專利名稱：產(chǎn)紫杉醇微生物飽和突變體庫(kù)的構(gòu)建和高產(chǎn)紫杉醇菌株的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物和藥用微生物領(lǐng)域，涉及一種利用包括轉(zhuǎn)座子突變方法構(gòu)建產(chǎn)紫杉醇微生物飽和突變體庫(kù)和利用紫杉醇抗體酶聯(lián)免疫篩選高產(chǎn)紫杉醇突變菌株的方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇(taxol)是在20世紀(jì)60年代早期從太平洋紫杉中分離出來(lái)的一種二帖類生物堿，經(jīng)對(duì)其化學(xué)、藥理方面的研究，表明其具有廣泛的抗癌活性，如對(duì)乳腺癌、子宮癌等多種癌癥都具有較好的療效。1992年美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)其上市，從此，紫杉醇成為抗癌新藥的熱點(diǎn)。過去這種藥靠從紅豆杉樹中提取，但由于該樹種十分稀少，生長(zhǎng)緩慢，瀕臨滅絕，這種藥化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量大，難以用化學(xué)合成法合成，細(xì)胞培養(yǎng)也未產(chǎn)業(yè)化，因此該藥價(jià)格十分昂貴，國(guó)際市場(chǎng)上其針劑純品價(jià)格高達(dá)600萬(wàn)美元/kg。1993年，美國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)紅豆杉內(nèi)生真菌也能產(chǎn)紫杉醇。這為解決紫杉醇藥源危機(jī)提供了理想的途徑。1996年，加拿大Novopharm制藥公司應(yīng)用Alternaria alternta菌種發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇技術(shù)取得歷史性進(jìn)展，并達(dá)到工業(yè)化要求，使得加拿大成為世界上第一個(gè)成熟應(yīng)用真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的國(guó)家。真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇是最理想但也異常艱難的科研開發(fā)之路。國(guó)內(nèi)華菌公司于97年粗篩到3株紫杉醇的內(nèi)生真菌；后經(jīng)誘變、育種終于在98年獲得了高產(chǎn)菌Phargen AA-013，菌種表達(dá)率高達(dá)120～227mg/L。周東坡教授采用從紅豆杉樹中分離得到的真菌，通過發(fā)酵法產(chǎn)生紫杉醇，搖瓶水平可高達(dá)400μg/L，比國(guó)際最高水平高出2倍多，發(fā)酵液中紫杉醇產(chǎn)率達(dá)到448.52ug/L。
為了產(chǎn)業(yè)化，除了優(yōu)化產(chǎn)紫杉醇微生物的培養(yǎng)基和條件、還需要進(jìn)一步提高產(chǎn)紫杉醇微生物的產(chǎn)量，利用各種育種方法可能獲得紫杉醇高產(chǎn)菌株。突變體庫(kù)就是由某種方法產(chǎn)生的、包含各種不同基因突變的群體。飽和突變體庫(kù)是指理論上該基因組的每個(gè)基因都發(fā)生了突變的突變體庫(kù)。根據(jù)公式P＝1-(1-(L/C)cf可以預(yù)測(cè)構(gòu)建飽和突變體庫(kù)所需的克隆數(shù)，P是發(fā)現(xiàn)任意一個(gè)基因插入突變的概率，L代表基因的平均長(zhǎng)度，C是單倍體基因組的大小，n是插入突變的克隆數(shù)，f是每個(gè)克隆平均插入位點(diǎn)數(shù)。
轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在當(dāng)代遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究中有很大的應(yīng)用價(jià)值.它不僅能作為反向遺傳學(xué)的工具，將外源基因轉(zhuǎn)入受體基因組而使受體產(chǎn)生表型的變化，同時(shí)，其又因?yàn)槟芡ㄟ^隨機(jī)的插入突變使內(nèi)源基因失活而成為正向遺傳學(xué)研究中的新寵。轉(zhuǎn)座子是美國(guó)遺傳學(xué)家McClintock在20世紀(jì)40年代首先在玉米中發(fā)現(xiàn)的可從染色體的一個(gè)位置跳到另一位置，乃至從一條染色體跳到另一染色體上的特殊基因，廣泛存在于幾乎所有原核和真核生物中。在結(jié)構(gòu)上，轉(zhuǎn)座子具有共同特征，即兩端是重復(fù)序列，有轉(zhuǎn)座酶的識(shí)別位點(diǎn)，中間是結(jié)構(gòu)基因，編碼轉(zhuǎn)座酶和另外一些蛋白質(zhì)。根據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)制，轉(zhuǎn)座子分為兩大類一類是DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子，以復(fù)制或直接切除兩種方式獲得可移動(dòng)片段，重新插入基因組DNA中，有人形象地稱它們的轉(zhuǎn)座為剪切和粘貼模式(cut-and-pastemode)。這類轉(zhuǎn)座子一般包括兩種結(jié)構(gòu)形式，如玉米的Ac/Ds。Ac編碼轉(zhuǎn)座酶，能自行轉(zhuǎn)座，稱為自主轉(zhuǎn)座元件；Ds多是Ac的缺失體，完全或部分失去了編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，不能編碼轉(zhuǎn)座酶，但仍保留有兩側(cè)的重復(fù)序列，能被轉(zhuǎn)座酶識(shí)別，因此能在Ac編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用下轉(zhuǎn)座，稱為非自主轉(zhuǎn)座元件，類似的還有玉米的En/Spm和Mu等。另一類是RNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)座的逆轉(zhuǎn)座子，通過轉(zhuǎn)錄合成mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄合成新的轉(zhuǎn)座元件整合到基因組中完成轉(zhuǎn)座，每轉(zhuǎn)座一次拷貝數(shù)增加一份，被稱為復(fù)制和粘貼模式(cut-and-paste mode)。它們?cè)诨蚪M中拷貝數(shù)高，是構(gòu)成基因組的主要成分(通常超過總DNA的一半)。
轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法利用轉(zhuǎn)座子能整合進(jìn)入昆蟲或微生物基因組中，常常能破壞一個(gè)正?；虻墓δ?，導(dǎo)致一種或幾種突變表型標(biāo)記，形成所謂轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽(transposon tag)。通過這種轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽，可跟蹤雜交后代，并以轉(zhuǎn)座子作探針，從基因組文庫(kù)中定位基因，對(duì)基因進(jìn)行突變和標(biāo)記，最終達(dá)到分離和克隆基因的目的。這種方法被稱為“轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法”(transposon tagging)。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽的設(shè)計(jì)基本原則是只保留轉(zhuǎn)座子上，完成轉(zhuǎn)座過程的必需片段，同時(shí)加入篩選標(biāo)記與報(bào)道基因。報(bào)道基因不含有啟動(dòng)子，只有在轉(zhuǎn)座標(biāo)簽插入ORF(open reading frames)，在其啟動(dòng)子控制下報(bào)道基因得以表達(dá)，因而用于檢測(cè)直接插入基因內(nèi)部的標(biāo)簽。篩選標(biāo)記和常規(guī)質(zhì)粒一樣有抗性標(biāo)記和營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記兩種。通過分離轉(zhuǎn)座子和突變基因的側(cè)翼區(qū)可鑒定該基因。轉(zhuǎn)座子基因標(biāo)簽法已用于克隆絲狀真菌基因。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法已經(jīng)用于克隆絲狀真菌基因。常用的有2種途徑1、將構(gòu)建的帶有轉(zhuǎn)座子的載體，轉(zhuǎn)化入異源寄主，從而克隆目標(biāo)基因。2、利用寄主的內(nèi)生同源轉(zhuǎn)座子克隆基因，不必構(gòu)建載體。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法已被用于果蠅分離出了十幾個(gè)基因，在哺乳動(dòng)物中利用反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子載體也分離定位了一些基因，在植物中利用玉米Ac/Ds系統(tǒng)，不僅在玉米而且在異源植物中也得到了廣泛應(yīng)用。作為生物標(biāo)簽的一種，除了不需要知道基因的產(chǎn)物，也無(wú)須了解基因的表達(dá)特點(diǎn)以外，轉(zhuǎn)座子的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1)插入是完整的元件，便于分子分析(2)可從插入位點(diǎn)切除，產(chǎn)生回復(fù)突變，我們不僅可據(jù)此確認(rèn)真正由轉(zhuǎn)座子引起的突變，還可進(jìn)一步驗(yàn)證突變基因的功能；(3)通過不斷跳動(dòng)產(chǎn)生新的突變，相對(duì)較少的起始轉(zhuǎn)化系就可獲得整個(gè)基因組的飽和突變，大大減少了工作量；(4)還可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化效率不高的微生物，通過雜交或繁殖獲得新的插入突變。
標(biāo)記系統(tǒng)轉(zhuǎn)座子捕捉插入突變載體如果左右邊界內(nèi)只包含一個(gè)選擇標(biāo)記基因的載體。在用這類載體建立的突變體庫(kù)中，能得到部分基因功能缺失的突變體(loss-of-functionmutant)，但不能得到有功能冗余及致死效應(yīng)的基因的突變體，也很難研究具有高度多效性的基因。插入突變只有產(chǎn)生了明顯表型變化時(shí)才能被發(fā)現(xiàn)利用，然而在真核生物中，多數(shù)基因在被插入或破壞時(shí)，并沒有明顯的表型變化，其中包括功能冗余基因、多發(fā)育階段表達(dá)基因和受環(huán)境條件誘導(dǎo)的基因。轉(zhuǎn)座子捕捉就是為了標(biāo)記和克隆這些基因設(shè)計(jì)的，在非自主轉(zhuǎn)座元件上融合進(jìn)一個(gè)表達(dá)受外界轉(zhuǎn)錄信號(hào)調(diào)節(jié)的報(bào)告基因，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，報(bào)告基因表達(dá)，不僅能反應(yīng)轉(zhuǎn)座子的位置，而且它的表達(dá)模式還能反應(yīng)標(biāo)記基因的表達(dá)活性及調(diào)節(jié)。為了彌補(bǔ)這方面的不足，開發(fā)出了轉(zhuǎn)座子捕捉系統(tǒng)如增強(qiáng)子捕捉(enhancer trap)、啟動(dòng)子捕捉(promoter trap)和基因捕捉(gene trap)三種模式。這三種載體通過插入的報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)研究被插入基因的表達(dá)模式，而且對(duì)致死基因也可以在雜合狀態(tài)下進(jìn)行研究。Enhancer trap中的報(bào)告基因與一個(gè)微小的啟動(dòng)子相連，單獨(dú)靠它無(wú)法啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，或者表達(dá)效率很低。只有插入到基因組的合適位置，利用被插入基因的增強(qiáng)子才能使報(bào)告基因表達(dá)。所以，報(bào)告基因的表達(dá)與否，一方面反映了轉(zhuǎn)座子插入的位置，另一方面反映了被插入基因的表達(dá)特性。例如，報(bào)告基因呈現(xiàn)時(shí)空特異性表達(dá)，則可以推斷被插入的基因是時(shí)空特異性表達(dá)的。Promoter trap和enhancer trap類似，不同在于promoter trap中沒有啟動(dòng)子部分。Gene jrap與promotertrap類似，不過在gene trap中報(bào)告基因前多了個(gè)剪切接受位點(diǎn)(splice acceptor)，當(dāng)其插入到一個(gè)基因的內(nèi)含子時(shí)，能與被插入基因外顯子同時(shí)轉(zhuǎn)錄，被插入基因表達(dá)時(shí)，報(bào)告基因也能表達(dá)。激活標(biāo)簽則是在靠近轉(zhuǎn)座子邊界處有四個(gè)串聯(lián)的CaMV35S增強(qiáng)子，當(dāng)其插入到一個(gè)基因的附近引起該基因的過量表達(dá)，可以產(chǎn)生獲得功能性(gain-of-function)的突變體。mariner轉(zhuǎn)座子在許多昆蟲中大量存在，不易分清到底是哪一個(gè)拷貝引起的基因突變(外源轉(zhuǎn)座子和內(nèi)源轉(zhuǎn)座子)，從而不能將突變表型與突變基因快速聯(lián)系起來(lái)，而且尋找整合的后代也需要大量的工作。因此，尋找一種較易識(shí)別定位轉(zhuǎn)座子的插入位置，鑒定轉(zhuǎn)座子整合后代的標(biāo)記基因非常重要。水母的綠色熒光蛋白基因(GFP)是一個(gè)很好的選擇標(biāo)記。通過將GFP基因插入到mariner轉(zhuǎn)座子中間，隨著mariner轉(zhuǎn)座子一起整合到基因組中，可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光的有無(wú)，以此來(lái)尋找整合后代和分析轉(zhuǎn)座子整合插入的初步位置。
激活標(biāo)簽對(duì)于那些插入突變不能導(dǎo)致明顯表型變化的基因，還可以用激活標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，做法就是使DNA或轉(zhuǎn)座子帶上強(qiáng)啟動(dòng)子，增強(qiáng)靶位點(diǎn)附近基因的轉(zhuǎn)錄，使它們過表達(dá)或異位表達(dá)。除了增強(qiáng)基因表達(dá)，激活標(biāo)簽還和一般標(biāo)簽一樣，插入一個(gè)基因內(nèi)部時(shí)，會(huì)造成基因斷裂，引起插入突變。如果激活標(biāo)簽反向插入到基因上游，有時(shí)會(huì)通過反義表達(dá)造成基因沉默。多種功能合而為一，大大提高了激活標(biāo)簽標(biāo)記基因的效率，再加上轉(zhuǎn)座子不斷跳躍的特點(diǎn)，可以預(yù)計(jì)，帶有激活標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座子必將成為功能基因組研究的最有效工具之一。與轉(zhuǎn)座子結(jié)合的睡美人轉(zhuǎn)座酶可以將特殊基因轉(zhuǎn)移進(jìn)目標(biāo)生物體內(nèi)。通過擴(kuò)增旁側(cè)序列就能很快的找到引起突變體的遺傳基礎(chǔ)。對(duì)于旁側(cè)序列的分析，目前反向PCR(inverse PCR)或TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)等方法使用得比較普遍。
在功能基因組時(shí)代，研究大量基因需要系統(tǒng)進(jìn)行，因此建立涵蓋廣泛的突變體庫(kù)非常必要。目前PCR檢測(cè)是反向遺傳學(xué)最有效的途徑，通過建立插入突變側(cè)翼序列庫(kù)就變得尤為重要，在整個(gè)微生物功能基因組序列已知的基礎(chǔ)上，只需把插入突變側(cè)翼序列與基因組序列加以比較就能很容易地找出突變的基因，并在染色體上繪出插入位點(diǎn)的位置。這樣任何一個(gè)基因的插入突變都可以通過計(jì)算機(jī)確認(rèn)，因此側(cè)翼序列庫(kù)將是反向遺傳學(xué)研究的最有效的工具，不僅能確認(rèn)突變，而且能發(fā)現(xiàn)新的基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供，1.一種構(gòu)建產(chǎn)紫杉醇微生物飽和突變體庫(kù)的方法；2.一種從突變體庫(kù)篩選紫杉醇產(chǎn)量變異菌株的方法，其特征是利用紫杉醇抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。
實(shí)現(xiàn)上述目的的基本技術(shù)路線為總體技術(shù)方案是利用轉(zhuǎn)座子、化學(xué)物質(zhì)如NTG、EMS、羥胺等和物理因素如UV、輻射等、生物因素如mu噬菌體、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和插入序列等構(gòu)建產(chǎn)紫杉醇微生物在基因組規(guī)模的飽和突變體庫(kù)，尤其是利用轉(zhuǎn)座子突變系統(tǒng)構(gòu)建。
1.菌株及其培養(yǎng)本技術(shù)方案采用的菌株包括但不限于下列產(chǎn)紫杉醇微生物，Taxomycesandreanae(紫杉霉屬)、Monochaetia sp(盤單毛孢屬)、Fusarium lateritium(鐮刀霉屬)、Alternaria sp(交鏈孢屬)、Pestalotiopsis microspora(盤多拉毛霉屬)、Pestalotiopsismicrospora(盤多拉毛霉屬)、Sumatrana Pithomyces sp(髓霉屬)、Pestalotiopsismicrospora(盤多拉毛霉屬)、Pestalotiopsis microspora(盤多拉毛霉屬)、Pestalotiopsisguepinii(盤多拉毛霉屬)、conia sp(黑團(tuán)孢霉屬)、Cephalosporium spp(頭孢霉屬)、Martensiomyces spp(輪柄梳霉屬)、Mycelia sterlia(無(wú)孢類群)、Tubercularia sp(瘤座孢屬)、Nodulisporium sylviforme(多節(jié)孢屬)、Pleurocytospora taxi(側(cè)孢座腔菌屬)、AlternariaTaxi(鏈格孢屬)、Rhizoctonis sp(絲核菌屬)、penicillium(青霉屬)、Trichoderma(木霉屬)、Mucor(毛霉屬)、Chaetomium(毛殼孢屬)等。
2.培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件為常規(guī)的PDA固體培養(yǎng)基和PDB液體培養(yǎng)基。
3.轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法構(gòu)建產(chǎn)紫杉醇微生物的飽和突變體庫(kù)本技術(shù)方案采用的轉(zhuǎn)座子包括但不限于restless轉(zhuǎn)座子，impala/fot1轉(zhuǎn)座子，MAGGY轉(zhuǎn)座子、基于細(xì)菌中的Tn3轉(zhuǎn)座子、Mu噬菌體和酵母的Ty成分等改造的用于轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法元件。該技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、規(guī)?；瘜ふ遗c某一表型相關(guān)的基因的操作特點(diǎn)，技術(shù)簡(jiǎn)單。Tn3成分是TnA家族成員，長(zhǎng)度為4957bp，其轉(zhuǎn)座必需片段為內(nèi)部解離位點(diǎn)(res位點(diǎn))、重組酶作用位點(diǎn)(lox位點(diǎn))及38bp的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列。同時(shí)含有編碼轉(zhuǎn)座酶的tnpA基因和編碼解旋酶的tnpR基因等。本技術(shù)方案采用的mTn3轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽之一是mTn-sacB/gfp，它保留了Tn3轉(zhuǎn)座子的38bp的末端重復(fù)序列、res位點(diǎn)與lox位點(diǎn)，并加入了Amp抗性標(biāo)記、sacB反選擇標(biāo)記和沒有啟動(dòng)子的報(bào)道基因GFP。也可以根據(jù)特定菌株的性質(zhì)，更換篩選標(biāo)記或報(bào)道基因。mTn3轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，屬于隨機(jī)性的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽，可能是真菌基因功能研究中應(yīng)用最廣泛的一種標(biāo)簽，適用于大規(guī)模構(gòu)建突變體、探尋功能基因。
Mu噬菌體和miniMu噬菌體標(biāo)簽Mu噬菌體是一種以大腸桿菌為宿主的溫和噬菌體。它的DNA為線性分子，能隨機(jī)地插入寄主染色體中，與其他轉(zhuǎn)座子不同的是，它不含有末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列。miniMu噬菌體標(biāo)簽自身長(zhǎng)度較小，卻可以融合較大的DNA片段(最大到39kb)，因而可以與各種目的載體進(jìn)行連接。除了存在個(gè)別插入熱點(diǎn)(hot spot)外，miniMu噬菌體標(biāo)簽對(duì)染色體的插入基本上是完全隨機(jī)的。該標(biāo)簽體系的應(yīng)用程序與mTn3轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽大體相同。
4.基因組DNA的制備采用常規(guī)方法制備菌體基因組DNA。
5.發(fā)酵實(shí)驗(yàn)250ml三角瓶裝入50ml培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后接入0.5cm2的菌絲塊，于30°搖床培養(yǎng)，6.生物量測(cè)定取一定體積培養(yǎng)液于4000r min、離心5-15min，傾去上清液，用蒸餾水洗滌2-3次，收集菌體，烘至恒重，再稱重。50-98h不等。苯丙氨酸在培養(yǎng)基滅菌后冷加入。
7.酶聯(lián)免疫方法篩選紫杉醇產(chǎn)量變異的突變體按本技術(shù)領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的方法，將紫杉醇與適當(dāng)?shù)姆肿?，如牛血清白蛋白、生物素等結(jié)合，免疫兔子或大鼠，制備抗血清，檢測(cè)血清的效價(jià)，利用抗血清和酶標(biāo)儀、96孔或384孔，甚至更多孔的酶標(biāo)板，檢測(cè)突變菌株的紫杉醇產(chǎn)量。
發(fā)明效果利用本技術(shù)方案涉及的轉(zhuǎn)座子，包括Tn3等，對(duì)產(chǎn)紫杉醇的出發(fā)菌株，構(gòu)建了飽和的突變體庫(kù)，利用紫杉醇抗體酶聯(lián)免疫方法快速、相對(duì)低成本地篩選到了紫杉醇產(chǎn)量提高的菌株。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.菌株及其培養(yǎng)Penicillium(青霉屬)真菌在常規(guī)的PDA固體培養(yǎng)基和PDB液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)，產(chǎn)紫杉醇的歐文氏菌屬細(xì)菌等在LB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
2.轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法構(gòu)建產(chǎn)紫杉醇微生物的飽和突變體庫(kù)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽中真菌分別采用restless轉(zhuǎn)座子、impala160和基于細(xì)菌中的Tn3轉(zhuǎn)座子、細(xì)菌采用Tn3轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽的篩選標(biāo)記為sacB反選擇標(biāo)記、URA和沒有啟動(dòng)子的報(bào)道基因GFP。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的分子生物學(xué)技術(shù)，擴(kuò)增轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽，采用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割含有篩選標(biāo)記和轉(zhuǎn)座酶的片段，分別轉(zhuǎn)化青霉或歐文氏菌。
Mu噬菌體和miniMu噬菌體標(biāo)簽Mu噬菌體是一種以大腸桿菌為宿主的溫和噬菌體。它的DNA為線性分子，能隨機(jī)地插入寄主染色體中，與其他轉(zhuǎn)座子不同的是，它不含有末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列。miniMu噬菌體標(biāo)簽自身長(zhǎng)度較小，卻可以融合較大的DNA片段(最大到39kb)，因而可以與各種目的載體進(jìn)行連接。除了存在個(gè)別插入熱點(diǎn)(hot spot)外，miniMu噬菌體標(biāo)簽對(duì)染色體的插入基本上是完全隨機(jī)的。該標(biāo)簽體系的應(yīng)用程序與mTn3轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽大體相同。根據(jù)公式P＝1-(1-(L/C)cf可以預(yù)測(cè)構(gòu)建飽和突變體庫(kù)所需的克隆數(shù)，P是發(fā)現(xiàn)任意一個(gè)基因插入突變的概率，L代表基因的平均長(zhǎng)度，C是單倍體基因組的大小，n是插入突變的克隆數(shù)，f是每個(gè)克隆平均插入位點(diǎn)數(shù)。計(jì)算預(yù)測(cè)的克隆數(shù)和實(shí)際克隆數(shù)，利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽方法獲得了預(yù)期的克隆數(shù)。
也可以采用帶有5-FU抗性基因的片段插入impala160的NheI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，獲得pNIpyr。電轉(zhuǎn)化完整的孢子，將NdeI-酶切的pNIpyr導(dǎo)入孢子。即0.5微克線性化的質(zhì)粒和500萬(wàn)個(gè)孢子放在0.2-cm電轉(zhuǎn)化槽(Bio-Rad)，1-kV脈沖(Bio-Rad電轉(zhuǎn)化儀400，25μF)?；蛘卟捎帽绢I(lǐng)域一般技術(shù)員熟悉的化學(xué)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
根據(jù)特定的表型分離轉(zhuǎn)化子。Southern分析基因組的分子特征。
4.基因組DNA的制備采用常規(guī)方法制備菌體基因組DNA。
5.發(fā)酵實(shí)驗(yàn)250ml三角瓶裝入50ml培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后接入0.5cm2的菌絲塊(真菌)或菌落(細(xì)菌)，于30°(真菌)或37°(細(xì)菌)搖床培養(yǎng)適宜的時(shí)間。
6.生物量測(cè)定取一定體積培養(yǎng)液于4000r min、離心5-15min，傾去上清液，用蒸餾水洗滌2-3次，收集菌體，烘至恒重，再稱重。50-98h不等。苯丙氨酸在培養(yǎng)基滅菌后冷卻加入。
7.酶聯(lián)免疫方法篩選紫杉醇產(chǎn)量變異的突變體按本技術(shù)領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的方法，將紫杉醇與適當(dāng)?shù)姆肿樱缗Ｑ灏椎鞍?、生物素等結(jié)合，免疫兔子或大鼠，制備抗血清，檢測(cè)血清的效價(jià)，利用抗血清和酶標(biāo)儀、96孔或384孔，甚至更多孔的酶標(biāo)板，檢測(cè)突變菌株的紫杉醇產(chǎn)量變異的菌株。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建產(chǎn)紫杉醇微生物飽和突變體庫(kù)的方法，其特征是利用帶有顏色標(biāo)記、抗性基因或營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的基因的轉(zhuǎn)座子體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)座產(chǎn)紫杉醇的微生物。
2.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建產(chǎn)紫杉醇微生物飽和突變體庫(kù)的方法，其特征在于產(chǎn)紫杉醇的微生物包括細(xì)菌、真菌和放線菌。
3.權(quán)利要求2所述的構(gòu)建產(chǎn)紫杉醇微生物飽和突變體庫(kù)的方法，其特征在于真菌包括青霉屬、曲霉屬。
4.權(quán)利要求2所述的構(gòu)建產(chǎn)紫杉醇微生物飽和突變體庫(kù)的方法，其特征在于細(xì)菌包括歐文氏菌。
5.一種從突變體庫(kù)篩選紫杉醇產(chǎn)量變異菌株的方法，其特征是利用紫杉醇抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用包括轉(zhuǎn)座子突變方法構(gòu)建產(chǎn)紫杉醇微生物的飽和突變體庫(kù)和利用紫杉醇抗體酶聯(lián)免疫篩選高產(chǎn)紫杉醇突變菌株的方法。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1800363SQ20051005745
公開日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日
發(fā)明者謝建平, 胡昌華, 廖國(guó)建, 余艷, 劉雪梅 申請(qǐng)人:西南大學(xué)