專利名稱：：將基因表達譜與蛋白質(zhì)表達譜相關聯(lián)的方法相關申請的交叉引用本申請要求于2001年2月16日申請的USSN60/269,772的優(yōu)先權，將其全文并入此處作為參考。關于在聯(lián)邦政府資助研發(fā)下做出的發(fā)明的權利的聲明不適用。
背景技術：
：基因組學是對一種物種全部的基因(基因組)進行的研究，以及對那些基因在不同和相同細胞中，隨時間及發(fā)育的各個階段，在各種環(huán)境條件下的功能和活性進行的研究。不同的基因功能和活性對細胞在體內(nèi)發(fā)展出專門的活性、以及健康細胞向病理細胞的轉(zhuǎn)變起著重要的作用。在細胞中遺傳信息的表達是通過轉(zhuǎn)錄中間體分子mRNA而進行的。細胞將表達的mRNA翻譯成多肽或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)會實現(xiàn)基因編碼的大多數(shù)功能。對一種物種的全部蛋白質(zhì)(蛋白組)，以及那些蛋白質(zhì)在細胞中的活性和功能進行的研究是一個新的生物學領域的主題，叫做“蛋白質(zhì)組學(proteomics)”。因為細胞的特性取決于該細胞表達的基因，因此制作基因表達譜已成為基因組學中的重要手段。制作基因表達譜設法測定在細胞中哪些基因被表達以及其表達水平。因此，細胞的基因表達譜(expressionprofile)就可提供細胞特征性的″指紋″，指示著該細胞的身份及其活性。比較不同細胞的基因表達譜的方法叫做“差異基因表達”。該方法可提供基因的信息，所述基因負責細胞的不同表型。在健康及病理性細胞中差異表達的基因可作為診斷標記和候選靶物質(zhì)用于治療性干預。因此，獲得不同細胞類型的準確基因表達譜是一個重要的目標。目前有許多方法用于制備細胞基因表達譜。這些方法包括傳統(tǒng)方法，如Northern印記，RT-PCR，核酸酶保護，差異顯示，cDNA指紋圖譜，及減法雜交，以及更新的方法，如產(chǎn)生已表達序列標志，或“EST”文庫和陣列，cDNA陣列，mRNA陣列，寡核苷酸陣列，和基因表達系列分析(serialanalysis)或“SAGE”(通常參見Lockhar&Winzeler，Nature405827-836(2000)；還可參見Velculeseu等，Science270484-487(1995))。在一個實例中，使用核酸陣列，如寡核苷酸陣列用于繪制表達譜。這些陣列是特別選擇的寡核苷酸的集合，這些寡核苷酸與固體支持物在預先確定的可尋址位置結(jié)合。在一些實施方式中，這些陣列包含寡核苷酸，其能夠特異地識別一個基因組中每一個已知的基因。來自細胞的信使RNA或cDNA被應用于該陣列。每個mRNA或cDNA都可與相應于特定基因的寡核苷酸雜交，該mRNA或cDNA是由所述基因轉(zhuǎn)錄而形成。由于每個固定的寡核苷酸的身份(identity)和位置是預先確定的，因此每個雜交事件都表明該細胞已經(jīng)表達了特定的基因。一個商品化的寡核苷酸陣列是來自Affymetrix的GeneChipTM。還有另一個商品化陣列方法范例用陣列或細胞包被珠子，每個珠子都與一個光學傳感分子相連。將珠子吸入光導纖維束纖維的末端孔內(nèi)以提供地址(例如參見BeadarrayTM(Illumina))。在另一實例中，可從EST文庫產(chǎn)生陣列。EST文庫通過反向轉(zhuǎn)錄在細胞中被表達的一套mRNA而產(chǎn)生。經(jīng)常并不用反向轉(zhuǎn)錄整個的mRNA，而是轉(zhuǎn)錄其中的一部分，該部分足以專一性地標識出表達該mRNA的基因。測序并在基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定EST。盡管現(xiàn)有基因表達技術的有力的，但仍應承認mRNA轉(zhuǎn)錄的水平并不總是直接與蛋白質(zhì)表達的水平相關，這有許多理由(1)不同的mRNA可能以不同的效率被翻譯成多肽；(2)在不同細胞中一個mRNA可能被差別性地拼接而產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)；(3)表達的多肽可能以不同的速率降解；以及(4)多肽可經(jīng)受翻譯后修飾，所以同一個多肽可能在相同和不同的細胞中呈現(xiàn)不同的形式或功能。因此，有必要將mRNA的表達與蛋白質(zhì)表達相互關聯(lián)起來(例如參見，Hancock等，Anal.Chem.News&Features，1999年11月1日，742A-748A頁；Nelson等，Electrophoresis211823-1831(2000))。同時，當前的蛋白質(zhì)表達譜繪制(expressionprofiling)方法，如質(zhì)譜分析法，2D凝膠電泳和層析法在靈敏度和分辨率上都有一些限制(例如參見，Pandey&Mann，Nature405837-846(2000))。所以本發(fā)明通過將繪制基因表達譜和蛋白質(zhì)圖譜相結(jié)合來解決這個問題，以在特殊的細胞類型中更快速精確地鑒定目的蛋白質(zhì)?；虮磉_譜被用于選擇在細胞中表達的候選的轉(zhuǎn)錄本。該轉(zhuǎn)錄本典型地被測序并用于推斷該編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。然后將氨基酸序列用于預測及鑒定該轉(zhuǎn)錄本所編碼的蛋白質(zhì)的理化特征，例如分子量，等電點，疏水性，親水性，糖基化作用，磷酸化作用，表位序列，配體結(jié)合序列，指定pH下的電荷，或金屬螯合物結(jié)合。然后利用這些理化特征來改進蛋白質(zhì)圖譜繪制的靈敏度及分辨率，從而更好地提供在特定細胞類型中表達的mRNA所編碼的蛋白質(zhì)的相關信息。本發(fā)明提供用于形成這種相互關系的方法，并同時具有其它優(yōu)點。發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供將基因表達與蛋白質(zhì)表達相互關聯(lián)的方法。該方法包括制備樣品的基因表達譜，選擇一個或多個表達的基因用于進一步的研究，測定這些基因所編碼的蛋白質(zhì)的特征性理化特性，并在樣品的蛋白質(zhì)表達譜中將這些理化特性作為標識，確定這些蛋白質(zhì)在樣品中是否表達。在某些實施方式中，選擇的基因在兩個目的細胞或樣品中，例如，在一個健康細胞和一個病理性細胞，或者處于細胞周期、成熟或分化途徑的不同階段的兩個細胞，或處于不同環(huán)境條件下的兩個細胞中被差異表達。在一個優(yōu)選實施方式中，使用質(zhì)譜法分級分離蛋白質(zhì)。在另一個優(yōu)選實施方式中，使用SELDI(表面增強的激光解吸電離)(surfaceenhancedlaserdesorptionionization)分級分離蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的方法可用于鑒定靶蛋白質(zhì)以進行藥物開發(fā)，以及用于鑒定診斷標記和疾病的狀態(tài)，所述疾病如癌癥如前列腺，乳腺，肺，膀胱，卵巢，結(jié)腸，腦和腎的癌癥；癌轉(zhuǎn)移；糖尿病(包括幼年型和成年型(late-onset))；自身免疫疾病，如類風濕性關節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥；心臟病，例如心肌梗死，動脈粥樣硬化，和心肌??；腦血管疾病，例如中風；腎??；肺病，例如肺氣腫；病毒性感染，例如HIV，HCV，CMV，HPV，HBV；細菌性感染，例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)，產(chǎn)毒性大腸桿菌(E.coli)，鏈球菌屬(Streptococcussp.)，葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)；真菌性感染；原生動物感染，例如瘧疾，血吸蟲病，查加斯病。本發(fā)明的方法還可用于研究不同等位基因的表達產(chǎn)物，例如用于藥物遺傳學應用。本發(fā)明的方法還可用于毒理學研究，以及用于研究細胞暴露在變化的環(huán)境條件，例如輻射，紫外輻射，熱，以及冷中的影響。不適用。發(fā)明詳述引言本發(fā)明提供將RNA和蛋白質(zhì)表達譜制備相結(jié)合的方法，用于鑒定不同條件下細胞所表達的基因和蛋白質(zhì)，所述不同條件為例如細胞周期的不同時期，變化的環(huán)境條件(例如離子流入或者流出；暴露于以下物質(zhì)毒素；藥物；配體；例如激素，細胞因子，或趨化因子；或者病原體，例如病毒，細菌，原生動物，或者真菌)，變化的病理學條件例如癌癥，成熟和分化過程中的不同時期，生物體發(fā)育的不同時期，應答的過程(例如炎癥)中，不同的組織類型或器官，不同的病理學條件如癌癥或自體免疫疾病，不同表型性狀的個體之間，例如對特定藥物有反應的個體和沒有反應的個體之間，等等。例如，本發(fā)明的方法可允許本領域技術人員鑒定在細胞或生物樣品中表達的一系列候選基因，然后使用本發(fā)明方法進一步鑒定目的基因所編碼的目的蛋白子集。本發(fā)明的方法還可將涉及mRNA表達的信息與該mRNA所編碼的蛋白的表達和功能相結(jié)合。因此本發(fā)明提供一種使細胞中基因和蛋白的表達相互關聯(lián)的方法，包括以下步驟獲取生物樣品；產(chǎn)生樣品的基因表達譜，從而鑒定樣品中表達的一個或多個mRNA；預測并鑒定該RNA所編碼的多肽的一個或多個理化特性；并通過分級分離樣品中的多肽，鑒定該mRNA所編碼的一個或多個多肽，即樣品中具備所述的理化特性的多肽，從而使樣品中基因和蛋白的表達相互關聯(lián)。在一個實施方式中，產(chǎn)生基因表達譜的步驟包括用EST陣列、mRNA陣列或寡核苷酸陣列鑒定表達的mRNA。在另一個實施方式中，鑒定多肽的步驟包括使用2-D電泳，層析法，質(zhì)譜法或SELDI分級分離樣品中的多肽。在另一個實施方式中，理化的特征選自氨基酸序列，分子量，等電點，疏水性，親水性，電荷(例如等電點)，糖基化作用，磷酸化作用，表位序列或抗體結(jié)合，配體結(jié)合，染料結(jié)合，以及金屬螯合物結(jié)合。在另一個實施方式中，鑒定理化特征的步驟包括預測在利用選定的蛋白水解試劑降解該編碼多肽后所產(chǎn)生的蛋白水解片段的質(zhì)量，且鑒定多肽的步驟包括用該試劑降解樣品中的多肽，并鑒定樣品中質(zhì)量對應于預測片段的質(zhì)量的實際蛋白水解片段。在另一個實施方式中，樣品包括人類細胞。在另一個實施方式中，樣品包括來自正?；蚪】导毎募毎芙馕?。在另一個實施方式中，樣品包括來自病理性細胞的細胞溶解物。在另一個實施方式中，樣品包括與有毒化合物接觸過的細胞的細胞溶解物。在另一個實施方式中，生物樣品包括受檢者細胞的細胞溶解物，所述受檢者對藥物處理有反應或?qū)λ幬锾幚頉]有反應。在一個實施方式中，樣品是人體的組織。在另一個實施方式中，mRNA在兩個生物樣品中差異表達。在另一個實施方式中，兩個生物樣品是正?；蚪】导毎约安±硇约毎?，例如癌細胞。在另一個實施方式中，兩個生物樣品來源于健康細胞和毒性化合物接觸過的細胞。在另一個具體實施方式中，樣品包括活檢組織；培養(yǎng)的細胞，例如轉(zhuǎn)化細胞，來自細胞系的細胞，外植塊，或原代培養(yǎng)物；血液，血清，痰，糞便，或尿液。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，該方法包括以下步驟獲取生物樣品；使用核酸陣列制備細胞的基因表達譜，從而鑒定該細胞中表達的一個或多個mRNA；鑒定此mRNA所編碼多肽的一種或多種理化特性；并用質(zhì)譜法分級分離樣品中的多肽，鑒定出具備所述理化特性的多肽；從而使該細胞中基因和蛋白的表達相互關聯(lián)。在本發(fā)明的一優(yōu)選方面，本方法包括以下步驟獲取含有細胞的生物樣品；使用寡核苷酸陣列產(chǎn)生細胞的基因表達譜，從而鑒定該細胞中表達的一個或多個mRNA；鑒定此mRNA所編碼多肽的一種或多種理化特性；并用SELDI法分級分離樣品中的多肽，鑒定具備此理化特性的多肽，其中的SELDI包括利用親合力在固相結(jié)合的吸附劑上滯留從而達到分級分離，然后用氣相離子光譜法(gasphaseionspectrometry)從固相上分級分離滯留的蛋白；從而使該細胞中基因和蛋白的表達相互關聯(lián)。在一個實施方式中，該方法包括使用一種以上的方法來鑒定樣品中表達的mRNA或蛋白。在一個實施方式中，利用基因組陣列(genomicsarrays)比較管家基因與其它的組織特異性基因的表達。在一個實施方式中，基因組陣列可比較差異水平的基因表達。在一個實施方式中，基因組陣列可比較類似水平的基因表達。定義除非另有說明，否則，本文使用的所有專業(yè)和科學術語具有本發(fā)明所屬領域技術人員通常理解的含義。以下參考文獻為本領域技術人員提供了本發(fā)明所用許多術語的一般定義Singleton等，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(2nded.1994)；TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology(Walkered.，1988)；TheGlossaryofGehetics，5thEd.R.Rieger等，(eds.)，SpringerVerlag(1991)；和Hale&Marham，TheHarperCollinsDictionaryofBiology(1991)。除非另有說明，在本文中使用的以下術語定義為“生物樣品”指來自病毒，細胞，組織，器官或生物體(真核或原核生物)的樣品，包括但不限于細胞，組織或器官溶解物或勻漿物，或體液樣品，例如，血液，尿液，痰或腦脊髓液。這種樣品包括，但不限于從人體分離的組織，或源于它們的外植塊、原代和轉(zhuǎn)化了的細胞培養(yǎng)物。生物樣品還可包括組織的切片，如為組織學目的采取的冰凍切片。生物樣品可從真核生物體獲得，如真菌，植物，昆蟲，原生動物，鳥類，魚類，爬行動物，優(yōu)選哺乳動物，如大鼠，小鼠，母牛，狗，豚鼠，或兔，最優(yōu)選靈長目動物，如黑猩猩或人類?！吧锞酆衔铩敝干飦碓吹木酆衔?，例如多肽，多核苷酸，多糖或甘油多酯(polyglycerides)(例如甘油二或三酯)?！岸嚯摹敝赣砂被釟埢?、其相關天然結(jié)構變體及非天然合成類似物通過肽鍵連接而成的聚合物，及其天然變體和非天然合成類似物?？梢杂米詣佣嚯暮铣蓛x來制備合成多肽?！暗鞍踪|(zhì)”一般指大的多肽。“肽”一般指短多肽。“多核苷酸”或“核酸”指由核苷酸單元構成的聚合物。多核苷酸包括諸如脫氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)的天然核酸和核酸類似物。核酸類似物包括含有非天然堿基、或含有以非天然磷酸二酯鍵(而不是天然磷酸二酯鍵)與其它核苷酸連接的核苷酸，或含有以非天然磷酸二酯鍵連接的堿基的核酸類似物。這樣，核苷酸類似物包括但不限于硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基磷酸酯，硼烷磷酸酯(boranophosphates)，甲基磷酸酯(methylphosphonates)，手性-甲基磷酸酯，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNA)等等。這些多核苷酸可用例如自動DNA合成儀來合成?！昂怂帷币话阒复蟮亩嗪塑账帷！肮押塑账帷币话阒付痰亩嗪塑账?，一般不超過50個核苷酸。應當理解，當用DNA序列(即，A，T，G，C)表示核苷酸序列時，也包括以“U”代替“T”的RNA序列(即，A，U，G，C)?！翱蓽y部分”或“標記”指可以用分光術，光化學，生物化學，免疫化學或化學方法測定的組分。有用的“標記”包括例如，32P，35S，熒光染料，電子密(electron-dense)試劑，酶(例如ELISA中常用的那些)，生物素-鏈霉親合素，dioxigenin，可以得到其抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白質(zhì)，或者序列與靶分子互補的核苷酸分子。這些可測部分通常產(chǎn)生一個可測信號，如放射性，生色性或熒光信號，這些信號可用于確定樣品中結(jié)合的可測部分的量?？蓽y部分可通過共價鍵、離子鍵，范德華力或氫鍵摻入或結(jié)合引物或探針，例如，摻入放射性核苷酸或可被鏈霉親合素識別的生物素化核苷酸?？芍苯踊蜷g接測定可測部分。間接測定可涉及將第二直接可測或間接可測部分與所述可測部分結(jié)合。例如，所述可測部分可以是與結(jié)合伴侶(partner)的配體，所述結(jié)合伴侶為例如作為鏈霉親合素的結(jié)合伴侶的生物素，或作為能與其特異雜交的互補序列的結(jié)合伴侶的一段核苷酸序列。結(jié)合伴侶本身可能是直接可測的，例如，抗體本身可被熒光分子標記。結(jié)合伴侶也可能是間接可測的，例如，具有互補核苷酸序列的核酸可能是分支DNA分子的一部分，而后者可通過與其它經(jīng)標記的核酸分子雜交而被檢測。(例如參見，F(xiàn)ahrlander&Klausner，BioTechnology61165(1988))。信號定量可通過例如，閃爍計數(shù)，密度測定法，或流式細胞計量術來進行。“分離的”、“純化的”或“生物純的”指一種材料，該材料實質(zhì)上或本質(zhì)上不含有在其天然狀態(tài)下通常伴隨其的各組分。通常使用分析化學方法測定純度和均一性，如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法。在制品中占主導地位的蛋白質(zhì)或核酸實質(zhì)上是純化的。特別地，一個分離的核酸是從該基因側(cè)翼的開放閱讀框分離出來的核酸，其中所述開放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)不同于該基因編碼的蛋白質(zhì)?！凹兓摹北硎竞怂峄虻鞍踪|(zhì)在電泳凝膠中基本上只產(chǎn)生一條帶。特別地，這指的是該核酸或蛋白質(zhì)的純度不低于85％，更優(yōu)選不低于95％，最優(yōu)選不低于99％?！凹兓被颉疤峒儭敝溉コ兓M合物中的至少一種雜質(zhì)。純化并不要求純化后的化合物純度達到100％?！爸亟M”當用于描述，例如，細胞，核酸，蛋白質(zhì)，或載體時，指該細胞，核酸，蛋白質(zhì)或載體通過導入異源核酸或蛋白質(zhì)或者改變天然核酸或蛋白質(zhì)而被修飾，或者指來源于如此修飾的細胞的細胞。因此，例如，重組細胞可以表達該細胞的天然(非重組細胞)形式中不存在的基因，或者表達那些原本異常表達、下調(diào)表達或根本不表達的天然基因?！爸亟M多核苷酸”指包含的序列在天然條件下并不連接在一起的多核苷酸?？蓪U增或組裝而成的重組多核苷酸包含在合適的載體內(nèi)，再用該載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞。含有重組多核苷酸的宿主細胞被稱為“重組宿主細胞”。然后在重組宿主細胞內(nèi)表達此基因，產(chǎn)生例如“重組多肽”。重組多核苷酸也可以行使非編碼功能(例如啟動子，復制起點，核糖體結(jié)合位點等)。合適的單細胞宿主包括常用于表達真核或哺乳動物多核苷酸的宿主，包括例如原核細胞如大腸桿菌；以及真核細胞，包括例如真菌，如酵母；還有哺乳動物細胞，包括昆蟲細胞(例如Sf9)和動物細胞，如CHO，R1.1，B-W，L-M，非洲綠猴腎細胞(例如COS1COS7，BSC1，BSC40和BMT10)以及培養(yǎng)的人細胞。“異源”當用于描述核酸的部分時，表明該核酸含有兩個或更多子序列，這些子序列在自然界中彼此并不具有相同的親緣關系。例如，該核酸通常由重組產(chǎn)生，具有兩個或更多來自不相關基因的序列，如來自某個來源的啟動子和來自另一來源的編碼區(qū)域，這些序列經(jīng)排列形成新的功能性核酸。類似地，異源蛋白質(zhì)指含有兩個或更多子序列的蛋白質(zhì)，這些子序列在自然界中并沒有相同的親緣關系(例如融合蛋白)?！斑x擇性(或特異性)雜交”指當序列存在于復雜混合物(如細胞的總DNA或RNA，或文庫DNA或RNA)中時，分子僅僅與特定核苷酸序列在嚴格雜交條件下結(jié)合，形成雙鏈體，或雜交。“嚴格雜交條件”指在該條件下探針可以與其目的子序列雜交但不與其它序列雜交，所述子序列通常在復雜的核酸混合物中。嚴格條件要視序列而定，并且在不同的環(huán)境中可以改變。較長的序列在較高的溫度下特異雜交。Tijssen，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicProbes，″雜交原理和核酸測定策略的綜述″(1993)提供了核酸雜交的廣義指導。通常，對于特定的序列的嚴格條件被選擇為在定義的離子強度pH下，比熱熔點(Tm)低大約5-10℃的溫度。Tm溫度是指在該溫度下(在指定離子強度，pH，以及核酸濃度下)，達平衡時，有50％與靶物質(zhì)互補的探針與該靶序列雜交(因為靶序列過量存在，故在Tm下達平衡時有50％的探針被占用)。嚴格條件是指在該條件下，在pH7.0到8.3時，鹽濃度低于約1.0M鈉離子，通常約為0.01-1.0M鈉離子濃度(或其它鹽類)，對于短探針(如10-50個核苷酸)而言，該溫度至少約為30℃，而對長探針(大于50個核苷酸)而言，該溫度至少約為60℃。嚴格條件還可通過加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺而實現(xiàn)。對于高度嚴格的雜交而言，陽性信號應該不低于背景的兩倍，優(yōu)選為雜交背景的10倍。示范性的高度嚴格或嚴格雜交條件包括50％甲酰胺、5xSSC以及1％SDS在42℃孵育，或5xSSC和1％SDS在65℃孵育，及用0.2xSSC和0.1％SDS在65℃洗滌。對于PCR，大約36℃的溫度一般用于低嚴格擴增，不過退火溫度可根據(jù)引物長度，在大約32℃-48℃之間變化。對于高度嚴格的PCR而言，一般是大約62℃的溫度，不過高度嚴格退火溫度可根據(jù)引物長度和特異性，在大約50℃到大約65℃的范圍內(nèi)變化。高度和低度嚴格擴增的典型循環(huán)條件包括90℃-95℃持續(xù)30秒-2min的變性期，退火期維持30秒-2min，延長期大約為72℃持續(xù)1-2min?！岸唷北硎静坏陀??！芭潴w”指與靶分子特異性結(jié)合的化合物?！笆荏w”指與配體特異性結(jié)合的化合物。“抗體”指含有來自免疫球蛋白基因或其片段的框架區(qū)域的多肽，其特異性地結(jié)合并識別抗原。已知的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε和μ恒定區(qū)域基因，以及相當多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈可分成κ或λ類。重鏈可分成γ，μ，α，δ或者ε類，反過來這些分類又定義了免疫球蛋白類，分別為IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。該術語還包括，例如，多克隆、單克隆、單鏈、人源化的、嵌合的抗體，及其片段。一個示范性的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構單位包括一個四聚物。每個四聚物由兩對相同的多肽鏈組成，每對都具有一個“輕”鏈(大約25kD)和一個“重”鏈(大約50-70kD)。每條鏈的N末端都定義了一個大約100-110或更多個氨基酸的可變區(qū)，其主要負責識別抗原。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈?？贵w能夠以例如完整的免疫球蛋白形式存在，或以多種已充分表征的片段形式存在，這些片段是通過用各種肽酶酶切產(chǎn)生的。因此，例如胃蛋白酶消化抗體，作用在絞鏈區(qū)的二硫鍵下方產(chǎn)生了F(ab)’2，即Fab的二聚物，F(xiàn)ab本身是通過二硫鍵與VH-CH1相連的一條輕鏈。這個F(ab)’2在溫和條件下可被還原，斷裂絞鏈區(qū)的二硫鍵，從而由F(ab)’2二聚物轉(zhuǎn)換為Fab’單體。Fab’單體實質(zhì)上是帶有部分絞鏈區(qū)的Fab(參見FundamentalImmunology(Paul等，3ded.1993))。當以完整抗體的消化來定義各種抗體片段時，本領域技術人員可以理解這種片段可通過化學方法或利用重組DNA方法從頭合成。因此，本文所用的術語抗體還包括修飾完整抗體而產(chǎn)生的或用重組DNA方法從頭合成的抗體片段(如單鏈Fv)，或者使用噬菌體展示文庫鑒定的那些(例如參見McCafferty等，Nature348552-554(1990))。可使用本領域已知的任何技術制備單克隆或多克隆抗體(參見，例如Kohler&Milstein，Nature256495-497(1975)；Kozbor等，ImmunologyToday472(1983)；Cole等，pp.77-96《MonoclonalAntibodiesandCancerTheraputy》，AlanR.Liss，Inc.(1985))。生產(chǎn)單鏈抗體的方法(U.S.專利4,946,778)可適應性修改用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的抗體。同樣，轉(zhuǎn)基因小鼠或其它生物體如其它哺乳動物，也可用于表達人源化的抗體?；蛘呖墒褂檬删w展示技術鑒定能夠特異性地結(jié)合選定抗原的抗體和異聚體Fab片段(參見例如McCafferty等，Nature348552-554(1990)；Marks等，Biotechnology10779-783(1992))。當一個配體或受體(例如一個抗體)可與某種化合分析物“特異性地結(jié)合”或“特異性地發(fā)生免疫反應”時，此配體或受體將在結(jié)合反應中起作用以確定異源化合物樣品中是否存在該分析物。因此，在指定的試驗(例如免疫測定)條件下，這個配體或受體會優(yōu)先與特定分析物結(jié)合，而不與存在于樣品中的其它化合物發(fā)生顯著量的結(jié)合。例如，在雜交條件下，一種多核苷酸會特異地結(jié)合含有互補序列的分析物多核苷酸；在免疫測定條件下，一種抗體會特異地結(jié)合具有導致生成該抗體的表位的抗原分析物；而一種吸附劑在適當?shù)南疵摋l件下會特異地與一種分析物結(jié)合?！霸噭敝敢环N化合物，化合物的混合物，組成尚不確定的樣品，小分子組合陣列，生物大分子，噬菌體肽展示文庫，噬菌體抗體(例如scFv)展示文庫，多核糖體肽展示文庫，或由細菌，植物，真菌，或動物細胞或組織等生物材料制備的提取物。合適的技術包括篩選在噬菌體或類似載體中的重組抗體文庫(參見例如Huse等，Science2461275-1281(1989)；和Ward等，Nature341544-546(1989))。Huse描述的方案結(jié)合噬菌體展示技術會更加有效(參見WO91/17271和WO92/01047)?！氨磉_控制序列”指多核苷酸內(nèi)的一段調(diào)節(jié)與其可操作連接的核苷酸序列的表達(轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的核苷酸序列?！翱刹僮鬟B接″指兩個部分之間的一種功能性關系，在這種關系中，一部分的活性(例如，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力)對另一部分產(chǎn)生作用(例如序列的轉(zhuǎn)錄)。表達調(diào)控序列包括但不限于啟動子序列(例如誘導型，抑制型或組成型)，增強子，轉(zhuǎn)錄終止子，起始密碼子(即ATG)，內(nèi)含子的剪接信號和終止密碼子?！氨磉_載體”指包含重組多核苷酸的載體，該多核苷酸又包含與待表達核苷酸序列可操作連接的表達調(diào)控序列。表達載體含有充足的表達順式作用元件；其它表達元件可由宿主細胞或體外表達系統(tǒng)提供。表達載體包括摻入了重組多核苷酸的所有本領域已知的那些，如粘粒，質(zhì)粒(例如裸露的或被脂質(zhì)體包被的)和病毒?！熬幋a”指多核苷酸內(nèi)特定的核苷酸序列，例如基因，cDNA，或mRNA的固有性質(zhì)，即其可作為模板在生物過程中合成具有確定核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或確定氨基酸順序以及由此帶來的生物特性的其它聚合物或大分子。因此，如果在細胞或其它生物系統(tǒng)內(nèi)由基因產(chǎn)生的mRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生了蛋白質(zhì)，則稱該基因編碼該蛋白質(zhì)?；蚧騝DNA的編碼鏈(即核苷酸序列與mRNA的序列一致且通常顯示在序列表中的鏈)與非編碼鏈(用作轉(zhuǎn)錄模板的鏈)都可以被認為其編碼著該基因或cDNA的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。除非另有說明，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括編碼相同氨基酸序列的所有簡并核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可含有內(nèi)含子?！澳芰课辗肿印敝冈诮馕止夤庾V儀(desorptionspectrometer)中從能源吸收能量使得分析物從探頭(probe)表面解吸(desorption)的分子。MALDI中所用的能量吸收分子通常稱為“基質(zhì)(matrix)”。在生物有機分子的激光解吸中常用肉桂酸衍生物(如α-4-氰基-羥基-內(nèi)桂酸)，cinnapinic酸和二羥基苯甲酸作為能量吸收分子。“探頭(Probe)”指能夠可移動地插入氣相離子光譜儀(例如質(zhì)譜儀)中且包含一個基體(substrate)的裝置，所述基體具有一個能夠呈遞分析物用于進行檢測的表面。探頭可隨分析不同進行修改，并可是一次性的。“氣相離子光譜儀”指一種設備，它測量的參數(shù)可以轉(zhuǎn)換成樣品揮發(fā)及電離時形成的離子的荷質(zhì)比。通常，由激光解吸/電離生成的離子帶有單一電荷，通常簡單地將荷質(zhì)比稱作質(zhì)量。氣相離子光譜儀包括例如質(zhì)譜儀，離子遷移率光譜儀和總離子流測量裝置?！百|(zhì)譜儀”指包括入口系統(tǒng)，電離源，離子光學組件，質(zhì)量分析儀和檢測器的氣相離子光譜儀。質(zhì)譜儀的實例是飛行時間，扇形磁場，四極過濾器(quadrapolefilter)，離子阱，離子回旋共振質(zhì)譜儀及其組合?！凹す饨馕|(zhì)譜儀”指用激光作為分析物解吸、揮發(fā)和電離的手段的質(zhì)譜儀?！百|(zhì)譜法”指通過質(zhì)譜儀分析樣品?！八臉O飛行時間質(zhì)譜儀”指含有碰撞阻尼界面(collisionaldampinginterface)的質(zhì)譜儀，此界面能夠在由能量源形成的離子進入四極Q(quadrupoleQ)之前對其進行冷卻。四極飛行時間質(zhì)譜儀還可含有碰撞室?！胺治鑫铩敝笜悠分锌赡苄枰獪艉蜋z測的組分。它可以表示樣品中單一一種組分或一組組分。“吸附劑”指任何能夠吸附分析物的材料?！拔絼痹诖思缺硎痉治鑫锼佑|的單獨一種物質(zhì)(“單吸附劑(monoplexadsorbent)”)(如一種化合物或官能團)，又表示樣品所接觸的多種不同物質(zhì)(“多重吸附劑”(multiplexadsorbent))。多重吸附劑中的吸附性物質(zhì)稱為“吸附劑種類(species)”，例如，基體上的可尋址位置可包含以多種具有不同結(jié)合特征的不同吸附劑種類(如陰離子交換材料，金屬螯合物或抗體)為特征的多重吸附劑。“吸附”指用洗脫劑(選擇性閾值調(diào)節(jié)劑)洗滌前或后，吸附劑與分析物之間的可被檢測到的結(jié)合。“基體”指吸附劑附著或沉積于之上的固相?！敖Y(jié)合特征”指支配吸附劑吸引分析物的化學和物理特征。如果在相同的洗脫條件下，兩種吸附劑結(jié)合相同分析物的親合性程度不同，則這兩種吸附劑具有不同的結(jié)合特征。結(jié)合特征包括，例如鹽促相互作用程度，疏水性相互作用程度，親水性相互作用程度，靜電相互作用程度，以及本文描述的其它特征?！敖Y(jié)合條件”指分析物所接觸到的結(jié)合特征?！跋疵搫敝赣脕斫閷Х治鑫锉晃絼┪降奈镔|(zhì)，一般為溶液。洗脫劑又稱“選擇性閾值調(diào)節(jié)劑”?！跋疵撎卣鳌敝敢?guī)定特定洗脫劑(選擇性閾值調(diào)節(jié)劑)介導分析物與吸附劑之間吸附的能力的特征。如果兩種洗脫劑與分析物和吸附劑接觸時，分析物與吸附劑之間的親合性程度不同，那么這兩種洗脫劑具有不同的洗脫特征。洗脫特征包括，例如pH，離子強度，水結(jié)構的修飾，去污劑強度，疏水性相互作用的修飾及本文描述的其它特征?！跋疵摋l件”指分析物所接觸到的洗脫特征?！斑x擇性特征”指具有特定結(jié)合特征的吸附劑與具有特定洗脫特征的洗脫劑相結(jié)合的特征，它規(guī)定了在用洗脫劑洗滌后分析物被吸附劑滯留的特異性?！斑x擇性條件”指分析物所接觸到的選擇性特征。“吸引基礎”指使得分子彼此吸引的化學和/或理化特性?！拔龔姸取敝阜肿颖舜宋膹姸?又稱親合力)?！敖馕觥薄敖馕鲎饔谩被颉胺治鑫锏慕馕觥敝笇悠分兄辽僖环N分析物的檢測。解析包括通過先分離然后差異性檢測來檢測樣品中的多種分析物。解析不要求將一種分析物與混合物中的其它所有分析物完全分離。而是，任何分離只要能夠區(qū)分至少兩種分析物就足夠了。“高信息量解析”指解析分析物的方式不僅能檢測出分析物，還可檢測出待評價的分析物的至少一種理化性質(zhì)，例如分子量?！敖馕庾V法”是一種檢測分析物的方法，其中，分析物接觸能量后從固定相解吸到氣相中，解吸的分析物或其可辯別部分直接被檢測器檢測，不需要將分析物捕捉到第二固定相上的中間步驟?！皺z測”指鑒定待測目標是否存在或其存在量?！皽簟敝附?jīng)洗脫劑洗滌后分析物被吸附劑所吸附?！皽魯?shù)據(jù)”是指示在特定選擇性條件下對滯留分析物的檢測結(jié)果(任選地包括檢測質(zhì)量)的數(shù)據(jù)?！皽魣D譜”指反映多種選擇性條件下滯留分析物的滯留數(shù)據(jù)的一組值。“識別圖譜”指反映分析物在多種選擇性條件下的相對滯留作用的一組值?！皬秃象w”指兩種或更多分析物聯(lián)合而成的分析物?！捌巍敝阜治鑫锏幕瘜W，酶學或物理降解產(chǎn)物。片段可能是中性的，也可以帶有離子?！安町惐磉_”指分析物的存在在質(zhì)或量上的可檢測差異?！盎虮磉_譜(geneexpressionprofile)”指對生物樣品中表達的至少一種mRNA所進行的鑒定。“理化特性”指能夠表征分子的該分子的物理或化學特性。蛋白質(zhì)的理化特性包括，但不限于氨基酸序列，分子量，等電點，疏水性，親水性，糖基化作用，磷酸化作用，表位序列，配體結(jié)合序列，指定pH下的電荷(等電點)，染料結(jié)合，以及金屬螯合物結(jié)合。理化特性可用作例如在蛋白質(zhì)圖譜中進行分級或分離的標識或手段。例如特征氨基酸序列可用于分級、分離或鑒定含有這種序列的多肽，這些序列如六組氨酸序列，配體結(jié)合基序或序列，結(jié)構域，蛋白酶裂解位點，金屬螯合物結(jié)合部位，或表位。在另一個實例中，可通過與相應的激酶或磷酸化酶相互作用，或通過比色酶反應，或通過能與多肽的磷酸化部分結(jié)合的抗體而分級，分離或鑒定磷酸化多肽。類似地，可通過與結(jié)合伴侶的相互作用，或通過能與多肽的糖基化部分結(jié)合的抗體，或通過能夠識別該碳水化合物的抗體，或通過凝集素或酶學方法而分級、分離或鑒定糖基化多肽。在另一個實例中，根據(jù)多肽在指定pH的電荷或其pI或等電點，可以利用具變化pH的緩沖液和溶液或陰離子或陽離子樹脂，分級、分離或鑒定多肽。在另一實例中，具變化疏水性的緩沖液、溶液和樹脂可根據(jù)多肽的疏水性或親水性用于分級、分離或鑒定多肽。在另一個實例中，多肽或其蛋白水解片段的質(zhì)量或分子量可用于分離、鑒定或分級該多肽。“核酸陣列”指具可尋址位置(即以區(qū)別性的、可訪問(interrogatable)的地址為特征的位置)的陣列，每個可尋址位置均含有一個與其相連的特征性核酸。核酸可以是本文定義的任何核酸，例如天然存在的或合成的核酸，如寡核苷酸或多核苷酸。在寡核苷酸陣列中，該核酸是寡核苷酸(如對應于外顯子，EST，或基因的一部分，轉(zhuǎn)錄本，或cDNA)；在EST陣列中，該核酸是EST或其部分；在mRNA陣列中，該核酸是mRNA或其部分，或相應的cDNA。寡核苷酸的長度可為4，6，8，10或12個核苷酸，或更長，通常為10，30，40或50個核苷酸，甚至長至約100個核苷酸?；虮磉_譜繪制本發(fā)明方法的第一個步驟是進行目的樣品的基因表達譜繪制?；虮磉_譜繪制指檢測細胞中的一種或多種RNA，優(yōu)選mRNA的表達。通常在一個單一試驗中要檢測至少或多達10、100、100、10000或更多種不同的mRNA。在一個具體實施方式中，差異圖譜(與另一細胞進行的比較，如具有不同表型的細胞，或處于不同時間或發(fā)育階段的細胞，或暴露于不同環(huán)境條件，如物理或化學條件等等下的細胞)可提供關于目的細胞的有價值信息，例如在指定細胞類型中優(yōu)先地或選擇性地表達的基因。目的基因經(jīng)常在一種細胞中高度表達，而在另一種細胞中卻不是。在其它具體實施方式中，在不同的細胞中，目的基因具有類似的表達。在其它具體實施方式中，目的基因在一個細胞中的表達低于在另一個細胞中的表達。用于檢測基因表達的方法(經(jīng)常但不總是以雜交為基礎)包括，例如northern印跡；點印跡；引物延伸；核酸酶保護；減法雜交和使用如羥基磷灰石進行的非雙鏈體分子的分離；溶液雜交；濾膜雜交；擴增技術如RT-PCR及其他PCR相關技術，如差異顯示，LCR，AFLP，RAP，等等(例如參見U.S.專利4,683,195和4,683,202；PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications(Innis等，編，1990)；Liang&Pardee，Science257967-971(1992)Hubank&Schatz，Nuc.AcidsRes.225640-5648(1994)；Perucho等，MethodsEnzymoL254275-290(1995))；指紋圖譜，例如用限制性核酸內(nèi)切酶(Ivanova等，Nuc.Acids.Res.232954-2958(1995)；Kato，Nuc.AcidsRes.233685-3690(1995)；和Shimkets等，NatureBiotechnology17798-803，還可參見US專利No.5,871,697))；以及利用結(jié)構特異性核酸內(nèi)切酶(參見，例如DcFrancesco，TheScientist1216(1998))。還可以使用質(zhì)譜法(例如MALDI或SELDI)，液相色譜以及毛細管凝膠電泳分析mRNA的表達，如下所述。關于這些技術的一般性說明，還可參見Sambrook等，MolecularCloning，ALaboratoryManual(2nded.1989)，參見，例如7.37-7.39，7.53-7.54，7.58-7.66，以及7.71-7.79；Kriegler，GeneTransferandExpressionALaboratoryManual(1990)；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等，eds.，1994)。已經(jīng)發(fā)展了可以對大量的核酸樣品進行快速表達分析和測序的技術。例如已經(jīng)發(fā)展了用于高密度且高處理量地進行表達分析的核酸陣列(參見，例如Granjeuad等，BioEssays21781-790(1999)；Lockhart&Winzeler，Nature405827-836(2000))。核酸陣列指大量的(例如成百，成千，上萬或更多)核酸探針與固體基質(zhì)，如尼龍，玻璃，或硅片相連(參見，F(xiàn)odor等，Science251767-773(1991)；Brown&Botstein，NatureGenet.2133-37(1999)；Eberwine，Biotechniques20584-591(1996))。單個陣列可含有，例如相應于一個完整基因組、或該基因組所表達的所有基因的探針。陣列中的探針可以是DNA寡核苷酸陣列(例如GenChipTM，參見Lipshutz等，Nat.Genet.2120-24(1999))，mRNA陣列，cDNA陣列，EST陣列，或光導纖維束上的光學編碼陣列(例如BeadArrayTM)。應用于該陣列進行表達分析的樣品可以是，例如PCR產(chǎn)物，cDNA，mRNA等等。其它用于快速基因測序和基因表達分析的技術包括，例如SAGE(基因表達的系列分析(serialanalysis))。對于SAGE而言，短序列標志(通常約10-14bp)含有的信息即足以專一地鑒定轉(zhuǎn)錄本。這些序列標志可以彼此連接以形成較長的連續(xù)分子，這些連續(xù)分子可被克隆和測序。計數(shù)某種特定標記被觀察到的次數(shù)就可以證實相應轉(zhuǎn)錄本的表達水平(參見Velculescu等，Science270484-487(1995)；Velculescu等，Cell88(1997)；和deWaard等，Gene2261-8(1999))。理化特性如同本文的描述，這些技術中的每一個都可單獨，或相互結(jié)合用于鑒定細胞中表達的目的候選基因或候選基因群。使用本領域已知的技術鑒定和分離目的轉(zhuǎn)錄本。如此鑒定的轉(zhuǎn)錄本被測序，并使用編碼的氨基酸序列信息分析其理化特征，例如分子量，等電點，疏水性，親水性，糖基化作用，磷酸化作用，表位序列，蛋白酶片段化，配體結(jié)合序列，指定pH的電荷，以及金屬螯合物結(jié)合。通常，生物信息學和序列數(shù)據(jù)庫可用于鑒定該轉(zhuǎn)錄本所編碼的蛋白質(zhì)的功能。目的基因包括，例如離子通道，受體，例如G蛋白偶聯(lián)受體，細胞因子，趨化因子，信號轉(zhuǎn)導蛋白質(zhì)，管家蛋白質(zhì)，細胞周期調(diào)控蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄因子，鋅指蛋白質(zhì)，染色質(zhì)重構蛋白質(zhì)等等。如此鑒定的理化特性是將轉(zhuǎn)錄本的表達水平與該轉(zhuǎn)錄本所編碼的蛋白質(zhì)的表達水平相互關聯(lián)的工具。使用如下所述的蛋白質(zhì)分析工具，蛋白質(zhì)的一種或多種理化特性可用于分級該目的蛋白質(zhì)，同時減少背景并提高蛋白質(zhì)檢測的靈敏度。如此，可以將細胞中目的候選轉(zhuǎn)錄本與細胞中被編碼蛋白的表達水平進一步相互關聯(lián)。這些信息可用于選擇小群轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)，以用于例如診斷和治療性應用。樣品的蛋白質(zhì)分級分析然后根據(jù)被鑒定的表達mRNA所編碼多肽的至少一種理化特性，將樣品中的多肽分級分離。例如，多肽的同一性可以指示該多肽預測的物理化學特性。氨基酸序列可以提供該蛋白質(zhì)預測的分子量。氨基酸序列還可用于預測該多肽的等電點，該多肽是親水性的還是疏水性的，以及該多肽是否具有金屬螯合物結(jié)合性能。氨基酸序列同樣可以指示該多肽是否含有糖基化作用或磷酸化作用位點。該多肽的翻譯后修飾將反映在分子量的改變上。氨基酸序列還可以鑒定表位，表位反過來可以是抗體結(jié)合的靶物質(zhì)。沒必要確切測量理化特性；獲取一些信息以便在根據(jù)該特性將樣品分級成多個部分時可預期該多肽將在這些部份中優(yōu)先分級就可足夠了。然后根據(jù)該多肽的理化特性分級分離樣品中的多肽。最有用的分離方法是根據(jù)分子量分離，因為有很多分離蛋白的方法是根據(jù)這個特點進行的，包括例如SDS凝膠電泳和氣相離子光譜法，例如質(zhì)譜法。另一個有用的理化特征是等電點。等電聚焦，親合層析和在離子交換樹脂上固相提取都是根據(jù)該特性分級樣品中的蛋白。分級蛋白質(zhì)的方法可用于檢測細胞中選定蛋白質(zhì)的表達水平。如上所述，通過一種或多種選擇的理化特性可以提高分級的靈敏度，降低背景。本文描述的技術可用于檢驗細胞中表達的一種或多種，以至幾十，幾百或成千上萬種蛋白質(zhì)?？筛鶕?jù)一種或多種理化特性，利用任何一種技術或其組合分級蛋白質(zhì)。分級的方法包括，例如雙向凝膠；毛細管凝膠電泳；質(zhì)譜法，例如MALDI，SELDI；ICAT(同位素編碼的親合標記，參見Mann，NatureBiotechnology17954-955(1999)；Gygi等，NatureBiotechnology17994-999(1999))；層析法，例如凝膠過濾、離子交換、親合、免疫親合、以及金屬螯合物層析法，HPLC，例如反相、離子交換和分子大小排阻HPLC；western印記；免疫組織化學技術，如ELISA和利用抗體原位篩選等等(參見，Blackstock&Weir，TrendsinBiotech.17121-127(1999)；Dutt&Lee，BiochemicalEngineering，176-179(April2000)；Page等，DrugDiscoveryToday，455-62(1999)；Wang&Hewick，DrugDiscoveryToday4129-133(1999)；Regnier等，TrendsinBiotech.17101-106(1999)；和Pandey&Mann，Nature405837-846(2000))?？墒褂帽绢I域已知的技術鑒定和分離目的蛋白質(zhì)。關于這些技術的一般性說明，還可參見Sambrook等，MolecularCloning，ALaboratoiyManual(2nded.1989)；和CunentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等，eds.，1994)。在一個具體實施例方式中，雙向電泳可用于分級本發(fā)明的蛋白質(zhì)。此技術根據(jù)pI和分子量理化特性分級蛋白質(zhì)。2d(雙向)凝膠電泳和本文所述的技術可單獨使用，或與其它技術結(jié)合使用，如質(zhì)譜分析法，例如MALDI和SELDI，本文將在以下描述。在另一個具體實施方式中，如下所述，MALDI是一種根據(jù)質(zhì)量分級蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術，經(jīng)常與分子大小和/或親合層析技術結(jié)合以提高分辨率。在另一個具體實施方式中，如下所述，SELDI是一種將親合分級和質(zhì)譜分析偶聯(lián)在一起的質(zhì)譜分析技術。根據(jù)，例如pI(離子交換樹脂和洗滌)，抗體結(jié)合，糖基化作用，磷酸化作用，組氨酸殘基等等的親合基質(zhì)或探針可用于SELDI中，與質(zhì)譜分析相結(jié)合，以高分辨率、準確度和靈敏度鑒定蛋白質(zhì)。當使用此技術時，可以根據(jù)轉(zhuǎn)錄本所編碼蛋白質(zhì)的理化特性確定可富集候選多肽的親合基質(zhì)。樣品的質(zhì)譜分析引言本發(fā)明的多肽或其片段可以使用質(zhì)譜分析方法進行分析。這些方法根據(jù)質(zhì)量分級多肽。在某些具體實施方式中使用了氣相離子光譜儀。在其它具體實施方式中，使用了激光解吸/電離質(zhì)譜法來分析基體結(jié)合的吸收劑上的樣品?，F(xiàn)代的激光解吸/電離質(zhì)譜分析(″LDI-MS″)可通過兩種主要的變型方式進行基質(zhì)輔助的激光解吸/電離(″MALDI″)質(zhì)譜分析法和表面增強的激光解吸/電離(″SELDI″)。利用激光解吸質(zhì)譜分析法的質(zhì)譜儀可進一步與一個四極飛行時間質(zhì)譜儀相連。在MALDI中，可含有生物分子的分析物與含有基質(zhì)的溶液混合，然后將一滴該混合液體滴到基體表面上。然后使該基質(zhì)溶液與生物分子共結(jié)晶。將基體插入質(zhì)譜儀。將激光能量導向基體表面，在該表面上造成生物分子解吸附并離子化，但不會明顯地將其碎裂。但是作為一種分析工具，MALDI也有缺陷。它不能提供分級樣品的裝置，并且基質(zhì)材料可能會影響檢測，特別是對低分子量的分析物而言。例如參見U.S.專利5,118,937(Hillenkamp等)，和U.S.專利5,045,694(Beavis&Chait)。在SELDI中，基體表面被修飾過，因此在解吸過程中該表面是一個活躍參與者。在一個變體方案中，該表面用能和分析物選擇性結(jié)合的親合劑衍生化。在另一個變體方案中，該表面用能量吸收分子衍生化，所述能量吸收分子當被激光沖擊后并不發(fā)生解吸附。在另一個變體方案中，該表面用能夠結(jié)合分析物并含有光解鍵的分子衍生化，所述光解鍵經(jīng)激光處理會斷裂。在每種方法中，衍生化試劑通常定位于應用樣品的基體表面特定位點。參見，例如U.S.專利5,719,060和5,6020208(Hutchens&Yip)和WO98/59360，WO98/59361，和WO98/59362(Hutchens&Yip)?？赏ㄟ^，例如使用SELDI親合表面以捕獲分析物，以及向捕獲的分析物中加入含有基質(zhì)的液體來提供能量吸收材料，從而使兩種方法相結(jié)合。在某些具體實施例方式中，激光解吸/電離質(zhì)譜儀進一步與一個四極飛行時間質(zhì)譜儀QqTOFMS相連(參見，例如Krutchinsky等，WO99/38185)。諸如MALDI-QqTOFMS(Knitchiusky等，WO99/38185；Shevchenko等(2000)AnaLChem.722132-2141)，ESI-QqTOFMS(Figeys等，(1998)RapidComm’ns.MassSpec.12-1435-144)以及芯片毛細管電泳(chip-CE)-QqTOFMS(Li等，(2000)Anal.Chem.72599-609)等方法先前已有描述。在一個具體實施例方式中，使用質(zhì)譜儀分級本發(fā)明的蛋白質(zhì)樣品。在一般的質(zhì)譜儀中，含有多肽分析物的基體被引入質(zhì)譜儀的入口系統(tǒng)中。然后通過諸如激光，快速原子轟擊，高能等離子體，電噴霧電離，熱噴霧電離，液體二次離子MS，場解吸等解吸源，使該分析物解吸附。所產(chǎn)生的解吸附揮發(fā)物由直接因該解吸事件而被離子化的預先形成的離子或中性物構成。通過離子光學組件收集所形成的離子，然后使用質(zhì)量分析儀分散并分析通過的離子。用檢測器檢測離開質(zhì)譜分析儀的離子。然后檢測器將檢測到的離子信息轉(zhuǎn)化為荷質(zhì)比。檢測標記或其它物質(zhì)的存在時通常涉及信號強度的檢測。這反過來可以反映與基體結(jié)合的多肽的數(shù)量和特性。質(zhì)譜分析儀及其技術是本領域技術人員公知的。任何所屬
技術領域：
的專業(yè)人員都可以理解，質(zhì)譜儀的任何組分(如解吸源，質(zhì)量分析儀，檢測器等)均可與本文描述的或本領域已知的其它適當組分結(jié)合使用。關于質(zhì)譜儀的其它信息，參見例如PrinciplesofInstrumentalAnalysis，3rded.，Skoog，SaundersCollegePublishing，Philadelphia，1985；以及Kirk-OthmerEncyclopediaofChemicalTechnology，4thed.Vol.15(JohnWiley&Sons，NewYork1995)，pp.1071-1094。在一個具體實施例方式中，激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀與本發(fā)明的基體共同使用。在激光解吸質(zhì)譜分析法中，帶有結(jié)合標記的基體被引入入口系統(tǒng)中。該標記被來自電離源的激光解除吸附并電離為氣相。用離子光學組件收集形成的離子，然后在飛行時間質(zhì)譜分析儀中，離子被加速通過一個短的高壓電場然后進入高真空室。在高真空室的遠端，被加速的各離子將以不同的時間撞擊靈敏檢測器的表面。由于飛行時間是離子質(zhì)量的函數(shù)，所以在離子形成和離子檢測器撞擊之間所經(jīng)過的時間可用于鑒定是否存在具有特定荷質(zhì)比的分子。滯留層析(retentatechromatography)是一種多維度解析樣品中分析物的方法。該方法包括(1)在多種不同的吸附劑/洗脫劑組合(“選擇性條件”)下將樣品中的分析物吸附到基體上和(2)用解吸光譜法檢測吸附的分析物的滯留情況。各選擇性條件提供分離的第一維度，將吸附分析物與未吸附的那些分離。解吸質(zhì)譜提供分離的第二維度，根據(jù)質(zhì)量將吸附分析物彼此分離。因為滯留層析涉及使用多種不同的選擇性條件，所以可以獲得多維度的分離。還可以確定一種或多種分析物在兩種選擇性條件下的相對吸附。這種多維度分離不僅對分析物且對它們的特征都作了解析。而且，由此分離的分析物仍然停留在滯留圖譜中，易于進一步接受操作以檢測例如分析物的結(jié)構和/或功能。而且，停留的分析物本身可以用作吸附劑來截留接觸基體的其它分析物?？傊?，本發(fā)明提供了一種快速、多維度而且高信息量解析分析物的方法。本發(fā)明方法可采用多種形式。在一個實施方案中，分析物在兩個物理上不同的位置被兩種不同的吸附劑吸附，每種吸附劑用相同的洗脫劑(選擇性闕值調(diào)節(jié)劑)洗滌。另一實施方案中，分析物在兩個不同的物理位置被相同的吸附劑吸附，然后用不同的洗脫劑洗滌。另一實施方案中，分析物在不同的物理位置被兩種不同的吸附劑吸附，然后用兩種不同的洗脫劑洗滌。另一實施方案中，分析物先用一種吸附劑吸附，用第一洗脫劑洗滌，檢測滯留情況然后用不同的第二洗脫劑洗滌，再檢測滯留情況。進行滯留層析的方法滯留層析特別適用于分級樣品中的多肽。根據(jù)該方法，多肽在固相吸附劑上被分級，該吸附劑能夠根據(jù)特定的理化性質(zhì)結(jié)合多肽。未結(jié)合的多肽被洗滌去除。然后通過質(zhì)譜法進一步分級該滯留的多肽，從而實現(xiàn)了根據(jù)至少兩種理化特性進行分級。分新物與選擇性條件接觸基體的制備在滯留層析過程中，被吸附劑滯留的分析物在基體上被呈遞給能源。含分析物的樣品可以在吸附劑固定于用于向解吸機制呈遞分析物的基體上之前或之后與吸附劑接觸。為了接觸，吸附劑可以是液態(tài)或固態(tài)(即位于基體上或呈固相)。具體地說，吸附劑的形式可以是溶液，懸浮液，分散體，油包水乳液，水包油乳液，或微乳液(microemulsion)。當吸附劑的形式是懸浮液，分散體，乳液或微乳液時，可以有合適的表面活性劑存在。在這樣的實施方案中，可以通過將液態(tài)樣品與液態(tài)吸附劑相互混合來使樣品與吸附劑接觸?；蛘?，樣品可以位于固體支持物上，則可通過含樣品的支持物在液體吸附劑中的浸浴、浸泡或浸漬來完成接觸。此外，可用液體吸附劑噴灑或洗滌固體支持物上的樣品來進行接觸。在這種實施方案中，不同吸附劑可用不同容器提供。在一個實施方案中，吸附劑位于基體上。基體可以是能夠結(jié)合或固著吸附劑的任何材料。通常，基體由玻璃；陶瓷；導電聚合物(例如炭化PEEK)；TEFLON包被的材料；有機聚合物；天然生物聚合物；金屬(例如鎳，黃銅，鋼或鋁)；薄膜；多孔和無孔交聯(lián)聚合物珠粒(例如瓊脂糖，纖維素或葡聚糖)；其它不溶性聚合物；或以上的組合構成。在一個實施方案中，基體采取可插在解吸檢測器內(nèi)的探頭或樣品呈遞裝置的形式。例如，參見圖1，基體是條形的。固定在基體上的吸附劑可以呈線形陣列的點形式，每個點各自能與分析物接觸。數(shù)條基體可連在一起，這樣許多吸附劑可形成在限定的各行上具有離散的點的陣列30?；w還可以是板形的，具有水平和垂直行的吸附劑陣列，形成諸如正方形、矩形或圓形等規(guī)則的幾何圖案。可如下生產(chǎn)探頭。基體可以是任何固體材料，例如不銹鋼、鋁或硅片。然后，可以使用那些允許表面衍生化的材料來包被金屬基體。例如，可用二氧化硅、二氧化鐵或金包被金屬表面。然后用雙官能接頭修飾表面。雙官能接頭一端具有的官能團能夠共價結(jié)合該表面上的官能團。因此，對于金，該官能團可以是無機氧化物或巰基。接頭的另一端通常具有一個氨基官能團。有用的雙官能接頭包括氨基丙基三乙氧基硅烷或氨基乙基二硫化物。一旦與表面結(jié)合，用作為吸附劑的基團進一步衍生化接頭。通常，吸附劑被加在探頭上的可尋址位置。在一種探頭中，直徑約3mm的點排列成正交陣列。吸附劑本身可以是雙官能分子的一部分，該雙官能分子包含一個與可得氨基反應的基團和另一個作為吸附劑的官能團。官能團包括如正常相(氧化硅)，反相(C18脂肪烴)，季胺和磺酸酯。還可以用其它雙官能分子，例如碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺進一步衍生化表面形成預活化坯(blank)。可用生物有機吸附劑(例如核酸，抗體和其它蛋白質(zhì)配體)將這類坯(blank)官能化。生物聚合物能夠通過胺殘基或巰基殘基結(jié)合坯上的官能團。在一個實施方案中，吸附劑與交聯(lián)聚合物(例如薄膜)結(jié)合，交聯(lián)聚合物本身則通過可得官能團與探頭表面結(jié)合。這類聚合物包括纖維素，葡聚糖，羧甲基葡聚糖，聚丙烯酰胺和以上的混合物。固定有吸附劑的探頭就可供使用了。在另一實施方案中，吸附劑固定在提供固相的第一基體(例如聚合物或玻璃珠)上，第一基體再位于用于向解吸檢測器的解吸能呈遞樣品的第二基體上。例如，第二基體可以呈板式，在預定的可尋址位置具有一系列孔。這些孔可以作為經(jīng)吸附劑衍生的第一基體(例如用吸附劑衍生的聚合物珠)的容器。這種實施方案的一個優(yōu)點是分析物可以在一種物理環(huán)境中吸附于第一基體上，再轉(zhuǎn)移到樣品呈遞基體上進行解吸光譜分析。通常，將基體改變成適于和本發(fā)明方法中的檢測器一起用來檢測與吸附劑結(jié)合并被滯留的分析物。在一個實施方案中，基體以可移動方式插在解吸檢測器內(nèi)，能量源在此擊中所述點并解吸分析物?？墒够w適當?shù)匕惭b在可水平和/或垂直轉(zhuǎn)移的架子內(nèi)，從而能水平和/或垂直移動基體以相繼使每個預定的吸附劑的可尋址位置位于可接受能量源的訪問并檢測結(jié)合在位置上的分析物的路徑中?；w的形式可以是常規(guī)的質(zhì)譜探頭。條、板或探頭形式的基體可用常規(guī)技術來制造。然后，在與含分析物的樣品接觸前，吸附劑可直接或間接偶聯(lián)、裝配或沉積在基體上?？捎酶鞣N合適的固著或固定化方法將吸附劑與基體直接或間接偶聯(lián)。例如，可用吸附劑衍生基體使得吸附劑通過共價或非共價鍵與基體直接結(jié)合來將吸附劑與基體直接偶聯(lián)。吸附劑在基體上的固著可通過多種機制實現(xiàn)。可用制備完全的吸附劑來衍生基體，即將預先制備好的吸附劑與基體連接?；蛘?，可將前體分子固定在基體上，然后再向通過第一前體分子結(jié)合在基體上的延長鏈添加其它前體分子，由此在基體上形成吸附劑。這種在基體上構建吸附劑的方法尤其適用于聚合物，特別是諸如DNA或RNA分子等生物聚合物的吸附劑?？捎霉押塑账嵝酒?br>技術領域：
已知的方法，通過向固著于基體上的第一堿基連續(xù)添加堿基來制成生物聚合物吸附劑。參見，美國專利5,445,934(Fodor等)。如圖2所示，可在一個基體上偶聯(lián)少到2種、多達10種，100種，1000種，10000種或更多種吸附劑。吸附劑位點的大小可根據(jù)實驗設計和實驗目的而不同。但是不能超過沖擊能源的直徑(例如激光點的直徑)。連續(xù)的位點上可以是相同或不同的吸附劑。有時，宜使同一吸附劑位于基體的多個不同位置，以允許對多種不同的洗脫劑進行評價或保存被吸附的分析物以備待用或參考(或許是在第二處理中)。提供帶有多種不同吸附劑的基體就能利用由不同吸附劑與一種樣品組合而產(chǎn)生的多種結(jié)合特征結(jié)合及檢測更多種不同的分析物。在基體上用多種不同的吸附劑評價一種樣品基本上等同于用不同的層析柱同時進行的多個層析，但是本方法的優(yōu)點在于只需要一個系統(tǒng)。當基體包含多種吸附劑時，特別有用的是使吸附劑位于預定的可尋址位置。吸附劑在預定的可定址位置上就能夠在預定第一可定址位置用第一洗脫劑洗滌吸附劑，在預定第二可定址位置用第二洗脫劑洗滌吸附劑。由此可在每種洗脫劑以不同方式選擇性改變吸附劑結(jié)合特征的不同洗脫劑存在下評價一種吸附劑對分析物的結(jié)合特征。可尋址位置可排列成各種樣式，但以規(guī)則圖案為宜，例如線形、正交陣列或如圓等規(guī)則曲線。同樣，當基體包含多種吸附劑時，可就各種不同吸附劑評價一種洗脫劑以評價某給定吸附劑在此洗脫劑存在下的結(jié)合特征。還可以在不同洗脫劑存在下評價不同吸附劑的結(jié)合特征。遞增或梯度吸附劑表面通過在基體上合成多個不同的聚合吸附劑，可提供一系列具有不同結(jié)合特征的吸附劑。將前體分子固定在基體上，引發(fā)聚合反應，然后對各吸附劑在不同完成程度時終止反應，如此可提供不同的聚合吸附劑。還可以與聚合物的末端官能團反應以便用不同的親合性試劑(例如-NH3或coo-)對其進行不同程度的化學衍生。通過終止聚合或衍生反應產(chǎn)生出聚合或衍生程度不同的吸附劑。不同的聚合或衍生程度使各種不同的聚合吸附劑具有不同的結(jié)合特征。該實施方案尤其適合在基體上提供多種不同的生物聚合物吸附劑。如果需要，可以在反應容器中而不是在基體本身上進行聚合反應。例如，可以在聚合/衍生反應進行過程中從反應器中抽取等份的產(chǎn)物，得到具有不同結(jié)合特征的聚合吸附劑。在聚合/衍生反應過程中不同時刻抽取的各等份將表現(xiàn)出不同的聚合/衍生程度，由此得到多種不同的吸附劑。然后，可將不同等份的產(chǎn)物用作具有不同結(jié)合特征的吸附劑?；蛘撸梢韵嗬^地重復終止反應的步驟，抽取等份的產(chǎn)物，然后重新啟動聚合/衍生反應，由此產(chǎn)生多種不同的吸附劑。在不同終止點抽取的產(chǎn)物將具有不同的聚合/衍生程度，由此產(chǎn)生多種具有不同結(jié)合特征的吸附劑。在一個實施方案中，基質(zhì)是被吸附劑所包被的條形或板形，在其中一種或多種結(jié)合特征呈單向或雙向梯度改變。例如這樣的含吸附劑的條形其一端為弱疏水性吸附劑，另一端為強疏水性吸附劑?；蛘哌@樣的板形其一角為弱疏水性陰離子性，對角為強疏水性陰離子性。這種吸附梯度可用于定性分析分析物?？赏ㄟ^有控噴涂或令材料按時間流經(jīng)表面從而在梯度方向上逐步完成反應來形成這樣的吸附梯度?？梢栽诖怪狈较蛏现貜瓦@一過程，從而形成具有不同結(jié)合特征的類似或不同吸附劑的正交梯度?？稍谖絼┒ㄎ辉诨w上之前或之后，用能令分析物與吸附劑結(jié)合的合適方法讓含分析物的樣品接觸吸附劑。可簡單地將吸附劑與樣品混合或合并。樣品與吸附劑接觸可以通過將基體浸浴或浸泡在樣品中，或在樣品中浸漬基體，或?qū)悠穱娡吭诨w上，用樣品淋洗基體，或使吸附劑接觸樣品或分析物實現(xiàn)。此外，樣品與吸附劑的接觸還可以通過將樣品溶于某種洗脫劑或與其混合，然后用上述技術(即浸浴，浸泡，浸漬，噴涂或淋洗)使洗脫劑和樣品的溶液與吸附劑接觸。分析物與吸附劑接觸在分析物結(jié)合吸附劑前先讓樣品接觸洗脫劑，這具有在樣品接觸吸附劑的同時改變吸附劑選擇性的作用。結(jié)合吸附劑并因此滯留的樣品組分將只包括能夠在與樣品混合的特定洗脫劑存在下結(jié)合吸附劑的那些，而不是在沒有改變吸附劑選擇性的洗脫特征時能結(jié)合吸附劑的所有組分。樣品必須與吸附劑接觸足夠長的時間以令分析物與吸附劑結(jié)合。通常，樣品與吸附劑接觸約30秒至12小時。較好的是樣品與吸附劑接觸約30秒至15分鐘。樣品接觸吸附劑時的溫度與具體樣品和選用的吸附劑有關。通常，樣品在常溫常壓條件下接觸吸附劑，但是有些樣品可能需要改變溫度(通常在4℃至37℃之間)和壓力條件，這可由本領域熟練技術人員方便地加以確定。本發(fā)明方法與常規(guī)檢測技術相比的另一優(yōu)點在于本發(fā)明能夠在非常少量樣品上進行許多不同的實驗。通常，含數(shù)埃摩爾至100皮摩爾分析物的1微升至500微升樣品就足以與吸附劑結(jié)合了。分析物可在與吸附劑結(jié)合后被保存以用于以后的實驗，因為沒有經(jīng)歷解吸和檢測滯留分析物的所有吸附劑位置將仍然保留分析物。所以，如果只有非常小部分樣品可供分析，本發(fā)明就提供了能夠在不同時間用不同吸附劑和/洗脫劑進行多個實驗而不浪費樣品的優(yōu)點。用洗脫劑洗滌吸附劑在樣品與吸附劑接觸使得分析物與吸附劑結(jié)合后，用洗脫劑洗滌吸附劑。通常，為了進行多維度分析，每個吸附劑位置至少用不同的第一和第二洗脫劑洗滌。洗脫劑洗滌改變了滯留在特定吸附劑上的分析物群。吸附劑的結(jié)合特征與洗脫劑的洗脫特性結(jié)合形成了選擇性條件，控制著洗滌后被吸附劑保留的分析物。所以，洗滌步驟從吸附劑上選擇性地去除樣品組分?？捎枚喾N技術進行洗滌步驟。例如前文所述，樣品可在接觸吸附劑前溶于第一洗脫劑或與其混合。樣品在接觸吸附劑之前或同時接觸第一洗脫劑大致上與先讓分析物結(jié)合吸附劑再用第一洗脫劑洗滌吸附劑的凈效果相同。合并后的溶液與吸附劑接觸后，可用第二洗脫劑或后繼洗脫劑洗滌吸附劑。洗滌結(jié)合有分析物的吸附劑可通過在洗脫劑中浸浴、浸泡、或浸漬帶此吸附劑的基體實現(xiàn)；或用洗脫劑淋洗、噴涂或洗滌基體來完成。最好用微流控技術將洗脫劑引入小直徑的親合性試劑位點。當分析物僅在一個位置上與吸附劑結(jié)合，并在洗滌步驟中使用了多種不同的洗脫劑時，可獲得有關吸附劑在各種洗脫劑存在下的選擇性的信息。用第一洗脫劑洗滌，解吸并檢測滯留分析物，然后用第二洗脫劑洗滌，解吸并檢測滯留分析物，可通過如此重復在每次用洗脫劑洗滌后測定與一個位置上的吸附劑結(jié)合的分析物?？捎孟嗤奈絼┮远喾N不同的洗脫劑重復洗滌，然后解吸和檢測的步驟。如此，可用多種不同的洗脫劑重復檢測一個位置上滯留有分析物的吸附劑，由此得出一系列有關各次洗滌后滯留的分析物的信息。以上方法當吸附劑位于多個預定可定址位置時也有用，而不論這些吸附劑是否相同。但是，當分析物與多個不同位置上相同或不同的吸附劑結(jié)合時，洗滌步驟可改用包括并行操作的更系統(tǒng)化、更有效的方法進行。即，洗滌步驟可以通過用洗脫劑洗滌第一位置上的吸附劑，再用洗脫劑洗滌第二吸附劑進行，然后解吸并檢測被第一吸附劑保留的分析物，再解吸和檢測被第二吸附劑保留的分析物。換言之，所有的吸附劑都用洗脫劑洗滌，然后對各吸附劑位置解吸被各吸附劑保留的分析物并進行檢測。如有必要，在檢測了各吸附劑位置后，可對各吸附劑位置進行第二階段的洗滌，然后是第二階段的解吸和檢測。洗滌所有的吸附劑位置，然后在各個吸附劑位置解吸和檢測，這些步驟可對多種不同的洗脫劑重復進行。用這種方法，可用整個陣列有效地鑒定樣品中分析物的特性。不論在第一階段洗滌中是用同一種洗脫劑洗滌所有的吸附劑位置還是用多種不同洗脫劑洗滌多個吸附劑，該方法都有用。檢測洗滌后仍被吸附劑保留的分析物吸附在基體上。用解吸光譜法來檢測滯留在基體上的分析物從吸附劑上解吸分析物，然后直接檢測解吸下來的分析物。解吸方法從吸附劑上解吸分析物包括令分析物接觸合適的能源。這通常意味著用放射能或能量粒子撞擊分析物。例如，能量可以是激光能(例如UV激光)或閃光燈能形式的光能?；蛘?，能量可以是一股快速原子流。也可以用熱能來誘導/協(xié)助解吸。解吸和/或離子化分析物以便直接分析的方法在本領域是眾所周知的。其中之一稱為基質(zhì)輔助激光解吸/離子化或MALDL。在MALDI中，分析物溶液與基質(zhì)溶液混合，混合物沉積在惰性探頭表面，然后結(jié)晶，通過將分析物捕獲在晶體中可實現(xiàn)解吸。選用的基質(zhì)吸收激光能并傳遞給分析物，導致解吸和離子化。通常，基質(zhì)吸收UV范圍內(nèi)的光。有關大蛋白的MALDI可參見美國專利5,118,937(Hillenkamp等)和美國專利5,045,694(Beavis和chait)。表面增強的激光解吸/離子化或SELDI比MALDI在特異性，選擇性和靈敏度方面有一大進步。有關SELDI參見美國專利5,719,060(Hutchens和Yip)。SELDI是一種固相解吸法，在其中，分析物在表面上被呈遞給能量流，該表面能夠強化分析物的捕獲和/或解吸。相比之下，MALDI是一種液相方法，在其中，分析物與液體物質(zhì)混合，液體物質(zhì)包圍著分析物形成結(jié)晶。SELDI的一種形式稱SEAC(表面增強的親合性捕獲)，包括將與親合性捕獲裝置(即吸附劑)偶聯(lián)的分析物呈遞給解吸能。已發(fā)現(xiàn)，用這種方法將被吸附的分析物呈遞給解吸能源時，實現(xiàn)目標分析物解吸的機會更大?？上蛱筋^添加吸能物質(zhì)協(xié)助解吸。然后可向能源呈遞探頭以解吸分析物。另一種SELDI稱SEND(表面增強的凈解吸)，包括使用一吸能物質(zhì)層，上面放以分析物?；w表面有一層與之化學結(jié)合的而且/或者基本無晶體的吸能分子。然后將單獨(即凈)分析物加在此層的表面，不與其發(fā)生實質(zhì)性混合。吸能分子象基質(zhì)那樣吸收解吸能并使分析物被解吸。這一進步是實質(zhì)性的，因為由于消除了溶液混合物和隨機結(jié)晶的特性，現(xiàn)在可以以更簡單更均一的方式將分析物呈遞給能源。這使得結(jié)果更統(tǒng)一更可預計，因此可能實現(xiàn)過程的自動化。吸能物質(zhì)可以是經(jīng)典基質(zhì)材料或者是pH被調(diào)至中性或堿性的基質(zhì)材料。吸能分子可通過共價鍵或非共價鍵與探頭結(jié)合。另一種SELDI稱SEPAR(表面增強的光不穩(wěn)定附著與釋放)，包括使用光不穩(wěn)定附著分子。光不穩(wěn)定附著分子是一種二價分子，具有一個與可作為探頭一部分的固相(例如探頭平表面或珠體等其它固相)共價結(jié)合的位點，和可與親合性試劑或分析物共價結(jié)合的第二位點。當光不穩(wěn)定附著分子與表面和分析物結(jié)合時另含一個可在光照后釋放親合性試劑或分析物的光不穩(wěn)定鍵。光不穩(wěn)定鍵可在附著分子內(nèi)，或者在與分析物(或親合性試劑)或探頭表面附著的位置。直接檢測分析物的方法有數(shù)種方法可檢測解吸下的分析物。當分析物在解吸過程(例如激光解吸/離子化質(zhì)譜法)中被離子化時，檢測器可以是離子檢測器。質(zhì)譜儀一般包括測定解吸離子飛行時間的手段。這一信息被轉(zhuǎn)化為質(zhì)量。但是，沒有必要測定解吸離子的質(zhì)量來解析和檢測它們離子化的分析物在不同時刻撞擊檢測器這一事實實現(xiàn)了它們的檢測和解析?；蛘?，可用例如熒光部分或放射性部分可測性地標記分析物。此時，檢測器可以是熒光或放射性檢測器。可相繼使用多種檢測方法來充分獲得與陣列中各位置上滯留物相關的分析物組分和功能信息。解吸檢測器解吸檢測器包含將分析物從吸附劑上解吸的裝置和直接檢測解吸下的分析物的裝置。即，解吸檢測器無需將分析物捕捉到另一固相內(nèi)然后進行分析的中間步驟就可檢測解吸分析物。檢測分析物一般涉及檢測信號強度。后者反過來可以反映與吸附劑吸附的分析物的量。解吸檢測器還可具有除上述兩元件外的其它元件。其中之一是加速解吸分析物向檢測器移動的裝置。另一元件是測定分析物從解吸到被檢測器測得之間的飛行時間的裝置。優(yōu)選的解吸檢測器是本領域熟知的激光解吸/離子化質(zhì)譜儀。此質(zhì)譜儀具有一個供插入攜帶被吸附分析物的基體(例如探頭)的端口。解吸通過用能量例如激光能撞擊分析物來進行。該設備可具有使表面平移的裝置，這使得陣列上的任一點都可與激光束共線。激光撞擊分析物使完整的分析物解吸進入飛行管并被離子化。飛行管一般是一個真空。真空管一段內(nèi)的帶電板產(chǎn)生一個電勢能，加速離子化的分析物向檢測器移動。由時鐘測定飛行時間，由系統(tǒng)電子設備測定分析物的速度并轉(zhuǎn)化為質(zhì)量。本領域技術人員都知道，以上各元件中任何一個都可以與本發(fā)明所述的其它元件組合，組裝成利用各種解吸、加速、檢測、時間測定等手段的解吸檢測器。選擇性條件本發(fā)明優(yōu)點之一是能夠令分析物處于多種不同的結(jié)合和洗脫條件下，由此既提高了分析物解析度，又增加了有關它們識別譜形式的信息。和常規(guī)層析法一樣，吸附劑保留分析物的能力直接與相比于分析物與洗脫劑之間或洗脫劑與吸附劑之間的引力或親合性，分析物對吸附劑的引力或親合性相關。當樣品與吸附劑接觸時，樣品中的某些組分可能因不具有與吸附劑的親合性而不與之結(jié)合。因為不能結(jié)合吸附劑，它們可立即與待解析的分析物分離。但是，根據(jù)樣品的性質(zhì)和所用的具體吸附劑，許多不同組分在一開始能夠與吸附劑結(jié)合。吸附劑吸附劑即為結(jié)合分析物的物質(zhì)。滯留層析可使用多種吸附劑。不同的吸附劑可表現(xiàn)出大不相同的結(jié)合特征，有些不同的結(jié)合特征，或略有不同的結(jié)合特征。結(jié)合特征大不相同的吸附劑一般在吸引基礎或相互作用模式上有差異。吸引基礎一般是一種化學或生物學分子的識別功能。吸附劑與分析物之間的吸引基礎包括，例如(1)鹽促相互作用，例如疏水性相互作用，親硫性相互作用和固定化染料相互作用(2)氫鍵和/或范德華力相互作用和電荷轉(zhuǎn)移相互作用，例如在親水性相互作用中(3)靜電相互作用，例如離子電荷相互作用，尤其是正負離子電荷相互作用；(4)分析物與吸附劑中的金屬離子形成配位共價鍵(即形成配位復合物)的能力(5)酶活性位點的結(jié)合；(6)可逆共價相互作用，例如二硫鍵互換作用(7)糖蛋白相互作用；(8)生物特異性相互作用或(9)上述兩種或兩種以上相互作用方式的組合。即，吸附劑可以表現(xiàn)出兩種或兩種以上吸引基礎，由此稱作“混合功能”吸附劑。鹽促相互作用吸附劑用于評定鹽促相互作用的吸附劑包括疏水性相互作用吸附劑。疏水性相互作用吸附劑包括例如具有脂肪烴，尤其是C1-C18脂肪烴的基質(zhì)；和具有芳香烴官能團例如苯基的基質(zhì)。疏水性相互作用吸附劑所結(jié)合的分析物包括暴露于溶劑中的不帶電氨基酸殘基，特別是常說的非極性、芳香族疏水性氨基酸殘基，例如苯丙氨酸和色氨酸。與疏水性相互作用吸附劑結(jié)合的分析物的具體例子包括溶菌酶和DNA。不希望受特定理論束縛，DNA被認為是因為其中的芳族核苷酸，具體地說即嘌呤和嘧啶基團而與疏水性相互作用吸附劑結(jié)合的。用于評定鹽促相互作用的其他吸附劑包括親硫性相互作用吸附劑，例如T-GEL，這是PierceRockford，Illinois出售的一種親硫性吸附劑。親硫性相互作用吸附劑能夠結(jié)合例如IgG等免疫球蛋白。IgG與T-GEL之間相互作用的機制尚不完全清楚，但暴露于溶劑中的trp基團被懷疑可能起著一定的作用。涉及鹽促離子相互作用和疏水性相互作用的第三種吸附劑包括固定化染料相互作用吸附劑。固定化染料相互作用吸附劑包括固定化染料的基質(zhì)，例如PharmaciaBiotech，Piscataway，NewJersey的CIBACHRONTM藍。固定化染料相互作用吸附劑通常結(jié)合蛋白質(zhì)和DNA。與固定化染料相互作用吸附劑結(jié)合的蛋白質(zhì)的一個具體例子是牛血清白蛋白(BSA)。親水性相互作用吸附劑用于評定基于親水性相互作用的氫鍵和/或范德華力的吸附劑包括諸如氧化硅(即玻璃)等具有表面的常態(tài)吸附劑的。常態(tài)或氧化硅表面起著官能團的作用。此外，包含親水性聚合物(例如聚乙二醇，葡聚糖，瓊脂糖或纖維素)修飾的表面的吸附劑也可以作為親水性相互作用吸附劑。大多數(shù)蛋白質(zhì)可結(jié)合親水性相互作用吸附劑，因為許多氨基酸殘基(即親水性氨基酸殘基)可通過涉及氫鍵或范德華力的親水性相互作用結(jié)合。結(jié)合親水性相互作用吸附劑的蛋白質(zhì)的例子包括肌紅蛋白，胰島素和細胞色素C。通常，極性或帶電氨基酸比例較高的蛋白質(zhì)將滯留在親水性表面上?；蛘?，親水性糖基暴露于表面的糖蛋白對親水性吸附劑的親合性也很高。靜電相互作用吸附劑用于評定靜電或離子相互作用的吸附劑包括陰離子吸附劑，例如硫酸根陰離子基質(zhì)(即SO3-)和羧酸根陰離子(即COO-)或磷酸根陰離子(即OPO3-)基質(zhì)。帶有硫酸根陰離子的基質(zhì)始終帶負電。但是，帶羧酸根陰離子的基質(zhì)只有當pH高于其pka時才帶負電。當pH低于pka時，基質(zhì)基本上呈電中性。合適的陰離子吸附劑還包括帶有硫酸根和羧酸根陰離子和磷酸根陰離子的組合的基質(zhì)吸附劑。這種組合可令負電荷強度隨pH連續(xù)變化。這類吸附劑吸引并結(jié)合帶正電的蛋白質(zhì)或大分子，例如核糖核酸酶和乳鐵蛋白。不希望受特定理論束縛，據(jù)信是吸附劑與帶正電荷氨基酸殘基(包括賴氨酸殘基，精氨酸殘基和組氨酸殘基)之間的靜電相互作用造成了結(jié)合。用于評定靜電或離子電荷相互作用的吸附劑還包括陽離子吸附劑。具體例子包括仲胺，叔胺或季胺基質(zhì)。季胺總是帶正電。但是仲胺和叔胺所帶電荷具有pH依賴性。當pH低于pka時，仲胺和叔胺帶正電，當pH高于pka時，仲胺和叔胺帶負電。合適的陽離子吸附劑還有包含仲胺，叔胺和季胺的組合的基質(zhì)。這種組合使得正電荷強度隨pH連續(xù)變化。陽離子相互作用吸附劑與分子上的陰離子位置結(jié)合，所述的分子包括氨基酸殘基(例如天冬氨酸和谷氨酸殘基)暴露于溶劑中的蛋白質(zhì)。如果是離子(既包括陰離子也包括陽離子)相互作用吸附劑，常期望使用既包含陰離子又包含陽離子的混合型離子吸附劑。這樣的吸附劑具有與pH相關的連續(xù)緩沖能力。這種連續(xù)緩沖能力使得分析物組合能夠與含有不同緩沖組分(尤其是pH在2至11之間)的洗脫劑接觸。由此在吸附劑上形成由固定化可滴定質(zhì)子交換基團決定的局部pH環(huán)境。這樣的系統(tǒng)等同于稱為色譜聚焦的固相分離技術。區(qū)別主要在于帶電糖組分的促卵泡激素異構體可在色譜聚焦吸附劑上分離。用于評定靜電相互作用的其它吸附劑包括偶極-偶極相互作用吸附劑，其中的相互作用是靜電力，但是不涉及正規(guī)的電荷或可滴定蛋白供體或受體。配位共價鍵相互作用吸附劑用于評定與金屬離子形成配位共價鍵的能力的吸附劑包括帶有(例如)二價或三價金屬離子的基質(zhì)。固定化金屬離子螯合物基質(zhì)提供的固定化合成有機分子具有一個或多個供電子基團，這些基團形成與過渡金屬離子之間配位共價相互作用的基礎。作為固定化金屬離子螯合物的基本供電子基團包括氧，氮和硫。金屬離子與固定化金屬離子螯合物結(jié)合，形成留有數(shù)個位置可與分析物上供電子基團反應的金屬離子配合物。合適的金屬離子一般包括例如銅、鎳、鈷、鋅、鐵等過渡金屬離子，以及諸如鋁和鈣等其它金屬離子。不希望受特定的理論束縛，金屬離子被認為與肽、蛋白質(zhì)中的特定氨基酸殘基或核酸選擇性反應。通常，參與這類相互作用的氨基酸殘基有組氨酸殘基，酪氨酸殘基，色氨酸殘基，半胱氨酸殘基，以及具有氧基團的氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸。例如，固定化三價鐵離子與蛋白質(zhì)上的磷酸絲氨酸，磷酸酪氨酸和磷酸蘇氨酸殘基反應。根據(jù)固定化的金屬離子，只有那些上述氨基酸殘基的局部密度足夠大的蛋白質(zhì)才被吸附劑滯留。某些金屬離子與蛋白質(zhì)之間的相互作用如此之強以致于無法用常規(guī)方法從配合物中切取蛋白質(zhì)。高度磷酸化的人β酪蛋白與固定化Fe(III)的結(jié)合非常強。表達時帶有6-組氨酸標記的重組蛋白與固定化Cu(II)和Ni(II)的結(jié)合非常強。酶活性位點相互作用吸附劑用于評定酶活性位點結(jié)合相互作用的吸附劑包括蛋白酶(例如胰蛋白酶)，磷酸酯酶，激酶和核酸酶。這種相互作用是分析物(通常是一種生物聚合物)上酶結(jié)合位點與酶上催化性結(jié)合位點之間的一種序列特異性相互作用。這類酶結(jié)合位點包括例如胰蛋白酶上與序列中具有賴氨酸-賴氨酸或賴氨酸-精氨酸的蛋白質(zhì)和肽相互作用的活性位點。更具體地說，大豆胰蛋白酶抑制劑與固定化胰蛋白酶吸附劑作用并結(jié)合?；蛘?，絲氨酸蛋白酶選擇性滯留在固定化L-精氨酸吸附劑上?？赡婀矁r相互作用吸附劑用于評定可逆共價相互作用的吸附劑包括二硫鍵互換作用吸附劑。二硫鍵互換作用吸附劑包括具有固定化疏基的吸附劑(例如固定化硫基乙醇或固定化二硫蘇糖醇)。此相互作用的基礎是在吸附劑與分析物上暴露于溶劑中的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。這類吸附劑結(jié)合具有半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)或肽以及堿基被修飾成包含還原硫化合物的核酸。糖蛋白相互作用吸附劑用于評定糖蛋白相互作用的吸附劑包括例如內(nèi)有固定化凝集素(即帶有寡糖的蛋白質(zhì))的吸附劑，例如PharmaciaBiotechofPiscataway，NewJersey出售的CONCONAVALINTM。這類吸附劑的作用基礎是涉及對大分子糖部分的分子識別的相互作用。與糖蛋白相互作用吸附劑反應并與之結(jié)合的分析物包括例如糖蛋白，特別是富含組氨酸的糖蛋白，全細胞和分離的亞細胞級分。生物特異性相互作用吸附劑用于評定生物特異性相互作用的吸附劑通常稱為“生物特異性親合吸附劑”。如果吸附作用有選擇性，而且親合力(平衡解離常數(shù)，kd)至少為10-3M至例如10-5M、10-7M，10-9M，則認為是生物特異性的。生物特異性親合吸附劑的例子包括任何能與特定生物分子特異性相互作用并與之結(jié)合的吸附劑。生物特異性親合吸附劑包括例如結(jié)合抗原的固定化抗體結(jié)合DNA結(jié)合蛋白、DNA和RNA的固定化DNA結(jié)合蛋白質(zhì)或酶的固定化底物或抑制劑結(jié)合藥物結(jié)合蛋白的固定化藥物結(jié)合受體的固定化配體；結(jié)合配體的固定化受體結(jié)合DNA和RNA結(jié)合蛋白的固定化RNA結(jié)合生物素和生物素化分子的固定化親合素或鏈霉親合素結(jié)合脂質(zhì)結(jié)合蛋白的固定化磷脂膜和小泡。酶是可修飾與之結(jié)合的分析物的有用吸附劑。細胞是有用的吸附劑。它們的表面具有復雜的結(jié)合特征。與細胞的吸附可用來鑒定例如結(jié)合表面受體的配體或信號分子。病毒和噬菌體也可用作吸附劑。病毒常具有細胞表面受體的配體(例如針對CD4的gp120)。而且，在噬菌體展示文庫形式中，噬菌體外殼蛋白起著與靶分子結(jié)合的檢測劑的作用。生物特異性相互作用吸附劑依賴于上述公知的特異性反應。吸附劑可利用的其它生物特異性相互作用的例子對本領域熟練技術人員來說是顯而易見的，而且包括在本發(fā)明構思中。在一個實施方案中，生物特異性吸附劑還可包含某種助劑，或“輔助者”，即不直接參與與靶分析物結(jié)合的分子。結(jié)合特異性程度通過接觸具有不同相互作用模式的吸附劑，樣品中的組分根據(jù)其與不同吸附劑的相互作用可被大致區(qū)分。這樣，分析物與具有不同相互作用模式的吸附劑之間的引力提供了第一分離參數(shù)。例如，通過含分析物的樣品與以疏水性為吸引基礎的第一吸附劑和以離子電荷為吸引基礎的第二吸附劑接觸，可從樣品中分離出結(jié)合疏水性吸附劑的分析物，和分離出結(jié)合帶有特定離子電荷的吸附劑的分析物。具有不同吸引基礎的吸附劑以低特異性解析分析物，因為吸附劑不僅結(jié)合分析物，而且結(jié)合樣品中借助同一吸引基礎吸引吸附劑的其它成分。例如，疏水性吸附劑不僅結(jié)合疏水性分析物，還結(jié)合樣品中任何其它疏水性成分；帶負電吸附劑不僅結(jié)合帶正電分析物，還結(jié)合樣品中任何其它帶正電成分；等等。通過采用相對中等特異性的結(jié)合特征或改變引力強度可以進一步提高以分析物與吸附劑之間的引力為基礎的分析物解析度?；谥械忍禺愋越Y(jié)合特征的分析物解析可用混合功能吸附劑來實現(xiàn)。當以較低特異性完成分析物的解析后，可將發(fā)現(xiàn)的吸引目的分析物的結(jié)合特征與多種其它結(jié)合和洗脫特性結(jié)合用以去除仍為不需要的組分，由此解析分析物。例如，如果分析物結(jié)合疏水性吸附劑，可通過提供以疏水性相互作用為吸引基礎之一且另含第二種不同的吸引基礎的混合功能吸附劑將分析物進一步與其它疏水性樣品組分分開。混合功能吸附劑可以表現(xiàn)出疏水性相互作用和負電離子相互作用，由此結(jié)合帶正電的疏水性分析物?；蛘?，混合功能吸附劑可以表現(xiàn)出疏水性相互作用和與金屬離子形成配位共價鍵的能力，由此結(jié)合能與吸附劑上金屬離子形成配位復合物的疏水性分析物。基于以上公開內(nèi)容和舉例，表現(xiàn)出中等特異性結(jié)合特征的其它吸附劑例子對本領域熟練技術人員來說是顯而易見的?；谥械忍禺愋越Y(jié)合特征解析分析物可以通過利用較高特異性的結(jié)合特征來進一步精細化。利用較高特異性的結(jié)合特征可以通過使用吸引基礎相同但引力強度不同的多種吸附劑來實現(xiàn)。換言之，雖然吸引基礎相同，但是用對分析物親合性程度不同的吸附劑可以進一步將分析物與其它樣品組分區(qū)分開來。例如，基于自身酸性結(jié)合吸附劑的某分析物可用在特定酸性pH范圍內(nèi)對分析物具有親合性的吸附劑將其與其它酸性樣品組分進一步區(qū)分。這樣，分析物可以用一種吸引pH1-2的樣品組分的吸附劑，另一種吸引pH3-4的樣品組分的吸附劑，及第三種吸引pH5-6的樣品組分的吸附劑來解析。以這種方式，可以將對結(jié)合pH5-6分析物的吸附劑具有親合性的分析物與pH1-4的樣品組分分離開來。通過降低引力間隔，即表現(xiàn)出相同吸引基礎的吸附劑的結(jié)合特征間的差異，可以使用更高特異性的吸附劑。吸附于原初吸附劑上的原初分析物本身可能具有吸附劑性能。此時，吸附于基體上的原初分析物可變成第二吸附劑用于分離第二分析物。以此類推，滯留的第二分析物可以作為第三吸附劑從樣品中分離第三分析物。以上過程可重復數(shù)次。洗脫劑洗脫劑或稱洗滌溶液選擇性地改變分析物與吸附劑之間的吸附閾值。洗脫劑解吸和洗脫已結(jié)合分析物的能力與其洗脫特性有關。不同的洗脫劑可能表現(xiàn)出大不相同的洗脫特性，有些不同的洗脫特性或略有不同的洗脫特性。洗脫劑與吸附劑的接觸溫度與具體的樣品和選用的吸附劑有關。通常，洗脫劑在0℃至100℃間的某溫度接觸吸附劑，以4℃至37℃為優(yōu)選。但是，對于某些洗脫劑來說，其它溫度更合適，這些，本領域熟練技術人員很容易確定。和吸附劑一樣，洗脫特性大不相同的洗脫劑通常其吸引基礎不同。例如，洗脫劑與分析物之間各種吸引基礎包括電荷或pH，離子強度，水結(jié)構，特定競爭性試劑的濃度，表面張力，介電常數(shù)以及上述兩者或數(shù)者的聯(lián)合?；趐H的洗脫劑基于pH(即電荷)改變吸附劑選擇性的洗脫劑包括已知的pH緩沖劑，酸性溶液和堿性溶液。通過用特定pH的緩沖劑洗滌與給定吸附劑結(jié)合的分析物，可以改變電荷，由此可能削弱特定pH緩沖劑中吸附劑與分析物之間的結(jié)合強度。在洗脫劑的pH下競爭性較低的分析物將從吸附劑上解吸而洗脫，僅留下在洗脫劑的pH下與吸附劑結(jié)合更牢固的分析物?；陔x子強度的洗脫劑在離子強度上改變吸附劑選擇性的洗脫劑包括各種類型和濃度的鹽溶液。溶于洗脫劑溶液的鹽量影響著洗脫劑的離子強度，相應改變吸附劑的結(jié)合能力。低鹽濃度的洗脫劑在離子強度上對吸附劑結(jié)合能力的改變較小。高鹽濃度的洗脫劑在離子強度上對吸附劑結(jié)合能力的改變較大?；谒Y(jié)構的洗脫劑通過改變水結(jié)構或濃度來改變吸附劑選擇性的洗脫劑包括尿素和離液鹽溶液。通常，尿素溶液包括例如濃度在0.1至8M的溶液?？捎脕硖峁┫疵搫┑碾x液鹽包括硫氰酸納，基于水結(jié)構的洗脫劑因?qū)λ献饔没蚪Y(jié)合水結(jié)構的改變而改變吸附劑結(jié)合分析物的能力。這類洗脫劑包括例如甘油，乙二醇和有機溶劑。離液陰離子提高非極性部分的水溶性因而降低分析物與吸附劑之間的疏水作用。基于去污劑的洗脫劑在表面張力和分析物結(jié)構上改變吸附劑選擇性的洗脫劑包括去污劑和表面活性劑。適合用作洗脫劑的去污劑包括離子型和非離子型去污劑，例如CHAPS，TWEEN和NP-40。基于去污劑的洗脫劑改變吸附劑結(jié)合分析物的能力是因為當引入了去污劑的疏水性和親水性基團時疏水相互作用被改變。分析物和吸附劑之間以及分析物內(nèi)部的疏水相互作用被改變并且引入了帶電基團，例如，離子型去污劑如SDS引起蛋白質(zhì)變性?；谑杷缘南疵搫┰诮殡姵?shù)上改變吸附劑選擇性的洗脫劑是在疏水相互作用方面改變吸附劑選擇性的洗脫劑。具有此種能力的洗脫劑的合適實例有尿素(0.1-8M)有機溶劑，例如丙醇，乙腈，乙二醇和甘油，還有前文所述的去污劑。乙腈常在反相層析中用作洗脫劑。在洗脫劑中包含乙二醇能夠從用親硫型吸附劑進行的鹽促相互作用中洗脫免疫球蛋白。組合洗脫劑合適的洗脫劑可以是選自以上的任何一種，也可以由以上兩種或多種洗脫劑組合而成。包含兩種或兩種以上上述洗脫劑的洗脫劑能夠基于多種洗脫特性改變吸附劑對分析物的選擇性。兩參數(shù)的可變性通過選用不同吸附劑來提供不同吸附特性的能力和通過用不同洗脫劑洗滌來提供不同洗脫特性的能力允許兩參數(shù)各自改變，各自都能影響分析物結(jié)合吸附劑的選擇性。這兩個參數(shù)能夠作大范圍的改變從而提供了一個大范圍的結(jié)合引力和洗脫條件，使得本發(fā)明方法能夠用于結(jié)合并由此檢測多種不同類型的分析物。即使尚不知道分析物的性質(zhì)，在分析特定樣品時吸附劑和洗脫劑的選擇仍取決于樣品的性質(zhì)和有待表征的具體分析物或分析物所屬類別。通常，適宜的是提供一個表現(xiàn)出多種結(jié)合特征和多種洗脫特性的系統(tǒng)，尤其是在樣品組成未知時。通過提供選擇特性范圍較寬的系統(tǒng)，目標分析物被一種或多種吸附劑滯留的可能性將顯著提高。通過提供具有大范圍的結(jié)合和洗脫特性的系統(tǒng)，并評定出提供最佳分析物解析度的結(jié)合和洗脫特性，化學或生物化學分析領域的技術人員都能夠確定用于滯留特定分析物的選擇性條件。因為本發(fā)明提供了包括大范圍的選擇性條件的系統(tǒng)，無需過多的實驗，本領域熟練技術人員就能夠方便地確定用于給定分析物的最適結(jié)合和洗脫特性。分析物本發(fā)明能夠基于分析物的多種生物、化學、或理化特性通過合適的選擇性條件利用這些特性來解析分析物。眾多通過合適的選擇性條件可加以利用的分析物特性包括疏水性指數(shù)(或分析物中疏水性殘基的量度)，等電點(即分析物不帶電時的pH)，疏水性力矩(hydrophobicmoment)(分析物的兩性量度或極性與非極性殘基分布的不對稱程度)，側(cè)向偶極矩(lateraldipolemoment)(或分析物內(nèi)電荷分布不對稱性的量度)，分子結(jié)構因子(引起分析物分子表面輪廓改變的因素，例如大側(cè)鏈沿分子骨架的分布)，二級結(jié)構組成(例如螺旋、平行和反平行片)，二硫鍵，暴露于溶劑的供電子基團(例如His)，芳香性(或分析物內(nèi)芳香殘基之間π-π相互作用的量度)和帶電原子間的線性距離。以上是可用本發(fā)明方法通過選擇合適的選擇性特性從樣品中解析給定分析物的特性種類的代表性舉例?？勺鳛榻馕鰳悠分刑囟ǚ治鑫锏幕A的其它合適的分析物特性是本領域熟練技術人員熟知的，并且包括在本發(fā)明構思中。本發(fā)明在可分析的樣品類型上沒有限制。樣品可以是固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)，但通常，樣品是液態(tài)的。固態(tài)或氣態(tài)樣品最好用本領域熟知的技術溶于合適的溶劑中成為液態(tài)樣品。樣品可以是生物組合物，非生物有機組合物或無機組合物。本發(fā)明特別適用于解析生物樣品，尤其是生物液體和提取物中的分析物還特別適用于解析非生物有機組合物中的分析物，尤其是有機小分子和無機分子組合物中的分析物。分析物可以是分子，多聚分子復合物，大分子部件，細胞，亞細胞器，病毒，分子片段，離子或原子。分析物可以是樣品中的單獨一種組分，也可以是具有一個或多個相同特征(例如分子量、等電點、離子電荷、疏水/親水相互作用等)并且具有結(jié)構、化學、生物或功能關聯(lián)的一類組分?？捎帽景l(fā)明滯留層析法解析的分析物的具體實例包括生物大分子，例如肽、蛋白質(zhì)、酶、多核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、寡糖、多糖；上述生物大分子的片段，例如核酸片段、肽片段和蛋白質(zhì)片段；上述生物大分子的復合物，例如核酸復合物，蛋白質(zhì)-DNA復合物，受體-配體復合物，酶-底物、酶抑制劑，肽復合物，蛋白復合物，糖復合物和多糖復合物；生物小分子，例如氨基酸、核苷酸、核苷、糖(sugar)、甾類、脂、金屬離子、藥物、激素、酰胺、胺、羧酸、維生素和輔酶、醇、醛、酮、脂肪酸、卟啉、類胡蘿卜素、植物生長調(diào)節(jié)素、磷酸酯和核苷二磷酸糖、合成小分子，例如藥學或治療上的有效藥劑、單體、肽類似物、甾類類似物、抑制劑、誘變劑、致癌物、抗有絲分裂藥、抗生素、離子載體、抗代謝藥、氨基酸類似物、抗細菌劑、轉(zhuǎn)運抑制劑、表面活性劑、線粒體和葉綠體功能抑制劑、電子供體、載體和受體，合成的蛋白酶底物，磷酸酶底物，酯酶和脂酶的底物，和蛋白質(zhì)修飾劑；以及合成的聚合物、寡聚物和共聚物，例如聚烷撐、聚酰胺、聚(甲基)丙烯酸、聚砜、聚苯乙烯、聚醚、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚碳酸酯、聚鹵乙烯、聚硅氧烷、POMA、PEG和以上兩者或兩者以上的共聚物。鑒定mRNA編碼的多肽各多肽被分級后，下一個步驟就是鑒定分級多肽中哪個多肽相應于由選定mRNA所編碼的多肽。存在于樣品中的該多肽已經(jīng)根據(jù)該編碼多肽已知的理化特性而被分級。該信息對于從分級的各個多肽中找到這個肽十分有用。例如，技術人員可能知道編碼的多肽在pH7時帶有負電荷，其質(zhì)量大約為18kD。可以使用含有陰離子吸附劑點的蛋白生物芯片，捕獲pH7時帶負電的蛋白質(zhì)。然后，使用質(zhì)譜儀根據(jù)分子量分級被捕獲的蛋白，得到質(zhì)譜圖。在大約18kD處檢查該圖譜，就可以得到一個或多個具有選定理化特性的候選蛋白?？梢酝ㄟ^本文所述的各種方法來進一步檢測這些候選蛋白，以確定其身份，并將其與表達的多肽相關聯(lián)。類似地，雙向凝膠電泳可以根據(jù)pI和分子量分離各蛋白。知道了表達蛋白的預測質(zhì)量和pI就能夠指引實驗人員到預期含有該蛋白的特定凝膠區(qū)域。然后檢測該位點上的蛋白，使用例如串聯(lián)質(zhì)譜分析并結(jié)合訪問蛋白數(shù)據(jù)庫，將其與表達的蛋白相聯(lián)系。鑒定由質(zhì)譜法分級的蛋白質(zhì)通過程序化數(shù)字計算機執(zhí)行算法(所述算法能夠?qū)S數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中的記錄相比較)，就能夠利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定樣品中的蛋白質(zhì)。當利用MS方法分析時，每種分子都具有特征性的質(zhì)譜(MS)數(shù)據(jù)(也稱為質(zhì)譜“特征”或“指紋”)?？蓪⑦@個數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(該數(shù)據(jù)庫中含有實際的或理論上的MS數(shù)據(jù)，或生物聚合物序列信息等等)相比較，從而分析該數(shù)據(jù)。另外，一個分子可以分裂為片段用于MS分析。從各片段的MS分析所獲的信息還可以與數(shù)據(jù)庫相比較，以鑒定分析物中的多肽(Yates，J.MassSpec.331-19(1988)；Yates等，U.S.專利No.5,538,897；Yates等，U.S.專利No.6,017,693)。其它鑒定SELDI所檢測到的蛋白的方法在U.S.專利6,225,047；國際專利申請PCT/US00/28163，和USSN60/277,677(2001年3月20日申請)中描述。由多肽解吸和檢測產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可使用任何合適的方法進行分析。在一個實施方案中，使用程序化數(shù)字計算機來分析數(shù)據(jù)。計算機程序通常含有儲存代碼的可讀介質(zhì)。可將某個代碼放入存儲器，這包括基體上每個特性的位置，在該特性處吸附劑的身份，以及用于洗滌該吸附劑的洗脫條件。使用該信息，該程序就可以鑒定出規(guī)定某些選擇性特征(如所用吸附劑和洗脫劑的類型)的基體上的一系列特性。該計算機還可包括這樣的代碼，其作為輸入而接收從基體上特定可定址位置獲得的有關在各種分子質(zhì)量下信號強度的數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)可以指示檢測的多肽的數(shù)目，任選地包括每種被檢測多肽的信號強度以及測定分子量。數(shù)據(jù)分析可包括確定被檢測多肽的信號強度(如峰高)以及去除“界外值”(偏離了預先確定的統(tǒng)計學分布的數(shù)據(jù))的步驟。觀察到的峰可進行標化，在該過程中計算每個峰相對于某個對照的高度。例如，對照可以是儀器或化學物質(zhì)(如能量吸收分子)所產(chǎn)生的背景噪音，該對照在比例尺中被設為零。然后從每種多肽或其它物質(zhì)所檢測到的信號強度可以顯示為期望比例尺(如100)的相對強度。或者，可以為該樣品導入一個標準，這樣，這個標準的峰可作為對照來計算檢測到的每種多肽或其它物質(zhì)的相對信號強度。在某些實施方案中，MS數(shù)據(jù)和由該數(shù)據(jù)所獲的信息可以與由生物多聚物的相關數(shù)據(jù)和信息組成的數(shù)據(jù)庫相比較。例如，該數(shù)據(jù)庫可由核苷酸或氨基酸的序列構成。該數(shù)據(jù)庫可由已表達序列標志(EST)的核苷酸或氨基酸序列構成?；蛘撸摂?shù)據(jù)庫可由核苷酸或氨基酸水平的基因序列構成。該數(shù)據(jù)庫可包括，但不限于以下物質(zhì)的集合任何物種基因組所包含的核苷酸序列、氨基酸序列或核苷酸序列的翻譯物。生物多聚物相關信息數(shù)據(jù)庫，如核苷酸或氨基酸序列數(shù)據(jù)庫，通常通過計算機程序或任選地由計算機運行的檢索算法進行分析。檢索序列數(shù)據(jù)庫中的信息，以得到與本發(fā)明方法所獲的數(shù)據(jù)及信息最佳的匹配(參見，例如Yates(1998)，J.MassSpec.331-19；Yates等，U.S.專利No.5,538,897；Yates等，U.S.專利No.6,017,693)?？捎糜跈z索數(shù)據(jù)庫的任何適當算法或計算機程序都可使用。檢索算法和數(shù)據(jù)庫都在經(jīng)常更新，本發(fā)明將使用這種更新后的版本。程序或數(shù)據(jù)庫的范例可在WordWideWeb(WWW)上找到http://base-peak.wiley.com/，http://mac-mann6.embl-heidelberg.de/MassSpec/Software.html，http://www.mann.embl-heidelherg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchlntro.html，ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/.和http://donatello.ucsf.edu.。U.S.專利Nos.5,632,041；5,964,860；5,706,498；和5,701,256也描述了進行序列對比的算法或方法。在一個實施方案中，蛋白，肽或核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫是組合數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫的實例包括，但不限于UCSF網(wǎng)址(prospector.ucsfedu)的ProteinProspector，Genpept數(shù)據(jù)庫，GenBank數(shù)據(jù)庫(Burks等描述，(1990)Methodsin.Enzymology1833-22)，EMBL數(shù)據(jù)庫(Kahn等描述，(1990)MethodsinElizymology18323-31)，ProteinSequenceDatabase(Barker等人描述，(1990)MethodsinEnzymology18331-49)，SWISS-PROT(Bairoch等人描述，(1993)NucleicAcidsRes.，213093-3096)，以及PIR-International((1993)ProteinSeg.DataAnaL567-192中描述)。在另一實施方案中，產(chǎn)生新的數(shù)據(jù)庫用于比較質(zhì)譜測定的MS數(shù)據(jù)，如分裂的蛋白和肽片段的質(zhì)量或質(zhì)譜。例如，產(chǎn)生被表征的肽質(zhì)量的所有可能氨基酸序列組合的理論數(shù)據(jù)庫(Parekh等，WO98/53323)。然后，與使用質(zhì)譜分析測定到的實際質(zhì)量相比較，以確定樣品中多肽的氨基酸序列。在一些實施方案中，用質(zhì)譜獲得的多肽質(zhì)量來檢索數(shù)據(jù)庫中與此質(zhì)量最接近的蛋白或由核酸序列預測的蛋白的質(zhì)量。以這種方式，可以無需測定氨基酸序列而快速地鑒定未知蛋白。在本發(fā)明的其它實施方案中，可以將由其設想出的(chimeric)多肽片段所提供的質(zhì)量與數(shù)據(jù)庫的預測質(zhì)譜相比較，所述數(shù)據(jù)庫為最匹配的蛋白或由核酸序列預測的蛋白的數(shù)據(jù)庫。算法或計算機程序在數(shù)據(jù)庫中產(chǎn)生序列的理論裂解，所用裂解劑與用于分裂MS方法分析的生物多聚物所用的裂解劑相同。使用SELDI檢測多肽在特定洗脫條件下檢測被吸附劑結(jié)合的分析物提供了有關樣品中分析物及其化學特征的信息。吸附作用在一定程度上取決于吸附劑的結(jié)合特征。與吸附劑結(jié)合的分析物具有使得結(jié)合成為可能的特性。例如，在特定pH下是陽離子的分子在包括該pH的洗脫條件下將與陰離子吸附劑結(jié)合。強陽離子分子只有在很強的洗脫條件下才從吸附劑上洗脫。具有疏水區(qū)的分子將結(jié)合疏水性吸附劑，而具有親水區(qū)的分子將結(jié)合親水性吸附劑。同樣，相互作用的強度在一定程度上取決于分析物包含疏水區(qū)或親水區(qū)的程度。所以，對樣品中特定分析物在特定洗脫條件下結(jié)合某種吸附劑的確定不僅通過分析物的彼此分離和與不具有結(jié)合所需的相應化學特性的分析物的分離而解析混合物中的分析物，而且鑒定出了具有特定化學特性的一類或單個分析物。采集有關分析物在多種洗脫條件下在一種或多種吸附劑上的滯留信息不僅可詳細解析混合物中的分析物，而且提供了有關分析物的化學信息，從這些信息本身就可以完成對他們的鑒定。這種數(shù)據(jù)被稱為“滯留數(shù)據(jù)”。用可編程數(shù)字計算機分析滯留試驗得出的數(shù)據(jù)是十分簡便的。計算機程序一般包括儲存代碼的可讀介質(zhì)?？蓪⒛炒a放入存儲器，其中包括基體陣列上各特性的位置，該特性處的吸附劑身份和用來洗滌吸附劑的洗脫條件。程序于是可用這些信息鑒定出陣列上確定某特定選擇性特征的一組特性。計算機還可包括這樣的代碼，它們接收有關探頭上特定可尋址位置在不同分子量下產(chǎn)生的信號強度的輸入數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)可指示檢測到的分析物的數(shù)量，任選地包括所測各分析物的信號強度和測得的分子量。計算機還具有處理數(shù)據(jù)的代碼。本發(fā)明構思包含了多種處理數(shù)據(jù)的方法。在一個實施方案中，處理方法涉及形成一個分析物識別譜。例如，可將據(jù)分子量測得的特定分析物的滯留數(shù)據(jù)根據(jù)特定的結(jié)合特征(例如與陰離子吸附劑或疏水性吸附劑結(jié)合)分類。收集到的數(shù)據(jù)可提供此特定分析物的化學特征概況。滯留特征反映分析物功能，后者繼而反映結(jié)構。例如，在配位共價金屬螯合物上滯留可能說明多肽分析物內(nèi)存在組氨酸殘基。根據(jù)不同pH洗脫條件下在多種陽離子和陰離子吸附劑上的滯留水平數(shù)據(jù)所揭示的信息可以得出某蛋白質(zhì)的等電點。這進而反映出該蛋白質(zhì)內(nèi)離子氨基酸的大致數(shù)量。所以，計算機可以包含將結(jié)合信息轉(zhuǎn)化為結(jié)構信息的代碼。而且，對分析物的二次處理(例如翻譯后修飾)將改變識別譜，這可以由結(jié)合或質(zhì)量差異反映出來。在另一實施方案中，在同一組選擇性閾值下對兩種不同的細胞進行滯留試驗，并將兩次試驗的滯留數(shù)據(jù)進行比較。滯留圖(即任一特性點上信號的存在或強度)內(nèi)的差異顯示出被兩種細胞差異表達的分析物。這可以包括，例如，形成一個顯示兩次滯留試驗之間信號強度差異的差異圖，由該圖顯示在兩試驗中，哪些分析物被吸附劑增加或減少地滯留。計算機還可以包含接受程序員輸入的指令的代碼?？蓪﹃嚵袃?nèi)特定預定位置上分析物的選擇性解吸提前預計并編程出漸進性和邏輯性途徑。計算機能夠?qū)?shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成另一種格式供顯示。數(shù)據(jù)分析可以包括由收集到的數(shù)據(jù)以特性位置的函數(shù)確定(例如)信號強度，去除“界外值”(偏離預定統(tǒng)計分布的數(shù)據(jù))，和由留下的數(shù)據(jù)計算分析物的相對結(jié)合親合力。得出的數(shù)據(jù)可以以各種格式顯示。一種格式中，信號強度顯示成分子量的函數(shù)圖。另一種格式又稱為“凝膠格式”，其中，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示，得出的外觀類似于凝膠上的條帶。另一格式中，達到一定閾值的信號顯示為分子量橫軸上的垂直線或條柱。于是，各條柱代表一種所測分析物。數(shù)據(jù)還可以顯示成根據(jù)結(jié)合特征和/或洗脫特性歸類的分析物的信號強度圖?？梢岳斫猓疚乃龅膶嵗蛯嵤┓绞絻H為舉例說明目的，根據(jù)這些說明，許多修改對于本領域技術人員而言是顯而易見的，也屬于本發(fā)明權利要求的精神和范圍之內(nèi)。本申請所引用的全部出版物，專利和專利申請都全文并入作為參考。權利要求1.將生物樣品中基因和表達蛋白相關聯(lián)的方法，該方法包括以下步驟a)獲取生物樣品；b)產(chǎn)生樣品的基因表達譜，從而鑒定樣品中表達的mRNA；c)鑒定該mRNA編碼的多肽的理化特性；d)根據(jù)該理化特性分級樣品中的多肽；以及e)從被分級的蛋白中鑒定該mRNA編碼的多肽，其中所述被鑒定的多肽具備該理化特性；從而將樣品中基因和蛋白表達相關聯(lián)。2.權利要求1的方法，其中生物樣品包含健康細胞的細胞溶解物。3.權利要求1的方法，其中生物樣品包含病理性細胞的細胞溶解物。4.權利要求1的方法，其中生物樣品包含與毒性化合物接觸過的細胞的細胞溶解物。5.權利要求1的方法，其中生物樣品包含受檢者細胞的細胞溶解物，所述受檢者對藥物處理有反應或者沒有反應。6.權利要求1的方法，其中生物樣品包含經(jīng)受過熱、冷或輻射處理的細胞的細胞溶解物。7.權利要求1的方法，其中生物樣品包含人類細胞。8.權利要求1的方法，其中產(chǎn)生基因表達譜的步驟包括用EST陣列鑒定表達的mRNA。9.權利要求1的方法，其中產(chǎn)生基因表達譜的步驟包括用寡核苷酸陣列鑒定表達的mRNA。10.權利要求1的方法，其中產(chǎn)生基因表達譜的步驟包括用mRNA陣列鑒定表達的mRNA。11.權利要求1的方法，其中mRNA在兩個生物樣品中被差異表達。12.權利要求11的方法，其中兩個生物樣品來自正常細胞和病理性細胞。13.權利要求12的方法，其中病理性細胞是癌細胞。14.權利要求11的方法，其中兩個生物樣品來自健康細胞和經(jīng)毒性化合物處理的細胞。15.權利要求1的方法，其中鑒定mRNA編碼的多肽的理化特性的步驟進一步包括鑒定多個理化特性。16.權利要求1的方法，其中鑒定理化特性的步驟包括預測在選定的蛋白裂解試劑對該多肽降解后該mRNA編碼的多肽所產(chǎn)生的蛋白裂解片段的質(zhì)量，鑒定該mRNA編碼的多肽的步驟包括用該試劑降解樣品中的多肽，并鑒定樣品中具有與預測片段質(zhì)量對應的質(zhì)量的實際蛋白裂解片段。17.權利要求1的方法，其中理化特性選自氨基酸序列，分子量，等電點，疏水性，親水性，糖基化，磷酸化，表位序列，配體結(jié)合序列，特定pH下的荷電，以及金屬螯合物結(jié)合。18.權利要求1的方法，其中分級樣品中多肽的步驟包括2D凝膠電泳。19.權利要求1的方法，其中分級樣品中多肽的步驟包括質(zhì)譜分析。20.權利要求1的方法，其中分級樣品中多肽的步驟包括表面增強的激光解吸電離，其中該表面增強的激光解吸電離包括通過在固相結(jié)合的吸附劑上親合性滯留而達到分級，再通過氣相離子光譜測定法從固相上分級滯留的多肽。21.權利要求20的方法，其中選擇吸附劑使其對具備至少一種下述理化特性的多肽具有親和性氨基酸序列，分子量，等電點，疏水性，親水性，糖基化，磷酸化，表位序列，配體結(jié)合序列，特定pH下的荷電，以及金屬螯合物結(jié)合。22.權利要求1的方法，其中鑒定多肽的步驟包括從分級的多肽中選出多肽，該選出的多肽包含該理化特性；鑒定該選出的多肽；并將該選出多肽的身份與mRNA編碼的多肽相關聯(lián)。23.將生物樣品中基因和蛋白表達相關聯(lián)的方法，該方法包括以下步驟a)獲取生物樣品；b)使用核酸陣列產(chǎn)生樣品的基因表達譜，從而鑒定樣品中表達的mRNA；c)鑒定該mRNA編碼多肽的理化特性；d)使用質(zhì)譜分析法，根據(jù)該理化特性分級樣品中的多肽；以及e)從被分級的蛋白中鑒定該mRNA編碼的多肽，其中所述被鑒定的多肽具備該理化特性；從而將細胞中基因和蛋白表達相關聯(lián)。24.權利要求23的方法，其中產(chǎn)生基因表達譜的步驟包括用EST陣列鑒定表達的mRNA。25.權利要求23的方法，其中產(chǎn)生基因表達譜的步驟包括用寡核苷酸陣列鑒定表達的mRNA。26.權利要求23的方法，其中產(chǎn)生基因表達譜的步驟包括用mRNA陣列鑒定表達的mRNA。27.權利要求23的方法，其中鑒定mRNA編碼的多肽的步驟包括用表面增強的激光解吸電離來分級樣品中的多肽，其中該表面增強的激光解吸電離包括通過在固相結(jié)合的吸附劑上親合性滯留而達到分級，再通過氣相離子光譜測定法從固相上分級滯留的多肽。28.將生物樣品中基因和蛋白表達相關聯(lián)的方法，該方法包括以下步驟a)獲取生物樣品；b)使用寡核苷酸陣列產(chǎn)生樣品的基因表達譜，從而鑒定樣品中表達的mRNA；c)鑒定該mRNA編碼的多肽的理化特性；d)根據(jù)該理化特性，使用表面增強的激光解吸電離來分級樣品中的多肽，其中該表面增強的激光解吸電離包括通過在固相結(jié)合的吸附劑上親合性滯留而達到分級，再通過氣相離子光譜測定法從固相上分級滯留的多肽；以及e)從被分級的蛋白中鑒定該mRNA編碼的多肽，其中所述被鑒定的多肽包含該理化特性；從而將細胞中基因和蛋白表達相關聯(lián)。29.權利要求28的方法，其中選擇吸附劑以使其對具備至少一種下述理化特性的多肽具有親和性氨基酸序列，分子量，等電點，疏水性，親水性，糖基化，磷酸化，表位序列，配體結(jié)合序列，特定pH下的荷電，以及金屬螯合物結(jié)合。30.權利要求28的方法，其中鑒定理化特性的步驟包括預測在選定的蛋白裂解試劑對多肽降解后該mRNA編碼的多肽所產(chǎn)生的蛋白裂解片段的質(zhì)量，而鑒定該mRNA編碼的多肽的步驟包括用該試劑降解樣品中的多肽，并鑒定樣品中具有與預測片段質(zhì)量對應的質(zhì)量的實際蛋白裂解片段。全文摘要本發(fā)明涉及將細胞中基因和蛋白表達相關聯(lián)的方法。文檔編號G01N33/50GK1636068SQ02806479公開日2005年7月6日申請日期2002年2月15日優(yōu)先權日2001年2月16日發(fā)明者W·E·里奇,T·W·赫琴斯申請人:賽弗根生物系統(tǒng)股份有限公司