用于七種豬病病原鑒定的基因芯片及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物芯片領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿 菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和 豬傳染性胃腸炎病毒等7種病原鑒別檢測(cè)的芯片裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬支原體肺炎（Mycoplasmapneumoniaeofswine,MPS)、豬傳染性胸膜肺 炎（porcinecontagiouspleuropneumonia，PCP)、豬多發(fā)性衆(zhòng)膜炎與關(guān)節(jié)炎（Swine polyserositisandarthrithis)、豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。╬orcinecircovirus associateddisease,PCVAD)、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiveand respiratorysyndrome，PRRS)、豬痕（classicalswinefever,CSF)和豬傳染性 胃腸炎（transmissiblegastroenteritisofswine，TGE)分別是由豬肺炎支原體 (Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)、副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis,Hps)、豬圓環(huán)病毒（ porcinecircovirustype2,PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductive andrespiratorysyndromevirus,PRRSV)、豬 痕病毒（classicalswinefever virus,CSFV)和豬傳染性胃腸炎病毒（porcinetransmissiblegastroenteritis virus，TGEV)引起的一類急性、接觸性傳染病，廣泛存在于世界各地，嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè) 的發(fā)展。臨床上，七種病原的單一感染均會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的危害，而近年來常出現(xiàn)幾種 病原體混合感染或繼發(fā)感染的現(xiàn)象，不僅加大了對(duì)豬群的危害，而且增加了病原快速準(zhǔn)確 檢測(cè)的難度。
[0003] 近年來，隨著全球一體化的加快，不斷擴(kuò)大的國際貿(mào)易為動(dòng)物疫病的擴(kuò)散增加了 機(jī)會(huì)。傳統(tǒng)的病原分離鑒定和血清學(xué)方法，耗時(shí)長，需要專業(yè)的操作人員，已不能完全滿 足進(jìn)出口動(dòng)物疫病的快速、準(zhǔn)確及高通量檢測(cè)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病的檢測(cè)，但目前尚無可同時(shí)檢測(cè)七種病原的檢測(cè)方法。此外， APP、HPS和Mhp的培養(yǎng)條件比較苛刻，不利于分離培養(yǎng)；TGEV、PRRSV和CSFV均為RNA病毒， RNA易降解、不穩(wěn)定性一定程度上增加病原檢測(cè)的難度?；蛐酒℅enechip)是由DNA或 寡核苷酸探針密集排列在經(jīng)過共價(jià)結(jié)合醛基、氨基或多聚賴氨酸的固相支持物所形成的探 針陣列，在適當(dāng)?shù)臏囟?、濕度條件下，利用特異性探針與經(jīng)過適當(dāng)方式標(biāo)記的待檢樣品DNA 通過堿基互補(bǔ)配對(duì)雜交，然后通過相應(yīng)的檢測(cè)設(shè)備，檢測(cè)雜交信號(hào)的位置和強(qiáng)弱，判斷樣品 種類，完成疾病檢測(cè)和基礎(chǔ)研究等方面的工作。該方法具有高通量、平行化、微量化、自動(dòng) 化、低成本的優(yōu)點(diǎn)。結(jié)合基因芯片的優(yōu)勢(shì)，建立一種快速檢測(cè)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、 副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬 傳染性胃腸炎病毒的基因芯片技術(shù)，可滿足進(jìn)出口動(dòng)物攜帶病原的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，有效防 止動(dòng)物疫病通過國際貿(mào)易擴(kuò)散傳播。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、節(jié)時(shí)省力并且易于觀察結(jié)果的微 陣列芯片用于檢測(cè)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒 2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬傳染性胃腸炎病毒。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：用于豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、 副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬 傳染性胃腸炎病毒七種病原檢測(cè)的基因芯片，包括：PCR反應(yīng)混合液管、Taq聚合酶、PCR陽 性對(duì)照、PCR陰性對(duì)照、ddH20、檢測(cè)芯片、芯片探針的點(diǎn)樣分布、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌 檢測(cè)探針的核苷酸序列、副豬嗜血桿菌檢測(cè)探針的核苷酸序列、豬肺炎支原體檢測(cè)探針的 核苷酸序列、豬圓環(huán)病毒2型檢測(cè)探針的核苷酸序列、豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)探針 的核苷酸序列、豬瘟病毒檢測(cè)探針的核苷酸序列、豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)探針的核苷酸 序列、芯片蓋片、雜交液、雜交陽性對(duì)照、雜交盒。
[0006] 采用基因芯片微量點(diǎn)樣技術(shù)，將待測(cè)樣品探針與各種質(zhì)控探針固定在經(jīng)過化學(xué)修 飾的基片上，形成的微陣列。微陣列包括質(zhì)控探針區(qū)和待測(cè)樣品探針區(qū)，其中所述質(zhì)控探針 區(qū)內(nèi)設(shè)置下述分區(qū)： 點(diǎn)樣位置質(zhì)控分區(qū)P1，包含至少一個(gè)點(diǎn)樣位置質(zhì)控探針，SEQIDN0. 8; 雜交陽性質(zhì)控分區(qū)P2,包含至少一個(gè)雜交陽性質(zhì)控探針，SEQIDNO. 9; 雜交陰性質(zhì)控分區(qū)N，包含點(diǎn)樣緩沖液； 所述待測(cè)樣品探針區(qū)內(nèi)設(shè)置下述至少一個(gè)待測(cè)樣品探針的分區(qū)： 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌探針分區(qū)；副豬嗜血桿菌探針分區(qū)；豬支原體肺炎探針分 區(qū)；豬圓環(huán)病毒2型探針分區(qū)；豬繁殖與呼吸綜合征病毒探針分區(qū)；豬瘟病毒探針分區(qū)； 豬傳染性胃腸炎病毒探針分區(qū)。
[0007] 各個(gè)探針序列如下： 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌探針：SEQIDNO. 1 ; 副豬嗜血桿菌探針：SEQIDNO. 2 ; 豬支原體肺炎探針：SEQIDNO. 3 ; 豬圓環(huán)病毒2型探針：SEQIDNO. 4 ; 豬繁殖與呼吸綜合征病毒探針：SEQIDNO. 5 ; 豬瘟病毒探針：SEQIDNO. 6 ; 豬傳染性胃腸炎病毒探針：SEQIDNO. 7。
[0008] 利用上述芯片檢測(cè)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬 圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的檢測(cè)方法，包 括如下步驟： (1) 待測(cè)樣品制備：按照商品化DNA/RNA提取試劑盒使用說明書提取待測(cè)樣品全基因 組DNA/RNA，制備待測(cè)樣品DNA/cDNA; (2) ?0?擴(kuò)增：25 1^?0?反應(yīng)液包含：^39酶12.5 1^、引物組1:3.11^、待測(cè) 樣品DNA/cDNA5yL、無核酸酶滅菌水4. 4uL; 其中，所述引物Mix含有： 序列為SEQIDN0. 10的10ymol/L豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌上游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 11的10ymol/L豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌下游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 12的10ymol/L副豬嗜血桿菌上游引物0. 1yL， 序列為SEQIDNO. 13的10ymol/L副豬嗜血桿菌下游引物0.lyL， 序列為SEQIDNO. 14的10ymol/L豬肺炎支原體上游引物0. 1yL， 序列為SEQIDNO. 15的10ym〇l/L豬肺炎支原體下游引物0.lyL， 序列為SEQIDNO. 16的10ymol/L豬圓環(huán)病毒2型上游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 17的10ymol/L豬圓環(huán)病毒2型下游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 18的10ymol/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒上游引物0. 1yL， 序列為SEQIDNO. 19的10ymol/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒下游引物0. 1yL， 序列為SEQIDNO. 20的10ymol/L豬瘟病毒上游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 21的10ymol/L豬瘟病毒下游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 22的10ym〇l/L豬傳染性胃腸炎病毒上游引物0.lyL， 序列為SEQIDNO. 23的10ym〇l/L豬傳染性胃腸炎病毒下游引物0.lyL序列為SEQIDNO. 24的20ymol/L通用引物上游引物1yL， 序列為SEQIDNO. 25的20ymol/L通用引物下游引物lyL. 按如下步驟進(jìn)行擴(kuò)增：94°C5min;94°C30sec，56°C30sec，72°C25sec循環(huán) 12 次；94°C30sec，5(TC30sec，72°C25sec循環(huán) 30 次；72°C5min; (3) 雜交：首先配制雜交液，包括雜交緩沖液7.9yL、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8yL、雜交陽性對(duì) 照0. 1yL，混勻后95°C變性8min，冰上放置5min，然后取其中15yL雜交液進(jìn)行雜交； (4) 結(jié)果判讀：用微陣列芯片掃描儀掃描分析，去除陰性對(duì)照背景，與芯片雜交說明對(duì) 照，判定結(jié)果。
[0009] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： (1)成功地構(gòu)建了APP&HPS&Mhp&PCV2&PRRSV&CSFV&TGEV檢測(cè)基因芯片：本發(fā)明所制備 的基因芯片采用的各條篩選探針可與對(duì)應(yīng)病原體目的基因進(jìn)行特異性結(jié)合，雜交信號(hào)較強(qiáng) 且穩(wěn)定。
[0010] (2)制備的檢測(cè)基因芯片具有良好的方法學(xué)特征：本發(fā)明建立了一種特異性好、靈 敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)和節(jié)時(shí)省力的基因芯片檢測(cè)方法。
[0011] (3)檢測(cè)基因芯片的構(gòu)建，為混合感染疾病的同步檢測(cè)和鑒別診斷提供快速、高效 的手段：為今后出入境動(dòng)物檢疫和相應(yīng)疫病控制提供了技術(shù)保障。對(duì)滿足進(jìn)出境動(dòng)物檢疫 工作的需要，控制豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2 型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的傳播，保障我國的畜牧業(yè) 安全、健康發(fā)展具有十分重要的意義。
【附圖說明】
[0012] 圖1是芯片探針分布不意圖； 圖2是豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌雜交結(jié)果； 圖3是副豬嗜血桿菌雜交結(jié)果； 圖4是豬肺炎支原體雜交結(jié)果； 圖5是豬圓環(huán)病毒2型雜交結(jié)果； 圖6是豬繁殖與呼吸綜合征病毒雜交結(jié)果； 圖7是豬痕病毒雜父結(jié)果； 圖8是豬傳染性胃腸炎病毒雜交結(jié)果； 圖9是七種病原核酸雜交結(jié)果； 圖中：P1-點(diǎn)樣位置質(zhì)控分區(qū)；P2-雜交陽性質(zhì)控分區(qū)；N-雜交陰性質(zhì)控分區(qū)；1-豬傳 染性胸膜肺炎放線桿菌探針分區(qū)；2-副豬嗜血桿菌探針分區(qū)；3-豬肺炎支原體探針分區(qū)； 4_