專利名稱：結(jié)核菌硫氰酸酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及結(jié)核菌硫氰酸酶及其用途。
背景技術(shù)：
硫代硫酸硫轉(zhuǎn)移酶(thiosulfate sulfurtransferase，TST)，是類似硫氰酸生成酶(rhodanese)的一種蛋白，廣泛存在于各種生物體中，包括細(xì)菌、植物以及哺乳動(dòng)物，一般定位在線粒體上，但在低等脊椎動(dòng)物如兩棲類、爬行類和魚，也存在于胞液中。含量隨種群、組織、性別、年齡而異。其主要功能為催化硫代硫酸鹽和氰根離子轉(zhuǎn)化為亞硫酸鹽和硫氰酸鹽從而達(dá)到代謝和解毒的目的，在Fe-S中心的Fe-S蛋白中作為一個(gè)硫插入酶產(chǎn)生氧化還原中心.，所以在鐵硫蛋白的合成或修復(fù)上不可缺少。且已證明TST可能與轉(zhuǎn)硫到tRNA核苷有關(guān)，這一改變可能在翻譯過程中是重要的。如今TST已被用作研究蛋白穩(wěn)定性和折疊的模型，研究顯示Cys247殘基是TST的一個(gè)催化位點(diǎn)，Arg186和Lys249在硫轉(zhuǎn)移功能中也是兩個(gè)主要的殘基，所有催化所需殘基在C端區(qū)域，而N端區(qū)域似乎與酶穩(wěn)定和活性結(jié)構(gòu)相關(guān)。
隨著結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)H37Rv基因組全序列破譯，明確了這一嚴(yán)重威脅人類健康的致病菌基因組共編碼了4種硫代硫酸硫轉(zhuǎn)移酶(CysA2[Rv0815c]，CysA3[Rv3117]，SseA[Rv3283]，SseB[Rv2291])，說明這類蛋白對分枝桿菌非常重要。用中醫(yī)臨床上治療肺結(jié)核的毛莨科植物貓爪草作用MTB后TST表達(dá)下調(diào)，表明它可能通過對該酶的抑制，對結(jié)核分枝桿菌的氨基酸代謝、轉(zhuǎn)錄水平、氰化物的解毒以及硫和鐵轉(zhuǎn)移等方面產(chǎn)生影響.結(jié)核菌在體內(nèi)主要宿主是巨噬細(xì)胞，低氧條件下，BCG的CysA2和CysA3表達(dá)明顯上調(diào)，這說明該酶可能在細(xì)菌和人體內(nèi)持續(xù)感染中也有作用。
鑒于結(jié)核病已成為全球頭號(hào)傳染病殺手，在全球結(jié)核病的疫情呈發(fā)展中國家居高不下，發(fā)達(dá)國家上升的嚴(yán)峻形勢。深入研究引起該病的結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)理，了解其生存所需重要蛋白結(jié)構(gòu)和功能，掌握結(jié)核菌調(diào)控機(jī)制，將為今后開發(fā)新藥，最終消滅這一纏繞人類多個(gè)世紀(jì)的頑疾打下基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供，1.結(jié)核菌硫氰酸酶的重組菌；2.固定化的結(jié)核菌硫氰酸酶工程菌或者純化酶；3.結(jié)核菌硫氰酸酶進(jìn)行脫毒和生物轉(zhuǎn)化的方法。4.含有SseB的DNA疫苗或者亞單位疫苗。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明包括以下內(nèi)容1.結(jié)核菌硫氰酸酶的重組菌；2.固定化的結(jié)核菌硫氰酸酶工程菌或者純化酶；3.結(jié)核菌硫氰酸酶進(jìn)行脫毒和生物轉(zhuǎn)化的方法。4.含有SseB的DNA疫苗或者亞單位疫苗的構(gòu)建及其應(yīng)用。
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，從結(jié)核菌基因組擴(kuò)增SseB基因，在大腸桿菌等適宜的宿主表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)行抗體制備，亞單位疫苗制備以及DNA疫苗制備并檢測效果。
1.基因模板提取將待克隆菌株在LB培養(yǎng)基或YE培養(yǎng)基或者M(jìn)iddlebrook 7H9、sauton等分枝桿菌能夠生長的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到合適的菌體濃度，按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法提取菌體DNA。
2.工程菌的構(gòu)建按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法，將基因組DNA克隆到適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骶?，通過一定的選擇標(biāo)記，收集獲得的工程菌。
3.功能基因的篩選按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑、完全可以從商業(yè)途徑獲得的載體、限制性內(nèi)切酶和方法，將目標(biāo)基因克隆到載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子。分別根據(jù)已知的結(jié)核菌入侵人體和動(dòng)物模型可能遭遇的不利環(huán)境，進(jìn)行人工模擬，從基因組表達(dá)文庫篩選相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)一步驗(yàn)證。
4.利用含有功能基因的重組菌，進(jìn)行功能基因抑制劑或激活劑的篩選。
發(fā)明效果利用本技術(shù)方案涉及的方法，構(gòu)建了結(jié)核菌sseB基因重組菌，純化了該蛋白，構(gòu)建了藥物篩選模型，利用純化的蛋白作為亞單位疫苗組分，免疫了動(dòng)物，取得了良好效果，采用固定化技術(shù)。


圖1.結(jié)核菌sseB基因PCR產(chǎn)物。M DNA分子量標(biāo)記；1 PCR產(chǎn)物。
圖2.SDS-PAGE分析包涵體和上清中重組蛋白sseB。1-2 30℃，IPTG1.0mmol/L，10h；包涵體和上清，3-4.25℃，IPTG1.0mmol/L，6h；包涵體和上清液，M小分子量標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式
1材料和方法1.1材料1.1.1菌株MTB H37Rv基因組DNA；克隆宿主E.coli DH5α；表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)由本研究所保存。
1.1.2載體pET-28a(+)為本研究所保存。
1.1.3主要試劑蛋白酶K為Merck公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶、EcoRI、HindIII為TaKaRa公司產(chǎn)品；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)為鼎國公司產(chǎn)品；卡那霉素、IPTG、RNase A為Sigma公司產(chǎn)品；低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為上海生物化學(xué)研究所產(chǎn)品。
1.2目的基因PCR擴(kuò)增和克隆、鑒定根據(jù)GenBank中MTB sseB基因序列，自行設(shè)計(jì)一對PCR引物(由北京賽百盛公司合成)，序列為5′-AGCGAATTCGTGCAAGCCCGT-3′；P25′-GCCAAGCTTCTATGCAGTGCCA-3′(劃線序列分別為EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn))。以MTB H37Rv基因組DNA為模板，P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(總體積20μl)10×Buffer 2μl，P1、P2(10pmol/μl)各1μl，dNTP(10mmol/l，含Mg2+)2μl，模板DNA 1μl(200ng/μl)，滅菌去離子水12.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl(2U/μl)。反應(yīng)條件94℃ 5min；94℃ 1min，58.5℃ 1min，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。
以EcoRI、HindIII雙酶切PCR純化產(chǎn)物和載體pET-28a(+)，經(jīng)T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)克隆宿主E.coli DH5α中通過質(zhì)粒大小、酶切分析及PCR擴(kuò)增鑒定重組克隆，獲得重組質(zhì)粒pET-28a(+)-sseB，由北京賽百盛公司進(jìn)行測序。
1.3 SseB基因序列識(shí)別和功能預(yù)測目的基因序列在線遞交到DAS(http://www.sbc.su.se/～miklos/DAS/tmdas.cgi)、SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TargetP進(jìn)行在線蛋白質(zhì)跨膜區(qū)、信號(hào)肽和剪切位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位。并用生物軟件DNAstar中MegAlign進(jìn)行基因序列比對及進(jìn)化樹繪制，在線用SWISSMODEL軟件進(jìn)行目的蛋白活性區(qū)域和三維模建預(yù)測。
1.4原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和蛋白表達(dá)可溶性分析將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-sseB轉(zhuǎn)化至感受態(tài)表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)中，經(jīng)篩選獲得原核表達(dá)重組菌pET-32a(+)-sseB1。將原核表達(dá)重組克隆接種于7mL(含卡那霉素50μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37℃ 200r/min培養(yǎng)過夜，次日取2ml接種于50mL(含卡那霉素50μg/mL)LB培養(yǎng)基中，37℃ 220r/min培養(yǎng)至OD600為0.8，加1mmol/ml IPTG誘導(dǎo)，分別取30℃、10h和25℃ 6h兩條件下菌液超聲波破碎，4℃、15000g離心10min，取上清和沉淀分別進(jìn)行15％的SDS-PAGE分析，檢測目的蛋白的存在形式，以確定純化方案。
2結(jié)果和分析2.1 PCR擴(kuò)增、重組子的鑒定及序列分析以結(jié)核分枝桿菌染色體DNA為模板，以sseA基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.3％瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1條約830bp的DNA片段，與預(yù)期DNA片段大小一致(圖1)。sseB純化的PCR產(chǎn)物與pET-28a(+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過質(zhì)粒大小、酶切分析、PCR擴(kuò)增及序列分析鑒定重組質(zhì)粒。以EcoRI、HindIII雙酶切重組質(zhì)粒，得到約5300bp的pET-28a(+)線性片段和約830bP的插入片段(圖2)。序列分析結(jié)果與GenBank MTB sseA基因序列對比完全吻合，表明成功地構(gòu)建出sseB基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒。
2.2蛋白表達(dá)可溶性分析IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的表達(dá)情況如圖5所示。在分子量約為30KD處包涵體和上清都出現(xiàn)蛋白，與目的蛋白分子量一致，可見這一蛋白在包涵體和上清中都存在，且25℃時(shí)僅誘導(dǎo)6小時(shí)上清中目的蛋白就已比30℃10h的多。
權(quán)利要求
1.結(jié)核菌硫氰酸酶，其特征是含有結(jié)核菌硫氰酸酶的重組菌以及純化的重組酶。
2.權(quán)利要求1所述的結(jié)核菌硫氰酸酶，其特征在于硫氰酸酶是結(jié)核菌的Rv2291基因編碼的SseB。
3.權(quán)利要求1所述的結(jié)核菌硫氰酸酶，其特征在于所述重組菌為大腸桿菌。
4權(quán)利要求1或2所述的結(jié)核菌硫氰酸酶的用途，其特征是利用固定化的重組菌或者純化酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化或者污染物清除。
5.權(quán)利要求1或2所述的結(jié)核菌硫氰酸酶的用途，其特征是利用重組菌或者純化酶進(jìn)行酶調(diào)節(jié)分子的篩選。
6.結(jié)核分枝桿菌SseB基因在結(jié)核病診斷和藥物治療效果監(jiān)控中的用途，其特征是利用重組表達(dá)的SseB的抗體或者抗體類似分子進(jìn)行免疫檢測。
7.結(jié)核分枝桿菌SseB基因在DNA疫苗或者亞單位疫苗中的應(yīng)用，其特征是利用結(jié)核分枝桿菌SseB基因及其產(chǎn)物，作為疫苗組分，預(yù)防結(jié)核病。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及結(jié)核菌硫氰酸酶及其用途，尤其是結(jié)核菌硫氰酸酶的重組菌，固定化的結(jié)核菌硫氰酸酶工程菌或者純化酶，結(jié)核菌硫氰酸酶進(jìn)行脫毒和生物轉(zhuǎn)化的方法，含有SseB的DNA疫苗或者亞單位疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1995335SQ200610095340
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月25日
發(fā)明者謝建平, 陳宏玲, 王洪海 申請人:西南大學(xué)