專利名稱：紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗癌藥物的偶合物，特別是涉及紫杉醇或多西紫杉醇的一種多肽
偶合物。
背景技術(shù)：
紫杉醇(Paclitaxel， PTAX)是從紅豆杉屬(Taxus)植物的樹皮中分離提取的二 萜類天然產(chǎn)物，為近二十年來所研發(fā)上市的最有效的化學(xué)抗癌藥物之一。通過特異性結(jié) 合到細(xì)胞微管小管的P位，使微管聚合為團塊或束狀，紫杉醇可有效抑制微管網(wǎng)的正常 重組，使細(xì)胞的分裂，繁殖及生長受到阻礙并停滯在G2期和M期。作為國際上廣泛認(rèn)可的 高效化學(xué)抗癌藥物，紫杉醇已被眾多國家批準(zhǔn)用于臨床，以治療包括乳腺癌，卵巢癌，結(jié)腸 癌，食管癌，非小細(xì)胞肺癌，膀胱癌、前列腺癌，黑素瘤(Melanoma)，淋巴瘤，白血球過多癥 (Leukemias)及胃癌等多種癌癥卜3。 紫杉醇的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前難以通過化學(xué)合成方法制備，因天然資源有限，使其價格 極為昂貴。紫杉醇具有高效細(xì)胞毒性，但卻缺乏細(xì)胞選擇性。在體內(nèi)除腫瘤組織外，也可分 布于正常組織中，除導(dǎo)致生物利用度明顯降低外，也使得紫杉醇在殺滅癌細(xì)胞的同時，對正 常細(xì)胞及組織造成傷害。紫杉醇細(xì)胞選擇性差也導(dǎo)致了臨床應(yīng)用中產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用，包 括中性白細(xì)胞減少，骨髓抑制，血管性水腫，低血壓，過敏性反應(yīng)，全身性蕁麻疹，感覺及中 樞神經(jīng)病變，觸覺異常，感覺減退，位置感覺缺失等，常使需要長期用藥的癌癥患者難以承 受。此外，紫杉醇水溶性極差( 0.4ug/ml)，在劑型及給藥方式上受到諸多限制。臨床制 劑中將紫杉醇加入聚氧乙烯蓖麻油(Cremphor EL):無水乙醇(V : V = 1 : 1)中，再以 生理鹽水稀釋后通過靜脈輸液給藥，除給患者帶來不便外，聚氧乙烯蓖麻油還可引起人體 的過敏反應(yīng)。對一些需要增加劑量才能獲得較好療效的病例，紫杉醇也因其水溶性極差而 難以有效使用2'4—7。 多西紫杉醇(Docetaxel， DTAX)是以從紫杉樹葉中提取的、含有紫杉醇基本母核 結(jié)構(gòu)的去乙酰漿果赤霉素III(lO-Deacetyl baccatin III)為原料，通過在其3'位的氨基 進行叔丁氧?；蟮玫降陌牒铣勺仙即碱愃莆?'9。通過與紫杉醇相同的作用機制，多西紫 杉醇在臨床上也用作有效的化學(xué)抗癌藥物。但多西紫杉醇在應(yīng)用中同樣顯示出細(xì)胞選擇性 差的弱點，在抑制腫瘤細(xì)胞的同時，對正常細(xì)胞及組織造成傷害，導(dǎo)致各種與紫杉醇類似的 毒副作用"'11。
紫杉醇與多西紫杉醇具 如下結(jié)構(gòu)
當(dāng)為紫杉醇時，&為C6H5_， R2為CH3-C0-;當(dāng)為多西紫杉醇時，&為(CH3)3C0_， R2 為H-。 近十年來引起高度關(guān)注的的分子靶向抗癌藥物研發(fā)策略，為從根本上克服化學(xué)抗 癌藥物細(xì)胞選擇性差的弱點提供了科學(xué)有效的解決方案。眾多研究結(jié)果表明，某些腫瘤細(xì) 胞能夠高密度地表達(dá)正常細(xì)胞不具有的特殊受體，而某些抗體或內(nèi)源性多肽可選擇性結(jié)合 于這類受體，使得腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制受到抑制，腫瘤的生長，繁殖及轉(zhuǎn)移受到干擾和阻 止。針對腫瘤細(xì)胞的特殊受體及相應(yīng)的抗體及靶向多肽開展研究，正成為新型高效低毒抗 癌藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點12—17。 生長抑素受體(Somatostatin rec印tors， STTRs)是一類含有7個跨膜區(qū)段的糖 蛋白，屬G蛋白偶聯(lián)受體家族。自1992年SSTR1和SSTR2被克隆至今，已成功克隆并確定 了 5種不同的STTRs分子亞型(STTR1-STTR5)，它們與細(xì)胞的內(nèi)攝作用及細(xì)胞生物信息傳遞 密切相關(guān)。大多數(shù)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，如前列腺癌，乳腺癌，小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌都表達(dá) 了高密度的STTRs。而含14個氨基酸的內(nèi)源性多肽生長抑素(Somatostatin)，與高密度表 達(dá)STTRs的腫瘤細(xì)胞具有良好的親和性及選擇性15'18。 奧曲肽(Octreotide)是在對生長抑素進行結(jié)構(gòu)修飾及序列調(diào)整的基礎(chǔ)上，通過 化學(xué)合成而研發(fā)的高效靶向多肽藥物。奧曲肽僅含8個氨基酸但卻具有更強的STTRs親和 能力和穩(wěn)定性，體內(nèi)代謝半衰期是生長抑素的50倍。其序列為D-Phe-c [Cys-Phe-D-Trp-L ys-Thr-Cys]-Thr-ol。除臨床上用于癌癥手術(shù)后患者的康復(fù)及抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移外，奧曲肽對 于研發(fā)針對類癌瘤及小細(xì)胞肺癌的靶向抗癌制劑也具有重要作用16—18。將奧曲肽氨基酸序 列中的3位苯丙氨酸(Phe3)用酪氨酸(Tyr)取代后得到奧曲肽_Tyr3(Tyr3-0Ctreotide)， 除保持奧曲肽的生物活性及靶向性外，其序列中的Tyr3易于進行放射性1311標(biāo)記，在腫瘤放 射性治療中具有重要用途19。
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種同時具備優(yōu)異抗癌活性與癌細(xì)胞 選擇性，以及具有良好水溶性的紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物。 本發(fā)明的另一目的在于提供上述紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物在制備藥物 方面的應(yīng)用。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案 本發(fā)明公開了一種紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物，所述紫杉醇或多西紫杉醇 在2'位羥基通過連接序列與多肽的氨基相連。
所述連接序列為-C0-CH2- (X) n_CH2-C0-; 其中，X為0 (CH2CH20CH2CH2CH2NHC0CH2_) 2， -CO-， _0_， _S_， _CH2-， _CHCH3-或_C (CH3) 2- ;n為O或1。 所述多肽為奧曲肽或者奧曲肽的3位苯丙氨酸(Phe3)用酪氨酸(Tyr)取代后得 到奧曲肽-Tyr3。 所述紫杉醇或多西紫杉醇在2'位羥基通過連接序列與奧曲肽或奧曲肽-Tyr3的 N-端氨基和/或5位賴氨酸(Lys5)側(cè)鏈的e -氨基相連接。 本發(fā)明還公開了上述紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物的制備方法，所述方法包 括 將紫杉醇或多西紫杉醇與連接劑反應(yīng)得到2'位羥基上連接有連接序 列-C0-CH2- (X)n-CH2-C0-0H的紫杉醇-Linker中間體或多西紫杉醇-Linker中間體，其中X 為0(CH2CH20CH2CH2CH2NHC0CH2_)2， _C0_， _0_， _S_， _CH2-， _CHCH3-或_C(CH3)2-， n為0或1 ;
將紫杉醇-Linker中間體或多西紫杉醇-Linker中間體通過固相或液相合成方法
6與多肽的氨基相連。 本發(fā)明還公開了上述紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物在制備用于預(yù)防和/或 治療腫瘤的藥物方面的應(yīng)用。
由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于 本發(fā)明所合成制備的紫杉醇、多西紫杉醇的多肽偶合物，特別是相應(yīng)的奧曲肽/ 奧曲肽-TyP偶合物，由于其中具高效細(xì)胞毒性的紫杉醇及多西紫杉醇與可識別癌細(xì)胞表 面受體的靶向多肽奧曲肽及奧曲肽-TyP相互連接后揚長避短，優(yōu)勢互補，顯示了良好的細(xì) 胞選擇性及水溶性，具有優(yōu)于母體藥物紫杉醇及多西紫杉醇的抗癌活性。偶合物可顯著增 強對癌細(xì)胞的選擇性，避免或減少在正常細(xì)胞及組織中的分布，在明顯提高生物利用度的 同時，通過克服紫杉醇及多西紫杉醇細(xì)胞選擇性差的弱點，有效降低母體抗癌藥在體內(nèi)產(chǎn) 生的毒副作用。此外，奧曲肽及奧曲肽-Tyr3特有的高親水性，可使偶合物具有良好的水溶 性，為劑型制備及給藥方式的選擇提供方便。而通過一分子靶向多肽與兩分子紫杉醇或多 西紫杉醇相連而制備的雙紫杉醇-奧曲肽偶合物、雙多西紫杉醇-奧曲肽偶合物、雙紫杉 醇_奧曲肽-Tyr3偶合物及雙多西紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物，有利于增加腫瘤部位紫杉 醇的濃度，更有效地提高抗癌效率。本發(fā)明的偶合物在新型高效低毒分子靶向抗癌藥物研 發(fā)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景。
具體實施例方式
本發(fā)明公開了系列雙紫杉醇-奧曲肽偶合物、雙多西紫杉醇-奧曲肽偶合物、雙紫
杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物及雙多西紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及它們的合
成制備方法。所涉及的系列偶合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如通式I所示。
通式I 通式I中，&可以是C6H5_或(CH3) 3C0_ ;
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R2可以是CH3-C0-或H-;R3可以是H-(Phe)或H0-(Tyr); X可以是0 (CH2CH20CH2CH2CH2NHC0CH2_) 2， _C0_， _0_， _S_， _CH2-， _CHCH3-或_C (CH3) 2- ;n可以是0或1。 具體地，本發(fā)明的偶合物是紫杉醇的2—位羥基及多西紫杉醇的2—位羥基分別與 不同類型的連接劑反應(yīng)而形成的紫杉醇-Linker中間體及多西紫杉醇-Linker中間體(通 式11)，紫杉醇-Linker中間體(通式11中& = C6H5- ;R2 = CH3C0_)通過連接橋-C0_CH2- (X) n-CH廠CO-與奧曲肽的N-端氨基及其氨基酸序列中5位賴氨酸(Lys5)側(cè)鏈的e -氨基相連 接而得到雙紫杉醇-奧曲肽偶合物(通式I中1 3 = !1-);與奧曲肽-TyP的N-端氨基及其 氨基酸序列中5位賴氨酸(Lys5)側(cè)鏈的e -氨基相連接而得到雙紫杉醇-奧曲肽-171~3偶 合物(通式I中R3 = HO-);多西紫杉醇-Linker中間體(通式II中& = (CH3)3CO_ ;R2 = H-)通過連接橋-CO-CH2- (X) n_CH2-CO-與奧曲肽的N-端氨基及其氨基酸序列中5位賴氨酸 (Lys5)側(cè)鏈的e -氨基相連接而得到雙多西紫杉醇_奧曲肽偶合物(通式I中R3 = H-); 與奧曲肽-Tyr3的N-端氨基及其氨基酸序列中5位賴氨酸(Lys5)側(cè)鏈的e -氨基相連接 而得到雙多西紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物(通式I中R3 = HO-)。
通式II 本發(fā)明方法中，可以選用多種類型的連接劑。所選擇的連接劑需滿足的條件為能 與紫杉醇及多西紫杉醇的的2—位羥基反應(yīng)生成通式II所表示的產(chǎn)物?？捎糜诒景l(fā)明的連 接劑如二羥乙酸酐、丁二酸酐、戊二酸酐、3-羰基戊二酸酐、3_甲基戊二酸酐、3，3' -二甲
基戊二酸酐等。紫杉醇或多西紫杉醇與連接劑反應(yīng)時，對于不同的連接劑，連接反應(yīng)的條件 基本相同，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)連接劑的不同適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)條件并得到所需產(chǎn)物。
以上通式I也可以表示為如下
雙紫杉醇_奧曲肽偶合物
Paclitaxel-2'-OCOCH2(X)nCH2CO-D-Phe-C^-Phe-D-Trp-Lys[-COCH2(X)nCH2COO-2'-PaclitaxeI]-Thr-C^s-Threoninol
雙紫杉醇-奧曲肽-Tyr3偶合物
Paclitaxel"2'-OCOCH2(X)nCH2CO-D-Phe-C^-Tyr-D-Trp-Lys[-COCH2(X)nCH2COO-2'-Paclitaxel]-Tlir-C*s-Threoninol
雙多西紫杉醇_奧曲肽偶合物<formula>formula see original document page 9</formula> 雙多西紫杉醇-奧曲肽-Tyr3偶合物
<formula>formula see original document page 9</formula>
本發(fā)明創(chuàng)建了固相與液相化學(xué)合成技術(shù)相結(jié)合進行分步相連的方法，用不同類型 的連接劑與紫杉醇或多西紫杉醇的2'位羥基相連而得到紫杉醇-Linker中間體及多西紫 杉醇-Linker中間體后，再分別與連接于固相合成樹脂、側(cè)鏈保護但N_端氨基游離的奧曲 肽或奧曲肽-Tyr3的N-端氨基通過固相合成方法相連，得到紫杉醇_奧曲肽偶合物、紫杉 醇_奧曲肽-Tyr3偶合物、多西紫杉醇_奧曲肽偶合物或多西紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合 物；；再用液相合成方法將紫杉醇-Linker或多西紫杉醇-Linker與從固相合成樹脂上切 下的紫杉醇_奧曲肽偶合物、紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物、多西紫杉醇_奧曲肽偶合物或 多西紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物的氨基酸序列中5位賴氨酸(Lys5)側(cè)鏈的e -氨基相 連而合成制備系列雙紫杉醇_奧曲肽偶合物、雙紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物、雙多西紫杉 醇_奧曲肽偶合物及雙多西紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物。具體步驟為
(1)將通式II表示的紫杉醇-Linker中間體及多西紫杉醇-Linker中間體分別與 與連接在固相合成樹脂上的奧曲肽衍生物及奧曲肽-Tyr3衍生物的N-端氨基通過固相合 成方法相連接，從而分別得到與樹脂相連的紫杉醇_奧曲肽偶合物衍生物、多西紫杉醇_奧 曲肽偶合物衍生物、紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物衍生物及多西紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合 物衍生物； (2)將上述衍生物分別從樹脂上切下，經(jīng)純化后得到通式III表示的紫杉醇-奧曲 肽偶合物、多西紫杉醇_奧曲肽偶合物、紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物及多西紫杉醇_奧曲 肽-Tyr3偶合物； (3)將通式II表示的紫杉醇-Linker中間體、多西紫杉醇-Linker中間體在液相 合成條件下分別與通式III表示的紫杉醇-奧曲肽偶合物、多西紫杉醇-奧曲肽偶合物、 紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物及多西紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物中多肽氨基酸序列中5 位賴氨酸(Lys5)側(cè)鏈的e-氨基相連接，從而得到通式I所表示的雙紫杉醇-奧曲肽偶合 物、雙多西紫杉醇_奧曲肽偶合物、雙紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物及雙多西紫杉醇_奧曲 肽-Tyr3偶合物。
通式III 通式II和通式III中，&可以是C6H5_或(CH3)3C-0- ;R2可以是CH3_C0_或H_ ;X 可以是0(CH2CH20CH2CH2CH2NHC0CH2-)2， _C0_， _0_， _S_， _CH2-， _CHCH3-或_C(CH3)2- ;n可以 是O或l。 發(fā)明中同時創(chuàng)建了采用液相化學(xué)合成進行同步相連的方法，將紫杉醇(多西紫杉 醇)-Linker中間體在液相合成條件下，與奧曲肽和奧曲肽_Tyr3的N_端氨基及它們氨基 酸序列中的5位賴氨酸側(cè)鏈的e-氨基同時連接，從而合成制備系列雙紫杉醇(多西紫杉 醇)_奧曲肽偶合物及雙紫杉醇(多西紫杉醇)_奧曲肽-Tyr3偶合物。具體步驟為
將通式11表示的紫杉醇-Linker或多西紫杉醇-Linker中間體分別與奧曲 肽及奧曲肽-Tyr3在液相合成條件下反應(yīng)，使紫杉醇/多西紫杉醇的2—-羥基通過連接 橋-C0-CH2- (X) n_CH2-C0-與奧曲肽及奧曲肽-Tyr3的N_端氨基及它們的氨基酸序列中5位 賴氨酸(Lys5)側(cè)鏈的e -氨基同時相連，產(chǎn)物經(jīng)高效液相儀(HPLC)分離純化后，得到通式I 所表示的雙紫杉醇_奧曲肽偶合物及雙紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物或雙多西紫杉醇_奧 曲肽偶合物及雙多西紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物。 本發(fā)明的系列偶合物將兩分子紫杉醇或多西紫杉醇與奧曲肽及奧曲肽-Tyr3中的 N-端氨基及它們氨基酸序列中5位賴氨酸(Lys5)側(cè)鏈的e -氨基相互連接而合成制備的 系列雙紫杉醇_奧曲肽偶合物、雙多西紫杉醇_奧曲肽偶合物、雙紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶 合物及雙多西紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物，可使具有高效細(xì)胞毒性的紫杉醇及多西紫杉 醇與可識別癌細(xì)胞表面受體，具有良好水溶性奧曲肽及奧曲肽-Tyr3相互揚長避短，優(yōu)勢互 補。在保持紫杉醇及多西紫杉醇抗癌活性的同時，借助奧曲肽及TyP-奧曲肽的靶向功能， 偶合物可顯著增強對癌細(xì)胞的選擇性，避免或減少在正常細(xì)胞及組織中的分布，在明顯提 高生物利用度的同時，通過克服紫杉醇及多西紫杉醇細(xì)胞選擇性差的弱點，有效降低母體 抗癌藥在體內(nèi)產(chǎn)生的毒副作用。此外，奧曲肽及奧曲肽-Ty一特有的高親水性，可使偶合物 具有良好的水溶性，為劑型制備及給藥方式的選擇提供方便。而通過一分子靶向多肽與兩 分子紫杉醇或多西紫杉醇相連而制備的雙紫杉醇_奧曲肽偶合物、雙多西紫杉醇_奧曲肽 偶合物、雙紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物及雙多西紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物，有利于增 加腫瘤部位紫杉醇或多西紫杉醇的濃度，更有效地提高抗癌效率。本發(fā)明涉及的系列偶合物在新型高效低毒抗分子耙向癌藥物研發(fā)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景。 本發(fā)明通過以下實施例對各中間體及偶合物的合成制備方法進行描述。實施例不 限制本發(fā)明，本發(fā)明的保護范圍由權(quán)利要求限定。
實施例1 :紫杉醇-2' _ 二羥乙酸酯的合成 紫杉醇(0. 854g， 1. 00,1)溶于無水四氫呋喃(10ml)，加入無水砒啶(0. 5ml)， 二羥乙酸酐(Diglycolic anhydride,0. 139g， 1. 20mmol)，于(TC攪拌24小時后加入乙酸 乙酯(100ml)，并用鹽酸(1.0M)調(diào)至pH 3-4。乙酸乙酯液依次用水(30mlx3)，飽和食鹽水 (20mlx2)萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓回收乙酸乙酯。所得殘余物用丙酮_乙醚重結(jié) 晶，得紫杉醇-2' _二羥乙酸酯純品0.8018，收率82.6%。 ESI-MS :971. 3[M+H] + (分子量 969. 99)。 實施例2 :多西紫杉醇-2' - 丁二酸酯的合成 多西紫杉醇(0. 808g， 1. OOmmol)溶于無水四氫呋喃(8ml)，加入無水砒啶 (0. 5ml) ， 丁二酸酐(Succinic anhydride, 0. 121g， 1. 20,1)，于(TC攪拌16小時后加入乙 酸乙酯(80ml)，并用鹽酸(l.OM)調(diào)至pH 3-4。乙酸乙酯液依次用水(30mlx3)，飽和食鹽 水(20mlx2)萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓回收乙酸乙酯。所得殘余物用丙酮-乙醚 重結(jié)晶，得多西紫杉醇_2， _ 丁二酸酯純品0. 728g，收率80. 1%。 ESI-MS :909. 2[M+H] + (分 子量907. 96)。 實施例3 :紫杉醇-2' - 二羥乙酰_奧曲肽-Tyr3偶合物的合成
將與固相合成樹脂相連，已形成分子內(nèi)二硫鍵，側(cè)鏈保護但N-端氨基游離的奧曲 肽-TyP-樹脂(含奧曲肽-Tyr3 0. lOmmol)置于固相合成反應(yīng)器中，用無水二氯甲烷浸洗 后抽去溶劑并通人干燥氮氣。將紫杉醇-2' - 二羥乙酸酯(0. 243g，0. 25mmol)溶于無水二 氯甲烷(10ml)，加入PyBop(O. 156g，0. 30mmol) ， N， N-二異丙基乙胺(0.039g，0. 30,1)并 攪拌IO分鐘后，滴入上述固相合成反應(yīng)器中并用干燥氮氣進行攪拌。1小時后將溶劑抽干， 依次用二甲基甲酰胺(x6)，二氯甲烷(x5)及乙醚(x3)洗滌樹脂并抽干。將干燥的樹脂加 入三氟乙酸/二氯甲烷(V : V=l : 5，20ml)溶液中，攪拌l小時后過濾，樹脂用二氯甲 烷(5mlx3)洗滌并過濾。濾液合并后減壓抽干，殘余物用乙醚洗滌(x3)，抽濾收集乙醚不溶 的固體，干燥后得紫杉醇_2' _ 二羥乙酰_奧曲肽-Tyr3偶合物粗品0. 192g，收率96. 6%。 ESI-MS :1988. 6[M+H] + (分子量1987. 22)。 實施例4 :多西紫杉醇-2' - 丁二酰-奧曲肽偶合物的合成 將與固相合成樹脂相連，已形成分子內(nèi)二硫鍵，側(cè)鏈保護但N-端氨基游離的奧曲 肽樹脂(含奧曲肽O. lOmmol)置于固相合成反應(yīng)器中，用無水二氯甲烷浸洗后抽去溶劑 并通人干燥氮氣。將多西紫杉醇-2' -丁二酸酯(0.227g，0.25mmo1)溶于無水二氯甲烷 (10ml)，加入PyBop(O. 156g，0. 30mmol) ， N， N_ 二異丙基乙胺(0. 039g，0. 30mmol)并攪拌 IO分鐘后，滴入上述固相合成反應(yīng)器中并用干燥氮氣進行攪拌。1小時后將溶劑抽干，依 次用二甲基甲酰胺(x6)，二氯甲烷(x5)及乙醚(x3)洗滌樹脂并抽干。將干燥的樹脂加入 三氟乙酸/二氯甲烷(V : V=l : 5，20ml)溶液中，攪拌l小時后過濾，樹脂用二氯甲烷 (5mlx3)洗滌并過濾。濾液合并后減壓抽干，殘余物用乙醚洗滌(x3)，抽濾收集乙醚不溶的 固體，干燥后得多西紫杉醇_2'_ 丁二酰_奧曲肽偶合物粗品0. 182g，收率95.3%。 ESI-MS : 1910. 6[M+H] + (分子量1909. 19)。
實施例5 :雙(紫杉醇-2' - 二羥乙酰)_奧曲肽-Tyr3偶合物的合成
紫杉醇-2'- 二羥乙酰_奧曲肽-Tyr3粗品0. 159g(0. 08mmol)加入無水二甲基甲 酰胺(5ml)。將紫杉醇-2'-二羥乙酸酯(0. 088g，0. 09mmol)溶于無水二氯甲烷(6ml)，加入 PyBop(O. 052g，0. lOmmol) ，N，N-二異丙基乙胺(0. 013g，0. lOmmol)攪拌IO分鐘后滴入上述 溶液。反應(yīng)液攪拌1小時后減壓抽去二氯甲烷，殘余物滴入冰水(60ml)中，抽濾收集水中析 出的固體并用蒸餾水洗滌(x3)。所得固體用甲醇-乙酸乙酯重結(jié)晶，得雙(紫杉醇-2'-二 羥乙酰)_奧曲肽-Tyr3偶合物純品0. 218g，收率92. 6%。 ESI-MS :2940. 6[M+H] + (分子量 麗.2939. 20)。 實施例6 :雙(多西紫杉醇_2' - 丁二酰)-奧曲肽偶合物的合成
多西紫杉醇-2' -丁二酰-奧曲肽粗品0. 153g(0.08mmo1)加入無水二甲基甲酰 胺(5ml)。將多西紫杉醇-2' -丁二酸酯(0.082g，0.09mmo1)溶于無水二氯甲烷(6ml)，加 入PyBop (0. 052g， 0. lOmmol) ， N， N- 二異丙基乙胺(0. 013g， 0. lOmmol)攪拌10分鐘后滴入 上述溶液。反應(yīng)液攪拌1小時后減壓抽去二氯甲烷，殘余物滴入冰水(60ml)中，抽濾收集 水中析出的固體并用蒸餾水洗滌(x3)。所得固體用甲醇-乙酸乙酯重結(jié)晶，得雙(多西紫 杉醇_2' _ 丁二酰)_奧曲肽偶合物純品0. 204g，收率91. 1%。 ESI-MS :2800. 6[M+H] + (分 子量麗.2799. 14)。 實施例7 :液相法合成雙(紫杉醇-2' - 二羥乙酰)_奧曲肽-Tyr3偶合物
紫杉醇-2' -二羥乙酸酯(0. 214g，0. 22mmo1)溶于無水二甲基甲酰胺或無水二 氯甲烷(8ml)，加入PyBop (0. 156g， 0. 30mmo1) ， N， N- 二異丙基乙胺(0. 039g， 0. 3mmo1)， 攪拌10分鐘后將反應(yīng)液加入冷至0。C的奧曲肽-Tyr3(0. 104g，0. lOmmol)的無水二甲基 甲酰胺(10ml)溶液中。在0t:攪拌3小時后，將反應(yīng)液滴入冰水(100ml)中，抽濾收集 水中析出的固體并用蒸餾水洗滌(x3)。所得固體用高效液相儀(HPLC)分離純化后得 雙(紫杉醇-2' -二羥乙酰)-奧曲肽-171~3偶合物純品0. 196g，收率66.6X。 ESI-MS : 2940. 6[M+H] + (分子量麗.2939. 20)。 實施例8 :液相法合成雙(多西紫杉醇_2' - 丁二酰)_奧曲肽偶合物
多西紫杉醇-2' -丁二酸酯(0. 200g，0. 22mmo1)溶于無水二甲基甲酰胺無水二 氯甲烷(8ml)，加入PyBop(0. 156g，0. 30,1)， N， N-二異丙基乙胺(0.039g，0. 3mmol)，攪 拌10分鐘后將反應(yīng)液加入冷至0t:的奧曲肽(0. 102g，0. lOmmol)的無水二甲基甲酰胺 (10ml)溶液中。在0t:攪拌3小時后，將反應(yīng)液滴入冰水(100ml)中，抽濾收集水中析出 的固體并用蒸餾水洗滌(x3)。所得固體用高效液相儀(HPLC)分離純化后得雙(多西紫杉 醇-2' - 丁二酰)_奧曲肽偶合物純品0. 186g，收率66. 4%。 ESI-MS :2800. 6[M+H] + (分子 量孤2799. 14)。 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護范圍。
權(quán)利要求
一種紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物，其特征在于所述紫杉醇或多西紫杉醇在2’位羥基通過連接序列與多肽的氨基相連。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物，其特征在于所述連接序列為_C0-CH2-(X)n-CH2-C0-;其中，X為0(CH2CH20CH2CH2CH2NHC0CH2-)2， _C0_， _0_， _S_， _CH2-， _CHCH3-或_C(CH3)2-; n為0或1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物，其特征在于 所述多肽為奧曲肽或者奧曲肽的3位苯丙氨酸(Phe3)用酪氨酸(Tyr)取代后得到奧曲 肽-Tyr3。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物，其特征在于所述 紫杉醇或多西紫杉醇在2'位羥基通過連接序列與奧曲肽或奧曲肽-Tyr3的N_端氨基和/ 或5位賴氨酸(Lys5)側(cè)鏈的e -氨基相連接。
5. 權(quán)利要求1 4任意一項所述的紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物的制備方法，所 述方法包括將紫杉醇或多西紫杉醇與連接劑反應(yīng)得到2'位羥基上連接有連接序列-C0-CH2-(X) n-CH2-C0-0H的紫杉醇-Linker中間體或多西紫杉醇-Linker中間體，其中X為0(CH2CH20C H2CH2CH2NHC0CH2-)2， _C0_， _0_， _S_， _CH2-， _CHCH3-或_C(CH3)2-， n為0或1 ;將紫杉醇-Linker中間體或多西紫杉醇-Linker中間體通過固相或液相合成方法與多 肽的氨基相連。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述多肽為奧曲肽或者奧曲肽的3 位苯丙氨酸(Phe3)用酪氨酸(Tyr)取代后得到奧曲肽_Tyr3，并且所述方法進一步包括步 驟將紫杉醇-Linker中間體或多西紫杉醇-Linker中間體與連接于固相合成樹脂、側(cè)鏈 保護但N-端氨基游離的奧曲肽或奧曲肽-Tyr3通過固相合成方法進行連接反應(yīng)，制備得到 紫杉醇-Linker連接于肽鏈N_端氨基的紫杉醇_奧曲肽偶合物或紫杉醇_奧曲肽_Tyr3偶 合物，或多西紫杉醇-Linker連接于肽鏈N_端氨基的多西紫杉醇_奧曲肽偶合物或多西紫 杉醇-奧曲肽-Tyr3偶合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述固相合成反應(yīng)具體是指， 將與固相合成樹脂相連，已形成分子內(nèi)二硫鍵，側(cè)鏈保護但N-端氨基游離的奧曲肽_樹脂或奧曲肽_Tyr3-樹脂置于固相合成反應(yīng)器中；將紫杉醇-Linker中間體或多西紫杉醇-Linker中間體溶于有機溶劑，并按1 : 1 1. 5的摩爾比分別加入PyBop及有機溶劑后滴入固相合成反應(yīng)器中，并用干燥氮氣進行攪 拌；洗滌樹脂并收集產(chǎn)物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于所述方法進一步包括步驟 將制備得到、并從固相合成樹脂上分離的偶合物進一步與紫杉醇-Linker中間體或多西紫杉醇-Linker中間體在液相合成條件下進行連接反應(yīng)，制備得到奧曲肽/奧曲肽_Tyr3 的N-端氨基與5位賴氨酸(Lys5)側(cè)鏈的e -氨基分別連接有紫杉醇-Linker的雙紫杉 醇_奧曲肽偶合物、雙紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物；或奧曲肽/奧曲肽-Tyr3的N_端氨基與5位賴氨酸(Lys5)側(cè)鏈的e -氨基分別連接有多西紫杉醇-Linker的雙多西紫杉醇_奧 曲肽偶合物或雙多西紫杉醇_奧曲肽-Tyr3偶合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述在液相合成條件下進行反應(yīng)是指，將制備得到、并從固相合成樹脂上分離的偶合物溶于無水二甲基甲酰胺； 將紫杉醇-Linker中間體或多西紫杉醇-Linker中間體溶于有機溶劑，并按1 : 1 1. 5的摩爾比分別加入PyBop及有機溶劑后滴入上述偶合物的有機溶劑溶液； 充分反應(yīng)后收集產(chǎn)物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述多肽為奧曲肽或者奧曲肽的3 位苯丙氨酸(Phe3)用酪氨酸(Tyr)取代后得到奧曲肽_Tyr3，并且所述方法進一步包括步 驟將紫杉醇-Linker中間體或多西紫杉醇-Linker中間體與奧曲肽或奧曲肽_Tyr3在液 相合成條件下反應(yīng)，制備得到奧曲肽/奧曲肽-Tyr3的N-端氨基與5位賴氨酸(Lys5)側(cè)鏈 的e -氨基分別連接有紫杉醇-Linker或多西紫杉醇-Linker的雙紫杉醇_奧曲肽/奧曲 肽-Tyr3偶合物或雙多西紫杉醇_奧曲肽/奧曲肽-Tyr3偶合物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于所述在液相合成條件下反應(yīng)是指， 將紫杉醇-Linker中間體或多西紫杉醇-Linker中間體溶于有機溶劑并按1 : 1 1. 5的摩爾比分別加入PyBop及N，N-二異丙基乙胺后滴入奧曲肽或奧曲肽-Tyr3的無水二 甲基甲酰胺溶液中，反應(yīng)后分離純化所得產(chǎn)物。
12. 權(quán)利要求1 4任意一項所述的紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物在制備用于預(yù) 防和/或治療腫瘤的藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了系列紫杉醇或多西紫杉醇的多肽偶合物，所述紫杉醇或多西紫杉醇在2′位羥基通過不同連接序列與多肽的氨基相連。本發(fā)明還公開了所述偶合物的制備方法及在制備藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明的偶合物具備優(yōu)異抗癌活性與癌細(xì)胞選擇性，以及具有良好水溶性。
文檔編號C07K7/00GK101724021SQ20081021642
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日
發(fā)明者傅雪琦, 王樸 申請人:江蘇天一時制藥有限公司