基于二代測序技術(shù)的微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的方法，具體是涉及一種基于二 代測序技術(shù)的微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 非基于培養(yǎng)的單細(xì)胞基因組學(xué)技術(shù)已成功實(shí)現(xiàn)，并被應(yīng)用于各種微生物生態(tài)學(xué)研 究。而對微生物細(xì)胞進(jìn)行分析的難點(diǎn)在于，大多數(shù)微生物，如細(xì)菌和古細(xì)菌細(xì)胞，有著難以 有效裂解的細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)；原核微生物的RNA半衰期短、穩(wěn)定性低；此外，細(xì)胞大小遠(yuǎn)小于 哺乳動物細(xì)胞（10?30皮克)，因此細(xì)胞內(nèi)的RNA分子的總濃度很低，大約為每個(gè)細(xì)胞4? 10菲克，這一 RNA濃度遠(yuǎn)低于真核生物細(xì)胞中的RNA濃度，為RNA抽提和分析提生了很多 挑戰(zhàn)。雖然針對真核生物單細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)已經(jīng)建立，但針對原核微生物單細(xì)胞 的全轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)一直沒能夠完全建立。
[0003] 微生物學(xué)家過去通常假定在相同條件下生長的微生物細(xì)胞是均一的，可以通過其 生理型、表型、基因型或其他參數(shù)的平均值進(jìn)行表征。盡管一直以來這一共識被成功地用于 眾多研究并取得一定的成績，然而最近的研究卻表明，即使對于同源基因組完全相同的微 生物種群，在細(xì)胞和分子水平的細(xì)胞異質(zhì)性要遠(yuǎn)超出以前所認(rèn)為的范圍。研究表明，同源 細(xì)胞群體中的異質(zhì)性可能產(chǎn)生于單個(gè)基因的隨機(jī)表達(dá)，而這種隨機(jī)性一旦被放大到某個(gè)程 度，將導(dǎo)致細(xì)胞水平上的異質(zhì)性，并最終決定微生物種群內(nèi)個(gè)體的不同命運(yùn)。同時(shí)，自然界 中復(fù)雜的化學(xué)、物理和生物因素，如微尺度下的化學(xué)梯度或溫度差異、微生物間相互作用， 甚至基因型的變化，都會進(jìn)一步放大這種細(xì)胞間的異質(zhì)性。現(xiàn)在人們逐漸認(rèn)識到，使用分子 或表型的平均值去衡量整個(gè)群體的性狀，所得到的結(jié)論可能有失偏頗，只有從單細(xì)胞角度 來研究才更接近真實(shí)狀況，因此，很有必要從單細(xì)胞的水平來獲得相關(guān)信息。
[0004] 此外，對單一微生物細(xì)胞分析的另一個(gè)重要意義在于從環(huán)境中獲取的99%以上的 微生物無法在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行培養(yǎng)，因此不能使用傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法進(jìn)行研究。同時(shí)，許多 不可培養(yǎng)的微生物中可能包含有細(xì)菌和古細(xì)菌域的新屬種。這可能與產(chǎn)生多種有價(jià)值的生 物過程直接相關(guān)，如生物修復(fù)、微生物生產(chǎn)和封存甲烷與二氧化碳、替代能源、碳、氮和金 屬元素的全球循環(huán)。雖然單細(xì)胞基因組學(xué)技術(shù)已成功實(shí)現(xiàn)，由于其僅僅提供了細(xì)胞在遺傳 結(jié)構(gòu)與代謝潛力方面的信息，而無法揭示代謝功能以及環(huán)境參數(shù)相關(guān)的基因的表達(dá)動力學(xué) 數(shù)據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供能夠提供對細(xì)胞的代謝功能及轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的動力學(xué)數(shù)據(jù)的 一種基于二代測序技術(shù)的微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析方法。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述方法的用途。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0008] 基于二代測序技術(shù)的微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析方法，包括如下步驟：
[0009] (1)微生物單細(xì)胞的分離：
[0010] 將新鮮微生物細(xì)胞培養(yǎng)樣本，在常溫下離心收集，立即懸浮于RNA保護(hù)劑 RNALater溶液中；使用顯微注射系統(tǒng)在倒置顯微鏡下進(jìn)行單細(xì)胞的選取分離，并將分離得 到的微生物單細(xì)胞重懸于RNALater溶液中；
[0011] (2)總 RNA 的抽提：
[0012] 對步驟（1)所獲取的微生物單細(xì)胞，利用美國ZYMO公司的ZYMO RNA MicroPrep試 劑盒進(jìn)行微生物單細(xì)胞總RNA的抽提操作；
[0013] (3)總RNA的線性擴(kuò)增：
[0014] 對步驟（2)所獲取的微生物單細(xì)胞總RNA進(jìn)行線性擴(kuò)增，利用美國NuGen公司的 NuGenOneDirect試劑盒，分別進(jìn)行cDNA第一鏈的合成、cDNA第二鏈的合成、SPIA擴(kuò)增、擴(kuò) 增產(chǎn)物的分離純化，得到cDNA文庫；
[0015] (4) RNA測序文庫的構(gòu)建：
[0016] 對步驟（3)所獲取的cDNA文庫，使用美國NuGen公司的NuGen Encore試劑盒，按 照試劑盒說明書進(jìn)行RNA測序文庫的構(gòu)建；
[0017] (5) RNA測序文庫的分析：
[0018] 對步驟（4)所獲取的RNA測序文庫，使用美國Illumina公司的Solexa Sequencer 測序儀，按照說明書進(jìn)行RNA測序文庫的分析。
[0019] 上述方法用于制備原核生物單細(xì)胞或真核生物單細(xì)胞的RNA-Seq測序文庫的應(yīng) 用。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 基于現(xiàn)有技術(shù)對微生物單細(xì)胞分析的困難，本實(shí)驗(yàn)室通過微生物單細(xì)胞分析的每 個(gè)步驟，如總RNA抽提，總RNA的線性擴(kuò)增，以及用于RNA測序文庫的構(gòu)建的多種商業(yè)試劑 盒的應(yīng)用效果比較評價(jià)，獲得了一套完整的技術(shù)流程，最終實(shí)現(xiàn)了對微生物單細(xì)胞進(jìn)行基 于二代測序技術(shù)的全轉(zhuǎn)錄組分析。使用本發(fā)明的方法不僅可以實(shí)現(xiàn)對不同微生物細(xì)胞個(gè)體 間的基因表達(dá)差異的分析，還可以實(shí)現(xiàn)對極端環(huán)境下不可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行單細(xì)胞水平的 生理功能分析；此外，這一方法可以適用于真核生物單細(xì)胞的分析，腫瘤發(fā)生和演化、干細(xì) 胞的誘導(dǎo)及發(fā)育等重要的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域等都有著非常廣闊的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0022] 圖1為單細(xì)胞RNA線性擴(kuò)增的示意圖。
[0023] 圖2為單細(xì)胞cDNA文庫末端修復(fù)的示意圖。
[0024] 圖3為利用End-It DNA End-Repair Kit對cDNA文庫進(jìn)行末端補(bǔ)齊的示意圖。
[0025] 圖4為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的主成分（Principle Component Analysis)分析圖，顯示 細(xì)胞細(xì)胞間的轉(zhuǎn)錄組差異。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面對本發(fā)明的實(shí)施操作做詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn) 行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí) 施案例。
[0027] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 本實(shí)施例選擇原核微生物藍(lán)細(xì)菌集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803)為實(shí)驗(yàn)材 料，該菌購自美國菌種保藏中心ATCC，菌株代碼ATCC27184.對缺氮條件下生長的6個(gè)集胞 藻6803單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組(缺氮培養(yǎng)24和72小時(shí)）以及相對應(yīng)時(shí)間的群體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行 了分析?；诙鷾y序技術(shù)的微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析方法，包括如下步驟：
[0030] (1)微生物單細(xì)胞的分離：
[0031] 將新鮮微生物藍(lán)細(xì)菌集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803)細(xì)胞培養(yǎng)樣本，在常溫 下離心收集，立即懸浮于RNA保護(hù)劑RNALater溶液中充分重懸；使用NARISHIGE M-9C顯 微注射系統(tǒng)（Narishige, Tokyo, JP)在Olympus 1X71倒置顯微鏡下進(jìn)行單細(xì)胞的選取分 離，并將分離得到的微生物單細(xì)胞重懸于RNALater溶液中；
[0032] (2)總 RNA 的抽提：
[0033] 利用美國ZYMO公司的ZYMO RNA MicroPrep試劑盒對步驟（1)所獲取的微生物單 細(xì)胞進(jìn)行總RNA的提取：
[0034] 1)向細(xì)胞懸液中加入Lysis Buffer,充分混勻后，12, OOOx g離心1分鐘；
[0035] 2)向離心液中加入無水乙醇，充分混勻后，將混合液轉(zhuǎn)移至Zymo-Spin IC Column 中，12, OOOx g離心1分鐘，棄去液體部分；
[0036] 3)向 Zymo-Spin IC Col