專利名稱：一種從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇是Wani等人于1971年首次從短葉紅豆杉中分離得到的一種天然抗癌藥物，它具有促進(jìn)微管雙聚體裝配成微管，使微管穩(wěn)定，從而阻礙細(xì)胞分裂，抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。由于紫杉醇的作用機(jī)理獨(dú)特、療效顯著，因此已用于轉(zhuǎn)移性卵巢癌、乳腺癌等小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌等的治療。對(duì)于紫杉醇的研究成為藥品行業(yè)研究的重點(diǎn)。
紫杉醇資源珍貴，價(jià)格居高難下，制備的收率成為制約紫杉醇成本的關(guān)鍵因素。在天然原料中紫杉醇的含量低，紫杉烷系列化合物共存，并含有大量植物臘、色素和樹(shù)膠等雜質(zhì)，因而，紫杉醇的分離難度極高。目前常用的工藝過(guò)程是將液—液萃取，色譜分離和重結(jié)晶等手段有機(jī)結(jié)合，并反復(fù)多次采用色譜手段。萃取和重結(jié)晶是紫杉醇回收率難以提高的制約因素，色譜過(guò)程中溶劑消耗大也使其加工成本居高難下。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單方便、回收率高、成本低廉的從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，這種方法利用發(fā)酵方式來(lái)提取紫杉醇，有利于破壞植物細(xì)胞壁，有利于紫杉醇的浸出，使提取時(shí)間縮短，提取工藝簡(jiǎn)化；濃縮液直接經(jīng)樹(shù)脂層析減少了溶劑損耗，縮短了工藝流程。
按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法包含下述步驟a、提取與濃縮粉碎后的紅豆杉全株按物料∶90％甲醇(重量比)＝1∶3～3.5的比例于溫度50～56℃下，利用超聲波提取50～55分鐘，得到濾液，再將濾液減壓濃縮，使?jié)饪s液的密度達(dá)到0.92～0.96kg/L，得濃縮液；b、一次層析上述濃縮液利用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行層析，按照樹(shù)脂∶濃縮液(重量比)＝1∶25～30的比例，采用甲醇水溶液為流動(dòng)相，流動(dòng)相洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)流出液的流速為0.5～1.5柱床體積/小時(shí)，收集紫杉醇段；c、一次結(jié)晶將一次層析后收集的紫杉醇段濃縮蒸干，按8～9mL/g的比例溶解在甲醇中，水浴加熱到50～55℃，同時(shí)在攪拌的情況下加入水，控制甲醇和水的比例為1∶3～3.5，靜止冷卻48～54小時(shí)，過(guò)濾結(jié)晶，低溫烘干后得黃白色粉末，紫杉醇的含量達(dá)到50～60％；d、二次層析將一次結(jié)晶獲得的黃白色粉末上硅膠柱層析，按黃白色粉末量∶硅膠∶二氯甲烷＝1∶2～2.2∶2～2.5(重量比)的比例拌勻成混合物，40～50℃烘干，過(guò)篩，按拌好干燥的混合物與硅膠1∶4～5(重量比)的比例裝入層析柱，采用正己烷與乙酸乙酯體系為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，收集紫杉醇段；e、二次結(jié)晶將經(jīng)過(guò)二次層析后收集的紫杉醇段進(jìn)行二次結(jié)晶，二次結(jié)晶的條件與一次結(jié)晶的條件相同，經(jīng)過(guò)二次結(jié)晶后，晶體中紫杉醇的純度達(dá)到99.5％。
在提取前，先進(jìn)行物料準(zhǔn)備選用人工種植的南方紅豆杉全株為原料，南方紅豆杉全株挖出后沖洗干凈，晾干，用粉碎機(jī)粉碎。在提取時(shí)，重復(fù)提取過(guò)程三次，再合并三次提取時(shí)獲得的所有濾液，然后進(jìn)行濃縮，同時(shí)回收甲醇，剩下的濾渣回收溶劑。所述大孔吸附樹(shù)脂為DA201或D101或AB-8。在一次層析中，甲醇水溶液濃度范圍為70～100％，洗脫方式為梯度洗脫，共分為四個(gè)梯度70～74％、80～84％、90～94％及98～100％，其中收集90～94％段為紫杉醇段。在二次層析中，硅膠為200～300目；在用正己烷與乙酸乙酯體系為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫時(shí)，先用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝7∶3洗脫；再用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7洗脫，并收集正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7的洗脫段為紫杉醇段，最后用純乙酸乙酯洗脫。
本發(fā)明從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法的優(yōu)點(diǎn)為1、采用紅豆杉全株發(fā)酵的方式，能破壞植物細(xì)胞壁，有利于紫杉醇的浸出，使提取時(shí)間縮短，減少了由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成的紫杉醇的損失。2、濃縮液直接經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂層析，減少了溶劑損耗，縮短了工藝流程。大孔吸附樹(shù)脂具有較好的吸附色素的能力，并能除去提取液中的水溶性雜質(zhì)。3、避免了萃取法、沉淀法、堿洗法雜質(zhì)去除不徹底，需反復(fù)多次、操作煩瑣、溶劑損耗大等弊端；4、極大地提高了后續(xù)色譜分離能力、降低了其負(fù)荷和費(fèi)用，工藝大為簡(jiǎn)化、總收率高。
本發(fā)明為制備紫杉醇提供了一種簡(jiǎn)單方便、回收率高、成本低廉的方法，發(fā)酵有利于破壞植物細(xì)胞壁，有利于紫杉醇的浸出，使提取時(shí)間縮短，提取工藝簡(jiǎn)化；濃縮液直接經(jīng)樹(shù)脂層析減少了溶劑損耗，縮短了工藝流程。使用本方法制備的紫杉醇含量≥99.5％，紫杉醇總收率≥85％。
具體實(shí)施例方式
1、物料準(zhǔn)備選用人工種植的南方紅豆杉全株為原料，南方紅豆杉全株挖出后沖洗干凈，晾干，用粉碎機(jī)粉碎。
2、提取與濃縮粉碎后的紅豆杉全株按物料∶90％甲醇(重量比)＝1∶3～3.5的比例于溫度50～56℃下，利用超聲波提取50～55分鐘；在提取時(shí)，重復(fù)提取過(guò)程三次，再合并三次提取時(shí)獲得的所有濾液，再將濾液減壓濃縮，使?jié)饪s液的密度達(dá)到0.92～0.96kg/L，同時(shí)回收甲醇，剩下的濾渣回收溶劑，得濃縮液；3、一次層析上述濃縮液利用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行層析，按照樹(shù)脂∶濃縮液(重量比)＝1∶25～30的比例，采用甲醇水溶液為流動(dòng)相，流動(dòng)相洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)流出液的流速為0.5～1.5柱床體積/小時(shí)，收集紫杉醇段；所述大孔吸附樹(shù)脂為DA201或D101或AB-8；在一次層析中，甲醇水溶液濃度范圍為70～100％，洗脫方式為梯度洗脫，共分為四個(gè)梯度(指甲醇水溶液的濃度)70～74％、80～84％、90～94％及98～100％，其中收集90～94％段為紫杉醇段。
4、一次結(jié)晶將一次層析后收集的紫杉醇段濃縮蒸干，按8～9mL/g的比例溶解在甲醇中，水浴加熱到50～55℃，同時(shí)在攪拌的情況下加入水，控制甲醇和水的比例為1∶3～3.5，靜止冷卻48～54小時(shí)，過(guò)濾結(jié)晶，低溫烘干后得白色發(fā)黃的針狀粉末，紫杉醇的含量達(dá)到50～60％；5、二次層析將第一次獲得的粉末上硅膠柱層析，按粉末量∶硅膠∶二氯甲烷＝1∶2～2.2∶2～2.5(重量比)的比例拌勻成混合物，40～50℃烘干，過(guò)篩，按拌好干燥的混合物與硅膠1∶4～5(重量比)的比例裝入層析柱，采用正己烷∶乙酸乙酯體系為流動(dòng)相，先用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝7∶3洗脫，再用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7洗脫，最后用純乙酸乙酯洗脫，收集正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7的洗脫段為紫杉醇段；在二次層析中所用的硅膠為200～300目；6、二次結(jié)晶第二次結(jié)晶的條件與第一次相同，經(jīng)過(guò)二次結(jié)晶，晶體中紫杉醇的純度達(dá)到99.5％。
下面描述具體的實(shí)施例。
實(shí)施例11、人工種植的南方紅豆杉全株鮮枝葉3kg，經(jīng)檢測(cè)紫杉醇含量為0.5/萬(wàn)，全株鮮枝葉粉碎過(guò)篩，發(fā)酵(24～48h)，90％甲醇水溶液超聲波提取(50℃，9L×3次，每次50分鐘)，提取液混合后濃縮，得濃縮液(10L)。
2、DA201型大孔吸附樹(shù)脂380g，經(jīng)甲醇浸泡前處理48小時(shí)后使用，將濃縮液(10L)經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂吸附，收集母液。
3、待母液收集完后，用70％甲醇水溶液洗脫，收集10L，80％甲醇水溶液洗脫，收集10L，90％甲醇水溶液洗脫，收集10L，此為紫杉醇收集液，最后直接用100％甲醇洗脫完畢。將紫杉醇收集液減壓濃縮蒸干，得紫杉醇浸膏(2g)，含量為7.2％，回收率96％。
4、紫杉醇浸膏(2g)溶解在16mL甲醇中，水浴加熱到50℃，同時(shí)在攪拌的情況下加入48mL水，靜止冷卻50h以上，過(guò)濾結(jié)晶，低溫烘干后得黃白色粉末(280mg)，紫杉醇的含量為50.5％，回收率為98％。
5、將黃白色粉末(280mg)上硅膠柱層析，正己烷∶乙酸乙酯為流動(dòng)相，先用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝7∶3洗脫，再用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7洗脫，此為紫杉醇段，最后用純乙酸乙酯洗脫。將紫杉醇段減壓濃縮蒸干后，用上述同樣的方法再結(jié)晶一次，得135mg結(jié)晶，紫杉醇含量可達(dá)到99.5％，回收率為95％。
6、從3kg(含量為0.5/萬(wàn))人工種植的南方紅豆杉全株鮮枝葉，經(jīng)過(guò)超聲波提取，大孔吸附樹(shù)脂層析，一次結(jié)晶，硅膠柱層析，二次結(jié)晶五步，得到純度為99.5％的結(jié)晶135mg，總回收率為89.6％。
實(shí)施例21、人工種植的南方紅豆杉全株鮮枝葉3kg，經(jīng)檢測(cè)紫杉醇含量為0.55/萬(wàn)，全株鮮枝葉粉碎過(guò)篩，發(fā)酵(24～48h)，90％甲醇水溶液超聲波提取(50℃，9L×3次，每次50分鐘)，提取液混合后濃縮，得濃縮液(12L)。
2、D101型大孔吸附樹(shù)脂400g，經(jīng)甲醇浸泡前處理48h后使用，將濃縮液(12L)經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂吸附，收集母液。
3、待母液收集完后，用72％甲醇水溶液洗脫，收集10L，82％甲醇水溶液洗脫，收集10L，92％甲醇水溶液洗脫，收集10L，此為紫杉醇收集液，最后直接用100％甲醇洗脫完畢。將紫杉醇收集液減壓濃縮蒸干，得紫杉醇浸膏(2.1g)，含量為7.5％，回收率95.5％。
4、紫杉醇浸膏(2.1g)溶解在16.5mL甲醇中，水浴加熱到52℃，同時(shí)在攪拌的情況下加入50mL水，靜止冷卻48h以上，過(guò)濾結(jié)晶，低溫烘干后得黃白色粉末(288mg)，紫杉醇的含量為52.8％，回收率為96.5％。
5、將黃白色粉末(288mg)上硅膠柱層析，正己烷∶乙酸乙酯為流動(dòng)相，先用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝7∶3洗脫，再用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7洗脫，此為紫杉醇段，最后用純乙酸乙酯洗脫。將紫杉醇段減壓濃縮蒸干后，用上述同樣的方法再結(jié)晶一次，得142mg結(jié)晶，紫杉醇含量可達(dá)到99.5％，回收率為93％。
6、從3kg(含量為0.55/萬(wàn))人工種植的南方紅豆杉全株鮮枝葉，經(jīng)過(guò)超聲波提取，大孔吸附樹(shù)脂層析，一次結(jié)晶，硅膠柱層析，二次結(jié)晶五步，得到純度為99.5％的結(jié)晶142mg，總回收率為85.6％。
實(shí)施例31、人工種植的南方紅豆杉全株鮮枝葉3kg，經(jīng)檢測(cè)紫杉醇含量為0.6/萬(wàn)，全株鮮枝葉粉碎過(guò)篩，發(fā)酵(24～48h)，90％甲醇水溶液超聲波提取(50℃，9L×3次，每次50分鐘)，提取液混合后濃縮，得濃縮液(12L)。
2、AB-8型大孔吸附樹(shù)脂400g，經(jīng)甲醇浸泡前處理48h后使用，將濃縮液(12L)經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂吸附，收集母液。
3、待母液收集完后，用74％甲醇水溶液洗脫，收集10L，84％甲醇水溶液洗脫，收集10L，94％甲醇水溶液洗脫，收集10L，此為紫杉醇收集液，最后直接用100％甲醇洗脫完畢。將紫杉醇收集液減壓濃縮蒸干，得紫杉醇浸膏(2.2g)，含量為7.8％，回收率95％。
4、紫杉醇浸膏(2.2g)溶解在18mL甲醇中，水浴加熱到50℃，同時(shí)在攪拌的情況下加入54mL水，靜止冷卻48h以上，過(guò)濾結(jié)晶，低溫烘干后得黃白色粉末(320mg)，紫杉醇的含量為51.5％，回收率為96％。
5、將黃白色粉末(320mg)上硅膠柱層析，正己烷∶乙酸乙酯為流動(dòng)相，先用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝7∶3洗脫，再用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7洗脫，此為紫杉醇段，最后用純乙酸乙酯洗脫。將紫杉醇段減壓濃縮蒸干后，用上述同樣的方法再結(jié)晶一次，得155mg結(jié)晶，紫杉醇含量可達(dá)到99.5％，回收率為93.6％。
6、從3kg(含量為0.6/萬(wàn))人工種植的南方紅豆杉全株鮮枝葉，經(jīng)過(guò)超聲波提取，大孔吸附樹(shù)脂層析，一次結(jié)晶，硅膠柱層析，二次結(jié)晶五步，得到純度為99.5％的結(jié)晶142mg，總回收率為85.7％。
權(quán)利要求
1.一種從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，該方法包括以下步驟a、提取與濃縮粉碎后的紅豆杉全株按物料∶90％甲醇(重量比)＝1∶3～3.5的比例于溫度50～56℃下，利用超聲波提取50～55分鐘，得到濾液，再將濾液減壓濃縮，使?jié)饪s液的密度達(dá)到0.92～0.96kg/L，得濃縮液；b、一次層析上述濃縮液利用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行層析，按照樹(shù)脂∶濃縮液(重量比)＝1∶25～30的比例，采用甲醇水溶液為流動(dòng)相，流動(dòng)相洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)流出液的流速為0.5～1.5柱床體積/小時(shí)，收集紫杉醇段；c、一次結(jié)晶將一次層析后收集的紫杉醇段濃縮蒸干，按8～9mL/g的比例溶解在甲醇中，水浴加熱到50～55℃，同時(shí)在攪拌的情況下加入水，控制甲醇和水的比例為1∶3～3.5，靜止冷卻48～54小時(shí)，過(guò)濾結(jié)晶，低溫烘干后得黃白色粉末，紫杉醇的含量達(dá)到50～60％；d、二次層析將一次結(jié)晶獲得的黃白色粉末上硅膠柱層析，按黃白色粉末量∶硅膠∶二氯甲烷＝1∶2～2.2∶2～2.5(重量比)的比例拌勻成混合物，40～50℃烘干，過(guò)篩，按拌好干燥的混合物∶硅膠按1∶4～5(重量比)的比例裝入層析柱，采用正己烷與乙酸乙酯體系為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，收集紫杉醇段；e、二次結(jié)晶將經(jīng)過(guò)二次層析后收集的紫杉醇段進(jìn)行二次結(jié)晶，二次結(jié)晶的條件與一次結(jié)晶的條件相同，經(jīng)過(guò)二次結(jié)晶后，晶體中紫杉醇的純度達(dá)到99.5％。
2.如權(quán)利要求1所述的從人工種植紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，其特征在于在提取前，先進(jìn)行物料準(zhǔn)備選用人工種植的南方紅豆杉全株為原料，南方紅豆杉全株挖出后沖洗干凈，晾干，用粉碎機(jī)粉碎。
3.如權(quán)利要求1所述的從人工種植紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，其特征在于，在提取時(shí)，重復(fù)提取過(guò)程三次，再合并三次提取時(shí)獲得的所有濾液，然后進(jìn)行濃縮，同時(shí)回收甲醇，剩下的濾渣回收溶劑。
4.如權(quán)利要求1所述的從人工種植紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，其特征在于，大孔吸附樹(shù)脂為DA201或D101或AB-8。
5.如權(quán)利要求1所述的從人工種植紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，其特征在于，在一次層析中，甲醇水溶液濃度范圍為70～100％，洗脫方式為梯度洗脫，共分為四個(gè)梯度70～74％、80～84％、90～94％及98～100％，其中，收集90～94％段為紫杉醇段。
6.如權(quán)利要求1所述的從人工種植紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，其特征在于，在二次層析中，硅膠為200～300目；在用正己烷與乙酸乙酯體系為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫時(shí)，先用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝7∶3洗脫；再用正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7洗脫，最后用純乙酸乙酯洗脫，其中，收集正己烷∶乙酸乙酯(體積比)＝3∶7的洗脫段為紫杉醇段。
全文摘要
一種從人工種植南方紅豆杉中全株提取紫杉醇的方法，過(guò)程為紅豆杉全株粉碎發(fā)酵，超聲波提取，大孔吸附樹(shù)脂層析脫色和純化，一次結(jié)晶，硅膠柱層析純化，二次結(jié)晶。其特征在于紅豆杉全株粉碎后，發(fā)酵，超聲波提?。挥锰崛『蟮臐饪s液直接經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂層析達(dá)到脫色和初步純化的目的。本發(fā)明為制備紫杉醇提供了一種簡(jiǎn)單方便、回收率高、成本低廉的方法，發(fā)酵有利于破壞植物細(xì)胞壁，有利于紫杉醇的浸出，使提取時(shí)間縮短，提取工藝簡(jiǎn)化；濃縮液直接經(jīng)樹(shù)脂層析減少了溶劑損耗，縮短了工藝流程。使用本方法制備的紫杉醇含量≥99.5％，紫杉醇總收率≥85％。
文檔編號(hào)C07D305/14GK1958580SQ20061009762
公開(kāi)日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2006年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月13日
發(fā)明者李弟貴, 任莉 申請(qǐng)人:江蘇紅豆杉生態(tài)科技有限公司