隆試劑盒與實(shí)施例1相同，克隆方法步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于特異性引物為CEL5’TCTCTGCCTGTGAAG 3’如圖23為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)λ-EcoT14酶切產(chǎn)物。1，2分別為特異性引物和通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物。
轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證后，序列測(cè)定結(jié)果與理論序列(NM 001807)一致。
實(shí)施例3芽孢桿菌新型阿拉伯糖苷酶基因(α-L-arabinofuranosidase，abfB)的克隆試劑盒與實(shí)施例1相同，克隆方法步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于根據(jù)蛋白NH2-端測(cè)序結(jié)果MNGTVKV，設(shè)計(jì)了兩條簡(jiǎn)并引物5’AA(T/C)GGNACNGTNAAAGT 3’(araN1)和5’AA(T/C)GGNACNGTNAAGGT 3’(araN2)。
按使用步驟操作，獲得目標(biāo)DNA(圖33為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000。1，為araN2和通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物。3為araN1和通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物)。將箭頭所指的條帶割膠回收。
測(cè)序分析序列，引物araN1的擴(kuò)增產(chǎn)物為目標(biāo)條帶，該基因的GeneBank登陸號(hào)為DQ324528；引物araN2的擴(kuò)增產(chǎn)物為非特異性條帶。
本發(fā)明不限于這些公開的實(shí)施方案，本發(fā)明將覆蓋在專利書中所描述的范圍，以及權(quán)利要求范圍的各種變型和等效變化。
權(quán)利要求
1.一種克隆新基因的試劑盒，主要包括以下單元PCR魔術(shù)緩沖、PCR緩沖、T-載體、Taq酶和多種通用引物；其中所述的PCR魔術(shù)緩沖含隨機(jī)寡聚核苷酸混合物、Tris緩沖液、dNTP、MgCl2、甲酰銨、二甲基亞砜、甘油、氯化四甲基銨、谷氨酸鉀、硫酸銨、離子化除垢劑及非離子化除垢劑；其中所說(shuō)的通用引物是能與任意模板上隨機(jī)分布的通用位點(diǎn)有效退火的人工合成的長(zhǎng)度為10-20bp的簡(jiǎn)并引物。
2.一種利用權(quán)利要求1的試劑盒進(jìn)行新基因克隆的PCR方法1)根據(jù)目標(biāo)基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，Tm≈44℃；2)以基因組DNA為模板，使用步驟1)中的特異性引物、PCR魔術(shù)緩沖及其它PCR反應(yīng)成分組成PCR反應(yīng)體系，3)擴(kuò)增得DNA片段；4)以步驟3)得到的DNA片段為新模板，使用步驟1)中的特異性引物、PCR緩沖、通用引物及其它PCR反應(yīng)成分組成PCR反應(yīng)體系，所說(shuō)的通用引物是與特異性引物配對(duì)使用的通用引物；5)擴(kuò)增得到目標(biāo)DNA。
3.一種利用權(quán)利要求1的試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆的方法，其特征在于，1)根據(jù)目標(biāo)基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，Tm≈44℃；2)以基因組DNA為模板，使用步驟1)中的特異性引物、PCR魔術(shù)緩沖及其它PCR反應(yīng)成分組成PCR反應(yīng)體系，3)擴(kuò)增得DNA片段；4)以步驟3)得到的DNA片段為新模板，使用步驟1)中的特異性引物、PCR緩沖、通用引物及其它PCR反應(yīng)成分組成PCR反應(yīng)體系，所說(shuō)的通用引物是與特異性引物配對(duì)使用的通用引物；5)擴(kuò)增得到目標(biāo)DNA。6)將得到的目標(biāo)DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選擇特異性最好的條帶作為目標(biāo)條帶割膠回收；用T4 DNA連接酶連接目標(biāo)條帶與T-載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌；培養(yǎng)重組菌。
全文摘要
一種克隆新基因的試劑盒及其應(yīng)用方法，涉及一種新型基因克隆試劑盒，以及用這種試劑盒克隆新基因的方法。所說(shuō)的試劑盒主要包括以下單元PCR魔術(shù)緩沖、PCR緩沖、T－載體、Taq酶和多種通用引物。使用本發(fā)明的新型基因克隆試劑盒，特異性引物可以是簡(jiǎn)并引物，可以在僅有一段氨基酸序列或者保守序列已知的情況下獲得完整基因，對(duì)于基因組簡(jiǎn)單的原核生物和復(fù)雜的真核生物都適用。該試劑盒適用于根據(jù)NH
文檔編號(hào)C12P19/00GK1948501SQ20061009630
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2006年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月19日
發(fā)明者邵蔚藍(lán), 蔣宇 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)