本發(fā)明屬于生物制藥中的植物細胞培養(yǎng)生產技術，具體涉及一種紅豆杉細胞長期培養(yǎng)穩(wěn)定生產紫杉烷的繼代與調控方法。

背景技術：

紅豆杉人工種植，周期長，產量低；在紅豆杉植物細胞培養(yǎng)方面，由于次級代謝產物的對自身的毒性，細胞株長期繼代過程中不穩(wěn)定，次級代謝產物產量越來越低，大規(guī)模商業(yè)化生產面臨極大困難。目前紅豆杉植物細胞培養(yǎng)生產紫杉烷的傳統(tǒng)工藝是兩階段法。第一個階段是無調控劑下，細胞在生長培養(yǎng)基下較快速的放大生長，主要目的是獲得大量可用的植物細胞團生物量。第二個階段是取一部分植物細胞團，以高接種量放入生產培養(yǎng)基中，在調控劑刺激下，生物合成次級代謝產物，比如表達各種紫杉烷，但同時這批細胞也走向死亡。兩階段培養(yǎng)法在植物細胞長期繼代過程中發(fā)揮了重大作用，尤其是繼代代次的前期和中期，但繼代次數超過50代后，植物細胞越來越適應生長培養(yǎng)基，生長越來越快，比生長率越來越高，倍增越來越大，而同時對調控劑的響應卻越來越低，而且對調控劑響應低或者敏感而凋亡。

兩階段調控工藝只能解決植物細胞長期繼代中的前中期產能問題，考慮到規(guī)模培養(yǎng)的植物細胞都是高代次的，都是位于長期繼代中的后期，我們需要一種繼代和調控方法，應付長期繼代的植物細胞產能下降的問題。

技術實現要素：

本發(fā)明采取了并發(fā)調控的策略，在傳統(tǒng)的生長階段也引入一定較低程度的弱調控方式，保持植物細胞系的生產能力，但也不影響比生長率的維持。在調控生產階段，加入的是中強度調控策略，從而更穩(wěn)定而高產的表達紫杉烷。與現有方案所不同的關鍵點在于：

在植物細胞繼代階段，加入弱調控劑，維持次級代謝基因的低水平表達；而在終端的調控生產階段，使用中強度的調控劑，在生長的初級代謝與次級代謝中達到了相對平衡，提高了生產系統(tǒng)的長期穩(wěn)定性。

為實現上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術方案：

（1）在紅豆杉細胞液體懸浮培養(yǎng)50代之后，第一階段采用加廣泛性弱調控劑硝酸銀水溶液，使用濃度為1-40 mM（毫摩爾每升）的弱調控方式繼代，第二階段采用強調控劑中強度調控方式進行紫杉醇及紫杉烷的生產；

（2）第二階段所述的強調控劑指的是：冠菌素、甲基茉莉酸一種或兩種的混合物；

當使用冠菌素水溶液時濃度為10-2000 nM（納摩爾每升），冠菌素水溶液加入的天數是1到8天；當使用甲基茉莉酸乙醇溶液式濃度為10-200 mM，甲基茉莉酸乙醇溶液加入的天數是1到8天；當聯合使用冠菌素與甲基茉莉酸，其摩爾份數比為1:5000到1:10000。

本發(fā)明所述的調控方法，其中的紅豆杉細胞系為南方紅豆杉細胞，經過50次的液體懸浮繼代；接種的培養(yǎng)基為B5類型植物基礎培養(yǎng)基，其配方：蔗糖起始濃度為20-35g/L ，選優(yōu)為25g/L；含6-BA為1-10mg/L，優(yōu)選為2mg/L，含NAA為1到10mg/L ，優(yōu)選為4mg/L；接種量為100目篩網上的15-30g鮮活細胞，優(yōu)選為20g鮮活細胞；培養(yǎng)避光，振蕩培養(yǎng)，2cm旋距，100rpm。培養(yǎng)周期為14天；所述的鮮活細胞指的是：紅豆杉液體懸浮培養(yǎng)的濕活細胞團。

本發(fā)明第一階段采用加廣泛性調控劑硝酸銀水溶液，優(yōu)選使用濃度為5-20mM ，特別優(yōu)選為10mM。第二階段采用調控劑冠菌素水溶液，優(yōu)選使用濃度為100-1000 nM，特別優(yōu)選為500 nM，冠菌素加入的天數優(yōu)選2到6天，特別優(yōu)選為第4天；調控劑甲基茉莉酸類乙醇溶液，使用濃度優(yōu)選為100-100mM，特別優(yōu)選為50mM。甲基茉莉酸加入的天數優(yōu)選是2到6天，特別優(yōu)選為第4天。強調控劑的使用有三種情況：單獨使用冠菌素，單獨使用甲基茉莉酸，聯合使用這兩者。原因是目前冠菌素太貴，雖然效果好，但考慮到經濟原因，所以可以選擇聯合使用。

本發(fā)明公開的第二階段采用的培養(yǎng)基是MS基礎鹽，加入蔗糖起始濃度為35-70g/L，優(yōu)選是50g/L；含6-BA為1mg/L，2,4-D為0.5mg/L。接種量是20-100g/L，優(yōu)選是30-60g新鮮細胞/L（新鮮細胞指的是紅豆杉液體懸浮培養(yǎng)的濕活細胞團）。

本發(fā)明進一步公開了采用紅豆杉細胞長期培養(yǎng)生產紫杉烷的調控方法在提高紫杉醇、紫杉烷中間體10DAB和BAT III產量方面的應用。試驗結果顯示（具體見實施例）：

常規(guī)的兩階段（無調控-強調控）技術路線，紫杉醇的產量為54到0mg/L，10DAB 和 BAT III的產量未檢出（小于3mg/L），細胞容易褐化死亡。采用本發(fā)明的方法（弱調控-中調控）后，紫杉醇產量為30-100mg/L，同時紫杉烷中間體10DAB和BAT III的產量為30-200mg/L，生產體系比較穩(wěn)定。

本發(fā)明公開的紅豆杉細胞長期培養(yǎng)生產紫杉烷的調控方法與現有技術相比其關鍵點在于：

（1）紅豆杉植物細胞長期繼代的第50代之后，若還采用強調控生產方式，紫杉醇產量會跌落到0-50mg/L，其他紫杉醇中間體產量接近0；若還采用弱強度繼代方式與中強度調控生產方式，紫杉醇產量升到30-100mg/L，同時紫杉烷中間體10DAB和BAT III的產量為30-200mg/L。

（2）在繼代階段也加入弱調控劑，而生產階段卻降為中強度調控劑，如此長期培養(yǎng)中植物細胞培養(yǎng)達到了兩個階段的和諧銜接，最終獲得了高產和穩(wěn)產的兼顧。

附圖說明

圖1為傳統(tǒng)不平衡兩階段（無調控-強調控）技術路線；

圖2為本專利相對平衡（弱調控-中調控）技術路線。

具體實施方式

下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發(fā)明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所用原料及試劑均有市售。紅豆杉植物細胞見專利CN201410726199.6，使用的是一種具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株（Taxus wallichiana var. mairei），命名為：南方紅豆杉植物細胞系NO51-3，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC No.10002。 實施例1

紅豆杉植物細胞新線在搖瓶初期階段的無調控繼代方式一：

紅豆杉細胞南方紅豆杉固體O38-2-2線轉為懸浮第25代搖瓶線懸浮培養(yǎng)物，編號為81#線的種子線，使用500mL容量的搖瓶，裝液量為100mL新鮮的B5培養(yǎng)基，蔗糖起始濃度為15g/L，含6-BA為1mg/L，2,4-D為0.5mg/L，接種量為100目篩網上的10g鮮活細胞，避光，振蕩培養(yǎng)，2cm旋距，100rpm。培養(yǎng)14天后，進行繼代，鮮活細胞倍增比例為2.68。

實施例2

紅豆杉植物細胞在搖瓶中期階段的無調控繼代方式二：

紅豆杉細胞南方紅豆杉固體O38-2-2線轉為懸浮第48代搖瓶線懸浮培養(yǎng)物，編號為81#線的種子線，采用實施例1的培養(yǎng)方式。在培養(yǎng)14天后，進行繼代，鮮活細胞倍增比例增加到2.92。

實施例3

紅豆杉植物細胞在搖瓶后長期階段的弱調控繼代方式三：

紅豆杉細胞南方紅豆杉固體O38-2-2線轉為懸浮第85代搖瓶線懸浮培養(yǎng)物，編號為81#線的種子線。使用500mL容量的搖瓶，裝液量為100mL新鮮的B5培養(yǎng)基，蔗糖起始濃度為20g/L，含6-BA為1.5 mg/L，接種量為100目篩網上的16g鮮活細胞，避光，振蕩培養(yǎng)，2cm旋距，100rpm。在繼代第2-7天，加入使用濃度為10 mMol/L的硝酸銀水溶液。培養(yǎng)14天后，進行繼代，鮮活細胞倍增比例為2.95。

實施例4

紅豆杉植物細胞在搖瓶中期階段的強調控生產方式：

紅豆杉細胞南方紅豆杉固體O38-2-2線轉為懸浮第56代搖瓶線懸浮培養(yǎng)物，編號為81#線的種子線，使用100mL容量的搖瓶，裝液量為20mL新鮮的MS培養(yǎng)基，蔗糖起始濃度為45g/L，含6-BA為1mg/L，2,4-D為0.5mg/L，接種量為100目篩網上的6g鮮活細胞，避光，振蕩培養(yǎng)，2cm旋距，100rpm；在接種第2天加入使用濃度為100 mMol/L的甲基茉莉酸的乙醇溶液，在接種第7天加入使用濃度為10m Mol/L的硝酸銀水溶液，在第28天進行收獲。經過HPLC的紫杉烷定量分析，紫杉醇的產量為54至0mg/L，10DAB 和 BAT III的產量未檢出（小于3mg/L）。

實施例5

紅豆杉植物細胞在搖瓶中長期階段的中調控生產方式一：

紅豆杉細胞南方紅豆杉固體O38-2-2線轉為懸浮第80-90代搖瓶線懸浮培養(yǎng)物，編號為81#線的種子線。紅豆杉植物細胞的中調控生產方式與強調控生產方式類似，但蔗糖起始濃度為45 g/L，接種量為9g，在接種第5天加入使用濃度為50 mMol/L的甲基茉莉酸的乙醇溶液。經過21天到35天的培養(yǎng)，收獲后進行HPLC的紫杉烷定量分析，紫杉醇產量為42.2 mg/L，同時紫杉烷中間體10DAB和BAT III的產量為分別為92.6和100.2mg/L，還存在其他紫杉烷，如C14位修飾的云南紫杉烷Tc。

實施例6

紅豆杉植物細胞在搖瓶中長期階段的中調控生產方式二：

紅豆杉細胞種子與實施例5相同的種子，第91代種子。在接種第7天加入使500 nMol/L的冠菌素水溶液。第28天，紫杉醇產量為66.4mg/L，同時紫杉烷中間體10DAB和BAT III的產量為分別為108.2和71.2 mg/L，其他紫杉烷產量很少。

實施例7

紅豆杉植物細胞在搖瓶中長期階段的的中調控生產方式三：

紅豆杉細胞種子與實施例5相同的種子和相同的代次階段。但在接種第5天聯合使用50 mMol/L的甲基茉莉酸的乙醇溶液，10 nMol/L的冠菌素，第28天，紫杉醇產量為46.7mg/L，同時紫杉烷中間體10DAB和BAT III的產量為分別為95.7和81.8 mg/L，其他紫杉烷產量很少。

實施例8

紅豆杉植物細胞在搖瓶中長期階段的的中調控生產方式四：

紅豆杉細胞種子與實施例5相同的種子和相同的代次階段。但在接種第5天聯合使用10 mMol/L的甲基茉莉酸的乙醇溶液，第28天，紫杉醇產量為5.1mg/L，其他紫杉烷產量很少。

實施例9

紅豆杉植物細胞在搖瓶中長期階段的的中調控生產方式五：

紅豆杉細胞種子與實施例5相同的種子和相同的代次階段。但在接種第7天聯合使用200 mMol/L的甲基茉莉酸的乙醇溶液，第21到28天，紫杉醇及其他紫杉烷產量很少，小于3 mg/L。

實施例10

紅豆杉植物細胞在搖瓶中長期階段的的中調控生產方式六：

紅豆杉細胞種子與實施例5相同的種子和相同的代次階段。但在接種第6天聯合使用10 nMol/L的冠菌素水溶液，第28天，紫杉醇產量為32.1mg/L，同時紫杉烷中間體10DAB和BAT III的產量為分別為65.7和59.7 mg/L，其他紫杉烷產量很少。

實施例11

紅豆杉植物細胞在搖瓶中長期階段的的中調控生產方式七：

紅豆杉細胞種子與實施例5相同的種子和相同的代次階段。但在接種第6天聯合使用2000 nMol/L的冠菌素水溶液，第28天，紫杉醇產量為72.1mg/L，同時紫杉烷中間體10DAB和BAT III的產量為分別為115.5和125.2 mg/L，其他紫杉烷產量很少。

實施例12

紅豆杉植物細胞在5L反應器培養(yǎng)階段的中調控生產方式八：

紅豆杉細胞南方紅豆杉固體O38-2-2線轉為懸浮第88代搖瓶線懸浮培養(yǎng)物，編號為81#線的種子線。在接種到5L 反應器內后，進行14天的弱調控繼代方式繼代到新的5L 反應器中，繼代3次后進行調控生產，此階段，5L反應器提高接種量達30 g/L，在接種第7天，聯合使用濃度為50m Mol/L的甲基茉莉酸的乙醇溶液和使用濃度為10 nMol/L（納摩爾每升）的冠菌素水溶液。在接種第28天收獲。進行HPLC的紫杉烷定量分析，紫杉醇產量為54.4 mg/L，同時紫杉烷中間體10DAB和BAT III的產量100.1和153.9mg/L。