一種從紅豆杉中高效提取紫杉醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從紅豆杉中高效提取紫杉醇的方法，特別是以紅豆杉為原料，超聲輔助酶解后，經(jīng)柱層析和堿性樹脂柱分離，重結(jié)晶精制，大幅提高了提取效率，降低了生產(chǎn)成本。
【背景技術(shù)】
[0002]紅豆杉(俗稱紫杉，yew)植物分類歸于裸子植物亞門(Gymnospcrloe)，在我國醫(yī)學(xué)中早有記載:《本草綱目》就記有紅豆杉治療霍亂、傷寒、排毒等療效。1971年美國化學(xué)家Wani等從產(chǎn)于北美的短葉紅豆杉(T.brevifolia)樹皮中分離出高抗癌活性紫杉燒二蔽化合物紫杉醇，發(fā)現(xiàn)紫杉醇具有獨特的抗腫瘤作用，它能與微管蛋白質(zhì)結(jié)合，形成穩(wěn)定的穩(wěn)管束，并使被解聚，將癌細(xì)胞停止在G2晚期或M期，抑制細(xì)胞復(fù)制，阻止癌細(xì)胞Z增殖。這一奇特的功效引起了 NCI的高度重視，促進(jìn)了臨床試驗研究。紫杉醇臨床研究始于1982年，到1989年完成了 1、11期的臨床試驗，1990年進(jìn)行III期臨床試驗。1992年12月29日美國國家食品與藥物管理局(FDA)正式批準(zhǔn)其作為晚期卵巢癌、肺癌、子宮癌等抗癌藥物上市。
[0003]紫杉醇是紅豆杉中主要活性成分，是萜類環(huán)狀結(jié)構(gòu)的天然次生代謝衍生物，因其含量低、結(jié)構(gòu)類似物較多、純度要求高、分離過程中易轉(zhuǎn)化等因素，給提取、分離和測定帶來了較大的困難，如何以低成本、簡單的工藝提取紫杉醇，將紫杉醇與其類似物分離(如與類似物三尖杉寧堿的分離)，獲得純度較高的紫杉醇產(chǎn)品，并對其進(jìn)行精確的測定就成為研究的重點。
[0004]常用的提取方法有:甲醇提取_有機溶劑萃取法、乙醇提取_有機溶劑萃取法等。萃取又可分為初級萃取和次級萃取，在這兩級萃取過程中，溶劑的選擇具有重要影響。常用的純化方法有:正相柱色譜法和反相色譜法主要包括常壓和低壓柱層析、干柱層析、制備性HPLC等法，以及一些較先進(jìn)的分離手段如HSCCC(高速逆流色譜)等。
[0005]紫杉醇作為一種抗癌藥品，臨床應(yīng)用對其純度的要求非常高，一般要大于99.0%，這就對紫杉醇的純化精制工藝提出了嚴(yán)格地要求?；谏鲜鲈颍倪M(jìn)或開發(fā)新工藝，尋求更為方便廉價的分離技術(shù)，越來越成為研究者們關(guān)注的熱點。
[0006]紫杉醇作為一種生物大分子物質(zhì)，受溫度、有機溶劑、酸、堿等環(huán)境條件的影響，易降解或異構(gòu)生成其它紫杉烷類物質(zhì)。如紫杉醇在強酸性或弱堿性環(huán)境條件下會降解為巴卡亭III或發(fā)生表位異構(gòu)生成7-表紫杉醇；溫度較高時也會發(fā)生降解反應(yīng)，生成相應(yīng)的小分子物質(zhì)。
[0007]在初級萃取過程中采用超聲技術(shù)，進(jìn)行超聲震蕩，以促進(jìn)原料中物質(zhì)的溶解，萃取過程所需的時間大為縮短。如果用紅豆杉植物體的枝葉作為紫杉醇的來源，由于枝葉特別是葉片中含有許多色素和蠟質(zhì)，無疑將大大增加紫杉醇提取分離的難度。
[0008]由于用來提取紫杉醇的天然紅豆杉資源有限，且天然紅豆杉屬于國家珍惜保護(hù)植物，因而天然紫杉醇原料藥的生產(chǎn)和供應(yīng)受到限制，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足紫杉醇的臨床應(yīng)用?，F(xiàn)在人們大規(guī)模種植紅豆杉，從中提取紫杉醇等物質(zhì)，以滿足臨床需要。但因紅豆杉種植生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)成本較高，傳統(tǒng)提取方法效率低，資源浪費嚴(yán)重，因而尋找一種從紅豆杉中高效提取紫杉醇的方法具有非常重要的意義。
[0009]目前有關(guān)紫杉醇類物質(zhì)的提取方法，大多采用有機溶劑對紅豆杉原料多次浸提，浸提液回收后再用有機溶劑萃取，再經(jīng)層析分離后結(jié)晶得到紫杉醇。這些方法存在最大問題是提取收率低，設(shè)備昂貴，并且造成了巨大的資源浪費，提高了生產(chǎn)成本，存在較大環(huán)保問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種從紅豆杉中高效提取紫杉醇的方法，有效解決了提取收率低、設(shè)備昂貴的問題，且環(huán)境友好，所得產(chǎn)品純度大于99.3%。
[0011]本發(fā)明的目的是提供一種從紅豆杉原料中高效提取紫杉醇的方法。
[0012]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0013]本發(fā)明提供了一種包括超聲輔助酶解、有機溶劑萃取、柱層析除雜、堿性樹脂柱連續(xù)純化分離、重結(jié)晶得精品為主要步驟的分離紫杉醇的方法。紅豆杉原料經(jīng)研磨后，在弱酸性條件下超聲酶解，有機溶劑萃取，再依次經(jīng)柱層析和堿性樹脂分離，重結(jié)晶精制。具體步驟為:
[0014]1)，取紅豆杉原料研磨過100-200目篩，向其中加入5-10倍量的水及0.1%的冰醋酸，加纖維素酶于超聲下酶解2-5小時；
[0015]2)，加入等體積的有機溶劑，超聲萃取0.5-2小時；
[0016]3)，靜置過濾，分液，水相用有機溶劑萃取2-3次，合并有機相；
[0017]4)，減壓除去有機溶劑，所得浸膏與等質(zhì)量中性氧化鋁拌樣，過200-300目硅膠或氧化鋁層析柱，石油醚和乙酸乙酯洗脫除去脂溶性雜質(zhì)，再以醇與乙酸乙酯混合液洗脫，TLC監(jiān)測，收集醇與乙酸乙酯流份；
[0018]5)，減壓除去醇與乙酸乙酯，所得粗品依次經(jīng)弱堿性樹脂柱、強堿性樹脂柱，二氯甲烷與丙酮混合液洗脫，得純品；
[0019]6)，純品再經(jīng)重結(jié)晶精制。
[0020]優(yōu)選的，其中步驟1)中，酶解溫度為室溫-50°C，超聲功率為20-80W。
[0021]優(yōu)選的，所述有機溶劑為甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙腈、丙酮中的一種或幾種。
[0022]優(yōu)選的，其中步驟2)中，超聲功率為300-500W。
[0023]優(yōu)選的，其中所述醇和乙酸乙酯混合液中，醇選自甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇中的一種或多種，且醇和乙酸乙酯的體積比為1: 0.1-1。
[0024]優(yōu)選的，其中所述二氯甲烷與丙酮混合液中，二氯甲烷與丙酮的體積比為
1: l-10o
[0025]優(yōu)選的，其中弱堿性樹脂為:聚丙烯酸甲酯型樹脂，強堿性樹脂為:聚苯乙烯型樹脂。
[0026]優(yōu)選的，重結(jié)晶在有機溶劑水溶液中進(jìn)行，保持溫度在0-5 °C，所述有機溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、乙腈中的一種或幾種，有機溶劑與水的體積比為0.3-0.9: 1。
[0027]優(yōu)選的，超聲輔助提取過程中，纖維素酶的加入量為紅豆杉原料重量的0.02-0.06%o
[0028]其中，步驟1)中，加入的水、冰醋酸以及纖維素酶的量以紅豆杉原料為基準(zhǔn)，步驟2)中，有機溶劑的加入量與水等體積。
[0029]本發(fā)明通過大量的研究和探索，獲得了上述紫杉醇分離純化的方法，使得紫杉醇的提取效率和純度都有很大的提升，提取過程環(huán)境友好，獲得了顯著的進(jìn)步。
[0030]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0031]本發(fā)明提供了一種操作簡單、成本低、重復(fù)性好、產(chǎn)品純度高的高效分離純化紫杉醇的方法。本發(fā)明以超聲輔助酶解為浸提手段，所用溶劑量較傳統(tǒng)方法大大降低，且提取效率高。酶解過程在弱酸存在下進(jìn)行，有效減少了對雜質(zhì)的浸提量，為后續(xù)處理提供了方便。簡單快速的柱層析過程能夠迅速除去脂溶性雜質(zhì)，減少純化過程中有機溶劑的用量。弱堿性樹脂和強堿性樹脂的聯(lián)合使用，可快速、高效分離出紫杉醇及性質(zhì)相近的雜質(zhì)，這些雜質(zhì)包括具有藥用價值的紫杉烷類化合物，可留作進(jìn)一步純化的原料。分離得到的紫杉醇純品，再經(jīng)重結(jié)晶，可獲得純度高于99.3%的精品，滿足臨床試驗對其產(chǎn)品純度的要求。
【具體實施方式】
[0032]實施例1
[0033]取紅豆杉原料0.5kg，研磨過100目篩，向其中加入5倍量的水及0.1 %的冰醋酸，室溫環(huán)境下，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%的纖維素酶，置于超聲(功率50W)下酶解5小時。酶解結(jié)束后，加入等體積的乙酸乙酯，超聲(功率400W)萃取1小時。靜置過濾，分液，