專利名稱：生長(zhǎng)因子復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白和玻連蛋白。特別地，本發(fā)明涉及一種分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含一種胰島素樣生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白和玻連蛋白。本發(fā)明還提供了生長(zhǎng)因子復(fù)合物，其包含促進(jìn)或增強(qiáng)生長(zhǎng)因子復(fù)合物形成的不同生長(zhǎng)因子和/或生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白。本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和/或遷移的方法，以進(jìn)行創(chuàng)傷修復(fù)，皮膚修復(fù)，化妝用皮膚護(hù)理和組織修復(fù)治療。相反，通過破壞蛋白質(zhì)復(fù)合物在體內(nèi)形成，可抑制生長(zhǎng)因子驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞增殖和/或遷移，以例如治療癌癥，牛皮癬，動(dòng)脈硬化和有疤痕過度生長(zhǎng)傾向的創(chuàng)傷。這些治療也許具有醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
皮膚的生長(zhǎng)，修復(fù)和愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物控制機(jī)制，其通過陽(yáng)性和陰性信號(hào)起作用。這種信號(hào)在控制細(xì)胞增殖，分化和遷移水平起作用，并典型地由生長(zhǎng)因子多肽介導(dǎo)。在此方面，重要的生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I和-II)。已經(jīng)報(bào)道人IGF-I發(fā)揮廣泛的生物學(xué)活性，包括刺激細(xì)胞增殖，分化和遷移，保護(hù)蛋白質(zhì)免于降解和細(xì)胞程序死亡，以及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌因子如生長(zhǎng)激素。IGF-II與IGF-I具有相似性質(zhì)，但表現(xiàn)為與癌發(fā)生及胎兒與胚胎發(fā)育更相關(guān)，IGF-I在出生以后的發(fā)育中具有更大的作用。IGF-I和IGF-II均通過與I型IGF受體(IGFR)結(jié)合而發(fā)揮作用。這種相互作用所需的IGF的可利用性由胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP 1-6)調(diào)節(jié)。IGFBP已知可陽(yáng)性和陰性調(diào)節(jié)IGF功能，以及呈現(xiàn)IGF-非依賴性活性。IGF途徑的另一種功能成分是II型IGFR，其還已知是陽(yáng)離子非依賴性6_磷酸甘露糖受體(CI-MPR)。II型IGFR是一種多功能蛋白質(zhì)，其結(jié)合攜帶6-磷酸甘露糖組分的溶酶體酶，以及IGF-II，但還不清楚與IGF-II結(jié)合的功能意義(O’ Dell&Day, 1998，國(guó)際生物化學(xué)細(xì)胞生物學(xué)雜志 30767; Braulke, 1999，Horm. Metab. Res. 31 242; Nykjaer 等，1998，細(xì)胞生物學(xué)雜志141 815)。也已經(jīng)報(bào)道IGF結(jié)合另一組蛋白質(zhì)，稱為“IGFBP-相關(guān)蛋白質(zhì)”，這一組蛋白質(zhì)呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)相似性并包括結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)及由mac25，nOV和cyr61基因編碼的產(chǎn)物。與IGFBP相比，這些物質(zhì)結(jié)合IGF的親和性較低。最近，鑒別出玻連蛋白(VN)是一種胞外基質(zhì)蛋白，結(jié)構(gòu)與IGFBP和IGFBP-相關(guān)蛋白不相關(guān)，其結(jié)合IGF-II但不結(jié)合IGF-I (Upton等，1999，內(nèi)分泌學(xué)1402928)。玻連蛋白是一種75kD糖基化胞外基質(zhì)蛋白，其也在血液中發(fā)現(xiàn)，并與癌癥，骨疾病和病理失調(diào)包括血管發(fā)生相關(guān)聯(lián)(參見Schvartz等，1999，生物化學(xué)細(xì)胞生物學(xué)雜志31539)。玻連蛋白在如血管發(fā)生和致瘤發(fā)生等病癥中的作用，至少部分源于玻連蛋白結(jié)合整聯(lián)蛋白及與尿激酶纖溶酶原激活物系統(tǒng)成分(例如PAI-l，uPAR，纖溶酶原)相互作用的能力，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，粘著，擴(kuò)散和遷移。玻連蛋白更特異性參與應(yīng)答藥物治療而防止致瘤細(xì)胞程序死亡(Uhm等，1999，癌癥臨床研究5 1587)。玻連蛋白表現(xiàn)為在循環(huán)中是IGF-II的載體(McMurtry等，1996，內(nèi)分泌學(xué)雜志150 149)。發(fā)明目的本發(fā)明人令人驚奇地揭示了 IGFBP能結(jié)合玻連蛋白，而且當(dāng)IGF-I與IGFBP結(jié)合時(shí)，其可以結(jié)合玻連蛋白。因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種分離的含有IGFBP和玻連蛋白的復(fù)合物。發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供了一種分離的多肽復(fù)合物，其包含一種生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白和玻連蛋白。優(yōu)選地，所述分離的多肽復(fù)合物還包含一種生長(zhǎng)因子。一種優(yōu)選的生長(zhǎng)因子是胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (IGF-I)。其它生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，骨橋蛋白，血小板反應(yīng)蛋白-1，腱生蛋白-C，PAI-1，纖溶酶原，纖維蛋白原，纖維蛋白和運(yùn)鐵蛋白。一種優(yōu)選的生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白是選自IGFBPl, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5和IGFBP6的一種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白。一種更優(yōu)選的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白是IGFBP2，IGFBP3, IGFBP4或IGFBP5。一種最優(yōu)選的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白是IGFBP3或IGFBP5。 第二方面，本發(fā)明提供了一種分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含一種IGFBP-相關(guān)蛋白和玻連蛋白。優(yōu)選地，所述分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物還包含一種生長(zhǎng)因子，優(yōu)選IGF-I。在一個(gè)實(shí)施方案中，IGFBP-相關(guān)蛋白選自結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)，由mac25基因編碼的多肽，由nov基因編碼的多肽和由cyr61基因編碼的多肽。第三方面，本發(fā)明提供了一種分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含玻連蛋白，一種變體生長(zhǎng)因子(a variant growth factor)和/或一種變體生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，這方面的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物包含玻連蛋白和一種工程化包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HBD)的變體生長(zhǎng)因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這方面的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物包含玻連蛋白和一種非糖基化生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這方面的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物包含玻連蛋白和選自des (1-6) IGF-II 和 des (1-3) IGF-I 的一種變體生長(zhǎng)因子。第一、第二和第三方面還涵蓋了本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物另外可以包括一種酸不穩(wěn)定亞單位，這是能與IGFBP復(fù)合的一種多肽，后文稱為ALS。根據(jù)第一，第二和第三方面，本發(fā)明還涵蓋了分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含變體生長(zhǎng)因子和其生物活性片段，生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白，IGFBP-相關(guān)的蛋白質(zhì)和玻連蛋白，本發(fā)明還涵蓋了這種復(fù)合物的應(yīng)用。生物活性片段和變異體包括所述生長(zhǎng)因子的類似物，突變體，興奮劑和拮抗劑，生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白，IGFBP-相關(guān)的蛋白質(zhì)和玻連蛋白。
第四方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明第一，第二和第三方面的一或多種分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，和一種藥物適當(dāng)?shù)妮d體或稀釋劑。第五方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含一種表達(dá)構(gòu)建體和一種可藥用載體或稀釋劑，所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼本發(fā)明第一，第二和第三方面的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物的一或多種核酸。第六方面，本發(fā)明提供了一種能表達(dá)重組的本發(fā)明第一，第二和第三方面的蛋白質(zhì)復(fù)合物或能形成所述復(fù)合物的重組蛋白的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。第七方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和/或遷移的方法，包括給予動(dòng)物或其分離的細(xì)胞本發(fā)明第一，第二和第三方面的一種分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物的步驟。優(yōu)選地，所述分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物包含一種IGFBP和玻連蛋白。
優(yōu)選地，所述分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物還包含IGF-I。第八方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和/或遷移的方法，包括給予動(dòng)物或其分離的細(xì)胞一種制劑，其防止或破壞本發(fā)明第一，第二和第三方面的一種分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成的步驟。優(yōu)選地，所述制劑防止或破壞IGFBP和玻連蛋白之間的相互作用。更優(yōu)選地，所述制劑防止或破壞IGFBP和玻連蛋白之間的相互作用，其中所述蛋白質(zhì)復(fù)合物包含IGF-I。所述制劑例如可以是IGFBP和玻連蛋白之間或IGFBP相關(guān)蛋白和玻連蛋白之間的相互作用的拮抗劑。抑制IGFBP和玻連蛋白復(fù)合物形成的制劑例如是IGF-II。如下文更詳細(xì)的闡述，IGFBP和玻連蛋白之間的相互作用的破壞不僅抑制致瘤細(xì)胞增殖，還抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，這兩種情況是腫瘤病理學(xué)的關(guān)鍵問題。本發(fā)明的另一方面提供了前述各方面的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物和方法在治療或預(yù)防性處理上皮細(xì)胞疾病如牛皮癬，動(dòng)脈硬化，胃腸道上皮惡化和上皮乳癌疾病，和/或在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，皮膚修復(fù)，潰瘍和燒傷康復(fù)，體外皮膚再生如針對(duì)移植自體皮膚，骨再生和修復(fù)損傷的神經(jīng)組織中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物一種外科植入物或修復(fù)物。所述外科植入物或修復(fù)物可以用所述分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物包被、浸潰或以其它方式預(yù)處理。根據(jù)本發(fā)明處理的動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人，或可以是非哺乳動(dòng)物脊椎動(dòng)物，如魚類，爬行動(dòng)物或鳥，或分離自其中的細(xì)胞。在本說明書中，除非特別指出，所用術(shù)語“包含”的含義是包含而不排除其它，所以所指出的整體或整體組可以包括一或多個(gè)其它非未指出的整體或整體組。附圖和表的簡(jiǎn)述表I :揭示編碼生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白的核酸的參考文獻(xiàn)列表。表2 :與玻連蛋白結(jié)合的IGF-I和IGFBP-5在HaCAT人角質(zhì)形成細(xì)胞中刺激蛋白質(zhì)合成。數(shù)據(jù)得自單次實(shí)驗(yàn)的3H-亮氨酸摻入測(cè)定值，并以相對(duì)于對(duì)照組(沒有IGF-I，IGFBP-5或玻連蛋白)在24小時(shí)后的刺激百分率表示，每種處理均以一式三份進(jìn)行。將IGF-I在存在(+)玻連蛋白(300ng/孔)或不存在(一)玻連蛋白的情況下加入IGFBP-5中(5ng/孔)。
圖I :使用增加濃度的胰島素(▲)或IGF-II ( )與[125I]-IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合300ng玻連蛋白(VN)/孔的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析。將放射標(biāo)記的IGF-II (10，OOOcpm)加入VN包被的孔中，并在溫育過夜及幾次洗滌后確定結(jié)合的計(jì)數(shù)。所述結(jié)合用相對(duì)于在沒有IGF-II或胰島素加入的對(duì)照孔中觀測(cè)的結(jié)合的百分率表示。所述結(jié)果以得自三個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表實(shí)驗(yàn)的三次重復(fù)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差示出。圖2 :使用增加濃度的IGF-I或IGF-II與[125I]_IGF_II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合300ng玻連蛋白(VN) /孔的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析。將放射標(biāo)記的IGF-II (10，OOOcpm)加入VN (■)或IGFBP2 ( )包被的孔中，并在溫育過夜及幾次洗滌后確定結(jié)合的計(jì)數(shù)。所述結(jié)合用相對(duì)于在沒有IGF加入的對(duì)照孔中觀測(cè)的結(jié)合的百分率表示。圖3 :使用增加濃度的proIGF-II ( ■)或IGF-II ( )與[125I]-IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合300ng玻連蛋白(VN)/孔的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析。將放射標(biāo)記的IGF-II (10，OOOcpm)加入VN包被的孔中，并在溫育過夜及幾次洗滌后確定結(jié)合的計(jì)數(shù)。所述結(jié)合用相對(duì)于在沒有IGF-II或 proIGF-II加入的對(duì)照孔中觀測(cè)的結(jié)合的百分率表示。所述結(jié)果以得自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的三份重復(fù)的平均值土SEM示出。圖4:使用增加濃度的PAI-K ■)或IGF-II( )與[125I]-IGF_II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合300ng玻連蛋白(VN)/孔的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析。將放射標(biāo)記的IGF-II (10，OOOcpm)加入VN包被的孔中，并在溫育過夜及幾次洗滌后確定結(jié)合的計(jì)數(shù)。所述結(jié)合用相對(duì)于在沒有IGF-II或PAI-I加入的對(duì)照孔中觀測(cè)的結(jié)合的百分率表示。所述結(jié)果以得自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)的三份重復(fù)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差示出。圖5 :對(duì)比(A) IGF-II和IGFBP3預(yù)溫育及⑶IGF-I和IGFBP3預(yù)溫育對(duì)結(jié)合玻連蛋白的作用的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析。IGFBP3是非糖基化的并在大腸桿菌中產(chǎn)生。將增加濃度的IGFBP3與10，OOOcpm[125I]-IGF-II (A)或[125I]-IGF-I⑶預(yù)溫育4小時(shí)，之后加入玻連蛋白包被的孔中?；蛘?，不用預(yù)溫育將 IGFBP3 和 10，OOOcpm[125I]-IGF-II (A)或[125Ij-IGF-I (B)加入玻連蛋白包被的孔中。所述結(jié)合以在沒有非特異性結(jié)合的情況中獲得的cpm表示。結(jié)果以得自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)的三份重復(fù)的平均值示出。圖6 :標(biāo)記的IGF-I與VN包被的孔在存在⑷IGFBPI，⑶IGFBP2，(C) IGFBP3, (D)IGFBP4, (E) IGFBP5和(F) IGFBP6情況下的結(jié)合。這些重組的IGFBP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。以在存在指定的IGFBP情況中結(jié)合的標(biāo)記IGF-I的平均cpm/VN包被的孔(300ng/孔)表示的數(shù)據(jù)，得自6個(gè)單獨(dú)測(cè)定。在每個(gè)孔中加入IOOOOcpm放射標(biāo)記的IGF-I。圖7 :標(biāo)記的 IGF-I 與 VN 在存在“Gly IGFBP-3” (糖基化 IGFBP-3)，“ IGFBP-3HBD突變體”(具有突變的推定的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的IGFBP-3)和“non-gly IGFBP-3”(非糖基化IGFBP-3)情況下的結(jié)合。圖8 :使用增加濃度的 IGF 和 desIGF 與用[125Ij-IGF-I 或[125I]-IGF-II 溫育的非糖基化IGFBP3競(jìng)爭(zhēng)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析。將30ng(A)或IOng⑶的IGFBP3加上10，000cpm[I]-IGF-II (A)或IGF-1 (B)加入VN-包被的孔中。加入增加濃度的IGF-I, IGF-II, des (1-3) IGF-I (未示出)和 des (1-6) IGF-II,以與放射標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合VN。經(jīng)IOng(A) or 30ng⑶IGFBP3處理的VN包被的對(duì)照孔與只用VN包被的對(duì)照孔一起示出。結(jié)合以在沒有非特異性結(jié)合中獲得的cpm表示。結(jié)果以在三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的三份重復(fù)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表不。
圖9:在人角質(zhì)形成細(xì)胞中刺激蛋白質(zhì)合成。以24小時(shí)之后聞?dòng)趯?duì)照(-VNj-IGF-II)的刺激％表示的數(shù)據(jù)，得自三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其中每種處理均以一式三份進(jìn)行測(cè)試。由空心桿(只有VN的作用)組合灰色桿(只有IGF-II的作用)表示的理論相加作用與實(shí)際觀測(cè)的預(yù)結(jié)合的IGF-II對(duì)VN的作用(黑色桿)相對(duì)比。在除了所測(cè)試的最低濃度IGF-II之外的所有情況中，實(shí)際觀測(cè)的作用明顯高于計(jì)算的相加作用(p〈0. 05)。

圖10 :標(biāo)記的 IGF-II 與 VN 包被的孔在存在(A) IGFBPI, (B) IGFBP2, (C)IGFBP3, (D) IGFBP4, (E) IGFBP5和(F) IGFBP6的情況下的結(jié)合。這些重組IGFBP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。以在存在指定IGFBP情況下結(jié)合的標(biāo)記IGF-II的平均cpm/VN包被的孔(300ng/孔)表示的數(shù)據(jù)，得自六個(gè)單獨(dú)的測(cè)定。將lOOOOcpm放射標(biāo)記的IGF-II加入每個(gè)孔中。發(fā)明詳述本發(fā)明至少部分得自本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，即IGF-I通過IGFBP與玻連蛋白之間的結(jié)合相互作用而結(jié)合玻連蛋白。另外，本發(fā)明闡述了變體IGF和IGFBP，其可以用于增加或減 少IGF，IGFBP和玻連蛋白之間的結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)使本發(fā)明人得以在體外運(yùn)用這些結(jié)合相互作用以操縱與細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖和遷移相關(guān)的偶然體內(nèi)生物學(xué)事件。本發(fā)明因此在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的醫(yī)學(xué)治療如創(chuàng)傷愈合，皮膚修復(fù)和保養(yǎng)，骨再生，動(dòng)脈硬化和癌癥治療中具有用途。本發(fā)明中，“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離，或以其它方式進(jìn)行人工操縱。分離的物質(zhì)可以完全或基本沒有在其天然狀態(tài)中通常伴隨的成分，或者可以操縱為加上其天然環(huán)境中通常伴隨其的成分的人工狀態(tài)。“多肽”也意味著“蛋白質(zhì)”，是指氨基酸聚合物。包括生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白和玻連蛋白的蛋白質(zhì)和肽，可以以天然的，化學(xué)合成的或重組合成形式分離?！半摹笔侵妇哂胁怀^50個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)?！吧锘钚云巍笔侵傅鞍踪|(zhì)的片段、部分或區(qū)段，其呈現(xiàn)所述蛋白質(zhì)的至少1%，優(yōu)選至少10%，更優(yōu)選至少25%，及最優(yōu)選至少50%的生物學(xué)活性。肽可以易于通過重組或化學(xué)合成方法合成。例如，可參考溶液合成或固相合成方法，例如Blaclcwell科學(xué)出版社出版的Nicholson編輯的題目為“合成疫苗”的出版物中由Atherton和Shephard所著第九章“肽合成”中所述方法。肽合成方法也見于Coligan等編輯的《蛋白質(zhì)科學(xué)通用方法》第18章所述(John ffiley&Sons NY. 1997)，在此并入?yún)⒖??；蛘?，肽可以通過用蛋白酶如endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化本發(fā)明多肽而產(chǎn)生。消化的片段可以通過例如高效液相層析(HPLC)技術(shù)純化。在一個(gè)優(yōu)選的形式中，本發(fā)明提供了一種分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含玻連蛋白，生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白?！吧L(zhǎng)因子”是指一種分子，其刺激或促進(jìn)機(jī)體或所述機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)。優(yōu)選的生長(zhǎng)因子是刺激細(xì)胞分化，尤其哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化的一種蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物包含生長(zhǎng)因子IGF-I。分離的IGF和IGFBP多肽可從如GroP印(Adelaide,澳大利亞)商購(gòu)，而VN多肽可從Promega公司(Madison WI,美國(guó))商購(gòu)。重組的IGF, IGFBP和VN易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員生產(chǎn)，在下文詳加闡述。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)意識(shí)到本發(fā)明還包括IGF的前體。pro-IGF-I蛋白的例子是已經(jīng)除去信號(hào)肽但未由切割E-結(jié)構(gòu)域而完全加工的IGF-I。IGF-I具有得自不同的mRNA剪接的三個(gè)不同E結(jié)構(gòu)域，而且這些前體蛋白可以存在于本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物中。 然而，本發(fā)明還涵蓋了分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子(EGF; (Heldin 等，1981，科學(xué) 41122-1123)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF; Nurcombe 等，2000，生物化學(xué)雜志275 30009-30018),堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF;Taraboletti等，1997，細(xì)胞生長(zhǎng)差異8471-479)，骨橋蛋白(Nam等，2000，內(nèi)分泌學(xué)141 1100),血小板反應(yīng)蛋白-I (Nam等，2000，如前)，腱生蛋白_C(Arai等，1996，生物化學(xué)雜志2716099)，PAI-I (Nam 等，1997，內(nèi)分泌學(xué) 138 2972)，纖溶酶原(Campbell 等，1998，Am.J. Physiol. 275E321),纖維蛋白原(Campbell等，1999，生物化學(xué)雜志274 30215),纖維蛋白(Campbell等，1999，如前)或運(yùn)鐵蛋白(Weinzimer等，2001，臨床內(nèi)分泌代謝雜志861806)。優(yōu)選地，包含骨橋蛋白，血小板反應(yīng)蛋白-I，腱生蛋白-C或PAI-I的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物還包含IGFBP-5。優(yōu)選地，包含纖溶酶原，纖維蛋白原，纖維蛋白或運(yùn)鐵蛋白的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物還包含IGFBP-3。本發(fā)明涵蓋了分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含單體的和多聚體玻連蛋白，因?yàn)椴＿B蛋白可以以單體或多聚體狀態(tài)存在。特別地，多聚體VN積聚在血管損傷區(qū)域，并在組織中也是VN的主要形式。因此多聚體形式的VN提供了形成一種VN復(fù)合物的機(jī)會(huì)，其中可同時(shí)輸送一種以上類型的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)意識(shí)到本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物可以包括本領(lǐng)域熟知的“天然”，“變性”或“延伸”狀態(tài)的玻連蛋白。本發(fā)明還涵蓋了包含nectinepsin的分離的生長(zhǎng)因子復(fù)合物，nectinepsin是一種胞外基質(zhì)蛋白，與VN在氨基酸水平示出60%同源性(Blanchert等，1996，生物化學(xué)雜志271 26220-26226)。也應(yīng)理解生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白和/或玻連蛋白的變體可以用于形成本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，并可以用于本發(fā)明方法中。如本文所用，本發(fā)明的“變體”蛋白質(zhì)，多肽和肽包括其中一或多個(gè)氨基酸由不同氨基酸置換的那些物質(zhì)。本領(lǐng)域熟知一些氨基酸可以用具有廣泛相似性質(zhì)的其它氨基酸置換，而不改變所述多肽的活性性質(zhì)(保守取代)。功能上的實(shí)質(zhì)變化可以通過選擇保守性較低的取代產(chǎn)生。其它置換是非保守取代而且相對(duì)較少可以被耐受。通常地，可能產(chǎn)生多肽性質(zhì)最大變化的取代是那些其中(a)親水性殘基(例如Ser或Thr)由疏水性殘基(例如Ala，Leu, He, Phe或Val)取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸由任何其它殘基取代；(c)具有陽(yáng)電側(cè)鏈的殘基(例如Arg，His或Lys)由陰電殘基(例如Glu或Asp)取代；或(d)具有大側(cè)鏈的殘基(例如Phe或Trp)由具有較小側(cè)鏈的殘基(例如Ala，Ser)或無側(cè)鏈殘基(例如Gly)取代。
變體還包括已經(jīng)例如通過綴合或復(fù)合其它化學(xué)組分或通過本領(lǐng)域已知的翻譯后修飾方法改變的蛋白質(zhì)，多肽和肽。這種衍生物包括氨基酸缺失和/或添加。本發(fā)明涵蓋的其它多肽和肽變體包括但非限于側(cè)鏈修飾，在肽，多肽或蛋白質(zhì)合成期間摻入非天然氨基酸和/或其衍生物，及使用交聯(lián)劑和對(duì)本發(fā)明多肽和肽變體具有構(gòu)象限制的其它化合物。本發(fā)明涵蓋的側(cè)鏈修飾例如包括修飾氨基基團(tuán)，如用乙酐?；挥苗牯退臍溧彵蕉姿狒；被鶊F(tuán)；用甲基酰亞胺化物酰胺化；用氰酸鹽氨甲?；被鶊F(tuán)；用5-磷酸吡哆醛吡哆化賴氨酸隨后用NaBH4還原；通過與醛反應(yīng)隨后用NaBH4還原進(jìn)行還原烷化；及用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基芐基化氨基基團(tuán)。羧基可以經(jīng)過O-酰異脲形成隨后衍生化而通過碳二亞胺活化而修飾，例如修飾為相應(yīng)酰胺。精氨酸殘基的胍基可以通過與如2，3- 丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛等試劑形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物而修飾。 修飾巰基可以通過如過甲酸氧化為胱氨酸；使用4-氯高汞苯磺酸，4-氯高汞苯甲酸，2-氯高汞-4-硝基酚，氯化苯汞和其它汞劑形成汞衍生物；與其它硫醇化合物形成混合的二硫化物；與馬來酰亞胺，馬來酐或其它取代的馬來酰亞胺反應(yīng)；用碘乙酸或碘乙酰胺進(jìn)行羧甲基化；及用氰酸鹽在堿性PH進(jìn)行氨甲?；?。修飾色氨酸殘基可以例如通過用2-羥基-5-硝基芐基溴化物或磺酰齒化物烷化吲哚環(huán)，或用N-溴琥珀酰亞胺氧化進(jìn)行。修飾酪氨酸殘基可以通過用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物而進(jìn)行。修飾組氨酸殘基的咪唑環(huán)可以用焦碳酸二乙酯進(jìn)行N末端carbethoxylation或用碘乙酸衍生物烷化進(jìn)行。在肽合成期間摻入非天然氨基酸和衍生物的實(shí)例包括但非限于使用4-氨基丁酸，6-氨基己酸，4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸，4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸，叔丁基甘氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，苯基甘氨酸，鳥氨酸，肌氨酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-異構(gòu)體。修飾還包括O-和N-連接的糖基化變體和天然發(fā)生狀態(tài)為糖基化的蛋白質(zhì)的非糖基化形式。關(guān)于這些變體，可以通過誘變多肽或誘變編碼核酸而產(chǎn)生，如通過隨機(jī)誘變或定點(diǎn)誘變。核酸誘變方法例如見于Ausubel等，分子生物學(xué)通用方法，第9章所述，在此并入?yún)⒖?。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到，當(dāng)有助于生物學(xué)活性的氨基酸殘基的知識(shí)可以獲得時(shí)，進(jìn)行定點(diǎn)誘變是最佳的。在許多情況中，這個(gè)信息不能獲得，或只能例如通過分子模擬近似值推斷。在這種情況中，進(jìn)行隨機(jī)誘變。隨機(jī)誘變方法包括通過羥胺化學(xué)修飾蛋白質(zhì)(Ruan等，1997，基因18835)，在核酸中摻入dNTP類似物(Zaccolo等，1996，分子生物學(xué)雜志255589)，及基于PCR的隨機(jī)誘變?nèi)鏢temmer, 1994，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)9110747或Shafikhani等1997，生物技術(shù)23304所述，在此均并入?yún)⒖?。也注意到基于PCR的隨機(jī)誘變?cè)噭┖锌缮藤?gòu)，如 DiversifyTM 試劑盒(Clontech)。本發(fā)明還涵蓋了生長(zhǎng)因子變體如des (1-6) IGF-II和des(l-3)IGF-I形成本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物的應(yīng)用。用作興奮劑或拮抗劑的其它變體IGF和IGFBP在下文進(jìn)一步闡述。重組生長(zhǎng)因子復(fù)合物可以意識(shí)到分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物可以通過在本領(lǐng)域熟知的適當(dāng)宿主細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)核酸而用重組生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白和/或玻連蛋白產(chǎn)生。 術(shù)語“核酸”是指單鏈或雙鏈的mRNA, RNA, cRNA和DNA，所述DNA包含cDNA和基因組DNA?！岸嗪塑账帷笔蔷哂?0或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”是少于80個(gè)核苷酸的核酸。 “探針”可以是適當(dāng)標(biāo)記的單鏈或雙鏈寡核苷酸或多核苷酸，以例如在Northern或Southern印跡中檢測(cè)互補(bǔ)序列?！耙铩蓖ǔＪ菃捂湹墓押塑账幔瑑?yōu)選具有15 - 50個(gè)連續(xù)核苷酸，其能與互補(bǔ)核酸“模板”退火，并以模板依賴性方式通過DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的作用而延伸。本領(lǐng)域熟知編碼IGF，EGF, IGFBP, ALS和VN的核酸，并且已供使用多年。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考表I，其中列出了提供這些核酸序列的參考文獻(xiàn)。表I中的所有參考文獻(xiàn)均并入?yún)⒖?。本發(fā)明的核酸可以根據(jù)以下程序制備(i)產(chǎn)生任選是簡(jiǎn)并的引物，其中每種引物均包含靶核酸的各自部分；及(ii)使用所述引物組合核酸擴(kuò)增技術(shù)以從核酸提取物中擴(kuò)增一或多個(gè)產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適當(dāng)?shù)暮怂釘U(kuò)增技術(shù)，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，例如Ausubel等，如前，第15章所述，在此并入?yún)⒖迹绘溨脫Q擴(kuò)增(SDA)，例如美國(guó)專利No5，422，252所述，在此并入?yún)⒖?；滾環(huán)復(fù)制(RCR)，例如Liu等，1996，J. Am. Chem. Soc. 1181587，國(guó)際出版物WO 92/01813和國(guó)際出版物WO 97/19193所述，在此并入?yún)⒖?；基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，例如Sooknanan等，1994，生物技術(shù)17 1077所述，在此并入?yún)⒖?；連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，例如國(guó)際申請(qǐng)W089/09385所述，在此并入?yún)⒖?；及Q-β復(fù)制酶擴(kuò)增，例如Tyagi等，1996，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)93 5395所述，在此并入?yún)⒖肌１疚乃谩皵U(kuò)增產(chǎn)物”是指通過核酸擴(kuò)增方法產(chǎn)生的核酸產(chǎn)物。重組蛋白可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)方法制備。例如，重組蛋白可以通過包括以下步驟的方法制備(i)制備一種表達(dá)構(gòu)建體，其包含可操縱地連接于一或多個(gè)調(diào)節(jié)核苷酸序列的一種核酸；(ii)用所述表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化一種適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；及(iii)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)所述多肽。為進(jìn)行宿主細(xì)胞表達(dá)，所述重組核酸可操縱地連接于表達(dá)載體中的一或多個(gè)調(diào)節(jié)序列?！氨磉_(dá)載體”可以是自身復(fù)制染色體外載體如質(zhì)粒，或整合入宿主基因組的載體。“可操縱地連接”是指所述調(diào)節(jié)核苷酸序列相對(duì)于本發(fā)明重組核酸的定位能起始、調(diào)節(jié)或以其它方式控制轉(zhuǎn)錄。調(diào)節(jié)核苷酸序列一般適于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞。針對(duì)不同的宿主細(xì)胞，本領(lǐng)域已知多種類型的適當(dāng)表達(dá)載體和適當(dāng)調(diào)節(jié)序列。典型地，所述一或多個(gè)調(diào)節(jié)核苷酸序列可以包括但非限于啟動(dòng)子序列，前導(dǎo)或信號(hào)序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始和終止序列，翻譯起始和終止序列，及增強(qiáng)子或激活子序列。本發(fā)明涵蓋本領(lǐng)域已知的組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以是天然發(fā)生的啟動(dòng)子，或組合一個(gè)以上啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含一個(gè)選擇標(biāo)記基因，以選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域熟知選擇標(biāo)記基因并可根據(jù)所用宿主細(xì)胞而變化。所述表達(dá)載體還可以包含一個(gè)融合配偶體(典型由所述表達(dá)載體提供)，以便本發(fā)明的重組多肽與所述融合配偶體形成融合多肽而表達(dá)。融合配偶體的主要優(yōu)點(diǎn)是其有助于鑒別和/或純化所述融合多肽，并還增強(qiáng)蛋白質(zhì)表達(dá)水平和整體產(chǎn)量?！?br> 為表達(dá)所述融合多肽，必需將本發(fā)明的核酸序列與所述表達(dá)載體連接，以便融合配偶體的翻譯讀框與本發(fā)明核苷酸序列一致。融合配偶體的熟知實(shí)例包括但非限于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，人IgG的Fe部分，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和六組氨酸(HIS6),這些物質(zhì)特別用于通過親和層析分離所述融合多肽。為通過親和層析純化融合多肽，親和層析的相關(guān)基質(zhì)分別是谷胱甘肽，直鏈淀粉和鎳或鈷綴合的樹脂。許多這種基質(zhì)可以以試劑盒形式獲得，如具有(HIS6)融合配偶體的QIA表達(dá)系統(tǒng)(Qiagen)和Pharmacia GST純化系統(tǒng)。本領(lǐng)域熟知的另一種融合配偶體是綠熒光蛋白(GFP)。這種融合配偶體作為熒光“標(biāo)記”，可以使本發(fā)明的融合多肽通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀鑒別。所述GFP標(biāo)記可用于評(píng)估本發(fā)明融合多肽的亞細(xì)胞定位，或分離表達(dá)本發(fā)明融合多肽的細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)如熒光激活細(xì)胞分選(FACS)在后一應(yīng)用中特別有用。在一些情況中，所述融合配偶體還具有蛋白酶切割位點(diǎn)，如因子Xa或凝血酶，其使相關(guān)的蛋白酶部分消化本發(fā)明融合多肽，并從而從中釋放本發(fā)明重組多肽。釋放的多肽然后通過隨后的層析分離可以自融合配偶體中分離。本發(fā)明融合配偶體還包含“附加表位”，其通常是短肽序列，由此可獲得特異抗體?？梢子讷@得特異的單克隆抗體的附加表位的熟知實(shí)例包括c-myc，流感病毒血凝素和FLAG
T 己 O所述重組蛋白可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)方法常規(guī)制備，例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(冷泉港出版社，1989)，特別是在第16和17章所述，在此并入?yún)⒖?；分子生物學(xué)通用方法，特別在第10和16章所述，Ausubel等編輯(John Wiley &Sons, Inc. 1995-1999)，在此并入?yún)⒖迹患暗鞍踪|(zhì)科學(xué)通用方法，Coligan等編輯(Johnffiley&Sons, Inc. 1995-1999)，特別在第1，5和6章所述，在此并入?yún)⒖?。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以分別進(jìn)行生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白和玻連蛋白的重組表達(dá)，并從中形成復(fù)合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在相同細(xì)胞中進(jìn)行生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白和玻連蛋白的重組表達(dá)，并從中形成復(fù)合物。在這里，本發(fā)明多肽可以通過培養(yǎng)用所述表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生，所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼本發(fā)明多肽或其類似物的核酸。
適于蛋白質(zhì)表達(dá)的條件隨著選擇的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞而變化。這易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)試驗(yàn)而確定。適于重組表達(dá)的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌如大腸桿菌，梭菌，假單胞菌，酵母，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞(如Sf9)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是人角質(zhì)形成細(xì)胞。本發(fā)明涵蓋了誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型表達(dá)載體。在適當(dāng)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多誘導(dǎo)和阻遏系統(tǒng)，包括金屬硫蛋白(MT)誘導(dǎo)的及四環(huán)素抑制(tetR)系統(tǒng)，本發(fā)明涵蓋每種系統(tǒng)。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體和重組IGFBP表達(dá)方法的特殊實(shí)例可見于美國(guó)專利5，973，115所述，在此并入?yún)⒖肌！つM物，興奮劑和拮抗劑本發(fā)明涵蓋了可以促進(jìn)，阻止或破壞蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的制劑，所述蛋白質(zhì)復(fù)合物包含生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白和玻連蛋白。這種制劑可以是一種模擬物。術(shù)語“模擬物”是指這樣的分子，其被設(shè)計(jì)為模擬蛋白質(zhì)或肽的特定功能區(qū)域，本領(lǐng)域熟知的術(shù)語“興奮劑”，“類似物”和“拮抗劑”包括在其范圍內(nèi)。關(guān)于負(fù)責(zé)IGF-IGFBP結(jié)合的IGF和IGFBP部分的闡述見于國(guó)際出版物W000/23469所述。另外，已經(jīng)產(chǎn)生選擇性結(jié)合IGFBP-I或IGFBP-3的IGF-I的興奮劑變體，如國(guó)際出版物 TO00/40612 所述。因此本發(fā)明涵蓋了可以被工程化以破壞或阻止IGFBP與VN之間形成多肽復(fù)合物的制劑。一個(gè)實(shí)例是一種肽，其通過模擬VN或IGFBP上的結(jié)合位點(diǎn)而競(jìng)爭(zhēng)IGFBP與VN的
彡口口 如后文的更詳細(xì)闡述，IGF-II是一種能抑制IGFBP與玻連蛋白之間結(jié)合的制劑。也提議IGF-II的C結(jié)構(gòu)域中第34 - 40位RVSRRSR序列的V35或S36殘基連同S39，可以突變?yōu)閴A性殘基，從而模擬IGFBP3的HBD(BXBBB，其中B是一個(gè)堿性氨基酸殘基)。這樣可以產(chǎn)生更能抑制IGFBP與玻連蛋白之間復(fù)合物的形成的制劑。本發(fā)明涵蓋的興奮劑的一個(gè)實(shí)例是被工程化而包含一個(gè)IGFBP的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HBD)從而直接結(jié)合玻連蛋白的IGF-I。例如，IGF-I的C結(jié)構(gòu)域中SSSRRAPQT序列可以工程化為具有BXBBB基序。一個(gè)優(yōu)選的BXBBB基序是IGFBP-3的KGRKR序列(第228-232位殘基)?；蛘撸梢詫⑼贫ǖ腎GF-II的玻連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域RVSRRSR (第34-40位殘基)導(dǎo)入IGF-I中。本發(fā)明拮抗劑的一個(gè)實(shí)例是被工程化而突變HBD中的堿性殘基(如前文所述)以降低或阻止IGFBP與玻連蛋白的結(jié)合的IGFBP，。適當(dāng)?shù)?，工程IGFBP能結(jié)合IGF-I。優(yōu)選地，工程IGFBP 是 IGFBP-3 或 IGFBP-5。本發(fā)明還涵蓋了 IGFBP的類似物，其可以被工程化使所述類似物與VN之間形成復(fù)合物。適當(dāng)?shù)兀鲱愃莆镞€可以結(jié)合IGF。這種類似物的潛在優(yōu)點(diǎn)是其比IGFBP更易于合成或分離，具有特別需要的生物學(xué)半衰期并或許已被工程化而特異性結(jié)合IGF-I。上述模擬物可以是具有所需生物學(xué)活性和半衰期的肽，多肽或其它有機(jī)分子，優(yōu)選小有機(jī)分子。計(jì)算機(jī)輔助結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索日益用作鑒別模擬物的程序。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索方法原則上可以適用于鑒別模擬物，見于國(guó)際出版物W094/18232(涉及產(chǎn)生HIV抗原模擬物)，美國(guó)專利No. 5，752，019和國(guó)際出版物WO 97/41526 (涉及鑒別EPO模擬物)所述，在此均并入?yún)⒖?。其它方法包括鑒別分子相互作用的各種生物學(xué)方法。這些方法可以根據(jù)所述候選分子是否影響IGF-IGFBP-VN復(fù)合物的形成而篩選候選分子。適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ绺?jìng)爭(zhēng)性放射性配體結(jié)合分析(見Upton等，1999，前述相關(guān)方法)，分析超速離心，微量量熱法，表面等離 子體共振和基于光學(xué)生物傳感器的方法，由Coligan等編輯的《蛋白質(zhì)科學(xué)》第20章所提供(John Wiley & Sons, 1997)，在此并入?yún)⒖?。藥物組合物本發(fā)明包括以藥物組合物形式的本發(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)合物的施用。本發(fā)明的藥物組合物可以包括分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含變體IGF和/或IGFBP或如前述破壞或阻止所述復(fù)合物形成的制劑。適當(dāng)?shù)兀鏊幬锝M合物包含一種可藥用載體。藥物組合物還可以包含如前述多肽變體，片段或模擬物?！翱伤幱幂d體”是指一種固體或液體充填劑，稀釋劑或形成膠囊的物質(zhì)，其可以安全用于全身施用。根據(jù)施用的特殊途徑，可以使用本領(lǐng)域熟知的各種載體。這些載體可以選自糖，淀粉，纖維素及其衍生物，麥芽，明膠，滑石，硫酸鈣，植物油，調(diào)和油，多元醇，藻酸，磷酸鹽緩沖溶液，乳化劑，等滲鹽水，和無熱源水?？梢允褂萌魏芜m當(dāng)途徑為患者提供本發(fā)明組合物。例如可以應(yīng)用經(jīng)口服，直腸，非腸道，舌下，口腔，靜脈內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，肌內(nèi)，皮內(nèi)，皮下，吸入，眼內(nèi)，腹膜內(nèi)，腦室內(nèi)，經(jīng)皮等方法。例如為施用免疫原性組合物、疫苗和DNA疫苗合適的是肌內(nèi)和皮下注射。劑型包括片劑，分散液，懸浮液，注射液，溶液，糖漿，藥片，膠囊，栓劑，氣霧劑，經(jīng)皮貼片等。這些劑型還可以包括特別為此設(shè)計(jì)的注射或植入控制釋放裝置，或經(jīng)修改以此方式起作用的其它形式植入體。所述治療劑的控制釋放可以例如用疏水性聚合物包衣而實(shí)現(xiàn)，所述聚合物包括丙烯酸樹脂，蠟，高級(jí)脂肪醇，聚乳酸和聚乙醇酸和某些纖維素衍生物如羥丙甲基纖維素。另外，所述控制釋放可以通過使用其它聚合物基質(zhì)，脂質(zhì)體和/或微球?qū)崿F(xiàn)。適于口服或非腸道施用的本發(fā)明的藥物組合物可以以分立單位存在，如膠囊，小袋或片劑，每劑均含有預(yù)定數(shù)量的一或多種本發(fā)明治療劑，可以以粉末或顆?；蛉芤夯蛟谒芤褐械膽腋∫?，非水溶液液體，水包油乳狀液或油包水液態(tài)乳狀液形式存在。關(guān)于包含IGF和IGFBP的藥物組合物，特別參考美國(guó)專利5，936，064和國(guó)際出版物W099/62536和W099/54359所述，在此并入?yún)⒖?。本發(fā)明的藥物組合物還可以包含表達(dá)載體，如病毒載體如痘苗，及在基因治療中有用的病毒載體。后者包括腺病毒和腺病毒伴隨病毒(AAV)，如Braun-Falco等，1999，基因治療6432所述，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體，如Buchshacher等，2000，血液952499所述，及得自單純皰疹病毒和巨細(xì)胞病毒的載體。用于內(nèi)分泌基因治療的病毒載體的綜述見于Stone等，2000，內(nèi)分泌學(xué)雜志164103所述。
本發(fā)明還可利用基因表達(dá)定向于表皮細(xì)胞的特殊表達(dá)載體，如美國(guó)專利5，958，764所述，及針對(duì)體內(nèi)創(chuàng)傷愈合應(yīng)用，如美國(guó)專利5，962，427所述。上述出版物在此均并入?yún)⒖?。治療用途本發(fā)明提供了使用本發(fā)明多肽復(fù)合物的治療方法。這些方法特別針對(duì)于治療性處理哺乳動(dòng)物，尤其是人。這種方法包括施用上述藥物組合物，而且可以通過顯微針注射入特異組織部位，如美國(guó)專利6，090, 790所述，用于創(chuàng)傷，燒傷或潰瘍的局部乳液，洗劑或密封敷料，如美國(guó)專利6，054, 122所述，或釋放所述組合物的植入體，如國(guó)際出版物W099/47070所述。
在這方面也可以應(yīng)用基因治療，如美國(guó)專利5，929，040和美國(guó)專利5，962，427所
述方法。還有可以遺傳修飾皮膚細(xì)胞以產(chǎn)生皮膚替代品的方法，如通過遺傳工程化所需生長(zhǎng)因子的表達(dá)(Supp等,2000，J. Invest. Dermatol. 1145)。關(guān)于這個(gè)領(lǐng)域的一個(gè)實(shí)例見于Bevan 等，Biotechnol. Gent. Eng. Rev. 16231 所述。本發(fā)明還涵蓋了將轉(zhuǎn)染的或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞“種植”給一種受體的方法，如國(guó)際出版物W099/11789 所述。這些方法可用于刺激細(xì)胞增殖，并從而促進(jìn)或加速創(chuàng)傷和燒傷愈合，修復(fù)皮膚損害如潰瘍，組織置換和移植如通過體外培養(yǎng)自體皮膚進(jìn)行，內(nèi)部器官如腎和肺的再上皮化，及修復(fù)損傷的神經(jīng)組織。皮膚置換治療已為本領(lǐng)域所熟知，并可以利用共同培養(yǎng)的上皮/角質(zhì)形成細(xì)胞系，如Kehe等，1999，Arch. Dermatol. Res. 291600所述，或體外培養(yǎng)原代(通常是自體的)表皮、真皮和/或角質(zhì)形成細(xì)胞。這些技術(shù)也可以利用工程生物材料及合成的聚合物“支架”。關(guān)于這個(gè)領(lǐng)域的實(shí)例見于Terskikh & Vasiliev, 1999，Int. Rev. Cytol. 18841 和Eaglestein&Falanga, 1998, Cutis 621 提供。更特別地，在顱面手術(shù)中所用的置換口腔粘膜的產(chǎn)生見于Izumi等，2000，J.Dent. Res. 79798所述。胎兒角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞可以在體外擴(kuò)展，以產(chǎn)生用于移植的皮膚，治療皮膚損傷，如Fauza等，J. Pediatr. Surg. 33357所述，同時(shí)得自在透明質(zhì)酸衍生的生物材料上體外培養(yǎng)的真皮和表皮的皮膚替代品示出具有治療燒傷的潛力(Zacchi 等，1998, J. Biomed. Mater. Res. 40187)。上皮細(xì)胞療法的另一方面涉及胃腸道上皮內(nèi)膜的修復(fù)，以治療或防止腸道功能衰退。本發(fā)明還涵蓋了聚合物支架，其促進(jìn)置換皮膚工程，例如Sheridan等，2000，控制釋放雜志14 91和Fauza等，1998，如前所述，本發(fā)明還包括作為將皮膚細(xì)胞輸送至創(chuàng)傷和燒傷部位的制劑的微球(LaFrance & Armstrong, 1999, Tissue Eng. 5153) 0根據(jù)本發(fā)明可容易地利用上述方法，使用本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖以進(jìn)行組織置換和美容性皮膚處理。關(guān)于骨再生，本發(fā)明提供了用本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物包被、浸潰或以其它方式預(yù)處理的外科或修復(fù)植入體。相反，通過阻止或破壞IGF-IGFBP-VN復(fù)合物形成而阻止或抑制細(xì)胞遷移，可以進(jìn)行預(yù)防性或治療性處理牛皮癬或惡性病如上皮細(xì)胞癌如乳癌。本發(fā)明還涵蓋了通過將本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物給予干細(xì)胞或祖細(xì)胞而分化干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法。在此方法中也可以使用包含變體生長(zhǎng)因子和IGFBP的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物。 根據(jù)這種方法產(chǎn)生的分化的細(xì)胞可以用于如前述治療方法中。例如，據(jù)信平滑肌細(xì)胞是“間充質(zhì)干細(xì)胞”，而且可以被驅(qū)動(dòng)分化為成纖維細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。為使本發(fā)明易于理解并實(shí)際應(yīng)用，現(xiàn)在通過以下非限制性實(shí)施例闡述特別優(yōu)選的實(shí)施方案。在此所述的所有放射性配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析均基本如Upton等，1999，如前所述進(jìn)行。實(shí)施例I :確定胰島素、pro-IGF-II和IGF-I與IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白的能力的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析由于IGF和胰島素之間結(jié)構(gòu)相似，因此檢測(cè)胰島素與玻連蛋白的結(jié)合。通過Upton等，1999 (如前)所述進(jìn)行交聯(lián)試驗(yàn)表明胰島素不太可能與IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白，用IGF-I出現(xiàn)相同情況。因此，檢測(cè)高濃度的胰島素以確定胰島素是否能與放射標(biāo)記的IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白。示于圖I的結(jié)果表明與最初用IGF-I觀測(cè)到的情況相同(Upton等，1999，如前)，胰島素幾乎不與[125I]-IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白。IGF-I作為IGF-II結(jié)合玻連蛋白的競(jìng)爭(zhēng)劑的研究表明IGF-I可以競(jìng)爭(zhēng)[125U-IGF-II與玻連蛋白的結(jié)合(圖2)。然而，在與放射標(biāo)記的IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白中，IGF-I的效力明顯低于IGF-II，要達(dá)到同樣效力，需要IGF-I的濃度高于IGF-II的大約3000 倍。相似研究表明proIGF-II可以與[125I]-IGF_II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白(圖3)。ProIGF-II在與[125I]-IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白中沒有IGF-II那樣的效力，IC5tl值分別為65. 6nM和9. 6nM。因此，在proIGF-II內(nèi)E結(jié)構(gòu)域的存在代表了改變與玻連蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)修飾。這可以是由于與IGF-II相比proIGF-II中額外的結(jié)構(gòu)域的位阻現(xiàn)象，或者可以是由于proIGF-II分子結(jié)構(gòu)改變從而改變了 proIGF-II與玻連蛋白的親和性。實(shí)施例2 =PAI-I和uPAR作為IGF-II與玻連蛋白結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)劑的研究對(duì)PAI-I和suPAR可能是與IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白的分子進(jìn)行研究，因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道這些蛋白質(zhì)結(jié)合玻連蛋白(Declerck等，1988，生物化學(xué)雜志263 15454; Wei等，1994，生物化學(xué)雜志 269 32380; Kanse 等，1996，Exp. Cell Res. 224 344)。在高達(dá) 2000nM濃度，觀測(cè)到PAI-I與[125I]-IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白IC5tl值為大約524nM(圖4)。盡管從IC50值看這個(gè)濃度相對(duì)較高，但是發(fā)現(xiàn)這類濃度可與體內(nèi)腫瘤相關(guān)(Grondahl-Hansen等，1993，癌癥研究 53 2513)。事實(shí)上，Kjoller 等，1997，Exp. Cell Res. 232 420，發(fā)現(xiàn)需要 370nM 的PAI-I才能在確定PAI-I抑制WISH細(xì)胞遷移能力的分析中達(dá)到半數(shù)最大效應(yīng)。推測(cè)這種抑制通過PAI-I與整聯(lián)蛋白和uPAR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白而產(chǎn)生。因此，在PAI-1，IGF-II和玻連蛋白之間觀測(cè)到的相互作用確實(shí)可能具有一些體內(nèi)功能結(jié)果，特別當(dāng)有時(shí)在腫瘤中發(fā)現(xiàn)IGF-II和PAI-I水平是高度表達(dá)的時(shí)候。盡管已知PAI-I結(jié)合玻連蛋白N末端生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域，仍需要高濃度PAI-I才能有效與IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白，提示這些研究未提供關(guān)于玻連蛋白上IGF-II結(jié)合位點(diǎn)的位置的明確信息。然而，所述結(jié)果可以以兩種方式解釋。第一種可能是在IGF-II和PAI-I之間觀測(cè)到的競(jìng)爭(zhēng)是由于在玻連蛋白生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域內(nèi)一級(jí)高親和性位點(diǎn)由于位阻現(xiàn)象的部分競(jìng)爭(zhēng)所致?；蛘?，所述競(jìng)爭(zhēng)可以是由于IGF-II和PAI-I之間的直接競(jìng)爭(zhēng)，結(jié)合玻連蛋白上PAI-I結(jié)合親和性降低的位點(diǎn)。需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究以闡明這個(gè)問題。
盡管本發(fā)明人不能示出可溶的SUPAR與IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合VN，但這可能是由于在國(guó)際運(yùn)輸后使用凍干的suPAR所致。沒有跡象表明復(fù)水的suPAR是生物學(xué)活性的，盡管觀測(cè)到[125Il-SuPAR不結(jié)合VN (數(shù)據(jù)未示出)也許支持用于這些研究的suPAR是失活的這種解釋。使用與鑒別玻連蛋白上PAI-I結(jié)合位點(diǎn)位于含有44個(gè)N末端氨基酸的一玻連蛋白片段內(nèi)的相似方法(Deng等，1995，Thromb. Haemost. 7466)，可以確定在PAI-I和IGF-II之間結(jié)合玻連蛋白的競(jìng)爭(zhēng)是否是任一這些可能性的結(jié)果。以前已經(jīng)示出可溶形式的尿激酶受體(suPAR)可以結(jié)合固定的玻連蛋白(Wei等，1994，sUP7-a)。然而，在此報(bào)道的研究中，甚至濃度高達(dá)300nM，在suPAR和[125I]-IGF-II之間也未觀測(cè)到競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白。實(shí)施例3 :在存在非糖基化重組IGFBP-3情況下，IGF-I和IGF-II與玻連蛋白的結(jié)合為研究IGFBP是否能介導(dǎo)IGF與玻連蛋白結(jié)合，評(píng)定增加濃度的IGFBP-3在存在[125Il-IGF-I或[125I]-IGF-II的情況下的作用。結(jié)果示于圖5。在所測(cè)試濃度，IOng/孔的IGFBP-3導(dǎo)致最大量的[125I]-IGF-I與玻連蛋白包被孔結(jié)合，而30ng/孔的IGFBP-3導(dǎo)致最大量的[125I]_IGF_II與玻連蛋白包被孔結(jié)合。所述作用在[125i]-igf-i的情況中最顯而易見，因?yàn)榈陀?jì)數(shù)的[125i]-igf-i結(jié)合玻連蛋白，甚至在最低濃度的IGFBP-3(3. 7ng)，這種結(jié)合也增加(圖5A)。相反，[125I]-IGF-II未示出在玻連蛋白包被孔上獲得的結(jié)合增加，直至濃度為llng/ΙΟΟ μ L — 33ng/100 μ L也未達(dá)到(圖5Β)。用[125IJ-IGF-I或[125U-IGF-II 預(yù)溫育 IGFBP-3，與未預(yù)溫育的 IGFBP-3 和[125U-IGF-I或[125I]-IGF-II相比，不改變與玻連蛋白的結(jié)合。實(shí)施例4 :在存在在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的重組IGFBP的情況下，IGF-I與玻連蛋白的結(jié)合如Upton等，1999所述(如前)進(jìn)行結(jié)合分析，所述分析檢測(cè)在存在IGFBP的情況下，[125I]-IGF-I結(jié)合VN包被平皿的能力，所述IGFBP與放射標(biāo)記同時(shí)加入。數(shù)據(jù)示于圖
6。IGFBP-2, -4和-5的數(shù)量增加導(dǎo)致標(biāo)記IGF-II與玻連蛋白包被孔結(jié)合增加。在測(cè)試的IGFBP最高量(5ng)，針對(duì)IGFBP-2，4和5，標(biāo)記的IGF-I的結(jié)合與對(duì)照孔相比提高大約
2.8，3. 8和8倍，所述對(duì)照孔中存在VN而不存在IGFBP。存在O. 05、O. 2和O. 5ng/孔的IGFBP-3也增加標(biāo)記IGF-1與VN的結(jié)合，而2和5ng/孔的IGFBP-3表現(xiàn)為抑制放射標(biāo)記的IGF-I的結(jié)合。測(cè)試的所有濃度的IGFBP-I和IGFBP-6也均是抑制性的。這些結(jié)果表明與IGF-II情況不同，觀測(cè)到IGF-I與VN的最小直接結(jié)合。然而，IGFBP、尤其IGFBP-2，-3，-4和-5的存在，增強(qiáng)IGF結(jié)合VN包被孔，提示在這種情況中IGFBP介導(dǎo)IGF-I與VN的結(jié)合。另外，數(shù)據(jù)提示IGFBP具有既增強(qiáng)又抑制IGF-I與VN結(jié)合的潛力，這取決于a)存在何種IGFBP及b) IGFBP存在量。實(shí)施例5 :在存在IGFBP-3變體的情況下，標(biāo)記IGF-II與VN的結(jié)合如上所述進(jìn)行結(jié)合分析，所述分析檢測(cè)在存在IGFBP-3變體的情況下，[125I] -IGF-I結(jié)合VN包被平皿的能力，所述變體中推定的“肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域”被突變(IGFBP-3HBD)及其中糖基化位點(diǎn)被突變(Non-gly IGFBP-3，即非糖基化IGFBP-3)。數(shù)據(jù)示于圖7。這些結(jié)合分析中使用的IGFBP-3糖基化突變體中的三個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)Asn89, Asnl09, Asnl72 突變?yōu)?Ala。IGFBP-3HBD突變體不增強(qiáng)[125I]_IGF_I與VN包被平皿的結(jié)合，提示IGFBP-3的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域參與IGFBP-3與VN的結(jié)合。其它研究已經(jīng)鑒別推定的“肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域”之外的氨基酸殘基與IGF-I結(jié)合IGFBP-3相關(guān)，因此很可能這個(gè)結(jié)果表示IGFBP-3與 VN結(jié)合降低，而不是標(biāo)記的IGF-II與IGFBP-3結(jié)合降低(Imai等，2000，生物化學(xué)雜志275:18188-18194)。令人感興趣地，非糖基化IGFBP-3突變體明顯增強(qiáng)[125I]_IGF_I與VN包被平皿的結(jié)合。在存在2ng突變體IGFBP-3的情況下，標(biāo)記的IGF-I與VN包被孔的結(jié)合驚人地提高20倍，這是令人感興趣的并提示IGFBP-3的糖基化抑制a) IGF-I與IGFBP-3或b) IGFBP-3與VN的相互作用?；蛘?，這兩個(gè)相互作用均可以通過存在碳水化合物而阻礙。非糖基化IGFBP-3在體內(nèi)是否功能相關(guān)還未確定。然而，這個(gè)發(fā)現(xiàn)提示結(jié)合VN的非糖基化IGFBP-3可以是將IGF-I輸送至需要IGF-I以加強(qiáng)細(xì)胞功能之處的一種有效方式，如在刺激細(xì)胞增殖中。或者，結(jié)合VN的非糖基化IGFBP-3可以提供一種機(jī)制，在不需要細(xì)胞增殖的情況下隔絕過量IGF-I，如在過表達(dá)IGF的腫瘤中。實(shí)施例6 :確定在存在非糖基化重組IGFBP-3的情況下，IGF變體與標(biāo)記的IGF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合VN的能力的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析在競(jìng)爭(zhēng)分析中使用圖5所述產(chǎn)生放射標(biāo)記的IGF最大結(jié)合的IGFBP3濃度，以確定在存在IGFBP3情況下，濃度增加的IGF和desIGF是否可以與放射標(biāo)記的IGF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白。結(jié)果表明高濃度的IGF-I, IGF-II, des (1-6) IGF-II及或許des (1-3) IGF-I (未示出)，在存在IOng的IGFBP3情況下，可以與[125I]_IGF_II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白(圖8)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在存在30ng的IGFBP3情況下，只有IGF-I、IGF-II和des(l_6) IGF-II可以與IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合玻連蛋白包被孔。實(shí)施例7 :包含IGF-II和玻連蛋白的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物對(duì)細(xì)胞增殖的刺激在這個(gè)研究中使用將IGF-II與VN預(yù)先結(jié)合的策略，以嘗試更真實(shí)反映體內(nèi)胞外環(huán)境。大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)方法均在溶液相中加入外源底物；從而所述細(xì)胞持續(xù)暴露于處理之下。組織中細(xì)胞不會(huì)遇到體內(nèi)這種“持續(xù)溶液相”環(huán)境。因此適于這個(gè)研究的方法是將IGF與VN預(yù)先結(jié)合，更真實(shí)反映體內(nèi)條件。在IGF與VN在培養(yǎng)皿中預(yù)先結(jié)合之后，將細(xì)胞種植于孔中，并通過制定的方法檢測(cè)與VN復(fù)合的IGF刺激蛋白質(zhì)合成的能力(Francis等，1986，生物化學(xué)雜志233:207-213)。蛋白質(zhì)合成增加與細(xì)胞數(shù)增加相關(guān)，因此是細(xì)胞增殖的反映。應(yīng)答以相對(duì)于對(duì)照孔(無VN或IGF)的百分比表示，通過測(cè)定在48小時(shí)后[3H]-亮氨酸摻入新合成的蛋白質(zhì)的情況表不。
參考圖9中數(shù)據(jù)，當(dāng)3、10、30、100、300和IOOOng的IGF-II與所述孔在沒有VN情況下預(yù)先結(jié)合時(shí)，分別觀測(cè)到產(chǎn)生超出對(duì)照孔(-VN，-IGF) 8 %、12 %、10 %、16 %、24%和43%的應(yīng)答。另外，這些相同劑量的預(yù)先結(jié)合VN包被孔的IGF-II刺激[3H]-亮氨酸摻入蛋白質(zhì)的作用分別為 19%、29%、39%、51%、70%和 101%。針對(duì) 3、10、30、100、300 和 IOOOng的IGF-II，組合只用VN (12%)獲得的應(yīng)答和只用IGF-II獲得的應(yīng)答(參考上文)，分別產(chǎn)生20%、24%、22%、28%、36%和55%的預(yù)計(jì)加合作用。這些數(shù)值明顯不同于當(dāng)IGF-II以除了兩個(gè)最低測(cè)試量IGF-II (3和IOng)之外所有劑量與VN預(yù)先結(jié)合時(shí)觀測(cè)到的實(shí)際作用(p〈0.05)。因此，預(yù)先結(jié)合VN的IGF-II在蛋白質(zhì)合成中刺激協(xié)同作用，比計(jì)算的加合作用高5 — 46%。這些應(yīng)答可能是IGF-II與VN直接結(jié)合的結(jié)果，也可能是IGF-II與VN通過IGFBP間接結(jié)合產(chǎn)生的。HaCAT角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生大量IGFBP-3 (Wraight等，1994，J.Invest. Dermatol 103:627-631)。實(shí)施例8 :在存在在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的重組IGFBP情況下，標(biāo)記的IGF-II與VN的結(jié)合
檢測(cè)[125I]-IGF-II在存在IGFBP的情況下結(jié)合VN包被的平皿的能力的結(jié)合分析如Upton等，1999 (如前)所述進(jìn)行,所述IGFBP與放射標(biāo)記同時(shí)加入。這些研究中使用的是在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的糖基化IGFBP。如圖10所示，增加量的IGFBP-1，-3和-6導(dǎo)致標(biāo)記的IGF-II與玻連蛋白包被孔的結(jié)合以劑量依賴性方式降低。IGFBP2還表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記IGF-II與VN的結(jié)合，但效力比IGFBP-1, -3或-6低。另一方面，IGFBP-4對(duì)IGF-II與VN的結(jié)合的作用很小，而IGFBP-5表現(xiàn)為少量增強(qiáng)IGF-II結(jié)合。IGFBP-3的抑制作用可以得自IGFBP3與IGF-II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合VN上相同結(jié)合區(qū)域。或者，或另外，IGFBP-3以及IGFBP-1和IGFBP-6的抑制作用，可以得自IGF-II與VN的親和性比IGF-II與這些IGFBP的親和性低，因此這些IGFBP隔絕IGF-II并且所述復(fù)合物不結(jié)合VN。實(shí)施例9 :包含IGF-I，IGFBP-5和玻連蛋白的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物對(duì)細(xì)胞增殖的刺激參考表2，IGF-I與IGFBP-5和玻連蛋白在所有測(cè)試濃度均刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖(通過3H-亮氨酸摻入新合成的蛋白質(zhì)中測(cè)定)，在最高測(cè)試濃度觀測(cè)到協(xié)同作用。本發(fā)明人提示分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物對(duì)細(xì)胞增殖的作用可能在比表2所述相對(duì)低量更高濃度的IGFBP-5存在下更強(qiáng)。實(shí)施例10 IGF和IGFBP變體的工程化IGFBP-3中在與ECM結(jié)合中重要的并已經(jīng)闡明是推定的“肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域”的氨基酸殘基是在第228 - 232位的KGRKR殘基。在IGFBP-5的相應(yīng)區(qū)域發(fā)現(xiàn)相似殘基。在此報(bào)道的結(jié)合研究中使用的IGFBP-3HBD突變體是殘基KGRKR變化為MDGEA，其基于在IGFBP-I中相應(yīng)位置中發(fā)現(xiàn)的氨基酸。這些變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)這個(gè)部分的電荷逆轉(zhuǎn)。這個(gè)突變體仍然高親和性結(jié)合IGF-I和IGF-II，但很少結(jié)合酸不穩(wěn)定亞單位及細(xì)胞表面(Firth等，1998，生物化學(xué)雜志2732631-2638)。不同類別蛋白質(zhì)中肝素結(jié)合基序最初由Cardin等，1989，動(dòng)脈硬化921-32闡述。人IGF-II的C結(jié)構(gòu)域含有許多陽(yáng)性電荷的氨基酸殘基，尤其第34 — 40位含有氨基酸RVSRRSR。這些陽(yáng)性電荷的氨基酸在介導(dǎo)IGFBP與細(xì)胞表面和VN結(jié)合中起重要作用，IGF-II中的這些氨基酸在IGF-II與VN的直接結(jié)合中也起重要作用。不管怎樣，通過產(chǎn)生缺失V35或S36及S39的一種IGF-II突變體而導(dǎo)入與在IGFBP-3中發(fā)現(xiàn)的序列相似的“肝素結(jié)合基序”是一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)便的方法。介導(dǎo)IGF-II與VN結(jié)合的正電荷殘基的重要性，還通過本發(fā)明人揭示了雞IGF-II突變體(desR4°)-IGF-II與VN的結(jié)合降低這個(gè)證據(jù)得以進(jìn)一步例證。另一方面，IGF-I的C結(jié)構(gòu)域在IGF-II蛋白質(zhì)上述相應(yīng)區(qū)域中含有相對(duì)非極性氨基酸鏈。這可以解釋為什么IGF-I不直接結(jié)合VN。另外，也不結(jié)合VN (或IGFBP)的胰島素不具有相應(yīng)的C結(jié)構(gòu)域，因?yàn)槠湓诔墒斓鞍踪|(zhì)中被切除。人IGF-ISSSRRAPQT人IGF-II RVSRRS—R將IGF-II序列RVSRRSR或IGFBP3序列KGRKR導(dǎo)入IGF-I能使IGF-I直接結(jié)合VN0 實(shí)施例11 :分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，細(xì)胞增殖和存活Bcl-2轉(zhuǎn)錄是細(xì)胞存活途徑的一個(gè)關(guān)鍵因子，其在通過α - β 3整聯(lián)蛋白附著于VN的細(xì)胞中增加(Matter & Ruoslahti, 2001,生物化學(xué)雜志 276 27757-27763)。另外，IGF-1通過以AKT依賴性方式增加bcl-2轉(zhuǎn)錄而保護(hù)細(xì)胞免于程序死亡(Pugazhenthi等，1999，生物化學(xué)雜志274 27529-35)。IGF受體與α -β 3整聯(lián)蛋白物理締合，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有協(xié)同作用(Schneller等，1997，EMBO雜志165600-5607)。因此本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物可以提供一個(gè)整合胞外點(diǎn)，以起始由整聯(lián)蛋白和生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)的細(xì)胞存活信號(hào)。已經(jīng)表明IGFBP-5在前列腺癌細(xì)胞中加強(qiáng)IGF-I的抗細(xì)胞程序死亡和促進(jìn)有絲分裂作用(Miyake等，2000，內(nèi)分泌學(xué)141 2257-2265)。另外，VN在體內(nèi)由神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的合成及在結(jié)腸直腸腺癌中的合成與腫瘤等級(jí)相關(guān)(Uhm等，1999，臨床癌癥研究51587-1594; Tomasini-Johansson 等，1994，Exp Cell Res. 214 303-312;Gladson 等，1995，細(xì)胞科學(xué)雜志 108 947-56 ;Gladson&Cheresh, 1991,臨床研究雜志 88 1924-32)。因此，根據(jù)本發(fā)明，提示在體內(nèi)形成的IGF: IGFBP: VN復(fù)合物可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明因此涵蓋了破壞體內(nèi)復(fù)合物形成的治療劑。已經(jīng)報(bào)道VN的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制纖連蛋白基質(zhì)裝配(Hocking等，1999，生物化學(xué)雜志274 2725727264)。纖連蛋白沉積降低與腫瘤細(xì)胞入侵相關(guān)，因?yàn)榧?xì)胞遷移速度降低與聚合的纖連蛋白水平提高相關(guān)(Morla等，1994，自然367 193-196)。因此，結(jié)合VN的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的IGF:IGFBP復(fù)合物可以阻礙纖連蛋白基質(zhì)裝配并促進(jìn)腫瘤侵入局部結(jié)締組織。因此本發(fā)明涵蓋了破壞這些體內(nèi)復(fù)合物以降低腫瘤侵染的治療劑。分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物與創(chuàng)傷愈合可以使用相反的論據(jù)支持所述復(fù)合物在需要細(xì)胞遷移如創(chuàng)傷修復(fù)的情況中應(yīng)用。IGF系統(tǒng)在創(chuàng)傷愈合中起重要作用，而且IGF-I和IGFBP-3均以顯著濃度存在于創(chuàng)傷處體液中(Skottner 等，1990，Acta Scand. Suppl. 367 63-66;Clark R(ed) 1996,創(chuàng)傷修復(fù)的分子和細(xì)胞生物學(xué)，PP 3-50，Plenum出版社，紐約；Robertson等，1996，內(nèi)分泌學(xué)1372774-2784; Vogt 等，1998，生長(zhǎng)激素 IGF 研究，8 Suppl B: 107-9)。已經(jīng)表明IGFBP降低IGF從創(chuàng)傷處清除速度(Robertson等，1999，. Am JPhysiol. 276E663-71)。IGFBP-3: IGF-I復(fù)合物在體外結(jié)合纖維蛋白凝塊，引起這種情況也在體內(nèi)發(fā)生使IGF-I在創(chuàng)傷部位積聚的推測(cè)(Campbell等，1999，生物化學(xué)雜志274 30215-30221)。相似地，玻連蛋白結(jié)合纖維蛋白(Podor等，2000，生物化學(xué)雜志27519788-19794)。還注意到玻連蛋白-裸鼠表現(xiàn)為創(chuàng)傷處纖維蛋白溶解增強(qiáng)及微血管發(fā)生減少(Jang 等，2000，外科學(xué) 127696-704)。根據(jù)本發(fā)明，提示結(jié)合IGFBP的IGF可以結(jié)合VN，其接著與纖維蛋白凝塊結(jié)合，因此在創(chuàng)傷部位提供了 IGF的集聚。因此本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物可以施用于創(chuàng)傷處以促進(jìn)修復(fù)過程。本發(fā)明涵蓋的創(chuàng)傷愈合的一個(gè)特殊方面涉及糖尿病足部潰瘍的愈合。創(chuàng)傷愈合在糖尿病患者中很慢。生長(zhǎng)因子影響愈合過程，而且尤其IGF已經(jīng)示出刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。然而，對(duì)糖尿病患者皮膚和足部潰瘍組織的分析表明與非糖尿病患者組織切片相對(duì)比，在基底層和成纖維細(xì)胞中沒有IGF-I表達(dá)(Blakytny等，2000，病理學(xué)雜志190589-594)。本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物可以用于將IGF-I輸送于這類創(chuàng)傷處。分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物與骨工程·
IGFBP-5通過一種非依賴于IGF受體的機(jī)制促進(jìn)標(biāo)記的IGF-I與骨的結(jié)合，(Mohan等，1995，生物化學(xué)雜志270 2042420431)，并增強(qiáng)IGF刺激的成骨細(xì)胞功能(Andress, 1995，生物化學(xué)雜志 27028289-28296)。在許多研究中已經(jīng)示出植入材料羥磷灰石是高度生物學(xué)相容的，及與現(xiàn)有骨良好整合。近來的跡象表明羥磷灰石從血清中比其它常規(guī)使用的植入材料如鈦和不銹鋼中吸收更多的VN。VN的吸收通過成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的更強(qiáng)結(jié)合而實(shí)現(xiàn)(Kilpadi等，2001，J.Biomed. Mater. Res. 57 258-267)。最近檢測(cè)了 VN對(duì)納米相氧化鋁/常規(guī)氧化鋁的作用，發(fā)現(xiàn)VN增強(qiáng)成骨細(xì)胞附著(Webster 等，2001，Tissue Eng 7291-301)。本發(fā)明人提示本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物可用于包被這些原料，并從而在整形外科應(yīng)用如髖關(guān)節(jié)置換中促進(jìn)骨細(xì)胞附著，生長(zhǎng)及整合。VN在兔骨細(xì)胞培養(yǎng)物中增強(qiáng)IGF-I刺激的破骨細(xì)胞再吸收和蛋白酶活性(Rousselle等，2001,組織學(xué)和組織病理學(xué)16727-734)，IGFBP-5增強(qiáng)IGF刺激的成骨細(xì)胞有絲分裂(Andress&Birnbaum, 1992，生物化學(xué)雜志 267 22467-22472)。本發(fā)明人提示由于骨細(xì)胞產(chǎn)生的主要IGFBP是IGFBP-5，因此通過VN引起的IGF作用增強(qiáng)很可能也涉及IGFBP-5。分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物和治療動(dòng)脈硬化IGF-I已經(jīng)預(yù)先包含于試驗(yàn)性動(dòng)脈硬化損傷的研究中。另外，α-β3抑制劑已經(jīng)表明降低動(dòng)脈硬化損傷，這與IGF-I介導(dǎo)的信號(hào)化抑制相關(guān)(Nichols等，1999，Circ.Res.851040-1045)。鑒于(i) IGFBP-5和VN由動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞合成和分泌，并存在于血管壁中；(ii) IGF:IGFBP-5:VN復(fù)合物促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞有絲分裂和遷移(Nam&Clemmons, 2000,生長(zhǎng)激素 IGF 研究 10:A23);本發(fā)明人提示IGF:IGFBP-5:VN復(fù)合物參與動(dòng)脈硬化損傷的形成。因此破壞所述復(fù)合物形成的治療劑可以有效治療動(dòng)脈硬化。本說明書闡述了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，這些實(shí)施方案無限制本發(fā)明之意。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到根據(jù)所揭示內(nèi)容，在不偏離本發(fā)明范圍內(nèi)可以對(duì)本發(fā)明例證的實(shí)施方案進(jìn)行各種修改和變化。也應(yīng)意識(shí)到所有專利和科學(xué)文獻(xiàn)及計(jì)算機(jī)程序在此均并入?yún)⒖?。表I
權(quán)利要求
1.分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白和玻連蛋白。
2.權(quán)利要求I的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，還包含生長(zhǎng)因子。
3.權(quán)利要求2的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中所述生長(zhǎng)因子是胰島素樣生長(zhǎng)因子I (IGF-I)。
4.權(quán)利要求2的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中所述生長(zhǎng)因子選自表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、骨橋蛋白、血小板反應(yīng)蛋白-I、腱生蛋白-C、PAI-1、纖溶酶原、纖維蛋白原、纖維蛋白和運(yùn)鐵蛋白。
5.權(quán)利要求I的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中所述生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白選自IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5 和 IGFBP6。
6.權(quán)利要求5的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白是IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4 或 IGFBP5。
7.權(quán)利要求6的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白是IGFBP3或IGFBP5。
8.分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含IGFBP相關(guān)蛋白和玻連蛋白。
9.權(quán)利要求8的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其還包含生長(zhǎng)因子。
10.權(quán)利要求9的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中所述生長(zhǎng)因子是IGF-I或IGF-II。
11.權(quán)利要求10的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中IGFBP相關(guān)蛋白選自 (i)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF); (ii)由mac25基因編碼的多肽； (iii)由nov基因編碼的多肽；及 (iv)由cyr61基因編碼的多肽。
12.分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含玻連蛋白、變體生長(zhǎng)因子和/或變體生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白。
13.權(quán)利要求12的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含玻連蛋白和經(jīng)工程化而包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HBD)的變體生長(zhǎng)因子。
14.權(quán)利要求13的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中所述變體生長(zhǎng)因子是經(jīng)工程化而包含所述 HBD 的 IGF-I。
15.權(quán)利要求13的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其由與玻連蛋白直接結(jié)合的經(jīng)工程化而包含所述HBD的IGF-I組成。
16.權(quán)利要求13的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中HBD具有氨基酸序列BXBBB，其中B是堿性氨基酸殘基。
17.權(quán)利要求14的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中所述HBD具有氨基酸序列KGRKR。
18.具有缺失或突變的HBD的變體IGFBP，其中所述IGFBP不能形成權(quán)利要求I的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
19.權(quán)利要求18的變體IGFBP，其能結(jié)合IGF-I。
20.權(quán)利要求19的變體作為拮抗劑的應(yīng)用。
21.權(quán)利要求12的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含玻連蛋白和非糖基化生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白。
22.權(quán)利要求21的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中所述非糖基化生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白是IGFBP3。
23.權(quán)利要求13的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含玻連蛋白和選自des(1-6) IGF-II和des (1-3) IGF-I的變體生長(zhǎng)因子。
24.權(quán)利要求1、8或12的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中玻連蛋白是多聚體。
25.權(quán)利要求1、8或12的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中玻連蛋白是單體。
26.權(quán)利要求24的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中每種玻連蛋白單體與選自IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5 和 IGFBP6 的相同或不同的 IGFBP 結(jié)合。
27.權(quán)利要求26的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其還包含直接與玻連蛋白結(jié)合的IGF-II。
28.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1、8或12任一項(xiàng)的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物和可藥用載體或稀釋劑。
29.外科植入物或修復(fù)體，其包含權(quán)利要求1、8或12任一項(xiàng)的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
30.轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其能表達(dá)權(quán)利要求1、8或12任一項(xiàng)的重組蛋白質(zhì)復(fù)合物，或者表達(dá)能形成所述復(fù)合物的重組多肽。
31.調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和/或遷移的方法，包括給予動(dòng)物或其分離的細(xì)胞權(quán)利要求1、8或12任一項(xiàng)的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物的步驟。
32.調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和/或遷移的方法，包括向動(dòng)物或其分離的細(xì)胞給予制劑的步驟，所述制劑阻止或破壞權(quán)利要求1、8或12任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述制劑阻止或破壞IGFBP與玻連蛋白之間的相互作用。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述制劑是IGF-II。
35.IGF-II在抑制權(quán)利要求I的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物形成中的應(yīng)用。
36.權(quán)利要求1、8或12任一項(xiàng)的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物在制備治療上皮細(xì)胞疾病的藥物中的應(yīng)用。
37.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述上皮細(xì)胞疾病是牛皮癬或上皮細(xì)胞乳癌。
38.權(quán)利要求36的應(yīng)用，其中所述上皮細(xì)胞疾病通過破壞胃腸道上皮內(nèi)膜而削弱腸道功能。
39.權(quán)利要求1、8或12任一項(xiàng)的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物在制備促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、皮膚修復(fù)、潰瘍和燒傷康復(fù)或體外皮膚再生的藥物中的應(yīng)用。
40.權(quán)利要求1、8或12任一項(xiàng)的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物在制備促進(jìn)骨再生的藥物中的應(yīng)用。
41.權(quán)利要求1、8或12任一項(xiàng)的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物在制備促進(jìn)損傷的神經(jīng)組織修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
42.破壞或阻止權(quán)利要求1、8或12任一項(xiàng)的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的制劑在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
43.破壞或阻止權(quán)利要求1、8或12任一項(xiàng)的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的制劑在制備治療動(dòng)脈硬化的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白和玻連蛋白。優(yōu)選地，所述分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物包含胰島素樣生長(zhǎng)因子I、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3或胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5和玻連蛋白。本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和/或遷移的方法，通過施用所述蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行創(chuàng)傷修復(fù)，皮膚修復(fù)和組織置換治療。相反，通過使用破壞生長(zhǎng)因子蛋白質(zhì)復(fù)合物在體內(nèi)形成的藥劑，可抑制生長(zhǎng)因子驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞增殖和/或遷移，以例如治療癌癥，牛皮癬，動(dòng)脈硬化和有疤痕過度生長(zhǎng)傾向的創(chuàng)傷。
文檔編號(hào)C07K14/75GK102940880SQ20121027454
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2001年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月22日
發(fā)明者齊·厄普頓, 珍妮弗·安·克里克爾 申請(qǐng)人:昆士蘭技術(shù)大學(xué)