專利名稱：與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的制作方法
技術領域：
本項發(fā)明涉及紫杉烷，尤其涉及與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉醇和多西紫杉醇，以及它們的制取工藝和在腫瘤學、自體免疫失調和再狹窄治療領域的使用。
背景技術：
紫杉烷，特別是紫杉醇和多西紫杉醇，目前以Taxol和Taxotere的商品名出售，是抗癌藥(Huizing M.T.等，Cancer Inv.，1995，13381-404)，它們通過作用于細胞的細胞骨系統(tǒng)中的微管的組織而發(fā)揮抗增殖生作用。通過抑制所述微管的去極化作用，它們阻止細胞有絲分裂中發(fā)生的正常的動態(tài)重組織作用(Manfredi J.J.等，JCell Biol，1982，9468-696)。
紫杉醇的主要治療適應癥如下-治療晚期乳腺癌；-治療卡波濟氏肉瘤；-治療肺癌(非小細胞瘤)；-對常規(guī)化學療法有抗性的卵巢癌。
此外，所述的化學療法還用于膀胱癌、前列腺癌和子宮內膜癌的治療。
確定紫杉醇不溶于水，它與聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEL)(蓖麻油)乙醇1∶1的比例混合在目前用于癌癥化學治療的藥物組合物中(Pfeifer R.W.等人，Am.J.Hosp.Pharm.，1993，502520-2521)。此配方通常用于連續(xù)的靜脈滴注(在3-24小時之間)，劑量為135-175mg/m2。
在上述配方中，CremophorEL的存在是引起不良反應的主要原因，該不良作用般在紫杉醇用藥中發(fā)生。從發(fā)生蕁麻疹到呼吸困難和支氣管痙攣，甚至，過敏性休克(Weiss，R.B.等，J.Clin.Oncol，1980，81263-1268)。
因此，準備接受紫杉醇-聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEL)的藥物組合物治療的病人首先必須采取術前用藥方案，服用地塞米松，可能還要配合使用抗組胺劑。
盡管有這些預防措施，高達40％接受紫杉醇靜脈滴注的給藥的病人仍然經受了或輕或重的不良反應。
因此可以說，目前臨床使用的泰克索(Taxol)配方及其使用的給藥方法，構成了它的功效的限制。這就是現在要對水溶性的上述抗癌藥物進行新的藥物配方合成和/或新的化學配方研究的原因。
例如，研究人員已經嘗試將紫杉醇裝入由可生物降解的共聚物(如聚乳酸)以及不可生物降解的共聚物(如乙烯-醋酸乙烯酯)所形成的聚合物壁構成的脂質體、納米膠囊和微球體。
此外，還制備了裝有紫杉醇的微球體，由生物降解的聚合物(如聚磷酸酯)形成，這樣，產生一種肺癌治療中的長久釋放藥物的系統(tǒng)(Nui jen，B.等，Investigational New Drugs，2001，19143-153)。還試圖通過在有機溶劑中與磷酸脂膽堿/膽酸鹽共同沉淀紫杉醇來制備所述的抗癌藥的膠束(Nui jen，B.等，Investigational New Drugs，2001，19143-153)。
但是，這些用來包裝紫杉醇的新系統(tǒng)在穩(wěn)定性、生產和重觀性方面會遇到麻煩。
而且，還做出許多努力用環(huán)糊精來溶解該藥物，但是，新配方并沒有產生所希望1的結果(Nui jen，B.等，Investigational New Drugs，2001，19143-153)。
既使得藥物更溶于水、又保持抗癌藥有效性的紫杉醇新配方的化學研究，已經導致在C2′和C7位置修飾的新類似物合成(美國專利2001/0018531)，以及制備新的前藥。
前藥是療效上惰性的藥物衍生物，它們被引入體內后活化。在自發(fā)的水解和(或)酶促降解過程后，釋放出活性成份。
有鑒于此，以及上述的理由，已經作出許多努力來合成新的前藥。例如，已經制備了如乙酰紫杉醇的藥物(Mellado，W.等，Biochen，Biophys，Res.Commun，1984，124(2)329-336)，或者，在C2′位置的碳上，用琥珀酸、谷胺酸及磺酸與上述藥物進行新的酯類合成。但是，這些酯類在水環(huán)境下表現出不穩(wěn)定性。
此外，還合成了在C2′或者C7位置帶有磷酰氧基苯基丙酸酯基因的一些衍生物(如紫杉醇-2′-碳酸酯)，以及一系列紫杉醇的氨基酸酯類和它們的在C2′位置帶有戊二?；鶊F的衍生物。
戊二酰-紫杉醇天冬酰胺和戊二酰-紫杉醇谷氨酰胺已證明是用上述合成方法得到的水溶性最高的產物，但它們比紫杉醇本身的效果要差(Nui jen，B.等，Investigational New Drugs，2001，19143-153)。
還知道紫杉醇用聚-L-谷氨酸酯化，生成所述化療藥的新的水溶性衍生物，它比非綴合的紫杉醇的血漿半壽期顯著提高(Li，C.等Cancer Research，1998，58(11)2404-2409)。
也已經通過在C2′位置通過酯化該化學療法藥物，用PEG(聚乙二醇)使紫杉醇衍生化。但是，新的分子已經表明雖然很溶于水，但是不太穩(wěn)定。
最近，已經通過紫杉醇與人血清白蛋白(HSA)綴合，開發(fā)出了這種藥物的一種新的輸送系統(tǒng)。紫杉醇-HSA的綴合物非常溶于水，并且能夠攜帶最多達30個該化療藥物的分子。但是，在體外進行的實驗表明，它對癌的抵抗作用不如紫杉醇本身。(Nui jen，B.等人，Investigational New Drugs，2001，19143-153)。
最近，研究人員用事先修飾的透明質酸(以下稱“HA”)使紫杉醇酯化，合成了一種新的輸送系統(tǒng)，即HA與通過酰胺鍵與HA的羧基結合的酰肼分子反應(Luo，Y.等Biomacromolecules 2000，1(2)208-218)；美國專利號5,874,417。紫杉醇新的輸送系統(tǒng)使得藥物能夠直接進入目標癌細胞的細胞膜表面，以HA受體(CD44)的超表達為特征。結果證實，與用酰肼官能化的HA鍵合的紫杉醇能夠專業(yè)性地與癌細胞的CD44結合，因此能夠(通過內吞作用過程)進入細胞質，在細胞質中，它能夠通過酶的作用而被釋放并活化，促發(fā)微管蛋白的去極化和細胞分裂的抑制作用。該藥物的這種選擇性傳輸的機理稱為“細胞靶向”(“cell targeting”)。
此外，我們已經知道，HA在藥物組合物中，可以用做抗癌藥物的賦形劑，其中HA與化學療法的藥物(如紫杉醇)締合(非共價鍵合)，由于上述的靶向現象，從而增大療效(國際專利申請?zhí)朩O 00/41730)，從而增大療效，并且能夠降低常規(guī)化療方案規(guī)定的劑量(國際專利申請?zhí)朩O 99/02151)。
最近，已經知道，將低分子量的HA和(或)脂質衍生物可用來制取用于傳輸藥物，包括抗癌藥物(如紫杉醇)的脂質體(國際專利申請?zhí)朩O 01/39815)。
綜上所述，仍然需要穩(wěn)定和具水溶性，以及療效至少達到未修飾的紫杉烷的新型紫杉烷衍生物。

發(fā)明內容
本申請人已經發(fā)現，任選地使用間隔分子(間隔基)(spacer)，與將紫杉烷與HA或者HA的衍生物共價鍵合，能夠獲得穩(wěn)定的、水溶性制品，對于治療腫瘤、自體免疫失調和再狹窄的治療的藥物的制取有用。
因此，本項發(fā)明的主題是，與HA或者HA衍生物共價健合的紫杉烷，其中共價鍵在紫杉烷的羥基和HA或HA衍生物的羧基，或脫去乙?；腍A的氨基之間形成，任選地通過間隔分子將紫杉烷鏈到HA或者HA衍生物，條件是所述間隔分子與酰肼不同。
本項發(fā)明還涉及制取與HA或HA衍生物共價鍵合的紫杉烷的工藝。
本發(fā)明的進一步主題是，包含至少一種與HA或HA衍生物共價鍵合的紫杉烷作為活性物質的藥物組合物，以及它們在腫瘤、自體免疫失調以及再狹窄的治療上的使用。
本發(fā)明的與HA或HA衍生物供價鍵合的紫杉烷有許多優(yōu)點，概括如下1)它們在血流中迅速溶解；2)在制備配方時，它們不需要與聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEl)混合，這樣就克服了上述有關過敏性和過敏性反應的問題；3)由于血漿中通常存在的酯酶等酶的酶促作用，紫杉烷被它們的賦形劑HA或HA衍生物從本發(fā)明組合物中迅速釋放到血液中，在血液中它們可以自由地發(fā)揮它們的抗癌作用。
4)它們能夠產生一種新的藥物，在某些種類的癌中，這些藥物比服用相同劑量的非共軛紫杉烷所獲得的化學療效大得令人吃驚。


圖1表明了實施例1中所描述的腫瘤細胞植入后存活百分比作為對照(黑色柱狀圖)，以及接受紫杉醇(灰色柱狀圖)，和接受實施例7制取的16％酯化、與HA共價鍵合的紫杉醇的小鼠的存活百分比(白色柱狀圖)。
圖2表明了以IC50所表示的和從實施例2的實驗所得出的，與具有16％酯化(灰色柱狀圖)、22％酯化(黑色柱狀圖)和6.8％酯化(白色柱狀圖)的HA的酯衍生物共價鍵合的紫杉醇，對乳腺癌的四個細胞系與參照制品紫杉醇相比的藥理學效果。
圖3表明實施例3所述的在對照小鼠(虛線)和接受ACP凝膠(實線)的小鼠中，腫瘤細胞植入后的存活百分比。
圖4表明了與實施例7中制備的與HA酯共價鍵合、釋放到實施例13所述的相對于時間的試驗中人血漿中的紫杉醇的百分比。
具體實施例方式
本項發(fā)明描述了屬紫杉烷家族的化合物，更優(yōu)選分別以分子式(I)和(II)所表示的紫杉醇和多西紫杉醇，它們與HA或者HA衍生物共價鍵合，優(yōu)選以間隔分子作為紫杉烷成份和HA或HA衍生物之間的界面的方法，與這兩個分子共價鍵合。

HA是一種雜多糖，由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺的交替殘基所組成，含有下列重復單元 HA是一種線性鏈型聚合物，其分子量在50,000和13×106Da之間不等，視其來源和獲取方法而定。它在自然界中存在于細胞外周的凝膠、脊椎動物結締組織的基本物質(是其主要成分之一)、關節(jié)的滑液、玻璃體液以及臍帶中。HA在生物的組織中發(fā)揮重要作用，對于許多組織，如皮膚、鍵、肌肉和軟骨等細胞起到機械支撐的作用。它是細胞外基質的主要成分，但是它有其它功能，如組織的水合、潤滑、細胞遷移以及分化。
用于本項發(fā)明中的HA可以從任何來源中提取，例如，從公雞的雞冠、通過發(fā)酵，或者通過其它工藝方法獲得，它的分子量在400和3×106Da之間，特別是在400和1×106Da之間，最好為400和230,000Da之間。
根據本項發(fā)明，HA衍生物最好從下列HA衍生物中選取。
-與有機堿和(或)無機堿形成鹽的HA；-Hyaff在美國專利號4851521中揭示的(在此引用作為參考)，與脂肪族、芳脂族(araliphatic)、脂環(huán)族、芳香族、環(huán)狀的以及雜環(huán)系列的醇類形成的HA酯類，其酯化程度隨著所使用的醇的類型和長度而變化，在任何情況下都不會有超過50％的酯化度，最好的在0.1-20％之間，因為最終獲得的聚合物必須是水溶性的，而未酯化的HA剩余部分百分比可能與有機堿和(或)無機堿形成鹽。
-HyaddTM在歐洲專利號1095064中揭示的(在此引用作為參考)，與脂肪族、芳脂族(araliphatic)、脂環(huán)族、芳香族、環(huán)狀的以及雜環(huán)系列的胺類形成的HA酰胺化合物，其酰胺化度為0.1-10％之間，因為最終獲得的聚合物必須是水溶性，而未酰胺化的HA的剩余部分可能與有機堿和(或)無機堿形成鹽。
-根據美國專利號6,027,741揭示的(在此引用作為參考)，O-硫酸化衍生物HA，其硫酸化度為第4度；-ACP在歐洲專利號0341745B1中揭示的(在此引用作為參考)，酯化度不超過15％的HA內酯作為聚合物必須是水溶性的，優(yōu)選具有0.05％-10％的酯化度，未酯化的HA的剩余部分可能與有機堿和(或)無機堿形成鹽。
-HA的去乙?；衔锼鼈儚腘-乙酰-葡萄糖胺的去乙酰化反應衍生而來，去乙?；俜謹祪?yōu)選在0.1-30％之間，而所有HA的羧基能夠與有機堿和(或)無機堿形成鹽，如以以下結構(A)所示
HA的去乙酰化合物揭示在國際專利申請?zhí)朩O 02/18450中，我們將其結合在此作為參考。
-HyoxxTM通過N-乙酰-葡萄糖胺單元的初級羥基的氧化獲得的全羧化HA衍生物，全羧化度為1到100％，最好為25到75％。HA全部羧基可以與有機堿和(或)無機堿形成鹽，如以下結構(B)所示 全羧基化的HA衍生物披露于美國專利申請?zhí)朥S2003181689中。
此外，現有的其中紫杉烷，尤其是紫杉醇，與HA酯類共價鍵合的化合物，可以從未化學修飾的HA分子開始，僅在與化學療法的藥物合成后，通過與上述所有醇類的酯化，將HA改性得到Hyaff產品，或者，在ACP的情況下，則形成內酯(見實施例8)。
前面所列出的HA衍生物，在前藥HA-紫杉烷，特別是前藥HA-紫杉醇的合成工藝中尤其重要，這些衍生物是去乙?；牧蛩峄苌铮驗橐韵嗤呐c原先的未改性的透明質量鍵合的百分比，它們形成的最終制品更易于溶于血流。
已經知道，通過CD44細胞膜的受體，HA調節(jié)許多與細胞生理學和生物學有關的不同過程，如癌細胞和其它細胞的增殖、分化和移動。
最近，科學文獻已經表明了當HA就此直接注射到癌的生長中時HA的抗癌效果。已經證明，可以測定到30％的腫瘤的完全退化。還知道，HA可以與各種化療藥物結合，以制取許多不同的藥物組合物，因為它能夠作為第二種抗腫瘤藥，協(xié)同提高與它相聯(lián)合的藥物的抗癌作用(國際專利申請?zhí)朩O 01/47561)；或者，已有人聲稱，HA自身可作為一種在不同臨床方案中使用的抗癌藥，用于抑制/退化癌的增長(國際專利申請?zhí)朩O 97/40841)。
現有的與HA或者HA衍生物共價鍵合的紫杉烷，如上所述，與紫杉烷的所有配方都不同，尤其是與HA或HA衍生物的紫杉醇的共價結合，任選地通過間隔分子，使紫杉醇變?yōu)樗苄?，而不影響藥效?br> 實際上，實施例1中所述的在體內的實驗證明，當使用的劑量相同時，本發(fā)明的綴合的紫杉醇與非綴合的紫杉醇具有相同的抗癌效果。
此外，HA紫杉醇能夠表現出意料之外的藥理學性能，這些性能與非綴合的紫杉醇的藥理學性能不同，尤其是在某些類型的腫瘤中。
實際上，實施例2清楚地表明了本發(fā)明的與紫杉醇鍵合的HA的酯類衍生物具有新的抗腫瘤藥理學的活性在下面所述的體外細胞毒性模型中，本發(fā)明的HA-紫杉醇表現出令人驚異的抗癌活性，遠遠超過單獨的非綴合的紫杉醇。
新的抗腫瘤特性意味著，本發(fā)明的紫杉烷，尤其是紫杉醇與HA或HA衍生物綴合后，能夠作為一種化療藥物用于藥物組合物的配制中，它不僅對使用泰克索的各種形式的腫瘤有用，而且對于通常不用泰克索治療的其它形式的腫瘤也有用，如胃癌和肝癌、結腸癌、黑色素瘤癌以及白血病。此外，它還可以用于系統(tǒng)性自體免疫失調，如類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自體免疫性腎小球腎炎，以及橋本化甲狀腺炎甲狀腺炎。
在上述疾病中使用本發(fā)明產品作為新的藥理治療是可能的，因為新的HA-紫杉醇化合物降低了泰克索(Taxol)的系統(tǒng)性毒性，這樣，就增加了藥物本身的治療效果，因為它是-水溶性的；-不與聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEl)結合，因此沒有該制品所產生的毒性；-劑量明顯小于或等于一般的臨床方案中使用的劑量，而效果相同；
另外還知道，作為藥物使用紫杉醇，一般還用于降低血管成形術(一般為動脈)、冠狀搭橋以及器官移植后的再狹窄。
本發(fā)明的紫杉烷，尤其是紫杉醇與HA或HA衍生物共價鍵合后，還可用于防止再狹窄，或者可用于上述血管成形術后，形成移植的支架和裝置的內涂層，因為已證明它能夠化學結合在所述支架的表面上，并且易于吸附在它們上面。
在這兩種情況下，本發(fā)明制品在支架表面上的停留時間，及其由此向血流中的逐漸釋放，大于非綴合的紫杉醇，因為HA的理化特性有利于漸進的、緩慢的但是連續(xù)地從裝置的表面釋放泰克索(Taxol)。
含有與HA或者HA衍生物共價鍵合的本發(fā)明紫杉烷的藥物組合物可以全身給藥，(通過靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下或者口腔路徑)，它還用于局部應用(通過透皮吸收)，或者通過直接注射到癌癥部位置給藥。
與紫杉醇共價鍵合的HA或其衍生物自身，也可以作為一種抗癌藥物。
在下列實施例3中，本申請人證明了HA、ACP的交聯(lián)衍生物，是如何處理裸鼠體內的實驗性誘發(fā)的腫瘤的生長的，從而與非處理對照相比測定了腫瘤的明顯退化。
因此，本申請人第一次描繪了構成本發(fā)明制品紫杉烷-HA或紫杉烷-HA衍生物的HA和HA衍生物，作為抗腫瘤藥的一種新作用以及它們在腫瘤學領域的使用。
此外，本發(fā)明的與HA或HA衍生物共價鍵合的紫杉烷，可與各種生物學和藥理學活性分子(例如類固醇、荷爾蒙、蛋白質、營養(yǎng)素、維生素、非類固醇消炎藥、化療藥物、鈣拮抗藥、抗生素、抗病毒劑、白介素和細胞因子如干擾素)聯(lián)合使用。
通過這種方法，可能獲得上述藥物的不同結合以及含有本項發(fā)明的紫杉烷的相應不同的藥物組合物。
本項發(fā)明還涉及本發(fā)明紫杉烷，尤其是紫杉醇與HA或HA衍生物共價鍵合的制取工藝，本發(fā)明的制品可以通過下列工藝獲得1)涉及在紫杉烷和HA或HA衍本物之間引進間隔基(分子)的間接合成，或2)在紫杉烷和HA或HA衍生物之間直接合成。
可通過直接或間接間隔分子的方法與紫杉醇反應的HA或HA衍生物的官能團如下1)羥基；2)羧基；
3)去乙酰HA的氨基。
例如，間隔分子(基)可選自脂肪族或芳脂族(araliphatic)鏈(直鏈或支鏈)，被一個或多個選自羥基、羧基或羰基、環(huán)氧化物、酰氯、硫醇、硝基、鹵素、酐、異氰酸酯和異硫氰酸酯，以及氨基所取代。
在可能的間隔分子中，含有2至18個碳原子的，尤其是那些含有3至10個碳原子的羧酸溴化物是較好的；3-溴丙酸和4-溴丁酸則更好。
HA或HA衍生物的官能團部羥基和諸如紫杉醇等紫杉烷成分之間的合成反應，可以通過直接或者間接合成的工藝獲得。
間接合成可能會導致在間隔分子和HA或HA衍生物之間形成下列類型的共價鍵酯鍵-包含適當選擇的間隔分子的羧基官能團，間隔分子通過碳二亞胺等活化劑活化(下列方案1)；-包含HA或HA衍生物的羥基，溴化或者用甲苯磺?；〈缓笸ㄟ^適當選擇的間隔分子的羧基進行親核取代(下列方案2)；或-包含適當選擇的間隔分子的酐化官能團(下列方案3)。
方案1-2-3
氨基甲酸乙酯(urethane)或硫代氨基甲酸乙酯鍵-包含適當選擇的間隔分子的氨基(下列方案4)；-包含適當選擇的間隔分子的異氰酸酯或異硫氰酸酯官能團(下列方案5)。
方案4-5
醚鍵-包含適當選擇的間隔分子的環(huán)氧官能團(下列方案6)-包含溴化或者用甲苯磺酰基取代的HA或HA衍生物的羥基，隨后通過適當選擇的間隔分子的羥基進行親核取代(下列方案7)。
方案6-7
縮醛鍵或縮酮鍵-包含適當選擇的間隔分子的乙醛和(或)酮基(下列方案8)；-包含適當選擇的間隔分子的羥基，并需要簡單羰基化合物的存在，如甲醛(下列方案8)。
方案8 方案9
可使用活化劑，例如，從選自羰基二咪唑和二-(N-琥珀酰亞胺基)(di-(N-succimidy1))碳酸酯來活化HA或HA衍生物的羥基，進行上述工藝過程。
HA或HA衍生物的羥基和紫杉烷(如紫杉醇)之間的直接合成反應可以導致下列類形共價鍵的形成縮醛鍵-包含紫杉烷的羥基和HA或HA衍生物的羥基，它們通過一個簡單的羰基化合物(如甲醛)的加成而實現共價鍵合(方案10)。
方案10 HA或者HA的衍生物的羧基和紫杉烷(如紫杉醇)之間的反應，可以通過直接或者間接的合成方法獲得。
間接合成可能會導致在間隔分子和HA或HA衍生物之間形成下列類型的共價鍵酯鍵-適當選擇的間隔分子的羧基，如4-溴丁酸(4-bromobutyric acid)，通過碳二亞胺等活化劑活化，這樣，就適用于與紫杉烷(如紫杉醇)的羥基合成(最好在C2′位置的碳上)。隨后，通過在無水溶劑中季銨鹽尤其是四丁銨(TBA)鹽直接接觸，獲得HA或HA衍生物的羧基對間隔分子的溴的親核取代。這樣，形成HA或HA衍生物與間隔分子之間的酯鍵，然后與紫杉醇鍵合?；蛘撸琀A或HA衍生物的羧基對間隔分子的溴的親核取代可以發(fā)生在間隔分子本身與紫杉烷的鍵之前(下列方案11)。
-通過使用HA或HA衍生物的羧基的活化劑(如碳二亞胺)，可能在所述的基團與適當選擇的間隔分子的羥基之間形成酯鍵，間隔分子或預先或之后與紫杉醇鍵合(下列方案12)。
方案11-12
酰胺鍵-HA或HA衍生物的羧基通過活化劑的活化，能夠與適當選擇間隔分子的氨基連接(但所有酰肼除外)，預先或之后與紫杉醇等紫杉烷鍵合(下列方案13)。
方案13
直接合成可以導致下列類型的共價鍵的形成酯鍵-HA或HA衍生物的羧基通過活化劑的活化，能夠使它與紫杉烷的羥基鏈接(下列方案14)；-紫杉烷成分的羥基通過活化劑的活化，能夠使它與HA或HA衍生物的羧基鏈接(方案14)；方案14 -下列類型的鍵需要紫杉烷的溴化物或甲苯磺酸酯。所述的鍵通過溴化物或甲苯磺酸酯被HA或HA衍生物的羧基的親核取代來制取(方案15)。
方案15 去乙酰HA的氨基和紫杉烷成分(如紫杉醇)之間的合成反應，可以通過直接或者間接的合成工藝實現。
間接的合成可以導致在間隔分子和HA之間形成下列類型的共價鍵酰胺鍵-包含適當選擇的間隔分子的羧基(方案16)；
方案16 氨基甲酸乙酯或硫代氨基甲酸乙酯鍵-包含適當選擇的間隔分子的羥基或巰基(thiolic)(方案17)。
方案17
直接合成可以導致下列類型的共價鍵的形成氨基甲酸乙酯鍵(urethane bond)-包含紫杉烷的羥基和去乙酰HA的氨基(方案18)。
方案18
同樣，包含間隔分子和紫杉醇等紫杉烷的鍵，可以是酯(方案19)、氨基甲酸乙酯或硫代氨基甲酸乙酯(方案20)、縮醛或縮酮類(方案21)，可能需要活化劑的存在，尤其是對于酯和氨基甲酸乙酯鍵。
方案19 方案20
方案21 間隔分子可以在與HA或HA衍生物的官能團鏈接之前或之后，與紫杉醇等紫杉烷鍵合，這取決于適當選擇的間隔分子的官能團的類型。
紫杉烷(如紫杉醇)與HA或HA衍生物的直接或者間接鏈接的百分比可以在0.1％和100％之間變化，最好在0.1％和35％之間。給出下列實施例，對現有發(fā)明提供非限定的說明。
實施例1在移植腫瘤細胞后，新的HA與紫杉醇的酯衍生物在裸鼠體內的效果對于這個實驗，我們在屬于無胸腺的CD-1物種的免疫抑制的裸鼠體內，使用人卵巢腺癌細胞，OVCAR-3細胞。
每個小鼠都通過腹膜路徑接種5×106個癌細胞。
實驗設計試驗藥品-泰克索(Taxol)，給5個動物使用-HYTAD1p20有16％羧基酯化度(w/w)的紫杉醇共價鍵合的HA的酯衍生物。用于合成這種新藥的HA的分子量是200,000Da(其制備詳見實施例7)。也對五個動物上使用這種藥物。
治療的動物10個動物首先被接種OVCAR-3細胞。5個用于作泰克索(Taxol)實驗而另5個用于HYTAD1p20實驗-所有10個動物隨后通過腹膜注射接受3個劑量的藥物治療(在接種癌細胞后的第6、13、20天)，劑量為20mg泰克索(Taxol)/kg體重或者125mgHYTAD/kg體重(相應于紫杉醇20mg/鼠)。
對照動物(CONTROL ANIMALS)5個動物首先接種了OVCAR-3細胞的癌誘發(fā)懸浮液，然后，不接受任何治療。
存活曲線的確定存活曲線從向腹膜內預防癌細胞后開始干預的日子起第92天計算。
結果獲得的結果如圖1所示。
三個對照動物得了卵巢腺癌，并且在移植癌細胞后的第70-75天之間死亡。在干預后的第92天，即試驗的最后一天，接受紫杉醇或HYTAD藥物治療的動物沒有一只死亡。
例2體外的實驗試管內試驗的目的主要在于確定與紫杉醇鍵合的新的HA酯衍生物的活性曲線，并評價/比較HYTAD衍生物和紫杉醇相比的抗瘤活性，從而確定它們與抗腫瘤藥物相比的藥物潛能。
實驗設計測試制品-泰克索Taxol參照制品-HYTAD1p20-HYTAD2p20-HYTAD2p10與紫杉醇共價鍵合的HA的酯衍生物，有16％的羧基酯化度(w/w)(如果是HYTAD1p20，用于新藥合成的HA分子量是200,000Da)(其制備詳見實施例7)或者22％(如果是HYTAD2p20，所使用的HA分子量是39,000Da)，或者6.8％(如果是HYTAD2p10，所使用的HA分子量是39,000Da)。
細胞系人源的細胞系使用了四個人乳腺癌細胞系。所有四個實驗細胞株對紫杉醇一般都有反應，并且表觀上的相同的放大度表達受體CD44。
-MCF-7-MDA-MB-231-MDA-MB-468-SKBR-3實驗方案1)在平底的96孔板中放上測試細胞系，濃度為每孔3000個細胞2)24小時后，用在培養(yǎng)基中適當稀釋的測試溶液補充細胞；3)在過72小時后，用3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物(MTT)用比色法測試對細胞進行測試；通過評估細胞的生存能力，此試驗還揭示了細胞對測試藥物的不同敏感性。這是有可能的，因為線粒體脫氫酶能夠將四唑鹽(黃色)還原為蘭色的甲晶體。顏色強度的大小用分光光度法測定(Dezinot F.等，J.Immunol Methods，1986，22(89)271-277)。
結果以下，我們將以圖2中的表格和圖表的形式，以術語IC50報告獲得的結果(IC50為對于使用的測試制品和不同細胞系，抑制50％的細胞增長所需的藥物濃度)。
圖2中，橫坐標軸表示藥效(以IC50表示)，并計算為克分子濃度與參照制品(紫杉醇)之間的比率，后者按慣例有一個0值。因此，短劃線表示大于參照制品的藥效。
IC50(以nM或者μM表示的培養(yǎng)基中紫杉醇或其HYTAD衍生物)

結論根據文獻報告，所有使用的細胞系都對泰克索敏感，泰克索是主要用于治療乳腺和卵巢的轉移性癌。關于乳腺癌細胞系，各種HYTAD證實比紫杉醇強得多，對于癌細胞系MCF-7，HYTAD1p20的系數為+150。
實施例3在移植腫瘤細胞后，裸鼠體內的ACP凝膠的效果。
對于這個實驗，我們在抑制免疫、屬無胸腺(nu/nu)物種的裸鼠體內使用人結腸癌HT29細胞。
每個動物都被麻醉，并且在它的腹膜腔內注入0.3ml濃度為166,000細胞/ml的HT29細胞懸浮液。這樣，每個小鼠接受50,000個癌細胞。
實驗設計治療的動物113個動物首先接種HT29，并且隨后立即接受一劑0.2ml濃度為40mg/ml的ACP凝膠；對照動物117個動物接種了HT29癌細胞懸浮液，但是不接受治療。
存活曲線存活曲線從接種日到死亡日計算。從開始的體重下降了20％以上和在表示擴散轉移的腹腔積血的情況下確認動物的死亡或將其處死。每天測定兩組中的存活率，并且以圖表表達，以獲得圖3中所報告的曲線。
此實驗持續(xù)了120天，隨后，將所有存活的動物處死并驗尸，以檢查腹部腫瘤的存在。
結果230個動物中有32個動物沒有形成明顯的腫瘤。這些動物中有22個屬于用ACP凝膠治療的小鼠組，有10個屬于對照組。
ACP凝膠19.5％的治療動物沒有發(fā)展成腫瘤；對照8.5％的控制動物沒有發(fā)展成腫瘤。
實施例4分子量為5,000和10,000道爾頓之間的HA的制備(對于HA-紫杉醇與低分子量HA的可能合成)2.40gHA鈉，分子量為990,000Da溶于240ml的0.15M NaCl溶液中。然后用7.9ml 14％NaOCl溶液補充。在+4℃的恒定溫度下，溶液在20Hz，150W，用聲波處理120分鐘。一旦反應結束，將pH用0.1N HCl調整到6.5，然后在1000ml 2∶1甲醇-丙酮混合物中沉淀。過濾收集制品在45℃，通過48小時的真空干燥。這樣就獲得1.65g鈉鹽。高壓液體色譜法(HPLC)-GPC的分析結果顯示，獲得的HA部分的平均分子量(MW)為5,850，數均分子量(MN)為3640，多分散性指數為1.61。
實施例5與紫杉醇鍵合的HA的酯衍生物的制備，羧基酯化度為約4％w/w51mg紫杉醇溶于CH2Cl2中，然后用104mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和20mg 4-溴丁酸補充溶液。接著，將溶液在水中分配。在去除碳二亞胺和溴化物殘余物后，用無水硫酸鈉干燥反應溶劑，并用旋轉蒸發(fā)器將其去除。這樣，獲得的21mg制品就溶于n-甲基-吡咯烷酮(NMP)中，加入20mg/ml的用四丁銨鹽化的HA溶液。NMP中的(TBA)(10mlNMP中200mg)。在室溫下發(fā)生7天的反應后，將溶液用5ml水和1ml飽和NaCl溶液稀釋。將如此獲得的溶液攪拌1小時，以使得鈉與TBA離子發(fā)生交換。然后，慢慢地一次加入一滴乙醇，這樣獲得的絲狀制品在水中溶解、透析并最終經過凍干。
實施例6用紫杉醇制備HA的酯衍生物，羧基的酯化度約10％w/w與實施例5一樣，將308.7mg溶于15ml的二氯甲烷的紫杉醇，用117.2mg4-溴丁酸和614.1mg EDC補充。接著，將水加入該溶液，以去除所有的溴化物和碳二亞胺。將如此獲得的有機溶液用硫酸鈉補充脫水，在用旋轉蒸發(fā)器排除溶液。最終，獲得363mg的中間制品。
在如此獲得的175mg中間制品中加入1g在無水NMP中溶解的HA-TBA。將該溶液在室溫下攪拌7天，然后，加入20ml水和4ml飽和NaCl溶液。將此攪拌1小時，以使鈉與TBA離子發(fā)生交換。然后，慢慢地一次加入一滴乙醇，這樣獲得的絲狀制品在水中溶解、透析并最終經過凍干。
實施例7用紫杉醇制備HA的酯衍生物，羧基的酯化度約16％w/w。
在通過前面實施例5和例6中所述的程序獲得的164mg中間制品中，加入680mg HA-TBA溶于25ml無水NMP的溶液。在室溫下發(fā)生7天的反應后，將溶液用20ml的水和4ml的飽和NaCl溶液進行補充。1小時后，慢慢地一次加入一滴乙醇。如此獲得的制品通過過濾收集，然后在水中溶解、透析，并且當透析液的導電性下降到10μS以下時，將它凝固。然后將凝固的溶液凍干。
實施例8用紫杉醇制備HA酯衍生物，羧基的酯化度為約10％w/w102.6mg的紫杉醇溶于5ml的二氯甲烷，將溶液用20.4mg琥珀酸酐補充。三小時后，通過使用旋轉蒸發(fā)器將溶液蒸發(fā)去除。如此獲得的制品溶于5ml低含水量的二甲基亞砜(DMSO)中，并加入27.3mg雙環(huán)-己基-碳二亞胺。約5分鐘后，用在15ml低含水量的二甲基亞砜(DMSO)溶解327mg聚合物獲得的HA-TBA溶液補充此溶液。在室溫下，將溶液攪拌約24小時。接著，在該溶液中加入數ml水和3ml飽和NACL溶液。1小時后，通過加入乙醇將其沉淀。這樣，通過過濾收集的絲狀制品在水中溶解、透析并最終凍干。
實施例9用紫杉醇制備的HA的酯衍生物，羧基的酯化度為約4％w/w510.1mg溶于6ml二氯甲的紫杉醇，用95.4mg 3-3-溴甲丙酸和525.0mg EDC補充。然后，在該溶液中加入水，通過分配以去除溴化物和碳二亞胺，并使用10倍量的水來去除這些試劑。有機溶液用硫酸鈉補充，以將其脫水，并用旋轉蒸發(fā)器將去除溶劑。
在如此獲得的155.5mg中間制品中加入1.46g溶于無水NMP的HA-TBA，這樣獲得的溶液在室溫下攪拌7天。接著，加入20ml水和4ml飽和NaCl溶液。將該溶液攪拌1小時，以使鈉與TBA離子發(fā)生交換。然后，慢慢地一次加入一滴乙醇，這樣獲得的絲狀制品在水中溶解、透析并最終經過凍干。
實施例10透明質酸的酯衍生物的制備，羧基的酯化度為約30％w/w500mg紫杉醇溶于CH2Cl2中，然后用397.6mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和300.9mg 4-溴丁酸補充溶液。接著，溶液在水中分配。一旦碳二亞胺和溴化物殘余物被去除，用無水硫酸鈉將反應溶劑干燥，并用旋轉蒸發(fā)器將溶劑去除。將如此獲得的制品溶于NMP中，加入約含有約20mg/ml與NMP中的TBA鹽合的透明質酸的溶液。(100ml NMP中1.95g)。在室溫下發(fā)生7天的反應后，加入20ml水和4.5ml飽和NaCl溶液進行稀釋。將該溶液攪拌1小時，以使鈉與TBA離子發(fā)生交換。然后，慢慢地一次加入一滴乙醇，這樣獲得的絲狀制品在水中溶解、透析并最終經過凍干。
實施例11HA的部分自交聯(lián)的酯(約10％取代度)的制備，紫杉醇w/w為8％。
3.10g用TBA鹽化的HA在室溫下溶于150ml低含水量的DMSO中。然后用541.0mg按照實施例5、6和7所述的方法所獲得的中間紫杉醇進行補充。在室溫下反應7天后，用126.5g三乙胺補充反應溶液，然后將整個攪拌30分鐘。將319.5g 2-氯-1-甲基-嘧啶碘化物溶于30ml DMSO所得到的溶液以45分鐘的時間間隔慢慢加入一滴，讓混合物在30℃下保持15個小時。加入由50ml水和1.7g氯化鈉所獲得的溶液，然后將所獲得的混合物慢慢倒入400ml的丙酮，同時不斷地攪拌。對形成的沉淀過濾并用50ml 5∶1的丙酮水洗三次，再用50ml丙酮洗三次。將如此獲得的最終制品在38℃真空干燥。
實施例12按照實施例5獲得的HA-紫杉醇在5％葡萄糖溶液中的溶解度的測試。
將按照實施例7的酯化作用(從分子量為200kDa的HA開始)獲得的HA-紫杉醇制(羧基取代度為16.3％w/w)14.6mg溶于1ml 5％的葡萄糖水溶液中。用磁性攪拌棒攪拌的溶液，可以通過按裝在注射器上的0.20μm無菌過濾器進行過濾。在溶液中的紫杉醇濃度為2.38mg/ml。
我們還試圖發(fā)現在每1ml 5％的葡糖糖水溶液中，制品的最大濃度。在1ml葡萄糖溶液中含有32.8mg HA-紫杉醇制品的濃度下，獲得粘性溶液，紫杉醇濃度為5.35mg/ml。
實施例13從人血漿中回收紫杉醇的試驗用101.3mg HA-紫杉醇溶于10ml水所得到的溶液。按照實施例7中所述，制備HA-紫杉醇。
將40mg上述溶液與2ml人血漿在37℃發(fā)生接觸，進行回收實驗。
為了測定通過將紫杉醇自身從HA分離出來而釋放到血漿中的紫杉醇，設置三個別接觸時間6、30和60分鐘。在每個接觸間隔的終點，從沖洗三次的血漿-HA-紫杉醇溶液中提取紫杉醇，每次用1.5ml叔丁基甲基醚(TBME)，將其收集一起，在65℃環(huán)境中自然蒸發(fā)至干，并重新在40μl無水乙醇中形成懸浮液，以通過HPLC(高壓液體色譜法)測定所討論的藥品含量。獲得的結果如圖4所示。6分鐘后，80％以上的紫杉醇與HA分離，然后，在此后的觀察中，此百分比不再增大。
對于所述的發(fā)明，很顯然這些方法可以通過不同方式進行改善。這樣的改進不被認為偏離發(fā)明的精神和目的，在下面的權力要求中將討論對于此領域的專家很清楚明白的此類改進。
權利要求
1.與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷，其特征在于，共價鍵在紫杉烷的羥基和透明質酸或透明質酸衍生物的羧基或羥基，或者脫去乙?；耐该髻|酸的氨基之間形成，任選地通過間隔分子將紫杉烷連接到透明質酸或透明質酸衍生物上，但條件是所述間隔分子與酰肼不同。
2.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，紫杉烷選自紫杉醇和多西紫杉醇之間進行選取。
3.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，所述紫杉烷為紫杉醇。
4.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，所述透明質酸的分子量為400至3×106道爾頓。
5.根據權利要求4的紫杉烷，其特征在于，所述透明質酸的分子量為400至1×106道爾頓。
6.根據權利要求4的紫杉烷，其特征在于，所述透明質酸的分子量為400至230,000道爾頓。
7.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，所述透明質酸用有機堿和(或)無機堿成鹽。
8.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，所述透明質酸衍生物選自透明質酸與脂肪族、芳脂族、脂環(huán)族、芳香族、環(huán)狀和雜環(huán)類系列的醇形成的酯，所述酯的酯化度等于或低于50％。
9.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，所述透明質酸衍生物選自透明質酸與脂肪族、芳脂族、脂環(huán)族、芳香族、環(huán)狀和雜環(huán)類系列的胺形成的酰胺，所述酰胺的酰胺化度為0.1％到10％之間。
10.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，所述透明質酸衍生物選自透明質酸的O-硫酸化衍生物，硫酸化度最高達第4度。
11.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，所述透明質酸衍生物選自酯化度等于或低于15％的透明質酸內酯。
12.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，所述透明質酸衍生物選自透明質酸的脫乙酰產物，透其從N-乙酰氨基葡萄糖單元的脫乙?；玫?，脫乙酰化度為0.1％和30％之間。
13.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，所述透明質酸衍生物選自透明質酸的全羧化衍生物，其從N-乙酰氨基葡萄糖單元的伯羥基的氧化制得，全羧化度為1和100％之間。
14.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，所述共價鍵在紫杉烷的羥基和透明質酸或透明質酸衍生物的羥基之間形成。
15.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，所述共價鍵在紫杉烷的羥基和透明質酸或透明質酸衍生物的羧基之間形成。
16.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，所述共價鍵在紫杉烷的羥基和脫乙酰的透明質酸的氨基之間形成。
17.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，將紫杉烷連接到透明質酸或透明質酸衍生物上的間隔分子，選自脂肪族或芳脂族鏈(直鏈或支鏈)，被一個或多個選自羥基、羧基、羰基、環(huán)氧化物、酰氯、硫醇、硝基、鹵素、酐、異氰酸酯、異硫氰酸酯和氨基取代。
18.根據權利要求17的紫杉烷，其特征在于，間隔分子選自具有2-18個碳原子的脂肪族或芳脂族鏈的羧酸，其被溴取代。
19.根據權利要求17的紫杉烷，其特征在于，間隔分子選自具有3-10個碳原子的脂肪族或芳脂族鏈的羧酸，其被溴取代。
20.根據權利要求17的紫杉烷，其特征在于，間隔分子選自3-溴丙酸和4-溴丁酸。
21.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵為在間隔分子和透明質酸或透明質酸衍生物的羥基之間的酯鍵。
22.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵為在間隔分子和透明質酸或透明質酸衍生物的間隔分子和羥基之間的氨基甲酸酯鍵或硫代氨基甲酸乙酯鍵。
23.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵為在間隔分子和透明質酸或透明質酸衍生物的羥基之間的醚鍵。
24.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵為在間隔分子和透明質酸或透明質酸衍生物的羥基之間的縮醛鍵或縮酮鍵。
25.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵為透明質酸或透明質酸衍生物的羥基和紫杉烷的羥基之間的縮醛鍵。
26.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵為間隔分子和透明質酸或透明質酸衍生物的羧基之間的酯鍵。
27.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵為間隔分子和透明質酸或透明質酸衍生物的羧基之間的酰胺鍵。
28.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵為透明質酸或透明質酸衍生物的羧基和紫杉烷的羥基之間的酯鍵。
29.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵為間隔分子和脫乙酰的透明質酸的氨基之間的酰胺鍵。
30.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵為間隔分子和脫乙酰的透明質酸的氨基之間的氨基甲酸酯鍵或硫代氨基甲酸乙酯鍵。
31.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵為脫乙酰的透明質酸的氨基和紫杉烷的羥基之間的氨基甲酸鍵。
32.根據權利要求8的紫杉烷，其特征在于，透明質酸在與紫杉烷形成共價鍵后酯化。
33.根據權利要求11的紫杉烷，其特征在于，透明質酸在與紫杉烷形成共價鍵后酯化。
34.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵是紫杉烷和間隔分子之間的酯鍵。
35.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵是紫杉烷和間隔分子之間的氨基甲酸酯鍵或硫代氨基甲酸乙酯鍵。
36.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，共價鍵是紫杉烷和間隔分子之間的縮醛鍵或縮酮鍵。
37.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，透明質酸和紫杉烷的鍵百分比在0.1％和100％之間。
38.根據權利要求37的紫杉烷，其特征在于，透明質酸和紫杉烷的鍵百分比在0.1％和35％之間。
39.根據權利要求1的紫杉烷，其特征在于，透明質酸或透明質酸衍生物提高了紫杉烷的抗癌作用。
40.根據權利要求11的紫杉烷，其特征在于，透明質酸的內酯提高了紫杉烷的抗癌作用。
41.根據權利要求26的紫杉烷，其特征在于，透明質酸提高了紫杉烷的抗癌作用。
42.包含至少一種在權利要求1-41中定義的與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷作為活性物質，以及藥學上可接受的賦形劑和稀釋劑的藥物組合物。
43.根據權利要求42的藥物成分，其特征在于，通過口服、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮下、腹膜內或透皮等方式給藥，或直接注射到腫瘤部位。
44.根據權利要求42的藥物組合物，其特征在于，通過口服進入方式給藥。
45.根據權利要求42的藥物組合物，其特征在于，透明質酸或透明質酸衍生物能夠將紫杉烷釋放到給藥部位。
46.根據權利要求42-45的藥物組合物，其特征在于，還包含一種或多種生物學或藥理學活性物質。
47.根據權利要求46的藥物成分，其特征在于，所述生物學或藥理學活性物質選取自類固醇、荷爾蒙、營養(yǎng)素、蛋白質、維生素、非類固醇消炎藥、化療藥物、鈣離子阻斷劑、抗生素、抗病毒藥、白介素和細胞因子。
48.根據權利要求46的藥物成分，其特征在于，所述生物學或藥理學活性物質為干擾素。
49.使用在權利要求1-41定義的與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷，其特征在于，用于制備腫瘤治療的有用的藥物組合物的用途。
50.根據權利要求49使用，其特征在于，腫瘤的治療包括乳腺癌、卵巢癌和(或)子宮內膜癌、黑素瘤、肺癌、肝癌、前列腺和(或)膀胱癌、胃癌和(或)腸癌、白血病和卡波濟氏肉瘤的化療。
51.使用在權利要求1-41定義的與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷，用于制備對自體免疫病狀治療有用的藥物組合物的用途。
52.根據權利要求51使用，其特征在于，所述自體免疫病狀選自風濕性關節(jié)炎、橋本氏甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和自體免疫性血管球性腎炎。
53.使用在權利要求1-41定義的與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷，用于制備對再狹窄治療有用的藥物組和物的用途。
54.使用在權利要求1-41定義的與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷，用于對支架和醫(yī)療設備的涂布的用途。
55.用權利要求1-41定義的與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷進行涂布的支架和醫(yī)療設備。
56.用于制備與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的方法(其中共價鍵是酯鍵)，其特征在于，所述方法包括以下步驟A)通過活化劑活化紫杉烷的羥基，或者，分別活化透明質酸或透明質酸衍生物的羧基；B)添加透明質酸或透明質酸衍生物，或者，分別添加溶解在適當溶劑中的紫杉烷；C)任選地純化如此獲得的制品。
57.與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的制備方法(其中共價鍵是酯鍵)，其特征在于，所述方法包括以下步驟A’)制取紫杉烷的溴化物或甲苯磺酸酯；B’)通過透明質酸或透明質酸衍生物的羧基，進行從步驟A’)獲得的紫杉烷的溴化物或甲苯磺酸酯的親核取代；C’)任選地純化獲得的制品。
58.與脫乙酰透明質酸共價鍵合的紫杉烷的制備方法(其中共價鍵是氨基甲酸乙酯或硫代氨基甲酸乙酯鍵)，所述方法包括以下步驟D)用活化劑活化紫杉烷的羥基；E)添加溶解在適當溶劑中脫乙酰透明質酸；F)任選地純化如此獲得的制品。
59.與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的制備方法(其中共價鍵是乙酰鍵)，所述工藝包括以下步驟G)制取溶解在適當溶劑中的含有透明質酸或透明質酸衍生物以及紫杉烷的溶液；H)添加簡單羰基化合物，如甲醛；I)任選地純化如此獲得的制品。
60.通過至少有一個羧基的間隔分子并由酯鍵鏈接透明質酸或透明質酸衍生物的羥基，制備與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的方法，所述方法包括以下步驟L)活化間隔分子的羧基，可能先與紫杉烷鍵合；M)添加透明質酸或透明質酸衍生物；N)任選地純化如此獲得的制品，如果之前未與間隔分子鍵合，則與紫杉烷進行反應。
61.通過至少有一個羧基的間隔分子并由酯鍵鏈接羥基透明質酸或透明質酸衍生物，制取與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的方法，所述方法包括以下步驟L’)用甲苯磺?；蜾寤锶〈该髻|酸或透明質酸衍生物的羥基；M’)添加間隔分子，可能先與紫杉烷鍵合；N’)任選地純化如此獲得的制品，如果之前未與間隔分子鍵合，則與紫杉烷進行反應。
62.通過至少有一個酐基的間隔分子并由酯鍵鏈接羥基透明質酸或透明質酸衍生物，制取與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的方法，所述方法包括以下步驟L”)將間隔分子添加到含有透明質酸或透明質酸衍生物的溶液中；M”)任選地純化如此獲得的制品；N”)將步驟L”)或M”)獲得的該制品與紫杉烷進行反應。
63.通過至少有一個氨基的間隔分子并由氨基甲酸乙酯鍵或硫代氨基甲酸乙酯鍵連接羥基透明質酸或透明質酸衍生物，制備與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的的方，所述方法包括以下步驟O)通過活化劑，活化透明質酸或透明質酸衍生物的羥基；P)添加間隔分子，可能先與紫杉烷鍵合；Q)任選地純化如此獲得的制品，如果之前未與間隔分子鍵合，則與紫杉烷進行反應。
64.通過至少有一個異氰酸酯或異硫氰酸酯的間隔分子并由氨基甲酸乙酯鍵或硫代氨基甲酸乙酯鍵鏈接羥基透明質酸或透明質酸衍生物，制備與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的方法，所述工藝包括以下步驟O’)將透明質酸或透明質酸衍生物添加到含有間隔分子的溶液中，可能之前與紫杉烷鍵合；P’)任選地純化如此獲得的制品，如果之前未與間隔分子鍵合，則與紫杉烷進行反應。
65.通過至少有一個環(huán)氧基的間隔分子并由醚鍵鏈接羥基透明質酸或透明質酸衍生物，制備與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的方法，所述方法包括以下步驟R)將可能之前與紫杉烷鍵合的間隔分子，在有酸或堿性催化劑的情況下，添加到透明質酸或透明質酸衍生物的溶液中；S)任選地純化如此獲得的制品，如果之前未與間隔分子鍵合，則與紫杉烷進行反應。
66.通過至少有一個羥基的間隔分子并由醚鍵鏈接羥基透明質酸或透明質酸衍生物，制備與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的的方法，所述方法包括以下步驟R’)用甲苯磺?；蜾寤锶〈该髻|酸或透明質酸衍生物的羥基；S’)將間隔分子在堿性環(huán)境下添加到從步驟R’)中獲得的制品；T’)任選地純化如此獲得的制品；U’)將步驟S’)或T’)獲得的制品與紫杉烷進行反應。
67.通過至少有一個羰基的間隔分子并由縮醛鍵或縮酮鍵鏈接羥基透明質酸或透明質酸衍生物，制備與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的方法，所述方法包括以下步驟V)在酸或堿性環(huán)境下，將間隔分子添加到含有透明質酸或透明質酸衍生物的溶液中；W)任選地純化如此獲得的制品；Z)將步驟V)或W)獲得的制品與紫杉烷進行反應。
68.通過至少有一個羥基的間隔分子并由縮醛鍵或縮酮鍵鏈接羥基透明質酸或透明質酸衍生物，制備與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的方法，所述方法包括以下步驟V’)將簡單羰基化合物(例如甲醛)添加到一種含有透明質酸或透明質酸衍生物和的間隔分子的溶液中，間隔分子可能之前與紫杉烷鍵合；W’)任選地純化如此獲得的制品，如果之前未與間隔分子鍵合，則與紫杉烷進行反應。
69.通過至少有一個羥基的間隔分子并由酯鍵鏈接透明質酸或透明質酸衍生物的羧基，制備與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的方法，所述方法包括以下步驟a)將活化劑添加到含有透明質酸或透明質酸衍生物的溶液中；b)將可能之前與紫杉烷鍵合的間隔分子，添加到步驟a)中獲得的溶液；c)任選地純化如此獲得的制品，如果之前未與間隔分子鍵合，則與紫杉烷進行反應。
70.通過至少有一個鹵素(例如溴)的間隔分子并由酯鍵鏈接透明質酸或透明質酸衍生物的羧基，制備與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的方法，所述方法包括以下步驟a’)將之前可能與紫杉烷鍵合的間隔分子，添加到透明質酸或透明質酸衍生物的溶液中；b’)任選地純化如此獲得的制品，如果之前未與間隔分子鍵合，則與紫杉烷進行反應。
71.通過至少有一個氨基的間隔分子并由酰胺鍵鏈接透明質酸或透明質酸衍生物的羧基，制備與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的方法，所述方法包括以下步驟d)將活化劑添加到含有透明質酸或透明質酸衍生物的溶液中；e)將之前可能與紫杉烷鍵合的間隔分子，添加到步驟d)中獲得的溶液；f)任選地純化如此獲得的制品，如果之前未與間隔分子鍵合，則與紫杉烷進行反應。
72.通過至少有一個羧基的間隔分子并由酰胺鍵鏈接脫乙酰透明質酸的氨基，制備與脫乙酰透明質酸共價鍵合的紫杉烷的方法，所述方法包括以下步驟g)用活化劑活化可能之前與紫杉烷鍵合的間隔分子的羧基；h)添加含有脫乙酰透明質酸的溶液；i)任選地純化如此獲得的制品，如果之前未與間隔分子鍵合，則與紫杉烷進行反應。
73.通過至少有一個羥基的間隔分子并由氨基甲酸乙酯或硫代氨基甲酸乙酯鍵鏈接脫乙酰透明質酸的氨基，制備與脫乙酰透明質酸共價鍵合的紫杉烷的方法，所述方法包括以下步驟l)用活化劑活化可能之前與紫杉烷鍵合的間隔分子的羥基；m)添加含有脫乙酰透明質酸的溶液；n)任選地純化如此獲得的制品，如果之前未與間隔分子鍵合，則與紫杉烷進行反應。
全文摘要
本發(fā)明涉及與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷，特別是紫杉醇和多西紫杉醇，它對于腫瘤學領域、自體免疫性失調和再狹窄的治療領域使用的藥物組合物的制備是有用的。本發(fā)明還涉及與透明質酸或透明質酸衍生物共價鍵合的紫杉烷的制備方法，制取方法包括通過透明質酸和紫杉烷之間的直接合成，或通過引入透明質酸或透明質酸衍生物和紫杉烷之間的間隔分子而進行的間接合成。
文檔編號C08B37/00GK1705683SQ200380101570
公開日2005年12月7日 申請日期2003年10月10日 優(yōu)先權日2002年10月18日
發(fā)明者捷爾達得盧卡, 尼拉爾得馬瑞尼貝托羅, 露易莎馬瑞米哥尼科 申請人:菲迪爾制藥公司