基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的est-ssr核心引物組及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一套基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR核心引物組，包括50對(duì)引物，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1～100所示。本發(fā)明的50對(duì)EST-SSR核心引物具有多態(tài)性豐富、擴(kuò)增穩(wěn)定、重復(fù)性好、便于統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)由于這些引物均來(lái)自絲瓜表達(dá)基因，能夠反映基因組中功能序列的變異，從而能夠更好的區(qū)分絲瓜遺傳種質(zhì)的多樣性。本核心引物組可用于絲瓜品種鑒定、品種遺傳系譜分析和種質(zhì)資源遺傳多樣性分析等領(lǐng)域，有利于保護(hù)育種者、生產(chǎn)者和消費(fèi)者的合法權(quán)益，促進(jìn)絲瓜遺傳育種和絲瓜生產(chǎn)的健康發(fā)展。
【專利說(shuō)明】基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR核心引物組及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及EST-SSR核心引物組，具體涉及一套基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR核心引物組及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]絲瓜為葫蘆科(Cucurbitaceae)絲瓜屬(Luffa spp.) —年生攀援性草本植物,其作為一種重要的蔬菜作物在我國(guó)的南北各地均有廣泛的種植面積。絲瓜除作為蔬菜外，還是一種重要的藥用植物?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明，絲瓜中含有生物堿類、黃酮類、固醇類、糖苷類等多種有效成分，具有抗真菌、抗細(xì)菌、消炎等作用。最近的研究結(jié)果證明，絲瓜種子中含有核糖體失活蛋白，能夠抑制艾滋病病毒的生長(zhǎng)，因此是潛在治療艾滋病的藥物。
[0003]近年來(lái)，隨著人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)保健的日益重視，絲瓜作為一種藥膳兼用及高溫季節(jié)市場(chǎng)供應(yīng)蔬菜，深受人們喜愛，需求量不斷增大，栽培面積呈擴(kuò)大趨勢(shì)。我國(guó)研究者從20世紀(jì)60年代起開始絲瓜遺傳育種、雜種優(yōu)勢(shì)及遺傳特性等方面的研究，取得了一定進(jìn)展，培育了一批優(yōu)良新品種。由于絲瓜的基礎(chǔ)理論研究薄弱，目前在絲瓜育種及品種保護(hù)方面存在兩個(gè)突出問(wèn)題:一、如何對(duì)絲瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，從而高效的指導(dǎo)育種家進(jìn)行親本的選配；二、如何準(zhǔn)確、快速進(jìn)行絲瓜品種的鑒定，從而更好的推動(dòng)絲瓜品種審定、品種保護(hù)、真假品種辨別、品種的產(chǎn)權(quán)糾紛的解決等方面的發(fā)展。
[0004]基于個(gè)體間DNA序列多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)具有測(cè)試周期短、潛在標(biāo)記數(shù)量多、不受環(huán)境影響和季節(jié)限制、沒(méi)有組織特異性、準(zhǔn)確性高、利于高通量測(cè)試分析等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、新品種鑒定、種子純度檢測(cè)中。在絲瓜中，已有一些研究者利用分子標(biāo)記對(duì)絲瓜種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，但是一般都是采用的RAPD、ISSR、SRAP等隨機(jī)引物標(biāo)記。這些標(biāo)記均是基于無(wú)基因組(或轉(zhuǎn)錄組)序列信息開發(fā)的標(biāo)記技術(shù)，盡管有一定的實(shí)用性，但是標(biāo)記的隨機(jī)性強(qiáng)、穩(wěn)定性差，從而影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0005]EST-SSR是基于EST序列或cDNA數(shù)據(jù)開發(fā)的一種SSR分子標(biāo)記。由于其來(lái)自表達(dá)基因，因而除具備傳統(tǒng)基因組來(lái)源SSR標(biāo)記的所有優(yōu)勢(shì)外，還具有信息含量高(反映表達(dá)基因信息)、開發(fā)費(fèi)用低、通用性好等優(yōu)點(diǎn)，從而強(qiáng)化了該標(biāo)記在遺傳研究中的應(yīng)用。目前，該標(biāo)記在遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因(QTL)定位等研究領(lǐng)域得到了較好的應(yīng)用。目前，在玉米、小麥、谷子等作物中為提高SSR技術(shù)的檢測(cè)效率，開展了核心引物組的相關(guān)研究，取得了較好的效果。核心引物組指均勻覆蓋全基因組、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好的一套引物，利用其進(jìn)行遺傳多樣性分析、品種鑒定具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)。目前，絲瓜尚無(wú)基于基因組或者轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的特異性分子標(biāo)記，因此，開發(fā)絲瓜EST-SSR核心引物組，已成為絲瓜育種、生產(chǎn)和品種保護(hù)領(lǐng)域中迫切需要解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一套基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR核心引物組。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述的基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR核心引物組在絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、絲瓜品種遺傳系譜或絲瓜品種鑒定中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR核心引物組，其包括50對(duì)引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1~100所示。
[0009]利用上述基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR核心引物組進(jìn)行絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、絲瓜品種遺傳系譜或絲瓜品種鑒定的方法，包括如下步驟:
(1)提取待測(cè)絲瓜樣品基因組DNA；
(2)以步驟(1)提取的待測(cè)樣品DNA為模板，利用序列表SEQID N0.1~100所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)將步驟(2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用采用6%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染顯色，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果；
(4)利用步驟(3)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、絲瓜品種遺傳系譜或絲瓜品種鑒定。
[0010]所述PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μ L)包括:2 μ LlOXbuffer ；0.5μ L Taq 酶(2U.μ L-1) ;0.4μ L dNTP(10mmol.171);上、下游引物各 0.1 μ L(50pmoL.μ L—1) ;lyL 模板DNA (50ng.μ L-1) ; 15.9 μ L ddffiOoPCR程序?yàn)?Touch-down PCR:94°C預(yù)變性 3min ；94°C 30S,65°C ( -10C /cycle) lmin,72°C lmin，15 個(gè)循環(huán)；94°C 30S，5(TC lmin,72°C lmin，25 個(gè)循環(huán)；72°C終延伸IOmin。
[0011]所述絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析或絲瓜品種遺傳系譜分析方法為:使用NTSYS-pc2.1Oe軟件進(jìn)行基于UPGMA法的聚類分析；使用POPGENE軟件計(jì)算各引物的等位基因數(shù)(Na)、基因多樣性(h)和Shannon值⑴。
[0012]所述絲瓜品種鑒定方法為:統(tǒng)計(jì)每個(gè)品種在引物中的擴(kuò)增情況，構(gòu)建DNA指紋圖譜，一一比較各引物位點(diǎn)差異，差異引物數(shù)> 2，判定兩個(gè)品種為不同品種；差異引物數(shù)=1，判定兩個(gè)品種為近似品種；差異引物數(shù)=0，判定兩個(gè)品種為相同品種。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的50對(duì)EST-SSR核心引物具有多態(tài)性豐富、擴(kuò)增穩(wěn)定、重復(fù)性好、便于統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)由于這些引物均來(lái)自絲瓜表達(dá)基因，能夠反映基因組中功能序列的變異，從而能夠更好的區(qū)分絲瓜遺傳種質(zhì)的多樣性。本核心引物組可用于絲瓜品種鑒定、品種遺傳系譜分析和種質(zhì)資源遺傳多樣性分析等領(lǐng)域，有利于保護(hù)育種者、生產(chǎn)者和消費(fèi)者的合法權(quán)益，促進(jìn)絲瓜遺傳育種和絲瓜生產(chǎn)的健康發(fā)展。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為依據(jù)50對(duì)絲瓜EST-SSR核心引物組對(duì)46份絲瓜材料聚類分析。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
實(shí)施例
[0016]一、絲瓜EST-SSR核心引物組的開發(fā)1、材料
從本單位保存的絲瓜種質(zhì)資源中篩選出46份核心種質(zhì)資源材料(表1)用于絲瓜EST-SSR核心引物組的評(píng)價(jià)和資源遺傳多樣性的鑒定。46份絲瓜資源材料中包括36份有棱絲瓜，10份普通絲瓜；其中25份材料來(lái)自中國(guó)，8份材料來(lái)自泰國(guó)，7份材料來(lái)自馬來(lái)西亞，另有6份材料未知來(lái)源。
表1本發(fā)明中用于絲瓜資源遺傳多樣性分析材料信息
【權(quán)利要求】
1.基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR核心引物組，其特征在于:所述引物組包括50對(duì)引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1~100所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR核心引物組在絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR核心引物組在絲瓜品種遺傳系譜中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR核心引物組在絲瓜品種鑒定中的應(yīng)用。
5.利用權(quán)利要求1所述基于絲瓜轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR核心引物組進(jìn)行絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、絲瓜品種遺傳系譜或絲瓜品種鑒定的方法，包括如下步驟: (1)提取待測(cè)絲瓜樣品基因組DNA； (2)以步驟(1)提取的待測(cè)樣品DNA為模板，利用序列表SEQID N0.1~100所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)將步驟(2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用凝膠電泳檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果； (4)利用步驟(3)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、絲瓜品種遺傳系譜或絲瓜品種鑒定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析或絲瓜品種遺傳系譜分析方法為:使用NTSYS-pc 2.1Oe軟件進(jìn)行基于UPGMA法的聚類分析；使用POPGENE軟件計(jì)算各引物的等位基因數(shù)(Na)、基因多樣性(h)和Shannon值(I)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述絲瓜品種鑒定方法為:統(tǒng)計(jì)每個(gè)品種在引物中的擴(kuò)增情況，構(gòu)建DNA指紋圖譜，一一比較各引物位點(diǎn)差異，差異引物數(shù)>2，判定兩個(gè)品種為不同品種；差異引物數(shù)=1，判定兩個(gè)品種為近似品種；差異引物數(shù)=0，判定兩個(gè)品種為相冋品種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)采用6%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染顯色。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，20UL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括:2 μ LIOXbuffer ；0.5 μ L Taq 酶(2U.μ L-1) ；0.4 μ L dNTP (IOmmol.L-1);上、下游引物各 0.1μ L (50 pmoL.μ L-1) ；1 μ L 模板 DNA (50 ng.μ L-1) ; 15.9 μ L ddH20。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增程序?yàn)門ouch-downPCR:94°C預(yù)變性 3min;94°C 30S,65°C (― 1°C /cycle) lmin,72°C lmin，15 個(gè)循環(huán)；94°C 30S,50°Clmin，72°C lmin，25 個(gè)循環(huán)；72°C終延伸 IOmin0
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104004833SQ201410196610
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月9日
【發(fā)明者】吳海濱, 羅劍寧, 龔浩, 何曉莉, 羅少波, 鄭曉明, 張長(zhǎng)遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所