專利名稱：基于組織培養(yǎng)的表達(dá)圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及樣品尤其是腫瘤樣品的制備，作為表達(dá)分析的mRNA來源。
背景技術(shù)：
組織培養(yǎng)的腫瘤樣品用于腫瘤發(fā)展的預(yù)后和作為預(yù)測藥物應(yīng)答性的工具已經(jīng)有很長的歷史了。作為組織培養(yǎng)藥物應(yīng)答試驗(yàn)(HDRATM)基礎(chǔ)的這些組織化學(xué)技術(shù)有很多文獻(xiàn)。如這樣應(yīng)用，將描述三維組織培養(yǎng)用途的參考書目附于本申請作為附錄。例如，在Singh，B.，等最近的論文Head and Neck(2002)24437-442中，該技術(shù)的總的特征得到了描述。如該論文中所述的，簡要地，洗滌活體檢查的組織并切成1至2mm3的碎塊，等量放置在0.5cm3的膠原海綿凝膠(Gel Foam，Pharmacia & Upjohn，Inc.)塊上。然后將海綿凝膠培養(yǎng)物放入含有10％胎牛血清和慶大霉素(50μg/ml)的DMEM/Ham’s F12培養(yǎng)基中。接著，將培養(yǎng)物在37℃和5％CO2下孵育24小時(shí)。對該技術(shù)進(jìn)行改造也是容許的，提供的樣品三維特征得到保存。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)除了作為預(yù)后和藥物篩選工具的用途以外，這樣的培養(yǎng)物也可以用作表達(dá)圖譜(expression profiling)底物的信使RNA的來源?？紤]提供可靠表達(dá)文庫相關(guān)的問題是重要的，尤其是源自患者樣品時(shí)，鑒于存在于腫瘤中的壞死區(qū)域和鑒于需要將腫瘤組織從治療或診斷中心轉(zhuǎn)移至能夠進(jìn)行圖譜分析的實(shí)驗(yàn)室，其中高質(zhì)量、無降解RNA的提取是困難的。通過將腫瘤非壞死部分維持在三維組織培養(yǎng)中，腫瘤原位表達(dá)圖譜得到有效地保存。
發(fā)明公開本發(fā)明提供了制備表征組織尤其是腫瘤組織表達(dá)圖譜mRNA文庫的方法，以便表征組織的特性。在腫瘤分析的情況中，該圖譜有助于設(shè)計(jì)治療，尤其是和具有相似表達(dá)模式的組織樣品(historical sample)相比較，該組織樣品對特定方案的應(yīng)答性是已知的。如涉及特定性組織來源的特征表達(dá)圖譜的其它用途對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
因此，一方面，本發(fā)明涉及制備表征組織表達(dá)RNA的方法，該方法包括，在海綿凝膠三維培養(yǎng)中培養(yǎng)完整組織樣品后，從所述培養(yǎng)物中提取RNA。
然后使用任何本領(lǐng)域已知技術(shù)如Northern印跡來分析提取的信使RNA。然而，優(yōu)選將提取的mRNA用作模板來制備cDNA文庫，接著使用已知的如那些基于基因芯片的矩陣技術(shù)來分析。另一方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法制得的mRNA、cDNA和cRNA文庫和將這些文庫用于預(yù)后和治療選擇的方法。
實(shí)施發(fā)明的方式本發(fā)明解決了用于表達(dá)圖譜的恰當(dāng)保存的組織樣品，尤其是腫瘤組織樣品的問題。目前，在活組織檢查和提取用于分析的RNA的間隔中，將活組織檢查樣品進(jìn)行RNA降解并改變了表達(dá)模式。通過在三維組織培養(yǎng)中維持組織完整性，保存了表達(dá)圖譜的準(zhǔn)確度并最小化了RNA的降解。
本發(fā)明方法中，使用常規(guī)技術(shù)將組織活體檢查，然后分成約1mm3大小的完整部分。當(dāng)然允許樣品大小有一些改變，例如，使用O.25mm3-5mm3、0.5-3mm3的塊，優(yōu)選1-2mm3。然后將完整的組織塊放入三維組織培養(yǎng)中，通常將完整樣品和膠原海綿凝膠(collagen sponge-gel)結(jié)合，如Singh，B.，等(上文)描述的和許多其它論文評論的那些，例如Hoffman，R.M.，等，Int’lJ.Oncol.(1992)1467-474；Hoffman，R.M.，Encyclopedia of Life Sciences(生命科學(xué)百科全書)(2001)Nature Publishing Group，London.，以及本領(lǐng)域通常所知的HDRATM實(shí)驗(yàn)。用于本發(fā)明方法的膠原型海綿凝膠是用作組織的支持物，因此海綿凝膠的大小基本上大于碎塊的大小；通常，海綿凝膠的表面積大概是完整組織樣品直徑的兩倍。然后在合適的培養(yǎng)基如所附出版物中所述的培養(yǎng)基中維持三維培養(yǎng)。按需要保持保存用于RNA提取的樣品的時(shí)間來保持培養(yǎng)。
使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行RNA提取。
為表達(dá)文庫來源的組織樣品通常是腫瘤組織。因此，本發(fā)明方法特別地用于評價(jià)乳房、肺、結(jié)腸、肝臟、胃、胰腺、前列腺、頭和頸、卵巢，和腦腫瘤的表達(dá)圖譜。該列舉不是窮舉，如任何固體腫瘤或，實(shí)際上，任何組織可以用作文庫的來源。
然后根據(jù)研究者的需要分析提取的RNA。可以使用Northern印跡技術(shù)，但是使用商業(yè)上可獲得的表達(dá)矩陣?yán)缒壳皬腁ffymetrix可獲得的表達(dá)矩陣可以獲得另外的信息。需要大約15μg標(biāo)記的cDNA。通常，通過反轉(zhuǎn)錄將提取的RNA轉(zhuǎn)化成cDNA，最常規(guī)通過寡-dT引物和T7RNA聚合酶啟動(dòng)子來引發(fā)。將所得到的單鏈cDNA轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA，其因此產(chǎn)生適于T7聚合酶啟動(dòng)的體外轉(zhuǎn)錄(IVT)模板。在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄過程中整合標(biāo)記的核苷酸，來許可所得到cRNA隨后的檢測。然后，將所得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cRNA用于提供根據(jù)芯片上的DNA矩陣檢測到的圖譜。
在隨后的檢測中，通過在含有Mg++緩沖液中加熱將標(biāo)記的cRNA片斷化，并在含有鮭魚精子DNA、BSA和有標(biāo)記的(spiked)對照RNA的雜交混合物中結(jié)合。如Affymetrix Gene Chip Expression Analysis Technical Manual(Affymetix基因芯片表達(dá)技術(shù)手冊)中所述的(2001)，將大約250μl混合物運(yùn)用至GeneChipTM并在50℃雜交16小時(shí)。如所述的，雜交后，使芯片通過高度和低嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌，接著用生物素化的抗-鏈霉抗生物素蛋白抗體(Vector Labs)放大(amplification)的藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(分子探針)抗體染色，和用藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白另外進(jìn)行染色。進(jìn)一步洗滌后，將矩陣在Affeymetrix掃描儀中數(shù)字化并使用MicroarraySuite 5TM軟件評價(jià)圖像。
之前所述的僅僅是用以分析從根據(jù)本發(fā)明方法培養(yǎng)物中提取的RNA的多種技術(shù)的實(shí)例。
從文庫成分測定獲得的數(shù)據(jù)可以有效地用于預(yù)測切除腫瘤患者的結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明方法分析，還可以用于設(shè)計(jì)治療方案，以及預(yù)測化學(xué)敏感性。
權(quán)利要求
1.制備組織表達(dá)譜的方法，該方法包括下述步驟從所述組織的完整樣品中提取RNA，所述組織是在三維膠原海綿凝膠培養(yǎng)中培養(yǎng)的。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括將所述RNA進(jìn)行分析以獲得表達(dá)數(shù)據(jù)。
3.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括將提取的RNA轉(zhuǎn)化成cDNA。
4.權(quán)利要求3的方法，其進(jìn)一步包括從所述cDNA制備標(biāo)記的cRNA并使用微矩陣分析來分析所述cRNA。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述組織是腫瘤組織。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述腫瘤是乳房、肺、結(jié)腸、肝臟、胃、胰腺、前列腺、頭、頸、卵巢，或腦的腫瘤。
7.根據(jù)權(quán)利要求1方法所制得的RNA表達(dá)文庫。
8.根據(jù)權(quán)利要求3方法所制得的cDNA表達(dá)文庫。
9.根據(jù)權(quán)利要求4方法所制得的cRNA表達(dá)文庫。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其進(jìn)一步包括基于所述數(shù)據(jù)制定預(yù)后。
全文摘要
從組織樣品獲得可靠表達(dá)文庫的方法，包括從完整組織中提取RNA，所述組織是基于組培的在三維海綿凝膠中培養(yǎng)的。
文檔編號C07H21/04GK1738910SQ200380108676
公開日2006年2月22日 申請日期2003年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月12日
發(fā)明者姜平, 徐明旭, 譚玉英 申請人:抗癌公司