專利名稱：改進(jìn)的組織培養(yǎng)方法
若干年來(lái)，以組織培養(yǎng)法培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞這一領(lǐng)域一直是生物科學(xué)中許多領(lǐng)域的研究中心。以組織培養(yǎng)培養(yǎng)這類細(xì)胞作為生化產(chǎn)物的來(lái)源，并供進(jìn)行生化與生物技術(shù)方法的基礎(chǔ)研究。哺乳類細(xì)胞在組織培養(yǎng)中的生長(zhǎng)與近來(lái)分子生物學(xué)的幾乎所有進(jìn)展密切相關(guān)。
因此，當(dāng)前研究組織培養(yǎng)的方法很重要，許多科學(xué)家正在研究組織培養(yǎng)的條件及組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一些機(jī)理。
本發(fā)明屬于生化領(lǐng)域，具體地說(shuō)是屬于組織培養(yǎng)領(lǐng)域。
本發(fā)明提供一種在無(wú)血清組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞的方法，所述哺乳類細(xì)胞適于在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)，并對(duì)組織培養(yǎng)基中所存在的胰島素呈陽(yáng)性反應(yīng)，所述組織培養(yǎng)基含有約0.1至約10，000毫微克精氨酰-A-O-胰島素/毫升。
本發(fā)明還提供一種適于在組織培養(yǎng)方法中培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞的無(wú)血清組織培養(yǎng)基，它含有約0.1～約10，000毫微克精氨酰-A-O-胰島素/毫升。
本發(fā)明的特征是以精氨酰-A-O-胰島素(AAO-胰島素)用作培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞的組織培養(yǎng)基的生長(zhǎng)促進(jìn)劑。AAO-胰島素是從人胰島素原制備人胰島素(HI)過(guò)程中的付產(chǎn)品，所述方法已詳細(xì)發(fā)表，并以與可分裂的先導(dǎo)順序共價(jià)連接的人胰島素原開(kāi)始，所述先導(dǎo)順序由為此目的進(jìn)行了遺傳改造的微生物合成(Frank，B.H.，andChance，R.E.(1983)Munch.Med.Wschr.，125(Suppl.1)14-20.Frank，B.H.，andChance，R.E.(1985)Symposium“QuoVadis？”，Sanofi，May29-30，Toulouse-Labege，F(xiàn)rance，pp.138-146.Frank，B.H.，Petee，J.M.，Zimmerman，R.E.，andBurck，P.J.(1981)inPeptidesSynthesis-Structure-Function.ProceedingsoftheSeventhAmericanPeptideSymposium.D.H.RickandE.Grosseds.，PierceChemicalCo.，Rockford，Ill.，pp.729-738.)胰島素原用胰酶和羧肽酶B切割，最好在金屬離子存在下，如歐洲專利公報(bào)0264250(美國(guó)專利申請(qǐng)06/917939)所述。
眾所周知，人胰島素由一條30個(gè)氨基酸的B鏈與一條21個(gè)氨基酸的A鏈通過(guò)二硫橋連接而構(gòu)成，所述二硫橋在A-7位與B-7位及A-20位和B-19位連接半胱氨酸。人胰島素原是一種含有86個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其中在HI的A-1位的甘氨酸通過(guò)一個(gè)內(nèi)部連接肽(一個(gè)35個(gè)氨基酸的鏈)被連接到B-30位的蘇氨酸上。所述連接肽在人胰島素原轉(zhuǎn)化成HI的過(guò)程中被切割而除去。
所述切割過(guò)程當(dāng)然并不完全，不完全切割產(chǎn)生一些付產(chǎn)物，其中一種是精氨酰-A-O-胰島素，它不同于HI，它在人胰島素氨基端A-1位額外地連接了一個(gè)精氨?；Ｔ摳懂a(chǎn)物可通過(guò)陽(yáng)離子交換層析與HI分離，如下列制備1所示。
有趣的是AAO-胰島素在體內(nèi)降低兔血葡萄糖的作用比HI弱。在兔的測(cè)試中，AAO-胰島素的效力為HI的75%(摩爾對(duì)摩爾)。但是，AAO-胰島素至少在刺激組織培養(yǎng)中哺乳類細(xì)胞的生長(zhǎng)方面同胰島素一樣有效。
當(dāng)生物學(xué)家和生物化學(xué)家最初開(kāi)始在組織培養(yǎng)方法中培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞時(shí)，在含有5-10%濃度的動(dòng)物血清的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細(xì)胞已成為常規(guī)。血清給細(xì)胞提供了大量的營(yíng)養(yǎng)物，許多重要的實(shí)驗(yàn)都是在這類培養(yǎng)中進(jìn)行的。但是，由于需要更精確的實(shí)驗(yàn)，人們已在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)組織培養(yǎng)細(xì)胞，其中所有的組成成分都是經(jīng)純化并準(zhǔn)確定性的化學(xué)物質(zhì)。為了許多細(xì)胞的適當(dāng)生長(zhǎng)而應(yīng)該或必須加到合成培養(yǎng)基中的一種物質(zhì)便是胰島素。
例如，下列細(xì)胞類型為文獻(xiàn)中已描述過(guò)的對(duì)加入胰島素的組織培養(yǎng)基呈陽(yáng)性反應(yīng)的類型。
大鼠垂體癌細(xì)胞人頸癌細(xì)胞犬腎癌細(xì)胞大鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤小鼠黑素瘤大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤人乳腺癌細(xì)胞大鼠卵巢小鼠胚胎癌細(xì)胞小鼠睪丸人結(jié)腸癌細(xì)胞Balb/c小鼠胚胎大鼠成肌細(xì)胞人肺表皮樣癌細(xì)胞倉(cāng)鼠腎人成纖維細(xì)胞人表皮樣癌細(xì)胞大鼠甲狀腺小鼠胚小鼠淋巴綿羊脂肪細(xì)胞顯然，胰島素是培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞的培養(yǎng)基中的一種必要的共同因子。在培養(yǎng)所有受培養(yǎng)基中胰島素刺激的哺乳類細(xì)胞時(shí)都需使用本發(fā)明。因此，所用細(xì)胞的性質(zhì)和來(lái)源不限制本發(fā)明。
組織培養(yǎng)基也不是限制因素。30多年來(lái)，無(wú)血清組織培養(yǎng)基已被廣泛研究及公開(kāi)。為方便讀者，下列文獻(xiàn)可作為關(guān)于培養(yǎng)基資料的來(lái)源，并作為本文的參考文獻(xiàn)。
JaymeandBlackman，CultureMediaforPropagationofMammalianCells，VirusesandOtherBiologicals，AdvancesinBiotechnologicalProcesses5，1-30，A.R.Liss，Inc.(1985)HamandMcKeehan，MethodsEnzymol.58，44-93(1979)TheGrowthRequirementsofVertebrateCellsInVitro，Waymouth，HamandChapple，Eds.，CambridgeUniversityPress(1981)MethodsforSerum-FreeCultureofCellsoftheEndocrineSystem，Barnes，SirbaskuandSato，Eds.，A.R.Liss，Inc.(1986)
一般說(shuō)來(lái)，用于哺乳類細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基由許多成份構(gòu)成，它們包括必需氨基酸如精氨酸、半胱氨酸、組氨酸、甲硫氨酸等;非必需氨基酸如丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸等;及氨基酸衍生物如谷胱甘肽、羥脯氨酸、丁二胺等。這類培養(yǎng)基通常還含有維生素如葉酸、生物素、煙酰胺、泛酸、吡多醇、核黃素及維生素B12。使用碳水化合物如葡萄糖和丙酮酸，常用的還有核酸衍生物如腺嘌呤、次黑嘌呤和胸腺嘧啶。
這類培養(yǎng)基含有一種類脂源如膽堿和異肌醇，無(wú)機(jī)離子包括鈣、鎂、鈉、磷酸根等。還常含有無(wú)機(jī)微量元素如鈷、鐵、硒和鋅。培養(yǎng)基通常是緩沖的以維持所需的pH，經(jīng)常用碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)怏w緩沖。上面引用的Ham和Mckeehan的文章便是已通過(guò)使用證實(shí)的并在本領(lǐng)域內(nèi)公知的一個(gè)培養(yǎng)基配方的特別好的來(lái)源。在《TCA手冊(cè)》(theTCAManual，theTissueCultureAssociation出版，12111ParkLawnDrive，Rockville，MD.20852)中可找到關(guān)于組織培養(yǎng)基的更詳細(xì)的描述。
如上所述，AAO-胰島素是作為從人胰島素原制備HI的付產(chǎn)品而發(fā)現(xiàn)的，因此，只需從不純的HI產(chǎn)品中分離便可容易地得到而用于本發(fā)明。下面的制備為用于上述分離的層析方法和用于純化AAO-胰島素的結(jié)晶步驟。
制備1層析將含有AAO-胰島素和HI的混合物溶于32ml含有7M脲、0.05M醋酸鈉和0.1M氯化鈉的緩沖液(pH3.8)中。用硫代丙基TRISACRYL樹(shù)脂(Rhone-Poulenc的分部ReactifsIBF制造，顆粒大小為40-80微米)裝1×15cm層析柱。將AAO-胰島素溶液上柱，用9倍于柱體積的梯度緩沖液洗脫，所述緩沖液的組成與上面的相同，只是氯化鈉濃度升到0.2M。流速為1ml/分。從柱中的流出液通過(guò)在280nm處的吸收而監(jiān)測(cè)。發(fā)現(xiàn)胰島素最先流出，它基本上在梯度洗脫開(kāi)始后的最初70ml中洗出。然后AAO-胰島素流出，在洗出液的72～105ml中收集，得到基本沒(méi)有HI污染的富含AAO-胰島素的部分。
結(jié)晶840ml的AAO-胰島素產(chǎn)品溶液，含有2.32gAAO-胰島素，用10%NaOH將其pH調(diào)至8.0。用截留分子量為3000的膜將溶液在4℃下濃縮至260ml，然后將濃縮液對(duì)280ml去離子水透析。將溶液稀釋至蛋白濃度為2g/l，并加入16.2ml冰醋酸和850ml去離子水，制成0.25M溶液(在醋酸中)。然后使其升溫至23℃，并加入0.93ml的20%氯化鋅水溶液。用濃氫氧化銨將pH調(diào)至6.0，然后在23℃下攪拌該混合物4小時(shí)。然后冷卻到4℃，并在此溫度下靜止保溫16小時(shí)。然后傾出上清液，將剩余的稠的結(jié)晶漿離心。所得的結(jié)晶用純水洗兩次。然后再用無(wú)水乙醇洗兩次，每次用23ml。將結(jié)晶在室溫下真空干燥，得到2.11g基本純凈的AAO-胰島素。
實(shí)例1在一種無(wú)血清培養(yǎng)基中，用AAO-胰島素培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞，所述培養(yǎng)基已被證明對(duì)培養(yǎng)這類細(xì)胞有效。培養(yǎng)基由三份Dulbecco′s修改的Eagle′s培養(yǎng)基(DME)和一份(體積)F12培養(yǎng)基組成，還加入了10-8M硒、50μM乙醇胺、20mM羥乙基哌嗪乙磺酸和1μg/ml人鐵傳遞蛋白。下表所述的AAO-胰島素的量以各種比例加入培養(yǎng)基，在12孔的Corning培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)皿用昆布氨酸(一種促進(jìn)細(xì)胞在培養(yǎng)孔上附著和分散的蛋白)預(yù)處理。每一種條件都重復(fù)進(jìn)行。
每個(gè)裝滿培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔在實(shí)驗(yàn)的0天接種25，000個(gè)細(xì)胞，在第6天用Colter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。在這些實(shí)驗(yàn)中用了4批不同的AAO-胰島素，AAO-胰島素以0.1N鹽酸溶液形式加入培養(yǎng)基，其濃度在所有情況中都以毫微克/毫升表示。
對(duì)照實(shí)驗(yàn)不向培養(yǎng)基中加入胰島素或AAO-胰島素，細(xì)胞的數(shù)目為10，000～200，000細(xì)胞/孔。培養(yǎng)在含有HI或小牛胰島素(而不是AAO-胰島素)的同樣培養(yǎng)基中的同樣的細(xì)胞，生長(zhǎng)情況和本文所描述的實(shí)驗(yàn)一樣。
AAO-胰島細(xì)胞數(shù)(x1，000)素濃度批批批批ng/mlABCD0.2538028027033013703603302702.54804204203801054055054047025600600530510100670640580580上述實(shí)驗(yàn)表明了AAO-胰島素刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的有效性，所述細(xì)胞是在組織培養(yǎng)中對(duì)胰島素有反應(yīng)的細(xì)胞。的確，在這些實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)AAO-胰島素的濃度不同，每孔的細(xì)胞平均數(shù)增加到240，000～610，000。
權(quán)利要求
1.一種適于培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞的無(wú)血清組織培養(yǎng)基，它含有約0.1～10，000毫微克的精氨酰-A-O胰島素/毫升。
2.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中精氨酰-A-O胰島素的濃度約為1～1，000毫微克/毫升。
3.權(quán)利要求2的培養(yǎng)基，其中精氨酰-A-O胰島素的濃度約為1～100毫微克/毫升。
4.一種在權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞的方法，所述哺乳類細(xì)胞適于在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)，并對(duì)組織培養(yǎng)基中存在的胰島素呈陽(yáng)性反應(yīng)。
5.一種在權(quán)利要求2所述的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞的方法，所述哺乳類細(xì)胞適于在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)，并對(duì)組織培養(yǎng)基中存在的胰島素呈陽(yáng)性反應(yīng)。
6.一種在權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞的方法，所述哺乳類細(xì)胞適于在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)，并對(duì)組織培養(yǎng)基中存在的胰島素呈陽(yáng)性反應(yīng)。
全文摘要
將精氨酰-A-O胰島素，一種由人胰島素原用生物技術(shù)合成人胰島素過(guò)程中的副產(chǎn)品，加入無(wú)血清組織培養(yǎng)基中，以刺激哺乳類細(xì)胞的生長(zhǎng)，所述哺乳類細(xì)胞在組織培養(yǎng)中對(duì)胰島素呈陽(yáng)性反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1045125SQ9010096
公開(kāi)日1990年9月5日 申請(qǐng)日期1990年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1989年2月27日
發(fā)明者沃爾特·弗朗西斯·普勞蒂 申請(qǐng)人:伊萊利利公司