專利名稱：核酸的銜接線性擴(kuò)增的制作方法
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背景技術(shù)：
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸的體外復(fù)制。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種用于復(fù)制感興趣核酸序列的方法，大量所需的序列最終由銜接的引物延伸反應(yīng)產(chǎn)生，其中的感興趣序列以數(shù)學(xué)線性方式積累。
2、背景技術(shù)簡(jiǎn)述當(dāng)今稱為(并在本文稱為)核酸“擴(kuò)增”的大量核酸復(fù)制無(wú)論在實(shí)踐上，還是在理論上都在多種方面發(fā)現(xiàn)有廣泛的應(yīng)用。H.G.Khorana和其合作者們首先提出用體外DNA擴(kuò)增方法以增加通過(guò)酶連接合成DNA而產(chǎn)生的雙鏈DNA(主要酵母丙氨酸t(yī)-RNA基因的部分序列)的可得到的數(shù)量。見(jiàn)K.Kleppe等；分子生物學(xué)雜志56341-361(1971)。后來(lái)，體外擴(kuò)增作為現(xiàn)在稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或＂PCR＂的技術(shù)應(yīng)用于基因組DNA的擴(kuò)增(Saiki等，科學(xué)，2301350-1354(1985))。通過(guò)合成寡核苷酸引物，耐熱DNA聚合酶和自動(dòng)化溫度循環(huán)儀的廣泛可用性，PCR成為分子生物學(xué)家廣泛利用的工具。
PCR方法在文獻(xiàn)中稱為“指數(shù)擴(kuò)增”方法。在每輪或“每個(gè)循環(huán)”的引物延伸中，合成了另外一個(gè)引物的引物結(jié)合位點(diǎn)。因此，在任一以前循環(huán)中產(chǎn)生的每個(gè)合成DNA分子可用作引物依賴性復(fù)制的模板。該方法的此方面，與存在足夠大量的引物分子一起導(dǎo)致合成的DNA隨著反應(yīng)的進(jìn)行以數(shù)學(xué)指數(shù)方式積累。
雖然已證明PCR是分子生物學(xué)家有用的技術(shù)，并且已廣泛應(yīng)用于人類遺傳研究、診斷和法醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域，且甚至用于抗體的檢測(cè)，不過(guò)已認(rèn)識(shí)到一些不足。PCR方法難以準(zhǔn)確定量，主要因?yàn)殡S著每輪擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物是指數(shù)增加。PCR產(chǎn)物，即，雙鏈DNA分子本身難以分析或測(cè)序。一般地在測(cè)序或需要單鏈核酸的其它下游方法(如與能檢測(cè)感興趣序列的探針的雜交)之前必需進(jìn)行鏈的分離。
PCR方法也已證明對(duì)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)移以前擴(kuò)增的DNA序列至一個(gè)新的反應(yīng)中產(chǎn)生的污染很敏感。此問(wèn)題似乎由下面的事實(shí)所引起(1)在任何給定的反應(yīng)循環(huán)中產(chǎn)生很大量的DNA且(2)此方法用所有的產(chǎn)物DNA鏈作為隨后循環(huán)的模板。即使微量的污染DNA也可被指數(shù)擴(kuò)增并導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。見(jiàn)Kwok和Higuchi，自然339237-238(1989)。隨著這些污染問(wèn)題被廣泛認(rèn)識(shí)，在文獻(xiàn)中已報(bào)導(dǎo)了各種減少這種污染的方法(如.化學(xué)去污染、物理處理、酶處理及利用封閉系統(tǒng))，見(jiàn)John B.Findlay，“用于體外診斷PCR的開(kāi)發(fā)”，出于“遺傳識(shí)別”，1992年，11月20日，San Diego，CA。
仍然存在對(duì)新的核酸(DNA)擴(kuò)增方法的需要，該方法應(yīng)能提供大量DNA并僅選擇性擴(kuò)增感興趣的特異序列，并避免現(xiàn)在與“PCR”反應(yīng)有關(guān)的問(wèn)題。具體地說(shuō)，仍然需要最終產(chǎn)生大量感興趣的核酸分子，或大量含有感興趣的核酸序列的分子，但對(duì)存在的污染核酸相對(duì)不敏感的核酸擴(kuò)增方法。也存在對(duì)產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物的核酸擴(kuò)增方法的需要。
發(fā)明小結(jié)前述的和其它的需要通過(guò)本發(fā)明得到滿足，其一方面提供了擴(kuò)增樣品含有的互補(bǔ)核酸鏈中特異性感興趣核酸序列的方法，該方法包括下面的步驟(a)在適當(dāng)條件下將鏈與含有不可復(fù)制因子的引物接觸，使第一代引物延伸產(chǎn)物用所述的鏈作為模板而合成，并且其中用于鏈的引物的選擇是使以其合成的第一代引物延伸產(chǎn)物在與鏈分離后，可用作互補(bǔ)鏈引物的模板用于合成第二代引物延伸產(chǎn)物；(b)將第一代引物延伸產(chǎn)物從其模板上分離以制備單鏈分子；和(c)在適當(dāng)條件下用步驟(a)的引物處理第一代引物延伸產(chǎn)物從而使用第一代引物延伸產(chǎn)物作為模板而合成第二代引物延伸產(chǎn)物；其中的第二代引物延伸產(chǎn)物至少含有感興趣核酸序列的部分序列，并且不能夠用作延伸后合成其模板的引物合成延伸產(chǎn)物的模板。
在本發(fā)明的另一方面，步驟(c)的產(chǎn)物被分離以制備單鏈分子，并且整個(gè)過(guò)程至少重復(fù)一次。步驟(c)優(yōu)選在可程控?zé)嵫h(huán)儀的控制下以自動(dòng)方式完成，步驟(c)的方法重復(fù)多次。
第二代引物延伸產(chǎn)物積累之后，其中的每一個(gè)均不能夠用作延伸以制備其第一代模板的引物的模板，可利用新的一套含有不可復(fù)制因子的引物。該套新引物優(yōu)先結(jié)合到第二代合成產(chǎn)物上，與待擴(kuò)增的感興趣序列鄰接。線性復(fù)制過(guò)程又一次通過(guò)多輪循環(huán)完成。這種“銜接在一起”的多輪引物延伸反應(yīng)最終導(dǎo)致最初感興趣的核酸序列千倍或百萬(wàn)倍的擴(kuò)增。因此，本方法命名為“銜接的線性擴(kuò)增”或“LLA”。
在本發(fā)明的另一方面，含有不可復(fù)制因子的多重(嵌套)引物組可以單個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)混合物提供。挑選這些引物組從而在嚴(yán)格程度遞減的條件下能夠結(jié)合到它們各自的模板上。因此，完成幾個(gè)銜接線性擴(kuò)增所必需的所有成份可以單個(gè)反應(yīng)混合物提供。
在本發(fā)明的另一方面，等位基因特異性的核酸復(fù)制通過(guò)使用針對(duì)模板上的已知表示遺傳疾病或紊亂，如鐮刀形細(xì)胞疾病的特異性多態(tài)位點(diǎn)的引物根據(jù)本發(fā)明而完成。設(shè)計(jì)含有不可復(fù)制因子的等位基因特異性引物從而使它們僅引導(dǎo)那些含有所需等位基因的模板的核酸合成。
本方法產(chǎn)生的合成核酸分子可用于遺傳紊亂或疾病的診斷，作為進(jìn)一步技術(shù)如基因克隆的試劑、用于法醫(yī)鑒定等。
本文描述的方法也可用單核酸鏈作為起始材料而完成。這種方法包括(a)將該鏈與含有不可復(fù)制因子的第一種引物在適當(dāng)條件下接觸，用該鏈作為模板合成第一代引物延伸產(chǎn)物；(b)將第一代引物延伸產(chǎn)物從其模板上分離以制備單鏈分子；和(c)將第一代引物延伸產(chǎn)物與第二種含有不可復(fù)制因子的引物在適當(dāng)條件下接觸從而用第一代引物延伸產(chǎn)物作為模板而合成第二代引物延伸產(chǎn)物；其中引物的選擇是使第二代引物延伸產(chǎn)物不能用作第一種引物延伸的模板。步驟(a)-(c)可重復(fù)多次，導(dǎo)致大量的核酸合成，然后將該反應(yīng)銜接到使用新的一套引物的隨后的反應(yīng)中。
本文描述的方法也可用含有可切割因子的引物來(lái)完成。此方法包括(a)將核酸模板鏈與含有可切割因子的第一種引物在適當(dāng)條件下接觸從而使第一代引物延伸產(chǎn)物用該鏈作為模板而合成；
(b)從其模板中分離第一代引物延伸產(chǎn)物以制備單鏈分子；(c)處理該單鏈分子從而使第一代引物延伸產(chǎn)物在可切割因子的位置被切割；(d)將第一代引物延伸產(chǎn)物與第二種引物在適當(dāng)條件下接觸從而使第二代引物延伸產(chǎn)物用第一代引物延伸產(chǎn)物作為模板而合成；其中引物的選擇是使當(dāng)?shù)谝淮镅由飚a(chǎn)物在可切割因子處被切割時(shí)，第二代引物延伸產(chǎn)物不可用作第一個(gè)引物延伸的模板。步驟(a)-(d)可重復(fù)多次，導(dǎo)致大量的核酸合成，然后將該反應(yīng)可與使用新一套引物的隨后的反應(yīng)銜接。此外，第二個(gè)引物可任選地含有可切割因子從而使銜接的線性擴(kuò)增反應(yīng)可用雙鏈或單鏈起始模板來(lái)完成。
本發(fā)明也涉及用于擴(kuò)增特定核酸序列的試劑盒。這樣的試劑盒包括如，DNA聚合酶，兩種或更多種用于待擴(kuò)增的每一序列的引物，其中所述的每種引物包括不可復(fù)制因子或摻入可切割因子，以及，任選地，能由引物和DNA聚合酶復(fù)制的對(duì)照核酸序列。該試劑盒也可含有能夠顯示特定序列擴(kuò)增產(chǎn)物存在與否的核酸探針。如果試劑盒含有摻入可切割因子的引物，其也可含有在可切割因子處切割引物的試劑。
附圖簡(jiǎn)述

圖1-4為本發(fā)明核酸擴(kuò)增方法的圖解。
圖5-6為與圖1-4中描述方法相連接的核酸擴(kuò)增方法的圖解。
圖7為用兩種引物進(jìn)行的本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的更為詳盡的圖解。
圖8-10給出了用四種引物進(jìn)行的本發(fā)明的銜接線性核酸擴(kuò)增方法的詳細(xì)圖解。
圖11為通過(guò)PCR方法及通過(guò)本發(fā)明的方法而制備的核酸分子的圖解。
圖12為人類β-珠蛋白基因序列(Gen Bank基因座HUMHBB)及本文描述的幾種引物的圖解。
圖13為實(shí)施例7中擴(kuò)增的人類生長(zhǎng)激素序列的序列。在本實(shí)驗(yàn)中使用的寡核苷酸的相對(duì)位置下面劃線。寡核苷酸GHl與所示的人類生長(zhǎng)激素序列的互補(bǔ)鏈雜交。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述本發(fā)明的核酸復(fù)制方法能夠制備大量感興趣的特異性核酸序列。該方法優(yōu)選形式包括系列銜接的多輪引物延伸反應(yīng)。在每個(gè)多輪循環(huán)引物延伸反應(yīng)中，引物依賴性核酸復(fù)制經(jīng)過(guò)許多循環(huán)來(lái)完成，其引物延伸產(chǎn)物以數(shù)學(xué)線性方式通過(guò)循環(huán)逐步積累。將一種獨(dú)特的引物或一套獨(dú)特的引物提供給含有待擴(kuò)增序列的起始樣品的每條核酸鏈。引物延伸產(chǎn)物從循環(huán)到循環(huán)的線性積累通過(guò)使用含有不可復(fù)制因子的引物加以保證-該成分終止引物延伸反應(yīng)，阻止核酸聚合酶復(fù)制引物全序列?；蛘?，所需引物延伸產(chǎn)物的線性積累通過(guò)使用含有可切割因子的引物加以保證，其中第一代引物延伸產(chǎn)物的切割產(chǎn)生缺乏第一種引物有功能的結(jié)合位點(diǎn)的第二代引物延伸產(chǎn)物。通過(guò)選擇含有這樣不可復(fù)制或可切割因子的適當(dāng)引物，及適當(dāng)?shù)囊锿嘶饤l件，保證了以最大豐度積累的引物延伸產(chǎn)物(本文稱為“第二代引物延伸產(chǎn)物”)不能自己用作以相同引物的隨后輪引物延伸的模板。因此，與利用每輪引物延伸產(chǎn)物作為隨后輪模板的核酸擴(kuò)增方法(如＂PCR＂)不一樣，“指數(shù)擴(kuò)增”不會(huì)從循環(huán)到循環(huán)中發(fā)生。
本發(fā)明方法采用并利用了寡核苷酸雜交及引物延伸反應(yīng)的許多重要特性。本發(fā)明利用了下面的優(yōu)點(diǎn)·DNA聚合酶通過(guò)變性及引物依賴性延伸的順序循環(huán)能夠拷貝模板DNA許多次。
·引物依賴性延伸可在適當(dāng)?shù)臈l件下，甚至引物與模板不完全互補(bǔ)時(shí)發(fā)生。
·引物延伸可利用在前輪引物延伸中產(chǎn)生的模板。
·當(dāng)模板中存在非堿基位點(diǎn)或非核苷酸殘基時(shí)，引物延伸反應(yīng)被抑制?；蛘撸镅由炜赏ㄟ^(guò)在摻入引物延伸反應(yīng)所用引物中的可切割位點(diǎn)切割該代引物延伸產(chǎn)物分子而物理去除其中一部分加以抑制。
·引物長(zhǎng)度和組成以已知的方式影響引物“引導(dǎo)”模板上聚合酶誘導(dǎo)的延伸的條件(如溫度)。
·引物延伸反應(yīng)可利用熱循環(huán)儀進(jìn)行快速循環(huán)。
本方法優(yōu)選利用一系列線性擴(kuò)增反應(yīng)，其可連續(xù)地或平行地(即，同時(shí)地)(銜接)進(jìn)行以產(chǎn)生大量拷貝的感興趣的核酸序列。感興趣的核酸序列可基本上包括全長(zhǎng)的模板鏈，或僅包括其很小的一部分。含有感興趣序列的模板鏈可存在于基本上均一的樣品中或作為核酸混合物的一部分(甚至是極少的一部分)。
根據(jù)本發(fā)明，將含有不可復(fù)制或可切割因子的引物提供給含有待擴(kuò)增序列的每條鏈。在雙鏈模板情況時(shí)，引物在模板變性之前或之后加入。使引物與其各自的起始模板退火，并在適合酶功能的條件下在聚合酶存在下使之延伸以形成第一代引物延伸產(chǎn)物。該方法通過(guò)變性得到的雙鏈核酸，使引物與鏈退火及再次完成引物延伸反應(yīng)而加以重復(fù)。在第一引物延伸產(chǎn)物上的引物延伸產(chǎn)生第二代引物延伸產(chǎn)物，其由于存在不可復(fù)制因子，不能夠用作那些相同的引物在隨后循環(huán)中的模板?；蛘撸绻锖锌汕懈钜蜃?，第一代引物延伸產(chǎn)物在可切割因子的位置被切割，從而當(dāng)?shù)谝淮镅由飚a(chǎn)物退火到適當(dāng)?shù)囊锷喜⒀由鞎r(shí)，形成的第二代引物延伸產(chǎn)物將缺乏用于產(chǎn)生第一個(gè)引物延伸產(chǎn)物的引物的結(jié)合位點(diǎn)。
圖1-5給出了根據(jù)本發(fā)明方法用DNA模板完成的一系列引物延伸反應(yīng)(即，一種線性擴(kuò)增反應(yīng))的圖解。該方法以步驟(a)中利用具有明確末端的雙鏈DNA分子開(kāi)始加以說(shuō)明。起始DNA鏈在圖1-4中以實(shí)心(——)線表示。
起始雙鏈優(yōu)選通過(guò)在含有其的緩沖液中加熱變性，且得到的單鏈與一對(duì)引物接觸(步驟(b))。每種引物優(yōu)選以基本上超過(guò)起始模板鏈的摩爾數(shù)提供并在其序列內(nèi)部含有不可復(fù)制或者可切割因子，在引物序列中以(X)或(O)表示。在適當(dāng)?shù)臈l件下，引物與其各自的模板退火并在DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸的存在下根據(jù)引物延伸反應(yīng)延伸(步驟(c))。合成的DNA以點(diǎn)劃線(……)表示在圖1-4中，以起始雙鏈DNA作為模板合成的DNA表示為“第一代”DNA。得到的模板再次變性，并且與引物退火(步驟(d))。
如圖2中步驟(e)中所見(jiàn)到的，用第一代DNA作為模板的引物延伸導(dǎo)致制備了第二代DNA并且沒(méi)有跨過(guò)摻入到第一代合成DNA中的不可復(fù)制因子。因此，合成了標(biāo)號(hào)為10和20的DNA分子。這些第二代分子不參與進(jìn)一步的引物延伸反應(yīng)，因?yàn)?，如圖中所示，分子10沒(méi)有摻入含有不可復(fù)制或可切割因子(X)的引物的有效結(jié)合位點(diǎn)，并且分子20沒(méi)有摻入含有不可復(fù)制或可切割因子(O)的引物的有效結(jié)合位點(diǎn)。因此，如步驟(F)和(g)中所見(jiàn)到的，第二代分子在隨后輪的引物延伸中以數(shù)學(xué)線性方式積累。
經(jīng)過(guò)需要的循環(huán)數(shù)以后，合成的DNA用作(即，銜接到)使用第二套引物的第二系列引物延伸反應(yīng)的起始材料。如圖5-6中所見(jiàn)到的，選擇含有標(biāo)記為(a)和(b)的不可復(fù)制因子的引物以能夠利用分子10和20(圖1-4的反應(yīng)產(chǎn)物)作為進(jìn)一步DNA合成的模板。該系列的引物延伸反應(yīng)同樣導(dǎo)致圖6步驟(e)中標(biāo)號(hào)為30和40的合成DNA分子的積累，該DNA不能用作用于那些反應(yīng)中引物的模板。經(jīng)過(guò)所需數(shù)目的循環(huán)以后，這些合成的分子可銜接到利用又含有不可復(fù)制或可切割因子的適當(dāng)引物進(jìn)行的進(jìn)一步復(fù)制中。如果引物含有可切割因子，第一個(gè)引物延伸反應(yīng)后接著下面的反應(yīng)，即第一個(gè)引物延伸產(chǎn)物在第二次引物延伸反應(yīng)之前于可切割因子位置被切割。
因此應(yīng)很明顯任何一系列循環(huán)的合成核酸產(chǎn)物僅當(dāng)提供新的引物或引物套時(shí)它們自身才可用作進(jìn)一步擴(kuò)增的模板。因此，如果第一個(gè)線性擴(kuò)增完成100個(gè)循環(huán)后，該反應(yīng)產(chǎn)生的100個(gè)拷貝可用作在能雜交到合成模板上的新引物對(duì)的銜接線性擴(kuò)增(LLA)反應(yīng)中的模板。再一次100個(gè)線性擴(kuò)增循環(huán)提供了10000倍(100×100)累積擴(kuò)增。以第三套引物重復(fù)該過(guò)程產(chǎn)生1×106的累積擴(kuò)增。通過(guò)使用又一套引物及又一次循環(huán)的引物延伸完成再一次擴(kuò)增。
圖7更為詳盡地圖解說(shuō)明了在本發(fā)明的擴(kuò)增方法中兩種引物的使用。參照該圖，兩種引物用于依次幾輪的引物延伸。每種引物互補(bǔ)于靶序列但含有單個(gè)不可復(fù)制因子(X)替代其中的一個(gè)互補(bǔ)核苷酸。
有4個(gè)反應(yīng)可參考。在反應(yīng)1中，引物P1產(chǎn)生數(shù)拷貝的模板上鏈(第一代核酸；產(chǎn)物I)。在每輪循環(huán)中產(chǎn)生1拷貝的產(chǎn)物I，m輪循環(huán)導(dǎo)致m個(gè)拷貝。以反應(yīng)2中，引物P2同樣產(chǎn)生數(shù)拷貝的模板下鏈(第一代核酸；產(chǎn)物II)。每輪循環(huán)中產(chǎn)一拷貝的產(chǎn)物II，n輪循環(huán)導(dǎo)致n個(gè)拷貝。實(shí)際上，n和m一般是相同的。
在反應(yīng)3中，除了模板II中摻入的不可復(fù)制因子以外的部分不能復(fù)制外，引物P1產(chǎn)生數(shù)拷貝的來(lái)自反應(yīng)2的產(chǎn)物II(第二代核酸；產(chǎn)物III)。因此，產(chǎn)物III不是引物P1或P2的模板。
同樣地，在反應(yīng)4中，除了模板I中不可復(fù)制因子以外的部分未被復(fù)制外，引物P2產(chǎn)生數(shù)拷貝的模板I(第二代核酸；產(chǎn)物IV)。因此，產(chǎn)物IV不是引物P1或P2的模板。
表1顯示了作為循環(huán)數(shù)函數(shù)的每種產(chǎn)物的積累。正如可以看到的，方程式(n2+n)/2可用于計(jì)算反應(yīng)的產(chǎn)量。如果反應(yīng)效率不到100％，擴(kuò)增將更少。
表1在兩種引物L(fēng)LA反應(yīng)中產(chǎn)物的積累循環(huán)(n)I累積的I III 累積的III 累積的I+III (n2+n)/21 1 1 0 0 1 12 1 2 1 1 3 33 1 3 2 3 6 64 1 4 3 6 10 105 1 5 4 10 15 156 1 6 5 15 21 217 1 7 6 21 28 288 1 8 7 28 36 369 1 9 8 36 45 4510 1 10 9 45 55 5511 1 11 10 55 66 6612 1 12 11 66 78 7813 1 13 12 78 91 9114 1 14 13 91 105 10515 1 15 14 105120 1201001 10099 5,0502001 20019920,1005001 500499125,2501,000 1 1,000 500,500
如果含有不可復(fù)制因子并互補(bǔ)于產(chǎn)物III或產(chǎn)物IV的第三種引物包括在反應(yīng)中，一種短于產(chǎn)物III或產(chǎn)物IV的新產(chǎn)物將會(huì)積累。該產(chǎn)物在反應(yīng)中較任何其它DNA鏈具有更大的豐度并將主要保持為單鏈。
在圖8-10中說(shuō)明了根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)與“銜接”線性擴(kuò)增反應(yīng)一起導(dǎo)致大量的DNA合成。在該反應(yīng)中使用了四種引物，因此連接兩個(gè)同時(shí)進(jìn)行的雙引物反應(yīng)。在此反應(yīng)中，引物P1和P3互補(bǔ)于靶核酸的上鏈且P2和P4互補(bǔ)于下鏈。引物P3的互補(bǔ)位點(diǎn)為P1互補(bǔ)位點(diǎn)的5’(相對(duì)于模板)。同樣地，引物P4的互補(bǔ)位點(diǎn)為P2互補(bǔ)位點(diǎn)的5’(相對(duì)于模板)。感興趣的核酸序列將優(yōu)先位于與2個(gè)引物對(duì)相鄰的區(qū)域之內(nèi)。
6個(gè)不同的反應(yīng)可被考慮，每個(gè)反應(yīng)所用的模板不同。并顯示于圖中。反應(yīng)1A，1B、2A和2B分別導(dǎo)致互補(bǔ)于各自起始核酸模板鏈的第一代合成核酸(分別為產(chǎn)物IA、IB、IIA和IIB)的線性積累。反應(yīng)3A、3B、4A和4B分別導(dǎo)致第二代合成核酸的線性積累，該第二代核酸由于在反應(yīng)1A、1B、2A和2B中合成的核酸中存在不可復(fù)制因子，所以不能用作引物P1或P2的模板。然而，正如在反應(yīng)5和6中所見(jiàn)到的，引物P3和P4由于它們互補(bǔ)位點(diǎn)的位置，能夠發(fā)揮作用從而分別在原始模板DNA及模板IVA和IIIA中引導(dǎo)DNA合成。當(dāng)然，產(chǎn)物IIIB和IVB，不是此反應(yīng)任何引物的模板，但含有感興趣的核酸序列。
很明顯對(duì)本文描述的反應(yīng)的變異將是可能的。例如，線性擴(kuò)增反應(yīng)可順序銜接，而不是圖8-10中所述同時(shí)進(jìn)行。因此，引物P3和P4可經(jīng)n輪引物延伸循環(huán)以后添加至反應(yīng)混合物中，其中的n范圍例如從2到100。
在另一種變異中，引物P1和P2的選擇是使它們能夠與模板DNA退火并在不允許引物P3與P4引導(dǎo)的條件(如溫度)下引導(dǎo)DNA合成。在起始反應(yīng)混合物中提供引物P1、P2、P3和P4。第一次線性擴(kuò)增在僅引物P1和P2參與引物延伸的更為嚴(yán)格的條件下進(jìn)行。經(jīng)過(guò)所需次數(shù)的循環(huán)以后，反應(yīng)條件變得較為不嚴(yán)格，其中的四種引物均參與核酸合成。引物P1和P2用起始模板繼續(xù)產(chǎn)生第一代引物延伸產(chǎn)物并且用第一代產(chǎn)物作為模板產(chǎn)生第二代引物延伸產(chǎn)物；引物P3和P4也利用引物P1和P2的第二代引物延伸產(chǎn)物作為模板。又一次，感興趣的核酸序列優(yōu)選位于以兩種引物對(duì)界定的模板鏈的區(qū)域之內(nèi)。
如果第五種含有不可復(fù)制因子并互補(bǔ)于產(chǎn)物IIIB或產(chǎn)物IVB的引物包括進(jìn)反應(yīng)中，一種短于IIIB或IVB的新產(chǎn)物將積累。此產(chǎn)物在反應(yīng)中的豐度將大于任何其它的DNA鏈并將主要保持為單鏈。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到每當(dāng)利用奇數(shù)的引物實(shí)施本發(fā)明時(shí)，將會(huì)得到單鏈DNA的積累。
除了用存在于起始材料中的最初模板核酸鏈合成的引物延伸產(chǎn)物之外(這種引物延伸產(chǎn)物本文稱為“第一代引物延伸產(chǎn)物”)，含有不可復(fù)制因子及/或可切割因子的引物的使用確保了在此過(guò)程中產(chǎn)生的合成核酸都不能用作隨后輪引物延伸的模板。因此，如在PCR反應(yīng)環(huán)境中所產(chǎn)生的(Kleppe等.，和Saiki等，出處同上)合成的核酸以數(shù)學(xué)指數(shù)方式從循環(huán)到循環(huán)的積累得以避免。
在分子生物學(xué)及DNA化學(xué)領(lǐng)域中有經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)家將能夠合成含有不可復(fù)制或可切割因子的引物。例如，含有1，3-丙二醇?xì)埢?終止DNA合成)的引物可根據(jù)Seela等，核酸研究. 15，3113-3129(1987)中描述的方法進(jìn)行合成并在商業(yè)上可從Glen Research，44901Falcon Place，Sterling VA，20166美國(guó)得到。含有1，4-脫水-2-脫氧-D-核糖醇?xì)埢囊?，即非堿基位點(diǎn)模型可借助Eritia，核苷及核苷酸6，803-814(1987)進(jìn)行合成。公開(kāi)的歐洲專利申請(qǐng)416，817 A2(帝國(guó)化學(xué)有限公司；1991年3月13日)描述了在引物序列與多聚核苷酸尾部之間含有一個(gè)或多個(gè)2’脫氧呋喃核糖萘(2’deoxyribofuranosyl naphthalene)成分作為不可復(fù)制因子的引物的合成。含有其它終止聚合酶依賴性的模板拷貝的因子，如核糖核苷及脫氧核糖核苷的衍生物的寡核苷酸引物的合成對(duì)于本領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。不可復(fù)制因子優(yōu)選不位于任何引物的末端殘基。
在分子生物學(xué)和DNA化學(xué)領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)家同樣能夠合成含有可切割因子的引物。例如，含有核糖核苷的引物一般可通過(guò)核酸化學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成方法，通過(guò)在寡核苷酸合成反應(yīng)中摻入保護(hù)的核糖核苷酸替代脫氧核糖核苷酸由核酸化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員合成。含有適當(dāng)核糖核苷的引物在商業(yè)上是可得到的。
切割第一個(gè)引物延伸產(chǎn)物的一種方法利用了與核糖核苷相鄰的磷酸二酯鍵的反應(yīng)性與同脫氧核糖核苷相鄰的磷酸二酯鍵的反應(yīng)性的差異。通過(guò)用核糖核酸酶(RNase)，如RNase A處理產(chǎn)物可較容易地切割含有核糖核苷酸的引物延伸產(chǎn)物。如果尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)摻入到引物中，尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)也可用于切割第一個(gè)引物延伸產(chǎn)物以去除其互補(bǔ)引物雜交位點(diǎn)?；蛘撸泻颂呛塑盏囊镅由飚a(chǎn)物可通過(guò)以氫氧化物，優(yōu)選0.5N的NaOH處理產(chǎn)物而被切割。優(yōu)選的引物將含有一個(gè)或更多個(gè)核糖核苷，其在引物中的位置應(yīng)使切割能破壞其中一個(gè)用于隨后引物延伸反應(yīng)引物的雜交位點(diǎn)。核糖核苷可位于引物的3’末端，因?yàn)榕c不可復(fù)制因子不一樣，其將不會(huì)干擾DNA聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)。
舉例來(lái)說(shuō)，典型的擴(kuò)增反應(yīng)將以雙鏈DNA分子起始來(lái)進(jìn)行，該DNA分子含有待復(fù)制的位于較長(zhǎng)序列內(nèi)的序列。對(duì)每條鏈特異的寡核苷酸引物退火到各自的鏈上，每條引物含有本文所述的不可復(fù)制因子和/或可切割因子。挑選引物從而使它們?cè)诖龜U(kuò)增序列的邊界位置結(jié)合到各自的模板上。
第一輪引物延伸在所選酶適宜的條件下在DNA聚合酶及四種脫氧核糖核苷酸堿基存在下完成。得到的第一代合成DNA將在其3’末端含有摻入其中的寡核酸引物并在其下游(5’)具有另外引物的完整結(jié)合位點(diǎn)。如果引物含有可切割因子，得到的第一代合成DNA將在其3’末端具有摻入其中的含有可切割因子或多個(gè)該成份的寡核苷酸引物。
進(jìn)行第二輪引物延伸循環(huán)，其中的第一代合成DNA用作其它引物的模板，即該引物未摻入其3’末端。DNA合成沿著模板進(jìn)行，但當(dāng)位于模板中的不可復(fù)制因子遇到聚合酶分子時(shí)便終止。得到的合成DNA，本文稱為“第二代合成DNA”，具有不連續(xù)的末端，在其5’末端由其引物的全部序列所限定，并在其3’末端僅由其它引物的部分序列所限定--該部分序列即在遇到不可復(fù)制因子之前由DNA聚合酶所拷貝的序列。
第二代合成DNA將不作為模板參于進(jìn)一步DNA合成。如上所述，第二代合成DNA僅含部分的必需引物結(jié)合位點(diǎn)。在所選的引物退火及延伸的條件下，該部分的引物結(jié)合位點(diǎn)不足以令引物結(jié)合并用作引物依賴性DNA合成的位點(diǎn)。因此，當(dāng)?shù)谌半S后輪引物延伸進(jìn)行時(shí)，僅最初的模板DNA及第一代合成DNA作為模板參與。那些模板的持續(xù)拷貝導(dǎo)致含有感興趣序列的第二代合成DNA的一輪又一輪地“線性”積累。
經(jīng)所需輪的引物延伸循環(huán)以后，通過(guò)提供每條鏈的第二種引物可實(shí)現(xiàn)再次的擴(kuò)增，該第二種引物的選擇是使之在第一套引物界定的區(qū)域內(nèi)結(jié)合到最初模板鏈。第二種引物也含有不可復(fù)制因子和/或可切割因子，因此確保它們的引物延伸產(chǎn)物不能用作以那些相同引物隨后進(jìn)行的核酸合成的模板。如果第二種引物含有可切割因子，用這些引物制備的第一個(gè)引物延伸產(chǎn)物將在可切割因子的位置被切割，從而使從第一個(gè)引物延伸產(chǎn)物制備的第二個(gè)引物延伸產(chǎn)物將不含有有功能的可產(chǎn)生與第一鏈引物相同的新的拷貝的結(jié)合位點(diǎn)。
已知引物結(jié)合條件，尤其是溫度能夠決定是否特異性引物將結(jié)合到特異的模板上。見(jiàn)Rychlik等，核酸研究18，6409-6412(1990)；Wu等，DNA細(xì)胞生物學(xué)10，233-238(1991)。因此，在含有多種堿基組成及/或長(zhǎng)度引物的反應(yīng)混合物中，引物結(jié)合溫度的選擇也能用來(lái)選擇能夠引導(dǎo)DNA合成的引物。例如，通過(guò)在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)混合物中提供分別在72℃、62℃和52℃引導(dǎo)合成的第一、第二及第三套引物，在72℃進(jìn)行第一系列的引物延伸反應(yīng)將確保僅第一個(gè)引物套將發(fā)揮功能從而導(dǎo)致引物依賴性的核酸合成。經(jīng)過(guò)所需數(shù)的循環(huán)以后，引物延伸溫度可降至62℃，此時(shí)第一及第二個(gè)引物套將指導(dǎo)DNA合成。降低引物延伸反應(yīng)溫度至52℃允許所有三個(gè)引物套參與引物依賴性的DNA合成。在本方法中引物混合物的使用允許該方法以有效的方式進(jìn)行，無(wú)需研究者隨著過(guò)程的進(jìn)行單獨(dú)加入每種引物套。
通過(guò)使用市售的，可程序化的熱循環(huán)儀，上述的所有三種引物套可提供在單個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)混合物中。挑選引物從而使那些在最嚴(yán)格的條件下指導(dǎo)DNA合成的引物在模板上結(jié)合到其它引物的3’。同樣地，在最不嚴(yán)格的條件下引導(dǎo)的那些引物結(jié)合到模板上其它引物的5’。第一系列引物延伸反應(yīng)(循環(huán))在最嚴(yán)格的(最高溫度)引物退火條件下進(jìn)行，其中僅第一種引物套參與含有感興趣序列的DNA的合成。經(jīng)過(guò)事先選定數(shù)目的引物延伸循環(huán)以后，使引物退火條件變得較不嚴(yán)格。第二個(gè)引物套將在選定條件下通過(guò)指導(dǎo)在第一系列引物延伸循環(huán)過(guò)程中產(chǎn)生的第二代合成DNA的線性拷貝而起始進(jìn)一步DNA擴(kuò)增。當(dāng)該條件被進(jìn)一步調(diào)整以使第三個(gè)引物套能參與引物依賴性的DNA合成時(shí)，在第一及第二系列引物延伸反應(yīng)中產(chǎn)生的第二代合成DNA用作DNA復(fù)制的模板。
在預(yù)先選定的溫度下結(jié)合的引物的設(shè)計(jì)在分子生物學(xué)家的技術(shù)范圍之內(nèi)。特異性引物發(fā)揮作用的溫度可通過(guò)已有計(jì)算方法(Wu等，DNA細(xì)胞生物學(xué)，10，233-238(1991)及通過(guò)計(jì)算機(jī)程序(Rychlik等，核酸研究，18，6409-6412(1990))，根據(jù)引物長(zhǎng)度及堿基組成來(lái)預(yù)測(cè)。體外DNA擴(kuò)增適宜的溫度循環(huán)可手工或通過(guò)商業(yè)上可得到的可程序化的熱循環(huán)儀來(lái)完成。用熱空氣循環(huán)儀可獲得很快的循環(huán)時(shí)間(Wittwer等，核酸研究。17，4353-4357(1989))；短至30秒的循環(huán)時(shí)間是可能的(Wittwer等，生物技術(shù)10，76-83(1991))。因此一百個(gè)引物延伸循環(huán)可在少至約50分鐘內(nèi)完成。
失活用于切割第一個(gè)引物延伸產(chǎn)物的試劑的適宜溫度循環(huán)可摻入到用于完成所需擴(kuò)增反應(yīng)的可程序化熱循環(huán)儀的程序中。例如，大多數(shù)RN ase的活性通過(guò)加熱含有RNase的反應(yīng)混合物至100℃，3至5分鐘而失活。等位基因特異性線性擴(kuò)增在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)引物使其3’核苷酸與模板中的已知可變異的(多態(tài)的)特定核苷酸互補(bǔ)。該可變異的核苷酸可以是涉及遺傳疾病如鐮刀型細(xì)胞貧血的核苷酸，或在已知具有多態(tài)性的另一位點(diǎn)的核苷酸。如果在引物的3’核苷酸和模板DNA的相應(yīng)核苷酸之間存在錯(cuò)配，引物設(shè)計(jì)保證其將很少延伸，或者，優(yōu)選地完全不延伸。見(jiàn)Petruska等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)美國(guó)85，6252-6256(1988)。因此，這樣的引物是“等位基因特異性的”并能夠在感興趣核酸序列內(nèi)識(shí)別單個(gè)堿基的存在與否。因此在本發(fā)明方法中使用等位基因特異性引物之后存在合成DNA則表示在最初DNA模板中感興趣的等位基因的存在。
此寡核苷酸引導(dǎo)的等位基因特異性特征已用于進(jìn)行等位基因特異性PCR。見(jiàn)，例如，Newton等，核酸研究17 2503，2516(1989)。然而，與一般PCR一樣，等位基因特異性PCR反應(yīng)的指數(shù)行為與運(yùn)行反應(yīng)的困難相關(guān)聯(lián)(見(jiàn)Ugozzoli等，方法2，42-48(1991))。然而，本擴(kuò)增方法的循環(huán)的線性行為由于在等位基因特異性引物內(nèi)存在不可復(fù)制因子而避免了這樣的困難。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)本發(fā)明擴(kuò)增方法的主要產(chǎn)物為具有限定長(zhǎng)度的單鏈合成DNA。產(chǎn)物鏈的長(zhǎng)度由最后使用的引物位置所決定并等于引物自身長(zhǎng)度和可從引物3’末端至模板不可復(fù)制因子之間摻入的核苷酸數(shù)目的總和。產(chǎn)物可通過(guò)已知的核酸檢測(cè)技術(shù)加以檢測(cè)，包括用放射性、螢光成分或酶等標(biāo)記的引物或探針，電泳，高壓液相色譜等。
本發(fā)明在人類及其它動(dòng)物遺傳疾病的診斷中將具有重要的應(yīng)用。已知許多人類遺傳疾病由已知序列的基因中的特異性改變所致。對(duì)于這些特異性突變，用雜交或其它等位基因特異性技術(shù)(見(jiàn)上)測(cè)定各種基因序列中哪個(gè)存在于具有疾病風(fēng)險(xiǎn)的病人DNA中來(lái)進(jìn)行基于DNA的診斷是可能的。很明顯，靶DNA的擴(kuò)增在開(kāi)發(fā)這些技術(shù)中是很有幫助的。該模板擴(kuò)增的主要優(yōu)勢(shì)為可用較小的樣本量，檢測(cè)系統(tǒng)的信噪比提高，存在真正自動(dòng)化的可能且擴(kuò)增系統(tǒng)自身可以是檢測(cè)系統(tǒng)。
本發(fā)明方法提供了由其它擴(kuò)增反應(yīng)所提供的所有相同的優(yōu)勢(shì)，且還有其它的好處。產(chǎn)物為單鏈并且因此在檢測(cè)之前不必變性。如果使用了奇數(shù)引物，將產(chǎn)生過(guò)量的單鏈分子。這些分子將是有用的，例如，作為雜交探針，并因此提供了優(yōu)于其它擴(kuò)增技術(shù)的額外優(yōu)勢(shì)。由于產(chǎn)物線性積累并因此可準(zhǔn)確定量，故還帶來(lái)了進(jìn)一步的優(yōu)勢(shì)；與用新合成DNA作為用相同引物的隨后輪循環(huán)的模板的指數(shù)方法相比，“假陽(yáng)性”的出現(xiàn)幾率將減少。
實(shí)施例在下面幾個(gè)實(shí)施例中使用的溶液描述如下TE(Tris-EDTA)10mM Tris-HCl，1mM EDTA pH8.0TBE(Tris-硼酸鹽-EDTA)89mM Tris-HCl，89mM硼酸，2mM EDTA，pH8.3Klenow聚合酶緩沖液50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，pH7.6激酶緩沖液50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，5mM DTT，0.1mM亞精胺-HCl，0.1mM EDTA，pH7.6DNA聚合酶I緩沖液50mM Tris-HCl，10mM MgSO4，0.1mM DTT，50μg/ml小牛血清白蛋白，pH7.2測(cè)序酶緩沖液40mM Tris-HCl，20mM MgCl2，50mMNaCl，pH7.5Bst聚合酶緩沖液20mM Tris-HCl，20mM MgCl2，pH8.5棲熱水生菌聚合酶緩沖液50mM KCl，10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl2，0.01％(w/v)明膠，pH8.310x Ficoll上樣緩沖液100mM Ths-HCl pH7.5，10mMEDTA，0.5％溴酚藍(lán)，0.5％二甲苯胺(xylene cyanol)，30％Ficoll5×SSPE50mM磷酸鈉pH7.0，0.9mM NaCl及5mM EDTA6×SSC0.9M NaCl，0.09M檸檬酸鈉本發(fā)明方法通過(guò)下面的實(shí)施例加以說(shuō)明，其并非限制權(quán)利要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1-當(dāng)存在于模板中時(shí)1，3-丙二醇阻止引物延伸為了證實(shí)1，3-丙二醇成分用作不可復(fù)制因子并終止DNA合成的能力，合成具有或不具有含1，3-丙二醇成分(標(biāo)記為不可復(fù)制因子“X”)的單核苷酸堿基的模板及互補(bǔ)于該模板3’末端的引物。合成的序列如下名稱 序列(5’→3’)DNA II 207 GCTCCCTTAGCATGGGAGAGTCTCCGGTTCDNA II 207X GCTCCCTTAXCATGGGAGAGTCTCCGGTTCP12 GAACCGGAGACT
引物與模板退火以形成下面的引物模板復(fù)合物5’GCTCCCTTAGCATGGGAGAGTCTCCGGTTCTCAGAGGCCAAG 5’5’GCTCCCTTAXCATGGGAGAGTCTCCGGTTCTCAGAGGCCAAG 5’該引物模板復(fù)合物然后在α-[32P]-dCTP存在下以各種DNA聚合酶(DNA聚合酶I Klenow片段，Ampli Taq聚合酶(珀金埃爾默-Cetus公司)，BST聚合酶(伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)室，Hercules，CA)及測(cè)序聚合酶(美國(guó)生物化學(xué)，Cleveland，OH))延伸并且產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳。
引物與模板以引物/模板比為10進(jìn)行混合，并采用對(duì)聚合酶適宜的緩沖液。20μl反應(yīng)液中含有1pmol207或207-X，10pmol P12，25μM dNTPs，0.5μCiα-[32P]-dCTP及Ampli Taq緩沖液，BST緩沖液，Klenow緩沖液或測(cè)序酶緩沖液。在加入一單位DNA聚合酶及37℃反應(yīng)10分鐘之前樣品于90℃加熱2分鐘并冷卻至0℃5分鐘。如下所示，結(jié)果表明丙二醇?xì)埢柚顾兴姆NDNA聚合酶的引物延伸5′GCTCCCTTAGCATGGGAGAGTCTCCGGTTC<-----------------TCAGAGGCCAAG 5’5′GCTCCCTTAXCATGGGAGAGTCTCCGGTTC<-----------------TCAGAGGCCAAG 5′實(shí)施例2-具有含丙二醇?jí)A基的引物不支持PCR制備四種寡核苷酸，其中的2種含有不可復(fù)制的1，3-丙二醇成分。該序列在具有Z位的MMT-丙二醇磷酰胺的Eppendorf EcosynD300自動(dòng)DNA合成儀上合成。當(dāng)將序列放入合成儀時(shí)，Z被導(dǎo)入。該序列列于下表
名稱序列(5’→3’)BGP-2 22GGGTGGGAAAATAGACCAATAGBGP-2 22X GGGTGGGAAAATAGACCXATAGBGP-1 30GGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCABGP-1 30X GGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAXGTCA人類β-珠蛋白基因(GenBank位置HUMHBB)中該寡核苷酸互補(bǔ)位點(diǎn)顯示于圖12。
體外擴(kuò)增反應(yīng)以四種引物的各種組合完成。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)緩沖液中每種反應(yīng)含有100ng人類基團(tuán)組DNA，各6pmol的兩種引物。反應(yīng)置于熱循環(huán)儀中(Ericomp)并加熱至94℃3分鐘，冷卻至55℃30秒，加熱至72℃30秒然后按如下進(jìn)行31輪加熱冷卻循環(huán)94℃，1分鐘，55℃，30秒，72℃30秒。經(jīng)熱循環(huán)以后，樣品于72℃中再孵育3.5分鐘。僅含有不具丙二醇引物(BGP-130和BGP-222)的反應(yīng)得到了319bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此證實(shí)含有丙二醇的引物不支持PCR。
實(shí)施例3-含有1，3-丙二醇的引物產(chǎn)生特異性DNA片段質(zhì)粒pHβA與含有丙二醇的引物(BGP-130X及BGP-222X)或不含丙二醇成分的對(duì)照引物(BGP-130及BGP-222)混合。引物/模板混合物置于94℃20秒的熱循環(huán)條件以解離雙鏈模板，接著以48℃20秒。最后一輪循環(huán)后，反應(yīng)混合物于48℃進(jìn)一步孵育5分鐘40秒以完成引物延伸反應(yīng)和退火單鏈DNA。利用含有丙二醇引物的反應(yīng)混合物(根據(jù)本發(fā)明)經(jīng)45輪的引物延伸循環(huán)。利用不含丙二醇成分的引物的PCR反應(yīng)經(jīng)10輪引物延伸的循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物于1.5％的瓊脂糖(TBE緩沖液)上電泳。含有丙二醇的引物產(chǎn)生小于PCR產(chǎn)生片段的DNA片段。較小的片段大小是由于引物延伸沒(méi)有延伸至模板鏈末端，導(dǎo)致在產(chǎn)物上留下5’突出端。
圖11顯示了PCR反應(yīng)產(chǎn)物與根據(jù)本發(fā)明的LLA反應(yīng)產(chǎn)物的比較。以指數(shù)方式積累的PCR反應(yīng)主要產(chǎn)物為完全的雙鏈，具有相應(yīng)于所用引物末端的限定的末端。然而，由于跨過(guò)不可復(fù)制因子的引物延伸沒(méi)有發(fā)生，本發(fā)明方法的產(chǎn)物短于相應(yīng)的PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例4-含有丙二醇的引物支持DNA擴(kuò)增根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)用BGP-130X及BGP-222X進(jìn)行各種數(shù)目的循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交，并且雜交信號(hào)與獲自含有該序列的已知量質(zhì)粒DNA信號(hào)相比較。
制備15μl的反應(yīng)液，其在標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液中含有1.1ng質(zhì)粒pHβA(含有克隆于pBR322中的完整人類β-珠蛋白基因)，5pmolBGP-1 30X，5pmol BGP-2 22X，83μM dNTPs，2.5單位的AmpliTaqRDNA聚合酶。熱循環(huán)反應(yīng)在Corbett Research FTS-1熱循環(huán)儀中進(jìn)行45、32及22輪循環(huán)，程序如下94℃20秒，48℃20秒。循環(huán)結(jié)束時(shí)反應(yīng)加熱至94℃20秒且然后于48℃孵育4分鐘。
反應(yīng)產(chǎn)物(3μl)與10μl 4N的NaOH、250mM EDTA混合并印跡到Zeta-探針膜(伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)室，Hercules，CA)上。同樣變性的56、118及231ng的質(zhì)粒pHβA也包括在膜上。該膜在5×SSPE，1％SDS，5mg/mlBlotto，10μg/ml Homomlx I RNA中與5’-32P-CTGCAG TAACGGCAGACTTCTCCT于55℃雜交3小時(shí)。雜交以后印跡在室溫下以6×SSC洗滌，然后用伯樂(lè)分子圖像儀掃描。反應(yīng)產(chǎn)物約250倍的擴(kuò)增證明本發(fā)明方法導(dǎo)致感興趣核酸序列的擴(kuò)增。
實(shí)施例5-從基團(tuán)組DNA中擴(kuò)增人類β-珠蛋白基因根據(jù)本發(fā)明的線性擴(kuò)增反應(yīng)根在15μl體積中完成，其中含有棲熱水生菌聚合酶緩沖液，模板DNA(800ng基因組DNA或104個(gè)質(zhì)粒pHβ4分子)，200μM的每種dNTP(dATP，dTTP，dCTP，及dGTP)，2pmol的寡核苷酸引物BGP5-22X及BGP4-22X，以及2單位的Ampli-Taq聚合酶(珀金埃爾默Cetus)。質(zhì)粒pHβA含有克隆于pBR322中PstI位點(diǎn)的4.4kb的人類β-珠蛋白基因的PstI的片段。作為陰性對(duì)照，除了模板DNA之外包括用于前述反應(yīng)中所有成分進(jìn)行反應(yīng)(“無(wú)模板”對(duì)照)。模板DNA變性3分鐘后，擴(kuò)增按如下進(jìn)行99輪循環(huán)55℃退火30秒，72℃聚合15秒，并于94℃變性30秒。在最后一輪循環(huán)結(jié)束時(shí)，樣品于55℃退火30秒并最后于72℃聚合4分鐘。
第一步驟(100輪循環(huán))結(jié)束時(shí)，從每種樣品(基因組DNA，質(zhì)粒DNA，和陰性對(duì)照)中取出7.5μl，并與7.5μl含棲熱水生菌聚合酶緩沖液，5pmol引物BGP1-35X及BGP2-35X，及2單位Apmpli Taq聚合酶的溶液混合。除了退火溫度為63℃以外，循環(huán)程序類似于第一步驟所用的程序。
為了控制由擴(kuò)增產(chǎn)生的片段的大小，進(jìn)行了兩種反應(yīng)。一種反應(yīng)含有棲熱水生菌聚合酶緩沖液，5pmol引物BGP5-22X及BGP4-22X，1×108個(gè)質(zhì)粒pHβA分子，及3單位的Ampli-Taq聚合酶。除了使用引物BGP1-35X和BGP2-35X之外第二種對(duì)照包括與前面反應(yīng)相同的成分。模板DNA于94℃變性4分鐘并然后用下面條件的程序循環(huán)48次于55℃退火及聚合30秒；于94℃變性30秒。在最后一輪循環(huán)結(jié)束時(shí)樣品于55℃退火30秒并于72℃聚合4分鐘。
引物序列(5’-->3’)BGP1-35XCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGXCATCBGP2-35XGGGTGGGAAAATAGACCAATAGGCAGAGAGXGTCABGP4-22XCCAAAGGACTCAAAGAAXCTCTBGP5-22XCCTCACCCTGTGGAGCCXCACCLLA產(chǎn)物的分析全部反應(yīng)(15μl)與1.6μl10×Ficoll上樣緩沖液混合并于1.5％瓊脂糖凝膠(伯樂(lè)超純瓊脂糖)中電泳。電泳于TBE緩沖液中110伏進(jìn)行90分鐘。凝膠隨后以溴化乙錠(1μg/ml)染色30分鐘，脫色15分鐘，并通過(guò)紫外(UV)照射拍照。電泳的DNA然后通過(guò)堿性轉(zhuǎn)移(Reed，K.C.和D.A.Mann，從瓊脂糖凝膠中快速轉(zhuǎn)移DNA至尼龍膜上，核酸研究，137207-722(1985))轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Zeta Probe，伯樂(lè))上并通過(guò)UV輻射(Church，G.M.和W.Gilbert，基因組測(cè)序，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，811991-1995(1984))固定至膜上。膜于5×SSPE，1％SDS，10μg/ml homomix RNA及0.5％脫脂奶粉(康乃馨，洛杉磯，CA)中預(yù)雜交1小時(shí)并隨后以2.5×106cpm/ml 5’末端32P標(biāo)記的探針5’CAGGAGTCAGGTGCACCATGGT在55℃雜交2小時(shí)。膜以6×SSC室溫洗2次各30分鐘并在室溫放射自顯影30分鐘。
基因組DNA產(chǎn)生與珠蛋白基因質(zhì)粒DNA對(duì)照相同的片段。片段的大小為由BGP1-35X及BGP2-35X引物產(chǎn)生的大小。
實(shí)施例6與PCR體外擴(kuò)增相比LLA擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)污染具有抗性本發(fā)明的“LLA”擴(kuò)增反應(yīng)在15μl體積中完成，其中含有棲熱水生菌聚合酶緩沖液，模板DNA(3.5×109個(gè)質(zhì)粒pHβA分子)，200μM每種dNTP(dATP、TTP、dCTP和dGTP)，5皮摩爾(picomoles)寡核苷酸引物BGP1-22X及BGP2-22X，以及1.25單位的Ampli-Taq DNA聚合酶(珀金埃爾默Cetus)。模板DNA變性1分鐘以后，通過(guò)于48℃退火30秒及94℃變性30秒進(jìn)行49輪擴(kuò)增。最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)，樣品于48℃孵育4分鐘。
為了比較目的，在15μl體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中含有棲熱水生菌聚合酶緩沖液，模板DNA(3.5×109個(gè)質(zhì)粒pHβA分子)，200μM的每種dNTP(dATP、TTP、dCTP、及dGTP)，5皮摩爾的寡核苷酸引物BGP1-22和BGP2-22，及1.25單位的Ampli-Taq DNA聚合酶。模板DNA變性1分鐘后，通過(guò)于48℃退火30秒并于94℃變性30秒進(jìn)行9個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)，樣品于48℃孵育4分鐘。
LLA和PCR產(chǎn)物的分析LLA及PCR產(chǎn)物的兩倍系列稀釋液(1/64μl、1/32μl、1/16μl、1/8μl、1/4μl、1/2μl、1μl、2μl、4μl及8μl)與1×Ficoll上樣緩沖液混合并于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳。電泳在1×TBE緩沖液中以110伏特進(jìn)行90分鐘。電泳的DNA通過(guò)堿性轉(zhuǎn)移(Reed和Mann，1985)轉(zhuǎn)移至尼龍膜，通過(guò)紫外輻射交聯(lián)(Church和Gilbert，1984)，且然后以2×SSC中和。然后，膜在5×SSPE、1％十二烷基磺酸鈉(SDS)，10μg/ml homomix RNA，0.5％脫脂奶粉及2.5×106cpm32p標(biāo)記的探針5’CAGGAGTCAGGTGCACCATGGT中雜交。雜交在55℃進(jìn)行2小時(shí)。雜交以后，膜在室溫以6×SSC洗兩次各15分鐘且然后以伯樂(lè)GS-250分子圖像儀掃描和定量。
擴(kuò)增子污染實(shí)驗(yàn)相同量的LLA產(chǎn)物(1/26μl)及PCR(1/16μl)產(chǎn)物(由圖像儀定量(上述))用蒸餾水進(jìn)行104、105及106倍的稀釋；這些稀釋液隨后用作PCR反應(yīng)的DNA模板。擴(kuò)增反應(yīng)在15μl體積中完成，其中含有棲熱水生菌聚合酶緩沖液，模板DNA(LLA或PCR稀釋液)，200μM的每種dNTP(dATP、TTP、dCTP及dGTP)，5皮摩爾的寡核苷酸引物BGP1-22和BGP2-22，及1單位的Ampli-Taq聚合酶。反應(yīng)以雙份進(jìn)行且在第-步94℃熱變性3分鐘以后，樣品進(jìn)行25和30輪擴(kuò)增循環(huán)(55℃30秒，72℃30秒，及94℃30秒)并最后于50℃孵育30秒及72℃孵育4分鐘。此外，包括除了模板DNA外含有所有試劑的陰性對(duì)照。
為了控制和定量LLA和PCR DNA模板的相對(duì)量，用在BGP1-22和BGP2-22內(nèi)部引導(dǎo)的不同引物套(MD040和PC04)進(jìn)行第二套PCR反應(yīng)。反應(yīng)成分(除了引物)和反應(yīng)條件如前面段落所述。
15μl反應(yīng)液與16μl 10×Ficoll上樣緩沖液混合并于1.5％瓊脂糖凝膠(伯樂(lè)超純瓊脂糖)中電泳。電泳于1×TBE緩沖液中110伏特進(jìn)行90分鐘。凝膠然后以溴化乙錠(1μg/ml)染色30分鐘，脫色15分鐘，并通過(guò)紫外(UV)照射拍照。電泳的DNA然后通過(guò)堿性轉(zhuǎn)移(Reed和Mann(1985))轉(zhuǎn)移至尼龍膜并通過(guò)UV照射固定至膜上(Church(1984))。膜于5×SSPE，1％SDS，10μg/ml homomix RNA及0.5％脫脂奶粉中預(yù)雜交1小時(shí)，然后與2.5×106cpm/ml 5’-P32標(biāo)記的探針5’CAGGAGTCAGGTGCACCATGGT于55℃雜交2小時(shí)。以6×SSC于室溫洗膜2次并且反應(yīng)以伯樂(lè)GS-250分子圖像儀定量。
結(jié)果測(cè)定以外側(cè)引物套(測(cè)量擴(kuò)增子在第二個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增的能力)與內(nèi)側(cè)引物套(測(cè)量存在于反應(yīng)中擴(kuò)增子的數(shù)量)擴(kuò)增的反應(yīng)的雜交比。正如從下表中所能見(jiàn)到的，LLA反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增子能抵抗從外側(cè)引物的擴(kuò)增并且因此將抵抗遺留污染的影響。
表II污染對(duì)隨后擴(kuò)增的影響稀釋外側(cè)內(nèi)側(cè)(PCR)外側(cè)內(nèi)側(cè)(LLA)10-41.58 0.1710-51.62 0.02實(shí)施例7通過(guò)LLA用含核糖核苷的引物制備特異性DNA片段用標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)固相合成方法制備具有下面序列的寡核苷酸及含核糖核苷的寡核苷酸。在寡核苷酸GH1和GH2中的尿嘧啶核苷為核糖核苷。
名稱序列(5’-->3’)GH1 SEQTTCCCAACCAUTCCCTTAGH2 SEQGGATTTCTGUTGTGTTTCGH3 SEQTTCCCAACCATTCCCTTACHG SEQGGATTTCTGTTGTGTTTCMd114 TAGCGTTGTCAAAAAGCC進(jìn)行用含有核糖核苷的引物GH1和GH2或脫氧引物GH3和GH4從基團(tuán)組DNA樣品中擴(kuò)增人類生長(zhǎng)激素基因片段的體外擴(kuò)增反應(yīng)。每種反應(yīng)在含有1.5單位Taq聚合酶(珀金-埃爾默)的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)緩沖液中含有500ng人類基因組DNA及兩種引物中每種引物40皮摩爾。通過(guò)將反應(yīng)混合物置于熱循環(huán)儀中，并加熱至95℃4分鐘，冷卻至52℃2分鐘，然后加熱至72℃1分鐘進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)按如下持續(xù)28個(gè)循環(huán)94℃4分鐘、52℃2分鐘及72℃1分鐘；且然后進(jìn)行如下的一輪循環(huán)94℃1分鐘，52℃2分鐘及72℃6分鐘。反應(yīng)以后，擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5％瓊脂糖凝膠中分離，然后用制備基因(“Prep-A-Gene”)DNA純化試劑盒(可從伯樂(lè)得到)純化。
于5.6μl反應(yīng)體積中的擴(kuò)增產(chǎn)物以1.4μl 0.5M NaOH處理以在相鄰于摻入到第一PCR產(chǎn)物中的尿嘧啶核苷的磷酸二酯鍵處切割擴(kuò)增產(chǎn)物，然后加熱至95℃15分鐘。這些溶液通過(guò)加入0.9μl 1M HCl而中和，然后將產(chǎn)物進(jìn)一步線性擴(kuò)增以證實(shí)第一個(gè)引物延伸產(chǎn)物不再含有用于PCR反應(yīng)的含核糖核苷酸引物的完全拷貝。PCR產(chǎn)物用在5’末端以P32標(biāo)記的寡核苷酸Md114進(jìn)行引物延伸。依據(jù)反應(yīng)中所用的引物，用以NaOH處理的PCR擴(kuò)增片段制備的引物延伸產(chǎn)物短于沒(méi)有被NaOH切割的PCR擴(kuò)增片段的引物延伸產(chǎn)物。這些結(jié)果證明了摻入的核糖核苷可被切割以阻止在隨后輪的PCR擴(kuò)增中引物的延伸。
權(quán)利要求
1.一種用于擴(kuò)增包含在互補(bǔ)核酸鏈內(nèi)的感興趣的核酸序列的方法，包括(a)在適當(dāng)條件下將所述的鏈與含有不可復(fù)制因子的引物接觸，使第一代引物延伸產(chǎn)物用所述的鏈作為模板而合成，并且其中用于鏈的引物的選擇是使以其合成的第一代引物延伸產(chǎn)物在與鏈分離后，可用作互補(bǔ)鏈引物的模板用于合成第二代引物延伸產(chǎn)物；(b)將第一代引物延伸產(chǎn)物從其各自模板上分離以制備單鏈分子；和(c)在適當(dāng)條件下用步驟(a)的引物處理第一代引物延伸產(chǎn)物從而用第一代引物延伸產(chǎn)物作為模板而合成第二代引物延伸產(chǎn)物；其中的第二代引物延伸產(chǎn)物至少含有感興趣核酸序列的部分序列，并且不能夠用作延伸后合成其模板的引物合成延伸產(chǎn)物的模板。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括將產(chǎn)生的第二代引物延伸產(chǎn)物與其各自的模板分離以制備單鏈分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的步驟(c)至少重復(fù)一次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的不可復(fù)制因子不位于任何所述引物的末端殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的不可復(fù)制因子為脫氧核糖核苷酸的衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的不可復(fù)制因子為核糖核苷酸的衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的不可復(fù)制因子為1，3-丙二醇?xì)埢?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的不可復(fù)制因子為1，4-脫水-2-脫氧-D-核糖醇?xì)埢?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括在適當(dāng)條件下以含有不可復(fù)制因子的引物處理第二代引物延伸產(chǎn)物的步驟從而利用第二代引物延伸產(chǎn)物作為模板而合成引物延伸產(chǎn)物。
10.一種用于擴(kuò)增包含在互補(bǔ)核酸鏈中的感興趣的核酸序列的方法，包括(a)在適當(dāng)條件下將所述的鏈與含有不可復(fù)制因子的第一種引物和第二種引物接觸，使第一代引物延伸產(chǎn)物用所述的鏈作為模板而合成，并且其中第一種引物和第二種引物的選擇是使第一代引物延伸產(chǎn)物在與其模板分離后，可用作第一種引物和第二種引物的模板用于合成第二代引物延伸產(chǎn)物；(b)將第一代引物延伸產(chǎn)物從其各自模板上分離以制備單鏈分子；和(c)在適當(dāng)條件下用第一種引物和第二種引物處理第一代引物延伸產(chǎn)物從而用第一代引物延伸產(chǎn)物作為模板而合成第二代引物延伸產(chǎn)物；其中的第二代引物延伸產(chǎn)物至少含有感興趣核酸序列的部分序列，第一種引物的第二代引物延伸產(chǎn)物能夠用作模板產(chǎn)生第二種引物的引物延伸產(chǎn)物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其進(jìn)一步包括分離步驟(c)中產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物以制備單鏈分子。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中的步驟(c)至少重復(fù)一次。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中的不可復(fù)制因子不位于任何所述引物的末端殘基上。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中的不可復(fù)制因子為脫氧核糖核苷酸的衍生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中的不可復(fù)制因子為核糖核苷酸的衍生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中的不可復(fù)制因子為1，3-丙二醇?xì)埢?br> 17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中的不可復(fù)制因子為1，4-脫水-2-脫氧-D-核糖醇?xì)埢?br> 18.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其進(jìn)一步包括在適當(dāng)?shù)臈l件下用第三種引物處理所述第二種引物的第二代引物延伸產(chǎn)物，其中所述的第三種引物含有不可復(fù)制因子，從而利用所述第二種引物的第二代引物延伸產(chǎn)物作為模板而形成第三種引物延伸產(chǎn)物。
19.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中每條所述的鏈含有第一種引物的引物結(jié)合位點(diǎn)和第二種引物的引物結(jié)合位點(diǎn)，第一種引物的引物結(jié)合位點(diǎn)位于第二種引物的引物結(jié)合位點(diǎn)的3’。
20.一種擴(kuò)增包含在互補(bǔ)核酸鏈內(nèi)的感興趣核酸序列的方法，包括(a)將所述的鏈在第一套引物延伸反應(yīng)條件下與第一種引物及第二種引物接觸，所述的第一種引物及第二種引物均含有不可復(fù)制因子，從而使第一代引物延伸產(chǎn)物用所述的鏈作為模板從第一種引物而不是第二種引物合成，并且其中第一種引物的選擇是使來(lái)自此步驟的第一代引物延伸產(chǎn)物在與其模板分離后，可用作模板合成所述互補(bǔ)鏈的第一種引物的第二代延伸產(chǎn)物；(b)將第一代引物延伸產(chǎn)物與其各自的模板分離以制備單鏈分子；(c)以步驟(a)的引物在適當(dāng)條件下處理第一代引物延伸產(chǎn)物從而用第一代引物延伸產(chǎn)物作為模板產(chǎn)生第二代引物延伸產(chǎn)物；(d)將第二代引物延伸產(chǎn)物與其各自的模板分離以制備單鏈分子；(e)重復(fù)步驟(c)和(d)至少一次；和(f)將步驟(e)的反應(yīng)混合物置于第二套引物延伸反應(yīng)條件中從而用第二代引物延伸產(chǎn)物作為模板從所述的第二種引物合成引物延伸產(chǎn)物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述的第一套引物延伸反應(yīng)條件較第二套引物延伸反應(yīng)條件更為嚴(yán)格。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述的第一套條件包括較所述的第二套條件更高的溫度。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中的不可復(fù)制因子不位于任何所述引物的末端殘基上。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中的不可復(fù)制因子為脫氧核糖核苷酸的衍生物。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述的不可復(fù)制因子為核糖酸苷酸的衍生物。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的不可復(fù)制因子為1，3-丙二醇?xì)埢?br> 27.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的不可復(fù)制因子為1，4-脫水-2-脫氧-D-核糖醇?xì)埢?br> 28.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述的每條鏈含有第一種引物的引物結(jié)合位點(diǎn)和第二種引物的引物結(jié)合位點(diǎn)，第一種引物的引物結(jié)合位點(diǎn)位于第二種引物的引物結(jié)合位點(diǎn)的3’。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的核酸序列含有與遺傳疾病有關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)，并且所述的每種引物的選擇是使之僅在所述疾病狀態(tài)存在或不存在時(shí)引導(dǎo)核酸合成。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的遺傳疾病為鐮刀型細(xì)胞貧血。
31.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)擴(kuò)增的感興趣核酸序列的存在與否。
32.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)擴(kuò)增的感興趣核酸序列的存在與否。
33.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)擴(kuò)增的感興趣核酸序列的存在與否。
34.用于擴(kuò)增特定核酸序列的試劑盒，包括DNA聚合酶，待擴(kuò)增的每種序列的引物對(duì)，以及能由所述的引物和DNA聚合酶復(fù)制的對(duì)照核酸序列，其中所述的每種引物均包括不可復(fù)制因子。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的試劑盒，其中的不可復(fù)制因子為1，3-丙二醇?xì)埢?br> 36.根據(jù)權(quán)利要求34的試劑盒，其中的不可復(fù)制因子為1，4-脫水-2-腫氧-D-核糖醇?xì)埢?br> 37.用于擴(kuò)增特定核酸序列的試劑盒，包括DNA聚合酶，每種待擴(kuò)增序列的引物對(duì)，以及能夠檢測(cè)特定核酸序列擴(kuò)增產(chǎn)物存在與否的核酸探針，其中所述的每種引物均包括不可復(fù)制因子。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的試驗(yàn)盒，進(jìn)一步包括能由所述引物和DNA聚合酶復(fù)制及能由所述的核酸探針檢測(cè)的對(duì)照核酸序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的試劑盒，其中的不可復(fù)制因子為1，3-丙二醇?xì)埢?br> 40.根據(jù)權(quán)利要求37的試劑盒，其中的不可復(fù)制因子為1，4-脫水-2-脫氧-D-核糖醇?xì)埢?br> 41.根據(jù)權(quán)利要求34的試劑盒，其中所述引物的選擇是使之?dāng)U增代表遺傳疾病或異常的核酸序列。
42.根據(jù)權(quán)利要求37的試劑盒，其中所述引物的選擇是使之?dāng)U增代表遺傳疾病或異常的核酸序列。
全文摘要
感興趣核酸序列的大量合成(“擴(kuò)增”)通過(guò)一系列銜接的多輪引物延伸反應(yīng)(LLA)來(lái)完成。本方法每個(gè)引物延伸反應(yīng)中使用的引物含有不可復(fù)制因子,其終止核酸合成并因此阻止合成的分子用作隨后循環(huán)的模板。合成的分子在引物延伸過(guò)程中以數(shù)學(xué)線性方式積累,因而使該方法對(duì)污染核酸相對(duì)不敏感。采用了多引物套從而保證了感興趣的核酸序列的大量拷貝的積累。本發(fā)明也提供了擴(kuò)增的感興趣核酸序列的檢測(cè)方法,以及完成該反應(yīng)的試劑盒。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1186520SQ96194406
公開(kāi)日1998年7月1日 申請(qǐng)日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者羅伯特·布魯斯·華萊士 申請(qǐng)人:伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)有限公司