多西紫杉醇免疫原、抗多西紫杉醇特異性抗體和多西紫杉醇檢測(cè)試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多西紫杉醇免疫原及其合成方法，以及由該免疫原獲得的抗多西紫杉醇抗體、檢測(cè)試劑及其制備方法。本發(fā)明的多西紫杉醇免疫原由全新的多西紫杉醇衍生物合成，具有免疫原性高的優(yōu)點(diǎn)，并且可以誘導(dǎo)得到特異性高和結(jié)合力強(qiáng)的抗多西紫杉醇特異性抗體，并且與常見的62種藥物無任何交叉反應(yīng)。由該抗體制備的多西紫杉醇檢測(cè)試劑，可以方便、精確地確定樣品中的多西紫杉醇含量，有利于臨床的個(gè)體化治療。與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，本發(fā)明的檢測(cè)試劑可以實(shí)現(xiàn)在全自動(dòng)生化分析儀上的高通量、快速化檢測(cè)，且具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，還能有效降低多西紫杉醇檢測(cè)成本，適合臨床大規(guī)模推廣使用。
【專利說明】多西紫杉醇免疫原、抗多西紫杉醇特異性抗體和多西紫杉 醇檢測(cè)試劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，設(shè)及多西紫杉醇免疫原、抗多西紫杉醇特異性抗體和 多西紫杉醇檢測(cè)試劑。

【背景技術(shù)】
[0002] 多西紫杉醇值ocetaxel)結(jié)構(gòu)式如式（III)所示：
[0003]

【權(quán)利要求】
1. 一種多西紫杉醇免疫原，其結(jié)構(gòu)式如式（I)所示：
式中，R為連接基團(tuán)-CO-(CH2)n-COO-,η是1至20之間的整數(shù)，優(yōu)選R為-CO-(CH2)2-C00-;載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)或多肽，選自血清蛋白、血藍(lán)蛋白或甲 狀腺球蛋白中的一種，優(yōu)選為血清蛋白，更優(yōu)選為牛血清白蛋白。
2. -種如權(quán)利要求1所述的多西紫杉醇免疫原的合成方法，其特征在于包含以下步 驟： ⑴將載體蛋白200mg溶解于50ml0· 2M，pH8. 5的磷酸緩沖液中； (2) 將如下化學(xué)品加入到小燒杯中室溫下攪拌溶解反應(yīng)30min:200mg多西紫杉醇衍 生物、3. 5ml二甲基甲酰胺、3. 5ml乙醇、7.Oml10mM，pH5. 0的磷酸鉀緩沖液、200mgl-乙 基-3-(-3-二甲氨丙基）碳二亞胺、50mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺； (3) 將溶解好的溶液滴加至載體蛋白溶液中，并在2?8°C下攪拌過夜，得到抗原；將合 成好的抗原經(jīng)過透析進(jìn)行純化，得到多西紫杉醇免疫原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多西紫杉醇免疫原的合成方法，其特征在于所述的多西紫杉 醇衍生物結(jié)構(gòu)式如式（II)所示：
上述R為連接基團(tuán)-CO-(CH2)n-COO-,η為1至20之間的整數(shù)，優(yōu)選η為2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)所述的多西紫杉醇衍生物，其特征在于由以下步驟合成： (1) 稱取Ig多西紫杉醇、2g化合物A加入反應(yīng)體系中，然后用20ml吡啶或者干燥的苯 在連續(xù)回流的玻璃燒瓶中進(jìn)行孵育； (2) 將此反應(yīng)混合物在70-80°C的回流溫度下持續(xù)加熱6小時(shí)，然后將反應(yīng)混合物緩慢 冷卻至室溫，輕輕倒去多余的吡啶或苯； (3) 將剩余的有機(jī)成分在負(fù)壓條件下持續(xù)通入氮?dú)饬魇蛊湔舭l(fā)干燥，得到干燥殘留產(chǎn) 物； (4) 將步驟（3)得到的產(chǎn)物用蒸餾水配制的60%乙醇沖洗10次以上，獲得重結(jié)晶物質(zhì) 即為多西紫杉醇衍生物； 所述的化合物A為含有3-22個(gè)碳原子的烷二酸或相應(yīng)的酸酐，優(yōu)選為丁二酸酐。
5. -種抗多西紫杉醇特異性抗體，由權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的多西紫杉醇免疫原免 疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后產(chǎn)生得到的完整抗體分子，或者為保留與多西紫杉醇特異性結(jié)合的能力的抗 體片段或抗體衍生物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗多西紫杉醇特異性抗體，其特征在于所述的完整的抗 體分子、抗體片段或抗體衍生物，為采用單一的多西紫杉醇免疫原對(duì)動(dòng)物加強(qiáng)免疫所獲得 的多克隆抗體，或者為免疫后經(jīng)體細(xì)胞雜交獲得的單克隆抗體；所述的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選自兔、山 羊、小鼠、綿羊、豚鼠或馬中的一種，優(yōu)選為兔。
7. -種如權(quán)利要求5-6中任一項(xiàng)所述的抗多西紫杉醇特異性抗體的制備方法，其特征 在于包含以下步驟： (1) 用PBS將多西紫杉醇免疫原稀釋至I.Omg/ml，得到抗原溶液，然后用I.Oml抗原溶 液與弗氏完全佐劑混合，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行注射； (2) 2?3周后，再用I.Oml相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對(duì)上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射一 次，之后每隔四周注射一次，共計(jì)注射4次； (3) 對(duì)步驟（2)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取血，分離純化得到效價(jià)為1:30000-1:50000的抗多西紫杉 醇特異性抗體。
8. -種多西紫杉醇檢測(cè)試劑，含有權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的抗多西紫杉醇特異性抗 體和指示試劑，所述的指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、熒光試劑或發(fā)光試劑中的 一種，優(yōu)選為酶試劑；所述的酶試劑由多西紫杉醇酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶底物所組成，酶標(biāo)偶聯(lián)物 優(yōu)選為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物，酶底物優(yōu)選為葡萄糖-6-磷酸。
9. 一種如權(quán)利要求8所述的多西紫杉醇檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于包含以下步 驟： (1) 試劑A:將4. 036g、ll. 25mM氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和I. 711g、ll. 25mM葡 萄糖-6-磷酸用IL55mM、pH= 8.O的Tris緩沖液溶解制成均相酶底物；將權(quán)利要求5-7 中任一項(xiàng)所述的抗多西紫杉醇特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗多西紫杉醇特異性抗 體與均相酶底物的體積比為1:100?1:10000 ; (2) 試劑B:將多西紫杉醇酶標(biāo)偶聯(lián)物加到120mM、pH= 8. 2的Tris緩沖液中，多西紫 杉醇酶標(biāo)偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:100?1:10000 ; 所述的抗多西紫杉醇特異性抗體與均相酶底物的體積比優(yōu)選為1:400 ; 所述的多西紫杉醇酶標(biāo)偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比優(yōu)選為1:1500。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8-9任一項(xiàng)所述的多西紫杉醇檢測(cè)試劑，其特征在于所述的多西紫 杉醇酶標(biāo)偶聯(lián)物的制備方法包含以下步驟： (1) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液的制備：稱取15mg規(guī)格為100KU的葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶，室溫溶解于 12mL含有 72.6mg0.05MTris、8mg3.3mMMgClJPlOOmgNaCl的溶液 中，pH= 9. 0 ;在溶液中加入225mg還原態(tài)的煙酰胺腺嗓呤二核苷酸、135mg葡萄糖-6-磷 酸以及0. 75mL卡必醇；再逐滴加入2mL二甲基亞砜； (2) 多西紫杉醇衍生物的激活：在無水狀態(tài)下稱取IOmg多西紫杉醇衍生物，溶解于 600μL二甲基甲酰胺中；使上述溶液溫度降到-2?-8°C;加入3μL三丁胺；加入1. 5μL 氯甲酸異丁酯；-2?_8°C攪拌30分鐘； (3) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與多西紫杉醇衍生物的連接：將步驟（2)激活的多西紫杉 醇衍生物溶液逐滴加入到步驟（1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液中；2-8°C攪拌過夜； (4) 純化產(chǎn)物：通過G-25凝膠層析柱純化連接產(chǎn)物，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磷 酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物，于2-8 °C下儲(chǔ)存。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK104447984SQ201410799413
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月20日
【發(fā)明者】虞留明, 涂建成, 盧忠心, 王英, 徐琦鋆 申請(qǐng)人:蘇州博源醫(yī)療科技有限公司