專利名稱：一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多西紫杉醇衍生物的合成方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術(shù)：
自從上個世紀70年代紫杉醇被人類發(fā)現(xiàn)以來，從各紅豆杉屬植物中發(fā)現(xiàn)了近400 余種天然的紫杉烷類化合物，此外通過人工結(jié)構(gòu)修飾的方法，更是獲得了數(shù)以千計的衍生 物。然而不論是天然的，還是人工合成的，這些同屬紫杉烷類的化合物在抗腫瘤活性研究中 卻表現(xiàn)出了巨大的差異。迄今為止，真正用于臨床的只有天然的紫杉醇和后天獲得的多西 紫杉醇兩種，而紫杉醇更有被多西紫杉醇取而代之的趨勢。紫杉烷類化合物在抗腫瘤活性上的差異，歸根結(jié)底在于其化學結(jié)構(gòu)上的不同。無 數(shù)的科研工作者在對眾多紫杉烷類化合物進行研究后歸納總結(jié)出了紫杉烷類化合物的結(jié) 構(gòu)與抗腫瘤活性之間的關(guān)系，即“構(gòu)效關(guān)系”。從紫杉烷類化合物的構(gòu)效關(guān)系上可以看出， 10-脫乙?；涂ㄍつ负撕捅交惤z氨酸側(cè)鏈是生物活性不可或缺的兩部分，在這兩部分 上，分別又有一些必須的官能團，如母核C2位的苯甲?；?，C4-5位的環(huán)氧丙烷，側(cè)鏈上的 C2’位的羥基和C3’位的酰胺基等等。仔細觀察已經(jīng)上市的或進入臨床研究的紫杉醇衍生物，我們不難發(fā)現(xiàn)側(cè)鏈是對活 性有著巨大影響的敏感區(qū)域，而C3’-氨基更是擁有巨大結(jié)構(gòu)修飾自由度的部位。在這個部 位上進行修飾最為成功的例子無疑就是多西紫杉醇。在多西紫杉醇的結(jié)構(gòu)中，C3’-氨基上 的叔丁氧羰基取代了紫杉醇結(jié)構(gòu)中的苯甲?；?。此外，兩者的不同之處還在于紫杉醇母核 C10位的乙酰氧基被多西紫杉醇中的羥基所取代。這些結(jié)論充分表明在多西紫杉醇的基礎(chǔ)上，對C3’ _氨基上進行結(jié)構(gòu)修飾尤其是 保留酰胺基的紫杉醇衍生物，是一類非常有希望獲得具有進一步開發(fā)成新藥的化合物。在 緒論部分我們就已經(jīng)介紹了天然含硫有機物是一類生物活性非常明顯的化合物，尤其是存 在于十字花科植物中的二硫雜環(huán)類物質(zhì)，在抗癌和化療保護方面更是倍受關(guān)注。另一方面， 通過文獻調(diào)研可知，迄今為止還沒有發(fā)現(xiàn)將二硫雜環(huán)用于修飾紫杉醇類化合物的報道。因 此，本發(fā)明根據(jù)紫杉醇的構(gòu)效關(guān)系進行分析，確定了對側(cè)鏈C3’ -氨基進行修飾，并設計了 一系列側(cè)鏈含有二硫雜環(huán)的多西紫杉醇類化合物。在眾多具有生物活性的天然化合物中，含硫的一類化合物具有鮮明的生物活性。 例如，大蒜中的有機硫化合物(包括甲基烯丙基硫、二烯丙基三硫、二烯丙基四硫、二烯丙 基硫代硫酸酯等)具有抗誘變及抗癌活性；二烯丙基三硫又名大蒜素，研究發(fā)現(xiàn)大蒜素具 有抗腫瘤作用，如可能改變調(diào)節(jié)致癌活性有關(guān)的酶活性，參與提高腫瘤患者的免疫功能，阻 滯細胞周期，介導細胞凋亡和分化等。西蘭花中含有的硫代葡萄糖苷可阻礙早期癌細胞的 生長，并有助于加強人體對癌細胞的抵抗能力，降低患癌癥的危險。結(jié)論表明，這些有機硫 化物可阻滯細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制DNA加合物的形成以清除自由基、調(diào)整P-糖 蛋白引起的多耐藥性等。
沈立等人曾將大蒜素與紫杉醇聯(lián)合使用，并研究了其對人肺癌A549細胞抗腫瘤 活性。結(jié)果表明大蒜素與紫杉醇聯(lián)合使用具有協(xié)同抗腫瘤作用。因此，我們設想在保持多 西紫杉醇C3’酰氨基的前提下，將含二硫雜環(huán)基團引入到多西紫杉醇的C3’_氨基上來完成 對多西紫杉醇的結(jié)構(gòu)修飾。設計并合成新的硫代的多西紫杉醇衍生物，并進一步研究這些 衍生物對多種癌細胞株的抗腫瘤活性及其毒測試，以期找到活性更好毒性更低的紫杉醇類 抗腫瘤藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法以及衍生物在抗腫 瘤方面的應用。一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法以及衍生物在抗腫瘤方面的應用，其主要特 征在于以3 _ 二羰基化合物為初始底物，通過與二硫化碳反應，形成雙硫鍵，再與二溴化 物發(fā)生反應生成二硫雜環(huán)中間體I，再將中間體II與取代苯甲醛通過發(fā)生Knoevenagel反 應在二硫雜環(huán)的a位形成雙鍵，同時在堿性條件下，將二硫雜環(huán)中的酯基水解成羧基，再 將羧基與保護后的多西紫杉醇的側(cè)鏈上的氨基或羥基進行縮合反應，最后將多西紫杉醇母 核上的保護基脫除后得到最終的多西紫杉醇的新衍生物，將得到的衍生物進行體外細胞毒 性試驗以及體內(nèi)的移植性S180肉瘤的抑制作用試驗。本發(fā)明所述的二羰基化合物，主要包括含有酯基的乙酰乙酸乙酯，乙酰乙酸 甲酯等。本發(fā)明中二硫雜環(huán)中間體I的合成，按照如下步驟進行將lOmmol 0 - 二羰基化 合物溶于5mL DMF中，加入3g無水碳酸鉀，于室溫下攪拌，目的是拔除分子中活性亞甲基上 的氫，形成C負電荷，在與llmmol 二硫化碳于冰浴下反應形成二硫鍵，攪拌lh后滴加二溴 化物于室溫下攪拌12h后，將反應體系傾倒入冰水中，析出白色固體，抽濾洗滌干燥得到中 間體I。其中所用的二溴化物主要包括1，2-二溴乙烷、1，3-二溴丙烷、1，-二溴丙烷、1， 2-二溴丁烷、1，3-二溴丁烷等。本發(fā)明中中間體II和III的合成，按照如下步驟進行將lmmol中間體I溶解于2mL 乙醇與lmL水的混合溶劑中，加入1. lmmol取代苯甲醛，攪拌下加入2mmol固體堿，于室溫 下攪拌24h，將反應體系倒入冰水中，用稀鹽酸酸化至pH為1 2，析出微黃色固體，抽濾洗 滌干燥得到中間體III。其中取代苯甲醛主要包括含有吸電子取代基的苯甲醛，如對硝基苯 甲醛、對氟苯甲醛、間硝基苯甲醛、鄰硝基苯甲醛等；含有給電子取代基的苯甲醛，如對甲基 苯甲醛、對甲氧基苯甲醛、3，4_ 二甲氧基苯甲醛，3，4，5-三甲氧基苯甲醛等。其中所用到的 固體堿包括氫氧化鈉和氫氧化鉀等。本發(fā)明中中間體IV的合成，按照如下步驟進行將0. lmmol含有游離氨基的多西 紫杉醇底物溶解于二氯甲烷中，加入0. 002g DMAP，二倍量的縮合劑，以及0. 15mmol中間體 III于冰鹽浴中反應，隨后升溫至室溫，攪拌7h，常規(guī)方法處理后進行柱層析，洗脫劑用(石 油醚/乙醚/甲醇，10/10/1)，(石油醚/乙醚/甲醇，8/8/1)，洗脫除去雜質(zhì)，再用(石油 醚/乙醚/甲醇，5/5/1)洗脫得產(chǎn)物中間體IV。其中所用的縮合劑包括N’ N-二環(huán)己基碳 二亞胺，N’ N- 二異丙基碳二亞胺等。本發(fā)明中最終產(chǎn)物的合成，按照如下步驟進行將0. lmmol中間體IV溶于lmL甲醇，攪拌溶解后，加入0. lmL冰乙酸，0. lg Zn粉，于50°C水浴下攪拌3h。反應結(jié)束后，過濾 除去固形物，用甲醇洗滌固形物幾次，將濾液減壓除去溶劑得黃色油狀物。加水稀釋后，用 飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)PH為弱堿性，用二氯甲烷萃取，有機相合并后用水反萃一次，有機相 干燥后，進行硅膠柱層析洗脫劑為(CH2C12/甲醇，80/3)，洗脫得產(chǎn)物。上述合成得到的多西紫杉醇衍生物體外對人乳腺癌細胞MCF-7，人結(jié)腸癌細胞 HT-29，人前列腺癌細胞PC-3，人肺癌細胞A549的增值具有明顯的抑制作用；體內(nèi)表現(xiàn)為較 低的毒性，小鼠LD50為40mg/kg，對小鼠移植性腫瘤S-180的生長有明顯的抑瘤作用，因此 可用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明的衍生物可以純化的形式與藥學上適當?shù)妮d體一起被使用?？芍瞥傻乃幬?劑型包括片劑、膠囊、外用搽劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、軟膏劑、口服液、或針劑，還可 以采用現(xiàn)代制藥界所公認的控釋或緩釋劑型。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明合成的衍生物為未見文獻報道過的新化合物2.本發(fā)明合成的新衍生物首次將二硫雜環(huán)引入到多西紫杉醇的結(jié)構(gòu)中。3.該合成方法簡單易行。4.本發(fā)明中的多西紫杉醇衍生物具有很好的抗腫瘤活性，且具有低毒不易產(chǎn)生耐 藥性的特點。
具體實施方案制備實施例1中間體I的合成 向盛有5mLDMF的圓底燒瓶中加入無水碳酸鉀(22mmol，3g)，攪拌5min后，加入 乙酰乙酸乙酯(lOmmol，1. 25mL)，常溫下攪拌30min，然后在冰水浴下攪拌5min后，向反應 瓶中加入CS2(llmmol，0. 66mL)，體系顏色變成血紅色，繼續(xù)攪拌lh后，滴加1，2_ 二溴乙 烷(llmmol，0. 95mL)，于30min內(nèi)滴加完畢，繼續(xù)攪拌12h，然后將反應體系傾倒入冰水中， 充分攪拌后，析出大量類白色固體，抽濾，洗滌，干燥后得2. 20g粉白色固體，收率95%。咕 NMR(CDC13，500MHz) 8 :4. 367-4. 325(q，2H)，3. 332(s，4H)，2. 435(s，3H)，1. 389-1. 360 (t, 3H) ；13CNMR(CDC13，500MHz) 8 :194. 19，166. 44, 118. 82,61. 20，17. 87,36. 85,30. 18， 14. 26 ；ESI MS m/z :233 [M+l]+，255 (M+Na)+。制備實施例2中間體III的合成 將底物(lmmol，0. 232g)加入圓底燒瓶中，加入2mL無水乙醇、lmL水，攪拌溶 解后，加入苯甲醛(1. lmmOl，0. llmL)，攪拌下加入氫氧化鈉(2mmol，0. 08g)，于室溫下攪 拌24h，TLC檢測底物消失后，將反應體系倒入水中，滴加稀鹽酸將溶液酸化至pH為1 2，析出大量微黃色固體，充分攪拌后，抽濾，洗滌，干燥后得0. 27g固體，收率95 %。咕 NMR(CDC13，500MHz) 8 12. 552 (br. s，1H)，7. 756and 7. 725 (d，1H)，7. 614-7. 600 (t，2H)， 7. 509and7. 478 (d, 1H), 7. 405and 7. 397 (d，3H)，3. 447 (s，4H) ； 13C 匪R(CDC13，500MHz). 8 188. 71,183. 82，168. 91,143. 31，135. 02，130. 47，128. 95，128. 61,125. 45,117. 31,38. 04， 37. 79 ；ESI MS m/z :293 [M+l]+，315 (M+Na)+。制備實施例3中間體III的合成 將底物(lmmol，0. 246g)加入圓底燒瓶中，加入2mL無水乙醇、lmL水，攪拌溶 解后，加入苯甲醛(1. lmmOl，0. llmL)，攪拌下加入氫氧化鈉(2mmol，0. 08g)，于室溫下攪 拌24h，TLC檢測底物消失后，將反應體系倒入水中，滴加稀鹽酸將溶液酸化至pH為1 2，析出大量微黃色固體，充分攪拌后，抽濾，洗滌，干燥后得0. 28g固體，收率91 %。咕 NMR(CDC13，500MHz) 8 11. 764 (br. s，1H)，7. 71 land 7. 680 (d，1H)，7. 574-7. 561 (t，2H)， 7. 411and7. 408(d，3H)，7. 212—7. 163 (q，1H) ,3. 048and 3. 040(d，4H)，2. 328 (s，2H) ； 13C NMR(CDC13，500MHz) 8 :190.60，143.27，134. 75，130. 64，129. 01,128. 57，126. 22，125. 52， 30. 23,24. 67 ；ESI MS m/z :307 [M+l]+，329 (M+Na)+。制備實施例4中間體IV的合成 將脫保護底物(0. lmmol,0. llg)溶于lmL 二氯甲烷中，加入0. 002g DMAP, DIC (0. 2mmol, 0. 03lmL)，加入二硫雜環(huán)底物(0. 15mmol, 0. 044g)，將反應瓶置于冰鹽浴中(_22°C，后逐漸升高至室溫22°C )，攪拌7h后，將反應體系用水洗滌5次，有機相用 無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸餾除去溶劑得黃色油狀物。進行柱層析洗脫劑用(石油醚 /乙醚/甲醇，10/10/1)，(石油醚/乙醚/甲醇，8/8/1)，洗脫除去雜質(zhì)，再用(石油醚 /乙醚/甲醇，5/5/1)洗脫得產(chǎn)物黃色固體0.071g，收率53%。屮NMR(CDC13，500MHz) 8 8. 170and 8. 151 (d，1H)，8. 118and8. 104 (d，2H)，7. 670and 7. 639 (d，1H)，7. 617and 7. 602 (d, 1H)，7. 529-7. 478 (m, 4H)，7. 353-7. 298 (m, 7H)，7. 285 (s, 2H)，6. 976and 6. 944 (d, 1H)，6. 272-6. 230 (t,2H)，5. 819-5. 795 (q, 1H)，5. 723and 5. 709 (d, 1H)，5. 576-5. 540 (q, 1H) ,5. 306 (s, 1H) ,4. 979and 4. 960 (d，1H)，4. 925and 4. 902 (d，1H)，4. 850and 4. 827 (d, 1H)，4. 763and 4. 739 (d, 1H)，4. 653-4. 630 (q, 1H)，4. 622and 4. 599 (d, 1H)，4. 583and 4. 565 (d, 1H) ,4. 352and 4. 335 (d，1H)，4. 211and 4. 194 (d，1H)，3. 911and 3. 898 (d, 1H), 3. 364-3. 320 (m, 1H)，3. 261-3. 207 (m, 1H)，3. 179-3. 136 (m, 1H)，3. 097-3. 043 (m, 1H)， 2. 646-2. 571 (m, 1H)，2. 541—2. 492 (m, 1H)，2. 441—2. 427 (d, 3H)，2. 374—2. 343 (t, 1H)， 2. 331 (s, 1H)，2. 087-2. 059 (m, 1H)，2. 033—1. 969 (m, 7H)，1. 860 (s,3H)，1. 253 (s,4H)， 1. 203 (s，4H)，1. 188 (s，4H)，0. 891-0. 772 (m，9H) ；ESI MS m/z : 1332 [M+H]+，1354 [M+Na] +。制備實施例5多西紫杉醇衍生物的合成 將底物(0. lmmol,0. 13g)溶于lmL甲醇，攪拌溶解后，加入0. lmL冰乙酸，0. lg Zn粉，于50°C水浴下攪拌3h。反應結(jié)束后，過濾除去固形物，用甲醇洗滌固形物幾次，將 濾液減壓除去溶劑得黃色油狀物。加水稀釋后，用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)PH為弱堿性，用 二氯甲烷萃取，有機相合并后用水反萃一次，有機相干燥后，進行硅膠柱層析洗脫劑為 (CH2C12/甲醇，80/3)，洗脫得產(chǎn)物黃色固體0.050g，收率51%。屯匪1 (0)(13，500MHz) 8 8. 118 (s，2H)，7. 783-7. 764 (m, 1H)，7. 654-7. 621 (m, 2H) ,7. 521 (s,4H)，7. 351-7. 296 (m, 8H)，7. 031-6. 998 (d, 1H)，6. 261 (s，1H)，5. 749and 5. 695 (d, 2H)，5. 216 (s，1H)，4. 966and 4. 951 (d, 1H)，4. 685 (s, 1H)，4. 335 (s，1H)，4. 216(s，3H)，3. 921 (s, 1H)，3. 663 (s，1H)， 3. 295and 3. 285 (d，1H)，3. 202and 3. 191 (d，1H)，3. 017 (s，2H)，2. 594and 2. 583 (d, 1H), 2. 401 (s，4H)，2. 351-2. 328 (m, 1H)，1. 879 (m, 4H)，1. 761 (s，3H)，1. 714and 1. 711 (d, 1H)，1. 603(s，3H)，1. 261 (s，4H)，1. 202 (s，4H)，1. 13(s，4H)，0. 882—0. 779 (m, 3H) ； 13C NMR(CDC13，500MHz) 8 :211.35，184.85，173.82，172. 61,170. 14，166. 91，166. 40，143. 71， 138. 57，138. 19，135. 85，134. 82，133. 74，130. 40，130. 19，129. 13，128. 98，128. 76，128. 69， 128. 21，127. 53，124. 09，122. 51,84. 14,81. 08,78. 68,74. 84,74. 54,73. 88,72. 71,71. 96， 57. 64,55. 73,46. 42,43. 08,37. 96,36. 99,36. 39,35. 91,29. 71,26. 51,22. 66,20. 63， 14. 41，9. 87 ；ESI MS m/z :982[M+H] +。制備實施例6多西紫杉醇衍生物的合成 將底物(0. lmmol,0. 163g)溶于lmL甲醇，攪拌溶解后，加入0. lmL冰乙酸，0. lg Zn粉，于50°C水浴下攪拌3h。反應結(jié)束后，過濾除去固形物，將濾液減壓除去溶劑得微 黃色粘稠狀固體。用二氯甲烷溶解后，用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相干燥后，進行柱 層析洗脫劑為(CH2C12/甲醇，80/3)，將含有目標產(chǎn)物的洗脫液合并后濃縮，得產(chǎn)物白 色固體 0. 043g，收率 34%。NMR(CDC13,500MHz) 8 :8. 149 (s，2H)，7. 617and 7. 593 (d, 2H) ,7. 521 (s,2H)，7. 461and 7. 428 (d, 2H)，7. 366-7. 319 (m, 7H) ,6. 831 (s,2H)，6. 753 (s, 2H)，6. 353 (s, 1H)，6. 002 (s, 1H)，5. 727and 5. 667 (d, 2H)，5. 305 (s, 2H)，5. 250 (s, 1H)， 5. 003-4. 986 (m, 1H)，4. 353-4. 282 (m, 3H) ,4. 215 (s,2H)，4. 012-3. 975 (m, 2H)，3. 832 (s, 3H) , 3. 777 (s, 2H)，3. 370 (s, 1H)，3. 307-3. 250 (m, 4H)，3. 190 (s，1H)，3. 118 (s, 2H)， 3. 054 (s，1H), 2. 617 (s，1H)，2. 531and 2. 525 (d, 1H)，2. 454(s，2H)，2. 355-2. 349 (m, 2H)， 2. 264 (s,2H)，2. 062 (s，2H)，1. 863—1. 858 (m, 2H)，1. 769 (s, 2H)，1. 623 (s,2H)，1. 567 (s, 4H)，1. 485 (s，3H)，1. 427 (s，4H)，1. 295-1. 131 (m，12H)，0. 873-0. 839 (m，10H) ；ESIMS m/z 1316 [M+H].，1338[M+Na] +。效果實施例1 MTT法觀察多西紫杉醇衍生物對人乳腺癌細胞MCF-7，人結(jié)腸癌細 胞HT-29，人前列腺癌細胞PC-3，人肺癌細胞A549的增值影響1 材料1. 1細胞株乳腺癌MCF-7細胞、結(jié)腸癌HT-29細胞、肺癌A549細胞和前列腺癌PC_3細胞購于 哈爾濱醫(yī)科大學。1. 2實驗藥物多西紫杉醇衍生物，本實驗室制備；0.9%的生理鹽水，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)；多西紫 杉醇，上海昊化化工有限公司；無水乙醇(AR)，天津市東麗區(qū)天大化工試劑廠；RPMI1640培 養(yǎng)基，美國Hyclone公司；胰蛋白酶，美國Gibco公司；EDTA，美國Sigma公司；MTT(噻唑 藍)，美國Sigma公司；小牛血清，天津灝洋生物制品科技有限責任公司；細胞培養(yǎng)瓶，美 國Corning公司；96孔培養(yǎng)板，加拿大JET公司；封口膜，美國PARAFILM公司；二甲基亞砜 (DMS0)，美國Amerseco公司；青霉素、鏈霉素，美國Hyclone公司；C02氣體，哈爾濱黎明氣 體公司。2實驗方法2. 1腫瘤細胞的復蘇(1)從液氮罐中取出保存有細胞株的凍存管，迅速置于37°C的水浴箱中，并反復搖動，直至凍存管中無固態(tài)物質(zhì)，取出置于超凈臺中。(2)用70%乙醇仔細擦凈凍存管的管口后開蓋，用1000 ii L微量移液器吸凈管中 液體，轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。(3)補加10mL細胞培養(yǎng)液，1500rpm離心5min，棄上清。(4)重復(3)。(5)加入含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，吹打混勻后置入細胞培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)入 37°C,5% C02孵箱中培養(yǎng)過夜。(6)次日進行完全換液后繼續(xù)培養(yǎng)。2. 2細胞培養(yǎng)與傳代(1)每日用倒置顯微鏡檢查細胞，如發(fā)現(xiàn)污染或細胞碎裂，丟棄。(2)肉眼觀察培養(yǎng)液顏色，如果顏色由紅色轉(zhuǎn)為黃色，則說明細胞密度過大，需要 及時更換培養(yǎng)液。(3)酶胰消化后，在超凈臺中用吸管將細胞吹打混勻，取lmL置于新培養(yǎng)瓶中，依 次加入8mLDMEM培養(yǎng)基lmL胎牛血清。(4)將傳代后細胞重新放回37°C、5% C02孵箱中培養(yǎng)。(5)將四種腫瘤細胞連續(xù)體外傳代20次后，可獲得相對純凈的腫瘤細胞，方可用 于之后實驗。2. 3細胞增值抑制實驗(1)分別取處于指數(shù)生長期的腫瘤細胞，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液 稀釋成20000個細胞/mL。(2)96孔板每孔中加入2001^細胞懸液，置于371、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。(3)將藥物用DMS0溶解，每孔中加入設定濃度藥物，稀釋至需要的工作濃度(用 RPMI1640細胞維持稀釋)。同時以紫杉醇為陽性對照。(4)置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。(5)MTT用無血清RPMI1640培養(yǎng)液配成5mg/mL溶液，每孔中加入20 y L，置于 37°C>5% C02孵箱中孵育4h。(6)吸出上清，用培養(yǎng)液洗三次加入100 y L DMS0溶解沉淀物，用振蕩器搖勻測定 OD570 值。(7)按下列公式計算藥物對腫瘤細胞的抑制率公式腫瘤細胞生長抑制率=(1-實驗組0D/對照組0D) X 100%3 結(jié)果表1多西紫杉醇衍生物對腫瘤細胞的體外半數(shù)抑制率 注*化合物的結(jié)構(gòu)位于說明書附圖3中在所測定的20種化合物中，化合物L對四種細胞都表現(xiàn)出了很強的細胞毒性，其 IC50值分別為4. 53，8. 04，6. 05和22. 84 y mol/mL，甚至強于陽性對照紫杉醇和多西紫杉醇 (除A549外)。而化合物F和G對四種癌細胞株的細胞毒性都很小。整體上看，大部分化 合物對四種癌細胞的有著不同的選擇性，化合物A、C、K、Q、S和T僅對肺癌細胞PC-3顯示 出很強的細胞毒性，而化合物D、E、M、N、0和R則對乳腺癌細胞和肺癌細胞同時具有較強的 細胞毒性。在所有化合物中，D和T對前列腺癌細胞PC-3表現(xiàn)出了最強的細胞毒性(IC5Q <0.82u mol/mL)，分別為紫杉醇和多西紫杉醇的16倍和73倍。對前列腺癌細胞PC-3而 言，有14種新化合物具有大于陽性對照的細胞毒性。而對于肺癌A549而言，除了化合物0， 其它的新化合物并沒有表現(xiàn)出優(yōu)于陽性對照紫杉醇和多西紫杉醇的細胞毒性。4 結(jié)論多西紫杉醇衍生物主要對MCF-7和PC-3兩種癌細胞表現(xiàn)出較強的細胞毒性，對 A549的細胞毒性稍弱，對HT-29的細胞毒性則最弱。效果實施例2多西紫杉醇衍生物體內(nèi)抗腫瘤實驗1 材料1. 1實驗動物昆明種小鼠，雄性18_22g，由哈爾濱醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院提供；荷肉瘤S-180小鼠， 由哈爾濱醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院傳代培養(yǎng)。
1. 2實驗藥品0.9%的生理鹽水，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)；多西紫杉醇(純度99.74% )，上海昊化化 工有限公司；多西紫杉醇衍生物，本實驗室自制；0.02%臺盼蘭(AR)，Sigma公司；苦味酸 (AR)，廣東汕頭西隴化工廠；無水乙醇(AR)，天津市東麗區(qū)天大化工試劑廠；過氧乙烯蓖麻 油，浙江海正藥業(yè)。2實驗方法取生長旺盛的S-180腹水瘤小鼠，無菌抽取腹水，用生理鹽水(1 6)稀釋，制成 細胞懸浮液，取0. lmL于玻璃片上，加0. 02 %臺盼蘭一滴，在光鏡下計數(shù)，活細胞數(shù)應大于 95%。取此腫瘤細胞懸液，無菌條件下接種于昆明種小鼠右腋下，每只0. 2mL，然后隨機分 組。取小鼠16只，按上述方法造模后，隨機分為4組，分別為多西紫杉醇組，多西紫杉醇衍 生物高劑量組，多西紫杉醇低劑量組和空白對照組。連續(xù)小鼠尾靜脈注射給藥7d,末次給藥 后次日處死動物，解剖取瘤，稱重，計算抑瘤率，并進行統(tǒng)計學(t檢驗)處理。按下公式計 算抑瘤率抑瘤率=(1-實驗組平均瘤重/模型對照組平均瘤重)X 100%3 結(jié)果表2多西紫杉醇衍生物L對腫瘤細胞的體內(nèi)抑制率 注*與空白對照組相比較P < 0. 05如表2所示，多西紫杉醇衍生物(以多西紫杉醇衍生物L為代表)對小鼠移植性 腫瘤S-180的抑瘤作用多西紫杉醇衍生物對小鼠移植性腫瘤S-180的生長有明顯的抑瘤 作用，高劑量抑制率為65. 81%，低劑量為39. 92%。陽性對照多西紫杉醇對小鼠移植性腫 瘤S-180的抑制率77. 17%。給藥組動物給予多西紫杉醇衍生物及多西紫杉醇后，與模型對 照組相比較，荷瘤小鼠體重均有不同程度的增長，說明在給藥劑量范圍內(nèi)多西紫杉醇衍生 物的毒性很小，安全系數(shù)高。4 結(jié)論實驗表明多西紫杉醇衍生物(以多西紫杉醇衍生物L為代表)對S180腫瘤細胞 具有明顯的抑制作用，對S180的腫瘤抑制率具體結(jié)果見表2。毒性實施例1多西紫杉醇衍生物(以多西紫杉醇衍生物L為代表)半數(shù)致死量 ld50的測定1 材料1. 1實驗動物昆明種小鼠，雄性18_22g，由哈爾濱醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院提供。1. 2實驗藥品0. 9%的生理鹽水，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)；多西紫杉醇(純度99. 74% )，上海昊化化工有限公司；多西紫杉醇衍生物，本實驗室自制；無水乙醇(AR)，天津市東麗區(qū)天大化工試劑 廠；過氧乙烯蓖麻油，浙江海正藥業(yè)。2實驗方法實驗劑量以80mg/kg為最高劑量組，以0. 5倍遞減，設40mg/kg、20mg/kg 10mg/kg、 Omg/kg共五組，將小鼠隨機分組，每組10只，雌雄各半，尾靜脈注射0. 2mL/10g。觀察3_7 天，記錄動物各種反應幾個組死亡的只數(shù)。根據(jù)各組動物的死亡率，用如下公式算出LD5(I 值。LD50 = lg-1 [Xm-i ( E p-o. 5)]Xm =最大劑量的對數(shù)值；i =相鄰兩組比值的對數(shù)(lgr) ；P =各組死亡率Death rate ； E P =各組死亡率總和3 結(jié)果在給藥后12小時內(nèi)，未見死亡，7天內(nèi)各組小鼠死亡情況見下表3 表3多西紫杉醇衍生物L半數(shù)致死量LD5(1 根據(jù)上述公式可以算出LD5Q為40mg/kg。4 結(jié)論多西紫杉醇衍生物L半數(shù)致死量LD5(1為40mg/kg。


圖1紫杉醇的結(jié)構(gòu)式圖2多西紫杉醇結(jié)構(gòu)式圖3多西紫杉醇衍生物的結(jié)構(gòu)式圖4多西紫杉醇衍生物L對小鼠移植性腫瘤S-180的抑瘤作用效果圖
權(quán)利要求
一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法及其用于制備抗腫瘤藥物的應用，具體包括多西紫杉醇衍生物的合成方法和在抗腫瘤方面的用途，包括以下步驟(1)一種合成多西紫杉醇衍生物的方法，其主要特征在于該方法包括二硫雜環(huán)的合成、水解、縮合、脫保護四個步驟a二硫雜環(huán)的合成以β-二羰基化合物為初始底物，與二硫化碳反應生成二硫雙鍵，再與二溴化物發(fā)生親和取代反應，得到中間體Ⅰ，將中間體Ⅰ利用Knoevenagel反應與取代苯甲醛反應生成雙鍵形成中間體Ⅱ；b水解合成得到的二硫雜環(huán)中間體Ⅱ在堿性條件下水解形成羧基得到中間體Ⅲ；c縮合將母核保護后的多西紫杉醇側(cè)鏈的游離氨基或羥基與中間體Ⅲ中的羧基進行縮合反應得到中間體Ⅳ；d脫保護將中間體Ⅳ中的保護基脫除得到最終產(chǎn)物；其反應式如下(2)多西紫杉醇衍生物在制備抗腫瘤細胞藥物方面的應用。FSA00000135663700011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法及其用于制備抗腫瘤藥 物的應用，具體包括多西紫杉醇衍生物的合成方法和在抗腫瘤方面的用途，其特征在于步 驟(l)a中所述的二硫雜環(huán)合成過程中，所需溶劑為DMF，催化劑為碳酸鉀。
3.如權(quán)利要求1所述的一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法及其用于制備抗腫瘤藥 物的應用，具體包括多西紫杉醇衍生物的合成方法和在抗腫瘤方面的用途，其特征在于步 驟(l)a中所述的，二硫雜環(huán)合成過程中，加入二硫化碳時需要的溫度為冰浴，加完后的反 應溫度為室溫，其中二溴化物包括1，2-二溴乙烷、1，3-二溴丙烷、1，2-二溴丙烷、1，2-二 溴丁烷、1，3_ 二溴丁烷等。
4.如權(quán)利要求1所述的一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法及其用于制備抗腫瘤藥物的應用，具體包括多西紫杉醇衍生物的合成方法和在抗腫瘤方面的用途，其特征在于步 驟(I)a中所述的二硫雜環(huán)合成過程中，將結(jié)束后的反應體系傾入到冰水中，攪拌靜止后析 出白色固體，過濾干燥后，得到中間體I。
5.如權(quán)利要求1所述的一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法及其用于制備抗腫瘤藥 物的應用，具體包括多西紫杉醇衍生物的合成方法和在抗腫瘤方面的用途，其特征在于步 驟(I)a和b中所述的二硫雜環(huán)的合成及水解，取代苯甲醛與中間體I在堿性條件下，發(fā)生 雙鍵反應的同時，酯基水解形成羧基，得到中間體II，其中取代苯甲醛包括對硝基苯甲醛、 對氟苯甲醛、間硝基苯甲醛、鄰硝基苯甲醛、對甲基苯甲醛、對甲氧基苯甲醛、3，4_ 二甲氧基 苯甲醛，3，4，5-三甲氧基苯甲醛等，其中堿包括氫氧化鈉和氫氧化鉀等。
6.如權(quán)利要求1所述的一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法及其用于制備抗腫瘤藥 物的應用，具體包括多西紫杉醇衍生物的合成方法和在抗腫瘤方面的用途，其特征在于步 驟(I)C中所述的，中間體II與母核保護后的多西紫杉醇側(cè)鏈的氨基通過酰胺化的反應連 接，通過活化羧基的方法完成。
7.如權(quán)利要求1所述的一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法及其用于制備抗腫瘤藥 物的應用，具體包括多西紫杉醇衍生物的合成方法和在抗腫瘤方面的用途，其特征在于步 驟(l)d中所述的，脫保護過程中所用的催化劑為鋅粉、乙酸，加熱條件下反應。
8.如權(quán)利要求1所述的一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法及其用于制備抗腫瘤藥物的應用，具體包括多西紫杉醇衍生物的合成方法和在抗腫瘤方面的用途，其特征在于步驟(l)d中所述的反應式中的R1包括苯基、對甲氧基苯基、對甲基苯基、對氟苯基、間硝基苯基、鄰硝基苯基、3，4_ 二甲氧基等多種取代苯基；R2為氫原子或如下基團
9.如權(quán)利要求1所述的一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法及其用于制備抗腫瘤藥 物的應用，具體包括多西紫杉醇衍生物的合成方法和在抗腫瘤方面的用途，其特征在于步 驟(2)中所述的腫瘤細胞，主要包括人乳腺癌細胞、人肺癌細胞、人結(jié)腸癌細胞、人前列腺 癌細胞、小鼠移植性腫瘤S180細胞。
10.如權(quán)利要求1所述的一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法及其用于制備抗腫瘤藥 物的應用，具體包括多西紫杉醇衍生物的合成方法和在抗腫瘤方面的用途，其特征在于步 驟(2)中所述的抗腫瘤細胞藥物，為衍生物加入不同的賦形劑后可加工成任何一種藥劑學 上所說的劑型，包括片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服液或粉針劑，以及用現(xiàn) 代制藥界所公認的控釋或緩釋劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多西紫杉醇新衍生物的合成方法及其用于制備抗腫瘤藥物的應用。該合成方法是以β-二羰基化合物為初始底物，先將其與二硫化碳反應合成二硫縮烯酮，再將不同取代的苯甲醛通過Knoevenagel反應以雙鍵的形式連接到二硫縮烯酮的α位，同時分子中的酯基在堿性條件的作用下，水解生成羧酸鹽，用稀鹽酸酸化后得到含有游離羧基的二硫雜環(huán)底物。再將二硫雜環(huán)底物的羧基與多西紫杉醇側(cè)鏈中的氨基或羥基進行酰胺化反應，最后脫除保護基得到多西紫杉醇衍生物。藥理實驗證明該類多西紫杉醇衍生物對多種癌細胞株具有顯著的抑制作用，且具有低毒不易產(chǎn)生耐藥性的特點，可用于制備抗腫瘤藥物，具有很高的醫(yī)學價值和廣闊的市場前景。
文檔編號A61P35/00GK101851231SQ20101018447
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者付玉杰, 劉霞, 華欣, 吳曉敏, 吳楠, 李雙明, 李政楠, 楊剛, 梁璐, 羅猛, 陳曉亮 申請人:東北林業(yè)大學;付玉杰