專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)全基因組CpG島的寡核苷酸芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因檢測(cè)芯片，尤其涉及一種檢測(cè)全基因組CpG島的寡核 苷酸芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
正常細(xì)胞功能的發(fā)揮與細(xì)胞本身的遺傳信息、遺傳調(diào)控和表觀遺傳調(diào) 控相關(guān)，隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)施，國(guó)內(nèi)外對(duì)基因組所攜帶的遺傳信息 在疾病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用已有比較深入的研究。相對(duì)而言，染色質(zhì) 所攜帶的表觀遺傳信息在疾病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用才剛開(kāi)始被認(rèn)識(shí)， 表觀遺傳學(xué)基因組正在興起。表觀遺傳學(xué)的過(guò)程包括DNA甲基化，組蛋白 的修飾和ATP依賴(lài)的染色質(zhì)的修飾，都可以引起基因表達(dá)的改變。其中 DNA的甲基化是目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。
疾病發(fā)生、發(fā)展是細(xì)胞內(nèi)遺傳本身、遺傳調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控的紊亂。 大量的臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果表明除了遺傳因素，環(huán)境因素在大多數(shù)疾病發(fā) 生、發(fā)展中有巨大的影響，而表觀遺傳調(diào)控機(jī)制在遺傳因素和環(huán)境因素的 互動(dòng)關(guān)系中起了橋梁的作用，已有的研究結(jié)果表明表觀遺傳因素的作用占 百分之七十左右。近年的研究更進(jìn)一步指出表觀遺傳調(diào)控機(jī)制在多種疾病 發(fā)生中起主導(dǎo)作用。基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控是保證細(xì)胞內(nèi)基因的時(shí)空正
確表達(dá)所必需的。因此，當(dāng)表觀遺傳調(diào)控出現(xiàn)異常時(shí)，在胚胎發(fā)育階段可 能引起各種先天性的發(fā)育缺陷，在成體階段可能造成各種疾病的發(fā)生。后
基因組時(shí)代表觀遺傳學(xué)的興起為解開(kāi)生命奧秘及征服疾病帶來(lái)了希望。
在哺乳類(lèi)動(dòng)物中，胞嘧啶的甲基化是惟一己知的DNA內(nèi)源性修飾方 式，即通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)的催化作 用，將甲基基團(tuán)加在胞嘧啶的5' C位置處。在哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞中，大多 數(shù)5'-甲基胞嘧啶(5mC)以雙核苷酸CpG的形式出現(xiàn)。CpG雙核苷酸在 基因組中的分布很不均勻，其中密度較高的區(qū)域稱(chēng)為CpG島(CpGisland)。 以人類(lèi)基因組為例，人類(lèi)5(m 6(m的基因有CpG島，據(jù)估計(jì)整個(gè)基因組 有45, 000個(gè)CpG島，并且?guī)缀蹩偸俏挥诨騿?dòng)子和(或)外顯子周?chē)?除了印記基因和女性失活的X染色體的幾個(gè)基因外，正常情況下，在CpG 島的CpGs總是非甲基化的，而大多數(shù)CpG島之外的CpGs則是甲基化的。
DNA甲基化的機(jī)制及其作用尚未完全清楚，目前認(rèn)為它與控制基因表 達(dá)、DNA修復(fù)、外源基因的識(shí)別和剔除、以及染色體的穩(wěn)定性等相關(guān)。已 證實(shí)，CpG島的甲基化可以直接導(dǎo)致相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)沉默，啟動(dòng)子 區(qū)域CpG島甲基化是與基因突變和缺失相并列的抑癌基因失活的第3種途 徑，并成為近年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)之-。
隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，DNA甲基化的檢測(cè)手段日漸豐富，常用技術(shù) 的基本原理主要可以歸納為四個(gè)方面:一種是依賴(lài)化學(xué)物質(zhì)對(duì)甲基化和非 甲基化胞嘧啶的化學(xué)活性不同，將甲基修飾基團(tuán)的差別轉(zhuǎn)變?yōu)閴A基序列的 不同，從而加以分離；另一種是依賴(lài)甲基化和非甲基化胞嘧啶對(duì)特定的限
制性?xún)?nèi)切酶處理的不同反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)；第三種是依據(jù)差異性雜交的原理；第
四種則是依靠甲基化CpG結(jié)合(methyl-CpG-binding domain, MBD)蛋白 家族對(duì)甲基化以及非甲基化的CpG序列的結(jié)合能力的不同進(jìn)行分離。此
外，還有單核苷酸法、甲基化接受力的檢測(cè)法等多種技術(shù)，這些技術(shù)極大 地促進(jìn)了表觀遺傳學(xué)的研究，推動(dòng)了表觀基因組學(xué)研究的開(kāi)展。目前雖然
已經(jīng)存在較多的DNA甲基化的檢測(cè)技術(shù)，但是每種方法都有一定的局限
性，難以達(dá)到大規(guī)模和全基因組范圍的分析，也不能檢測(cè)全基因組中甲基
化或非甲基化DNA具體的CpG位點(diǎn)?，F(xiàn)有的表觀基因組學(xué)急需要高通量， 大規(guī)模的研究手段，全面地了解在疾病的發(fā)生過(guò)程中甲基化譜式的改變。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)全基因組CpG島的寡核苷 酸芯片，能夠高通量、大規(guī)模地對(duì)全基因組DNA進(jìn)行CpG島的檢測(cè)。為此， 本發(fā)明還提供應(yīng)用該寡核苷酸芯片進(jìn)行檢測(cè)的方法。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種檢測(cè)全基因組CpG島的寡核苷酸芯 片，包括固相載體和探針，所述探針與全基因組中CpG島及CpG島上下游 2kb區(qū)域的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。
所述探針的設(shè)計(jì)針對(duì)包括人類(lèi)、大鼠、小鼠在內(nèi)的哺乳動(dòng)物全基因組 CpG島及CpG島上下游2kb區(qū)域的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種應(yīng)用上述寡核苷酸芯片檢測(cè)全基因 組CpG島位置的方法，包括如下步驟
(1) 抽提待測(cè)樣品核酸；
(2) 對(duì)步驟(1)抽提的DNA進(jìn)行純化；
(3) 標(biāo)記步驟(2)純化的DNA;
(4) 選取上述寡核苷酸芯片，在適于與所選芯片進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的DNA，并使其反應(yīng)足夠時(shí)間；
(5)檢測(cè)雜交反應(yīng)結(jié)果，以確定待測(cè)樣品DNA的CpG島位置。
其中，所述步驟(2)中，DNA經(jīng)純化后，可按不同的研究目的進(jìn)行 富集，并經(jīng)片段化處理；所述步驟(3)的標(biāo)記包括熒光素標(biāo)記、生物 素標(biāo)記、熒光共振能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記和酶標(biāo)記。
本發(fā)明的檢測(cè)全基因組CpG島的寡核苷酸芯片，能高通量、快速、準(zhǔn) 確地在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)目的DNA所在的CpG島位置，有助于全面了解 全基因組CpG島區(qū)域的甲基化譜式的改變。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。 附圖是應(yīng)用本發(fā)明的寡核苷酸芯片檢測(cè)全基因組CpG島的方法的流 程圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的針對(duì)全基因組CpG島的寡核苷酸芯片，包括固相載體和探 針，所述固相載體選材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材 料中的一種或它們的任意組合；所述探針與全基因組范圍內(nèi)CpG島及CpG 島上下游2kb區(qū)域的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。
應(yīng)用本發(fā)明的寡核苷酸芯片檢測(cè)人全基因組CpG島的方法如附圖所 示，具體步驟為
(1)寡核苷酸芯片的制備 l)探針設(shè)計(jì)
針對(duì)全基因組范圍內(nèi)的CpG島及CpG島上下游2kb區(qū)域的核苷酸序列
設(shè)計(jì)探針，平均每個(gè)CpG島設(shè)計(jì)6 10條探針，用于確定所檢測(cè)DNA所在 的CpG島的位置。設(shè)計(jì)探針長(zhǎng)度為30 bp 55bp， Tm值65。C 7(TC， GC 含量為50 60%。 2)芯片制備
采用原位合成的方式進(jìn)行。 (2)待測(cè)樣品的處理和標(biāo)記
1) 全基因組DNA抽提及目的基因的獲取
采用FlexiGene DNA Kit (250) (QIAGEN， Cat. No. 51206) i式劑盒 抽提待測(cè)樣品基因組DNA。將抽提溶解好的DNA移入高壓滅菌過(guò)的1. 5ml 離心管中，取lul進(jìn)行電泳(1%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE, EB， 80MV， 1.5 小時(shí)電泳)，在FR-200紫外與可見(jiàn)分析裝置上拍攝照片，并對(duì)照marker (Lambda DNA/EcoRI+Hindlll)進(jìn)行定量。抽提的DNA依據(jù)不同的研究需 要可做進(jìn)一步的篩選和富集。
2) 目的DNA的純化和片段化
目的DNA采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)純化。純化的DNA經(jīng)測(cè)定濃度后，用DNase I進(jìn)行片段化，片斷 化長(zhǎng)度控制在80 200bp左右。片段化的反應(yīng)體系包括IX DNase I緩沖液，200 ngM純化目的DNA， DNase I (0. 0012 ,g)。反應(yīng)條件 為37。C溫浴5 min，然后95°C 15 min。片段化后的產(chǎn)物跑1. 5%瓊脂糖 凝膠，電泳檢測(cè)結(jié)果。
3) 熒光素標(biāo)記
利用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶在3'末端進(jìn)行熒光素標(biāo)記，標(biāo)記的反應(yīng)
體系包括
片段化目的DNA 25 W
5X脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶緩沖液 8 KL 40 W體系^ Cy3-dCTP (1 rnM) 1 W
脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(20 U/Hl)3 W 、ddH20 3 W
反應(yīng)條件為37X:溫浴120min，然后95。C加熱15min。 (3)芯片雜交及結(jié)果分析
以熒光標(biāo)記為例，標(biāo)記的DNA 95C變性10 min，立即置于冰上，用 于雜交。雜交反應(yīng)體系包括IOXSSPE， 0.01% triton， 5XDenhard， s solution, 10% DMSO以及熒光素標(biāo)記的DNA。反應(yīng)條件為45。C 65。C溫 浴1小時(shí) 16小時(shí)。然后相繼用洗漆緩沖液I (2XSSC， 0.2% SDS)和 洗滌緩沖液II (1XSSC， 0.1% SDS)在45。C 65X:各洗滌10 min，室溫 下用洗滌緩沖液III (0. 1XSSC)洗滌5分鐘，最后在室溫下用cWH20洗滌 30秒。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，用Axon 4000A芯片掃描儀進(jìn)行掃描(也 可以用其他的激光掃描儀)。掃描結(jié)果用GenePix 4000A軟件處理圖像得 到數(shù)據(jù)文件，然后對(duì)數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析。
對(duì)寡核苷酸芯片的雜交結(jié)果進(jìn)行分析，以確定目的DNA所在的CpG島位置。 實(shí)施例1
應(yīng)用本發(fā)明的寡核苷酸芯片檢測(cè)人全基因組CpG島的方法如附圖所 示，具體步驟為
l.寡核苷酸芯片的制備
1) 探針設(shè)計(jì)
針對(duì)人類(lèi)全基因組范圍內(nèi)46， 957個(gè)CpG島及CpG島上下游2kb區(qū)域 的核苷酸序列，設(shè)計(jì)共設(shè)計(jì)367， 802條探針，平均每個(gè)CpG島設(shè)計(jì)8條探 針，用于確定所檢測(cè)DNA所在的CpG島的位置。設(shè)計(jì)探針長(zhǎng)度為30bp 55bp， Tm值65。C 70。C， GC含量為50 60%。
2) 芯片的制備采用原位合成的方式進(jìn)行。 2.待測(cè)樣品的處理和標(biāo)記
1) 人基因組DNA抽提及目的基因的獲取
采用FlexiGene DNA Kit (250) (QIAGEN， Cat. No. 51206)試劑盒 抽提人外周血或組織中基因組DNA。將抽提溶解好的認(rèn)A移入高壓滅菌過(guò) 的1.5ml離心管中，取lul進(jìn)行電泳(1%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE, EB， 80MV， 1.5小時(shí)電泳)，在FR-200紫外與可見(jiàn)分析裝置上拍攝照片，并對(duì) 照marker (Lambda DNA/EcoRI+HindIII)進(jìn)行定量。抽提的DNA依據(jù)研 究需要分別使用甲基化和非甲基化特異的DNA親和層析柱進(jìn)行分離富集。
2) 目的DNA的純化和片段化
分離的甲基化和非甲基化修飾的DNA分別采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)進(jìn)行純化。純it的DNA 經(jīng)測(cè)定濃度后，用DNase I進(jìn)行片段化，片斷化長(zhǎng)度控制在S0 150bp左 右。3(￥1片段化的反應(yīng)體系包括IX DNaseI緩沖液，200 ng/W純化 目的DNA， DNase I (0. 0012 U/Pg)。反應(yīng)條件為37。C溫浴5 min，然后95 °C 15 min。片段化后的產(chǎn)物跑1.5%瓊脂糖凝膠，電泳檢測(cè)結(jié)果。
3) 熒光素標(biāo)記
利用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶在3'末端進(jìn)行熒光素標(biāo)記，標(biāo)記的反應(yīng) 體系包括
片段化目的DNA 25 W
5X脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶緩沖液 8 W 40 rt體系^ Cy3-dCTP (1 mM) 1 W
脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(20 U/W) 3 W 、ddH20 3 W
反應(yīng)條件為37'C溫浴120min，然后95"加熱15min。 (3)芯片雜交及結(jié)果分析
標(biāo)記的DNA經(jīng)95。C變性10min,立即置于冰上，用于雜交。雜交反 應(yīng)體系包括10XSSPE，0.01%triton，5XDenhard， s solution,腦DMS0 以及熒光素標(biāo)記的DNA。反應(yīng)條件為48。C溫浴12小時(shí)。然后相繼洗滌緩 沖液I (2XSSC， 0.2% SDS)和洗滌緩沖液II (1XSSC， 0.1% SDS)在 48。C各洗滌10 min，室溫下用洗滌緩沖液III (0. 1XSSC)洗滌5分鐘， 最后在室溫下用ddH20洗滌30秒。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，用Axon 4000A 芯片掃描儀進(jìn)行掃描。掃描結(jié)果用GenePix 4000A軟件處理圖像得到數(shù)據(jù) 文件，然后對(duì)數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析。
對(duì)寡核苷酸芯片的雜交結(jié)果進(jìn)行分析，以確定甲基化和非甲基化DNA 所在的CpG島位置。
權(quán)利要求
1. 一種檢測(cè)全基因組CpG島的寡核苷酸芯片，包括固相載體和探針，其特征在于，所述探針與全基因組中CpG島及CpG島上下游2kb區(qū)域的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。
2. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的探針長(zhǎng)度 為30 bp 55bp， Tm值為65。C 70。C， GC含量為50 60%，且每個(gè)CpG 島設(shè)計(jì)6 10條探針。
3. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述探針的設(shè)計(jì) 針對(duì)包括人類(lèi)、大鼠、小鼠在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的全基因組CpG島及其上下游 2kb區(qū)域的核苷酸序列。
4. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述固相載體選 材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的 任意組合。
5. —種應(yīng)用權(quán)利要求1所述寡核苷酸芯片檢測(cè)全基因組CpG島的方 法，其特征在于，包括如下步驟(1) 抽提待測(cè)樣品核酸；(2) 對(duì)步驟(1)抽提的DNA進(jìn)行純化；(3) 標(biāo)記步驟(2)純化的DNA;(4) 選取權(quán)利要求1所述的寡核苷酸芯片，在適于與所選芯片進(jìn)行雜 交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的DNA，并使其反應(yīng)足夠時(shí)間；(5) 檢測(cè)雜交反應(yīng)結(jié)果，以確定待測(cè)樣品DNA的CpG島位置。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，DNA經(jīng)純化后，可按不同的研究目的進(jìn)行富集，并經(jīng)片段化處理。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的標(biāo)記包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、熒光共振能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記和酶標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因芯片，公開(kāi)了一種檢測(cè)全基因組CpG島的寡核苷酸芯片，包括固相載體和探針，所述探針與全基因組中CpG島及CpG島上下游2kb區(qū)域的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。本發(fā)明還公開(kāi)了一種應(yīng)用上述寡核苷酸芯片檢測(cè)全基因組CpG島位置的方法。本發(fā)明的寡核苷酸芯片，能高通量、快速、準(zhǔn)確地在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行甲基化和/或非甲基化DNA的CpG島檢測(cè)，為全基因組CpG島的相關(guān)研究提供有力工具。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101205559SQ20061014747
公開(kāi)日2008年6月25日 申請(qǐng)日期2006年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月19日
發(fā)明者穎 秦, 肖華勝 申請(qǐng)人:上海生物芯片有限公司