一種棕櫚?？箟难狨ズ投辔髯仙即嫉慕M合物納米粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于注射給藥治療腫瘤的組合物納米制劑，尤其涉及一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨ズ投辔髯仙即嫉慕M合物納米粒及其制備方法。通過將棕櫚?？箟难狨ヅc多西紫杉醇組合，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)其可以顯著增強(qiáng)多西紫杉醇的抗腫瘤藥效，使多西紫杉醇在極低的劑量下就能發(fā)揮藥效，經(jīng)靜脈、動脈、肌肉、皮下、腹腔等方式給藥，特別是用于靜脈注射或瘤內(nèi)注射等介入給藥，提高了多西紫杉醇臨床應(yīng)用的有效性和安全性。本發(fā)明采用的制備方法工藝簡單、成本低廉，制備得到的納米粒粒徑均勻，包封率高，釋藥性能良好，與棕櫚?？箟难狨ゼ岸辔髯仙即嫉膯畏郊{米粒相比，該復(fù)合物的體外抑制腫瘤細(xì)胞生長和體內(nèi)抗腫瘤增生作用得到顯著增強(qiáng)。
【專利說明】
一種棕櫚?？箟难狨ズ投辔髯仙即嫉慕M合物納米粒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于注射給藥治療腫瘤的組合物納米制劑，尤其涉及一種復(fù)方棕 櫚?？箟难狨ズ投辔髯仙即嫉慕M合物納米粒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多西紫杉醇是目前臨床使用最為有效的紫杉烷類抗腫瘤藥物。多西紫杉醇的作用 機(jī)制與紫杉醇類似，但抗腫瘤活性是紫杉醇的1.3-12倍，臨床用于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、 胃癌、卵巢癌、宮頸癌、頭頸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等。由于多西紫杉醇水溶性差，目前臨 床使用的主要有凍干粉針和水針注射劑，該注射劑先將藥物溶解于吐溫80中，臨床使用前， 用13 %乙醇水溶液稀釋至lmg/mL，而在給藥時，進(jìn)一步用5%葡萄糖溶液稀釋，使最終藥物 濃度達(dá)到0.3~0.9mg/L，稀釋后的注射液應(yīng)在4小時內(nèi)使用，否則將可能會有沉淀產(chǎn)生。研 究發(fā)現(xiàn)，Tween-80會誘導(dǎo)短暫適中的超敏反應(yīng)，因此在使用前均須使用抗組胺類藥物和菲 甾體抗炎藥物進(jìn)行預(yù)處理，但藥物的臨床應(yīng)用表明，即使是經(jīng)過預(yù)處理的患者，在臨床應(yīng)用 紫杉烷類藥物后，仍有3%左右的患者會出現(xiàn)不同程度的過敏反應(yīng)。此外Tween-80還具有輕 微的溶血性，而且黏度大。多西紫杉醇作為細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物，其全身毒性，特別是造成 中性粒細(xì)胞減少癥等免疫系統(tǒng)毒性，給患者的身心造成了極大的損害，使其臨床應(yīng)用也因 此受到了一定局限。因此，如何減輕多西紫杉醇注射液的毒性，成為人們所十分關(guān)注的熱點(diǎn) 之一。
[0003] 棕櫚?？箟难狨ナ强箟难岬囊环N脂溶性衍生物，與抗壞血酸相比，其穩(wěn)定性 更強(qiáng)，具備更好的理化性質(zhì)。脂溶性增強(qiáng)后，棕櫚?？箟难崤c抗壞血酸相比進(jìn)入細(xì)胞的能 力增強(qiáng)，藥效增強(qiáng)。前期研究已經(jīng)表明抗壞血酸可以增強(qiáng)多西紫杉醇的抗腫瘤作用及安全 性。因此其與抗壞血酸、多西紫杉醇或它們的組合物比較，經(jīng)靜脈、動脈、肌肉、皮下、腹腔等 給藥，特別是瘤內(nèi)注射、介入給藥等給藥方式可以更加顯著的增強(qiáng)多西紫杉醇的抗腫瘤作 用及安全性。而與抗壞血酸相似的是，棕櫚酰抗壞血酸可以選擇性的在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥 效，對正常細(xì)胞毒性小，因此毒副作用較小。
[0004] 抗腫瘤藥物在發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞作用的同時，亦可損傷正常細(xì)胞藥物。治療的一個 關(guān)鍵問題是如何把藥物定向輸送到癌癥細(xì)胞而又不損傷正常細(xì)胞。納米粒因其超微小體 積，日益受到人們的關(guān)注。載藥納米控釋系統(tǒng)用于抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)有望通過延緩藥物釋 放速度，減慢其轉(zhuǎn)化為代謝物，從而減輕其毒性作用，是一種很有前途的抗腫瘤藥物載體。 納米技術(shù)是將宏觀物體細(xì)分成超微顆粒，在納米尺寸范圍內(nèi)，通過直接操縱單個原子、分子 束組裝和創(chuàng)造具有特定功能的新物質(zhì)，使其物理、化學(xué)及生物活性產(chǎn)生意想不到的巨變?？?生物降解聚合物制成的納米級微粒的研究日益受到生物醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的重視，這種聚合物包 括天然和合成類聚合物，前者主要有葡聚糖、白蛋白、甲殼素及其衍生物、卵磷脂、膽固醇 等，后者主要有聚酯類如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸羥基乙酸(PLGA)、聚酸酐 類、半固態(tài)聚原酸酯類等。近年來，將可生物降解的聚合物制成納米粒，這種聚合物的納米 ?？煽蒯屗幬铮苊馑幬锝到饣蛐孤?，改變可降解單體的比例和聚合反應(yīng)條件來調(diào)節(jié)聚合 物在體內(nèi)降解，提高療效，降低不良反應(yīng);將這種聚合物進(jìn)行表面修飾可以使藥物在體內(nèi)靶 向分布。PLGA是美國FDA批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)的可生物降解高分子聚合物，由兩種單體一乳酸 和羥基乙酸隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容 性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng) 域。在體內(nèi)代謝終產(chǎn)物為〇) 2和出0,對人體無毒副作用。所形成的兩親多糖衍生物可有效避 免藥物載體本身可能的毒副作用，可用作醫(yī)用手術(shù)防粘連膜，注射用微膠囊、微球、納米粒 及埋植劑等緩釋制劑的輔料，同時可用作組織工程細(xì)胞培養(yǎng)的多孔支架。
[0005] PLGA-磷脂-PEG-biotin納米粒具備極其顯著的優(yōu)勢，磷脂的加入可以增加PLGA納 米粒的包封率和載藥量，并且磷脂上豐富的活性基團(tuán)可用于各種小分子靶頭的鍵合，用于 主動靶向；本組合物可加入DSPE-PEG-BIOTIN(二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-生物 素），是一種新型的靶頭，其不僅可以通過BIOTIN靶向于腫瘤細(xì)胞上的SMVT(Na+依賴的多維 生素轉(zhuǎn)運(yùn)體)通道，還可以通過PEG的加入起到在體內(nèi)長循環(huán)的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨ズ投辔髯仙即嫉慕M合物納米 粒及其制備方法。本發(fā)明的復(fù)方棕櫚?？箟难狨ズ投辔髯仙即嫉慕M合物納米粒具有良好 的包封率、載藥量和穩(wěn)定性;粒徑分布集中，大小分布均勻:粒徑為80-200nm，包封率為70% 以上，多西紫杉醇的載藥量為0.03 %~1.67 %，棕櫚酰抗壞血酸酯的載藥量為3.57 %~ 25.37%〇
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明涉及一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒，包括各組 分和組分之間的質(zhì)量百分比如下：
[0009] 多西紫杉醇:棕櫚?？箟难狨ィ焊叻肿硬牧?表面活性劑:磷脂類物質(zhì)=3~30: 0.024~2.4:30~120:0~600:0~144
[0010] 本發(fā)明所述高分子材料可為天然高分子材料和生物可降解合成高分子材料中的 一種或幾種材料混合。
[0011]優(yōu)選的天然高分子材料選自明膠、海藻酸鹽、殼聚糖、葡聚糖、甲殼素、白蛋白；
[0012] 最優(yōu)選的天然高分子材料選自白蛋白。
[0013] 優(yōu)選的白蛋白選自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、驢血清白蛋白、 馬血清白蛋白、兔血清白蛋白、豬血清白蛋白、酪蛋白。
[0014] 優(yōu)選的生物可降解合成高分子材料選自PLA(聚乳酸）、PGA(聚羥基乙酸）、PLGA(聚 乳酸羥基乙酸）、PCL(聚己內(nèi)酯酸）、PVA(聚乙烯醇）、。
[0015] 最優(yōu)選的生物可降解合成高分子材料選自PLA(聚乳酸）、PGA(聚羥基乙酸）、PLGA (聚乳酸羥基乙酸）。
[0016] 優(yōu)選的PLGA分子量為500~100000長鏈高分子，其乳酸與羥基乙酸的比例為15:85 ~85:15中的一種或幾種材料混合。
[0017] 本發(fā)明所述磷脂類物質(zhì)可為磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘 油、憐脂酉支、
[0018] 二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷 脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰、二棕櫚酰磷脂酸、二油酰磷脂酰膽堿、二 油酰磷脂酰乙醇胺、
[0019] 卵磷脂、大豆磷脂、心磷脂、天然或合成的腦磷脂及其混合物。
[0020] 優(yōu)選為卵磷脂、大豆磷脂、腦磷脂、心磷脂。
[0021] 優(yōu)選為卵磷脂、大豆磷脂、
[0022]所述的表面活性劑選自聚乙二醇-十二羥基硬脂酸鋰、泊洛沙姆、吐溫、司盤、脫氧 膽酸鹽、膽酸鹽、脫氧膽酸、膽酸、牛黃膽酸鹽中的一種或幾種材料混合。
[0023] 優(yōu)選的泊洛沙姆選自泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338、泊 洛沙姆407;
[0024] 優(yōu)選的吐溫選自吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、吐溫-85;
[0025] 優(yōu)選的司盤選自司盤-80;
[0026] 最優(yōu)選的選自聚乙二醇-十二羥基硬脂酸鋰、泊洛沙姆188、吐溫-80、脫氧膽酸鹽。
[0027] 本發(fā)明所述凍干保護(hù)劑可為乳糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖、蔗糖中的一種或幾種 材料混合。更優(yōu)選的凍干保護(hù)劑選自海藻糖、甘露醇。
[0028] 本發(fā)明還涉及一種上述復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒的制 備方法，可以采用下述不同方法制備：
[0029] 方法一：
[0030] A、將生物可降解合成高分子材料溶解于有機(jī)溶劑中形成高分子材料有機(jī)溶液；
[0031] B、棕櫚酰抗壞血酸酯與多西紫杉醇加入高分子材料有機(jī)溶液中渦旋形成的溶液 作為油相；
[0032] C、將磷脂類物質(zhì)溶于4%的有機(jī)水溶液中，加入表面活性劑，水浴除去有機(jī)溶劑， 作為水相；
[0033] D、將油相滴加入磁力恒溫?cái)嚢柚乃嘀校?br>[0034] E、滴加完后繼續(xù)攪拌2小時以除去有機(jī)溶劑；
[0035] F、將除去有機(jī)溶劑的納米粒溶液加入透析袋中透析過夜后，加入凍干保護(hù)劑冷凍 干燥，即得。
[0036] 步驟A中，所述生物可降解合成高分子材料濃度優(yōu)選為2.5mg/mL~20mg/mL;
[0037]有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇；
[0038]步驟B中，棕櫚?？箟难崤c生物可降解合成高分子材料的質(zhì)量比為0.024~2.4: 30~120,棕櫚?？箟难崤c多西紫杉醇的質(zhì)量比為0.024~2.4:3~30;
[0039] 步驟C中，所使用的有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、丙酮、乙醇、異丙醇；
[0040] 表面活性劑其濃度為Omg/mL~30mg/mL;
[0041] 磷脂類物質(zhì)與生物可降解合成高分子材料的質(zhì)量比為0~144:30~120;
[0042] 水浴溫度設(shè)定為35 °C~80 °C;
[0043] 步驟D中，油相與水相的體積比為1: 2~1:15，油相滴加速度為0.5mL/min~4mL/ min;磁力攪拌時攪拌速度為200rpm~4000rpm，溫度設(shè)定為15°C~70°C。
[0044] 方法二：
[0045] A、將處方量的棕櫚酰抗壞血酸酯與多西紫杉醇溶解于有機(jī)溶劑中，形成的溶液作 為油相；
[0046] B、將處方量的天然高分子材料溶解于蒸餾水中，恒溫水浴后得到的溶液作為水 相；
[0047] C、將油相滴加入恒溫并攪拌著的水相中；
[0048] D、加入戊二醛水溶液，繼續(xù)攪拌固化；
[0049] E、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑；
[0050] F、過0.22μπι微孔濾膜，加入凍干保護(hù)劑冷凍干燥，即得。
[0051]沒有用到磷脂類物質(zhì)和表面活性劑。
[0052]方法二的步驟Α中棕櫚?？箟难崤c多西紫杉醇的質(zhì)量比為0.024~2.4: 3~30; 優(yōu)選的有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇；
[0053] 方法二的步驟B中，天然高分子材料濃度為0.5mg/mL~5mg/mL;水浴溫度設(shè)定為35 。(:~100。。；
[0054] 方法二的步驟C中，油相與水相的體積比為1:2~15;油相滴加速度為0.5mL~5mL/ min;攪拌時攪拌速度為200rpm~5000rpm，恒溫的溫度設(shè)定為15°C~80°C ;
[0055] 方法二的步驟D中，戊二醛水溶液中戊二醛的濃度優(yōu)選是2%。
[0056]方法二的步驟E中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度設(shè)定為25°C~80°C。
[0057]有益技術(shù)效果
[0058]本發(fā)明的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒具有良好的包封 率、載藥量和穩(wěn)定性。
[0059]本發(fā)明的復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸酯/多西紫杉醇的組合物納米粒與棕櫚?？箟难?酯單方納米粒及多西紫杉醇的單方納米粒相比，藥效明顯增強(qiáng)，可以顯著提高多西紫杉醇 的抗腫瘤效果，且毒性降低，安全性高。提高了多西紫杉醇臨床用藥的安全性及有效性，具 有重要的實(shí)際應(yīng)用前景。
[0060]本發(fā)明的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒制備方法具有工藝 簡便、制備成本低、工藝重現(xiàn)性好、實(shí)驗(yàn)處方和工藝可放大到生產(chǎn)應(yīng)用等特點(diǎn)，因而對產(chǎn)業(yè) 化的應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。
【附圖說明】
[0061 ]圖1為靜注2mg/kg給藥后多西紫杉醇溶液組與納米粒組在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間曲線
【具體實(shí)施方式】
[0062]納米粒評價(jià)方法：
[0063 ]納米粒的粒徑的測定:采用激光粒度測定儀測定。
[0064]包封率以及載藥量的測定:0.3mL的復(fù)方納米粒過葡聚糖凝膠柱，用生理鹽水為洗 脫液，分開游離的藥物和納米粒后，收集納米粒組分，用甲醇破乳定容后用HPLC進(jìn)行測定， 計(jì)算得復(fù)方納米粒濃度Ci。另取0.3mL復(fù)方納米粒用甲醇定容到與上柱后納米粒組分相同 體積，然后進(jìn)樣并計(jì)算得復(fù)方納米粒破乳后總濃度Co。根據(jù)以下公式計(jì)算包封率 (Encapsulation Efficiency，EE%)以及載藥量(Drug Loading Efficiency ,DLE% )：
[0065]
[0066]
[0067] 實(shí)施例1: 一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒配方及其制備 如下：
[0068] 所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒制備工藝為：
[0069] A、將PLA溶解于6mL丙酮中形成PLA丙酮溶液；
[0070] B、將棕櫚?？箟难狨ヅc多烯紫杉醇加入PLA丙酮溶液中渦旋形成溶液，作為油 相；
[0071] C、將卵磷脂溶于10%的乙醇溶液中，加入泊洛沙姆188和DSPE-PEG-BI0TIN(DPB) 后，其中卵磷脂:〇?8 = 10:1，（《/?)，30°(：水浴除去乙醇作為水相；
[0072] D、將油相以lmL/min的速度滴加入1000rpm，30°C恒溫?cái)嚢柚乃嘀校?br>[0073] E、滴加完后繼續(xù)攪拌2小時以除去丙酮；
[0074] F、將除去丙酮的納米粒溶液加入透析袋中透析過夜后，加入500g甘露醇冷凍干 燥，即得。
[0075]實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0076]表1.實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0077]
[0078]
[0079] 多烯紫杉醇:D0C，棕櫚酰抗壞血酸酯：PA，DSPE-PEG-BIOTIN:DPB，卵磷脂:DPB=10 :1，（w/w)·
[0080] 制劑評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):粒徑：100~200nm，包封率：>80%，PA載藥量：1 %~20 %為合格制 劑
[0081] 實(shí)施例2:-種復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒配方及其制備 如下：
[0082] 所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒制備工藝為：
[0083] A、將PGA溶解于4L丙酮中形成PGA丙酮溶液；
[0084] B、將棕櫚?？箟难狨ヅc多西紫杉醇加入PGA丙酮溶液中渦旋形成溶液，作為油 相；
[0085] C、將卵磷脂溶于20%的二氯甲烷溶液中，加入聚乙二醇-十二羥基硬脂酸鋰后，30 °c水浴除去二氯甲烷作為水相；
[0086] D、將油相以lmL/min的速度滴加入100rpm，30°C恒溫?cái)嚢柚乃嘀校?br>[0087] E、滴加完后繼續(xù)攪拌2小時以除去丙酮；
[0088] F、將除去丙酮的納米粒溶液加入透析袋中透析過夜后，加入100g海藻糖冷凍干 燥，即得。
[0089]實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0090]表2.實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0091]
[0092] _____
[0093]多烯紫杉醇:D0C，棕櫚?？箟难狨?PA，聚乙二醇-十二羥基硬脂酸鋰:PEG-12-OH-Li
[0094] 制劑評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):粒徑：100~200nm，包封率：>80%，PA載藥量：1 %~20 %為合格制 劑
[0095] 實(shí)施例3:-種復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸酯/多西紫杉醇的組合物納米粒配方及其制備 如下：
[0096]所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒制備工藝為：
[0097] A、將PLGA溶解于5L丙酮中形成PLGA丙酮溶液；
[0098] B、將棕櫚酰抗壞血酸酯與多西紫杉醇加入PLGA丙酮溶液中渦旋形成溶液，作為油 相；
[0099] C、將大豆磷脂溶于20%的二氯甲烷溶液中，加入吐溫-80后，30°C水浴除去二氯甲 烷作為水相；
[0100] D、將油相以lmL/min的速度滴加入500rpm，30°C恒溫?cái)嚢柚乃嘀校?br>[0101] E、滴加完后繼續(xù)攪拌2小時以除去丙酮；
[0102] F、將除去丙酮的納米粒溶液加入透析袋中透析過夜后，加入100g海藻糖冷凍干 燥，即得。
[0103] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0104] 表3.實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0105]
[0106] 夕師系t夕0?: uul ,你個剛:饑外皿阪閉：。
[0107] 制劑評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):粒徑：100~200nm，包封率：>80%，PA載藥量：1 %~20 %為合格制 劑
[0108] 實(shí)施例4: 一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒配方及其制備 如下：
[0109] 所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒制備工藝為：
[0110] 將棕櫚?？箟难狨ズ投辔髯仙即既芙庥诒?，作為油相;將牛白蛋白溶解于 5L蒸餾水中，40°C水浴3h后得到的溶液作為水相;將油相以2mL/min的速度滴加入500rpm， 80 °C恒溫?cái)嚢柚乃嘀?；加? %戊二醛水溶液，繼續(xù)攪拌12h; 30 °C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶 劑;過0.22μπι微孔濾膜，加入100g乳糖冷凍干燥，即得。
[0111] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0112] 表4.實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0113]
[0114] 多烯紫杉醇:D0C，棕櫚?？箟难狨?PA。
[0115] 制劑評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):粒徑：100~200nm，包封率：>80%，PA載藥量：1 %~20%為合格制 劑。
[0116] 實(shí)驗(yàn)例1:棕櫚?？箟难狨ヅc多西紫杉醇合用對腫瘤細(xì)胞的作用 [0117] MTT法測定腫瘤細(xì)胞活性
[0118] 對數(shù)生長期的細(xì)胞株經(jīng)0.25 %胰酶消化后，用含10 %胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液 配成單細(xì)胞懸液，以3 X103個/mL的密度接種于96孔板中，每孔加入100yL細(xì)胞懸液，置于37 °C、5%C02培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞充分貼壁后，去除原有的培養(yǎng)液，每孔加 入用培養(yǎng)液配制的不同濃度的多西紫杉醇溶液50yL，再加入用用培養(yǎng)液配置的不同濃度棕 櫚?？箟难狨?0yL。對照組加入含0.1 %DMS0的培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后吸棄藥 液，每孔加入roS 100yL洗去殘留的藥液，每孔加入含10 % 5mg/mL MTT工作液培養(yǎng)液100yL， 37 °C繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄上清液，每孔加入150yL DMS0，振蕩1 Omin以充分溶解結(jié)晶物，在酶標(biāo) 儀570nm下測定0D值，按下列公式計(jì)算給予多西紫杉醇后腫瘤細(xì)胞的抑制率，并采用SPSS數(shù) 據(jù)處理軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC 50)。
[0119]
[0120]根據(jù)各濃度藥物的抑制率，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC5Q，并依據(jù) IC50計(jì)算多西紫杉醇與不同濃度的棕櫚?？箟难狨ズ嫌煤驣C5Q減少倍數(shù)。
[0121] PA提高了藥物A的化療作用的判斷方法
[0122] IR(A+PA)>IR(A)，表示PA的存在提高了藥物A的化療作用，右上角標(biāo)記為氣
[0123] 協(xié)同作用判斷方法
[0124] 用以下的計(jì)算方法對協(xié)同作用進(jìn)行判斷：
[0125] IR(A+B)>IR(A)+IR(B)-IR(A)XIR(B)，藥物間存在協(xié)同作用；
[0126] IR(A+B) = IR(A)+IR(B)-IR(A)XIR(B)，藥物間只是簡單疊加作用；
[0127] IR(A+B)<IR(A)+IR(B)-IR(A)XIR(B)，藥物間存在拮抗作用；
[0128] 其中11?以+8)，11?以），11?(8)分別對應(yīng)藥物48聯(lián)用4單獨(dú)作用及8單獨(dú)作用時的生 長抑制率。
[0129] IR(A)+IR(B)-IR(A)XIR(B)的結(jié)果示為預(yù)測值，如AB聯(lián)用的抑制率{IR(A+B)}大 于預(yù)測值，則表示合用具有協(xié)同作用。右上角標(biāo)記^為具有協(xié)同作用。如抑制率為負(fù)值者記 為0〇
[0130] 上述細(xì)胞株選自：人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人肝癌細(xì)胞株HepG-II、人肺癌細(xì)胞株 A549、人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、人原位胰腺腺癌細(xì)胞株BxPC-3、人宮頸癌細(xì)胞株Hela。
[0131] PA合用多西紫杉醇對人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的作用結(jié)果見表1-1，表1-2。
[0132] PA合用多西紫杉醇對人肝癌細(xì)胞株HepG-II的作用結(jié)果見表2-1，表2-2。
[0133] PA合用多西紫杉醇對人肺癌細(xì)胞株A549的作用結(jié)果見表3-1，表3-2。
[0134] PA合用多西紫杉醇對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的作用結(jié)果見表4-1，表4-2。
[0135] PA合用多西紫杉醇對人原位胰腺腺癌細(xì)胞株BxPC-3的作用結(jié)果見表5-1，表5-2。
[0136] PA合用多西紫杉醇對人宮頸癌細(xì)胞株Hela的作用結(jié)果見表6-1，表6-2。
[0137] 表1-1.PA合用多西紫杉醇對MCF-7的作用結(jié)果
[0138]
[0139] 注："^"表示具有協(xié)同作用；"A"表示PA可以提高化療藥作用
[0140] 表1-2.多西紫杉醇單獨(dú)作用MCF-7和與不同濃度PA合用后的IC5Q值及藥效增加倍 數(shù)
[0141]
[0142] 注："A"表示PA可以提高化療藥作用
[0143] 表2-1.PA合用多西紫杉醇對HepG-II的作用結(jié)果
[0144]
[0145]
[0146] 注："Μ"表示具有協(xié)同作用；"A"表示PA可以提高化療藥作用
[0147] 表2-2.多西紫杉醇單獨(dú)作用HepG-II和與不同濃度PA合用后的IC5Q值及藥效增加 倍數(shù)
[0148]
[0149] 注："A"表示PA可以提高化療藥作用
[0150] 表3-1.PA合用多西紫杉醇對A549的作用結(jié)果
[0151]
[0152] 注："^"表示具有協(xié)同作用；"A"表示PA可以提高化療藥作用
[0153] 表3-2.多西紫杉醇單獨(dú)作用A549和與不同濃度PA合用后的IC5Q值及藥效增加倍數(shù)
[0154]
[0155] 汪：-衣不PA口」以捉咼化燈約忭用
[0156] 表4-1.PA合用多西紫杉醇對SGC-7901的作用結(jié)果
[0157]
[0158]
[0159] 注："μ"表示具有協(xié)同作用；"A"表示PA可以提高化療藥作用
[0160] 表4-2.多西紫杉醇單獨(dú)作用SGC-7901和與不同濃度PA合用后的IC5Q值及藥效增加 倍數(shù)
[0161]
[0162] 注："A"表示PA可以提高化療藥作用
[0163] 表5-1.PA合用多西紫杉醇對BxPC-3的作用結(jié)果
[0164]
[0165] 注："表示具有協(xié)同作用；"A"表示PA可以提高化療藥作用
[0166] 表5-2.多西紫杉醇單獨(dú)作用BxPC-3和與不同濃度PA合用后的IC5Q值及藥效增加倍 數(shù)
[0167]
[0168] 注："A，"表示PA可以提高化療藥作用
[0169] 表6-1.PA合用多西紫杉醇對Hela的作用結(jié)果
[0170]
[0171] 注："Μ"表示具有協(xié)同作用；"A"表示PA可以提高化療藥作用
[0172] 表6-2.多西紫杉醇單獨(dú)作用Hela和與不同濃度PA合用后的IC5Q值及藥效增加倍數(shù)
[0173]
[0174]注："A"表示PA可以提高化療藥作用
[0175] 藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)
[0176] 實(shí)驗(yàn)例1:復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸酯/多西紫杉醇的組合物納米粒與多西紫杉醇溶液 的藥動學(xué)性質(zhì)比較
[0177] 取大鼠6只，按體重隨機(jī)分成兩組，每組三只大鼠，按2mg/kg劑量靜注給予0.5mg/ mL多西紫杉醇溶液(大鼠編號為如.1、如.2、如.3)、復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸酯/多西紫杉醇組 合物納米粒(棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇= 6:1，其中多西紫杉醇濃度為0.5mg/mL，大鼠 編號為No · 4、Νο · 5、No · 6)，分別于給藥前約0 · 25h和給藥后0 · 083h、0 · 25h、0 · 5h、lh、2h、4h、 8h、12h、24h、48h取血，約200yL至肝素化試管中，于8000rpm離心5min，分離出血衆(zhòng)，于-80 °C 保存供測試。
[0178]表7.大鼠靜注給予2mg/kg多西紫杉醇溶液后的血藥濃度(yg/L)
[0179]
[0180] 表8.大鼠靜注給予2mg/kg多西紫杉醇溶液后大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)
[0181]
[0182] 表9.大鼠靜注給予2mg/kg復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇組合物納米粒后的 血藥濃度（yg/L)
[0183]
[0184] 表10.大鼠靜注給予2mg/kg復(fù)方棕櫚酰抗壞血酸酯/多西紫杉醇納米粒后大鼠體 內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)
[0185]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒，其特征在于，各組分和組 分之間的質(zhì)量百分比如下： 多烯紫杉醇:棕櫚?？箟难狨?高分子材料:表面活性劑:磷脂類物質(zhì)=3~30:0.024 ~2.4:30~120:0~600:0~144。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒，其特征 在于，所述高分子材料可為天然高分子材料和生物可降解合成高分子材料中的一種或幾種 材料混合。天然高分子材料可為明膠、海藻酸鹽、殼聚糖、葡聚糖、甲殼素、白蛋白；生物可降 解合成高分子材料可為PLA(聚乳酸）、PCL(聚己內(nèi)酯酸）、PLGA(聚乳酸羥基乙酸）、PVA(聚乙 烯醇）、PGA(聚羥基乙酸）。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒，其特征 在于，所述高分子材料優(yōu)選白蛋白和PLGA。白蛋白可為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血 清白蛋白、驢血清白蛋白、馬血清白蛋白、兔血清白蛋白、豬血清白蛋白、酷蛋白；PLGA分子 量為500~100000長鏈高分子，其乳酸與羥基乙酸的比例為15:85~85:15中的一種或幾種 材料混合。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒，其特征 在于，所述表面活性劑可為聚乙二醇-十二羥基硬脂酸鋰、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛 沙姆237、泊洛沙姆338、泊洛沙姆407、吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、吐溫-85、司盤-80、脫氧膽酸鹽、膽酸鹽、脫氧膽酸、膽酸、牛黃膽酸鹽中的一種或幾種材料混合。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒，其特征 在于，所述表面活性劑優(yōu)選聚乙二醇-十二羥基硬脂酸鋰、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、脫氧 膽酸鹽。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒，其特征 在于，所述磷脂類物質(zhì)可為磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、 二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽 堿、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰、二棕櫚酰磷脂酸、二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷 脂酰乙醇胺、卵磷脂、大豆磷脂、心磷脂、天然或合成的腦磷脂及其混合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒，其特征 在于，所述磷脂類物質(zhì)優(yōu)選卵磷脂、大豆磷脂、腦磷脂、心磷脂。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒，其特征 在于，所述凍干保護(hù)劑可為乳糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖、蔗糖中的一種或幾種材料混合。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的包載復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒，其 特征在于，可以采用下述不同方法制備： 方法一： A、 將生物可降解合成高分子材料溶解于有機(jī)溶劑中形成高分子材料有機(jī)溶液； B、 棕櫚酰抗壞血酸酯與多西紫杉醇加入高分子材料有機(jī)溶液中渦旋形成的溶液作為 油相； C、 將磷脂類物質(zhì)溶于4%的有機(jī)水溶液中，加入表面活性劑，水浴除去有機(jī)溶劑，作為 水相； D、 將油相滴加入磁力恒溫?cái)嚢柚乃嘀校? E、 滴加完后繼續(xù)攪拌2小時以除去有機(jī)溶劑； F、 將除去有機(jī)溶劑的納米粒溶液加入透析袋中透析過夜后，加入凍干保護(hù)劑冷凍干 燥，即得。 方法二： A、 將棕櫚?？箟难狨ヅc多西紫杉醇溶解于有機(jī)溶劑中，形成的溶液作為油相； B、 將天然高分子材料溶解于蒸餾水中，恒溫水浴后得到的溶液作為水相； C、 將油相滴加入磁力恒溫?cái)嚢柚乃嘀校? D、 加入2 %戊二醛水溶液，繼續(xù)攪拌固化； E、 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑； F、 過0.22μπι微孔濾膜，加入凍干保護(hù)劑冷凍干燥，即得。10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的復(fù)方棕櫚?？箟难狨?多西紫杉醇的組合物納米粒制備 方法一，其特征在于，步驟Α中，所述生物可降解合成高分子材料濃度為2.5mg/mL~20mg/ mL;有機(jī)溶劑可為二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇、乙醚、異丙醇及其混合物。
【文檔編號】A61K9/14GK105997982SQ201610294264
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】盧楊, 王子厚, 郭朝瑞, 陳西敬, 趙娣, 李寧, 陳琪, 馬恩龍, 張玲
【申請人】陳西敬