一種組織培養(yǎng)植株再生的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種組織培養(yǎng)植株再生方法，具體涉及一種東農(nóng)冬麥I號(hào)的組織培養(yǎng)及植株再生方法。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥分為春小麥和冬小麥，在我國，由于氣候的影響，南方主要以種植冬小麥為主，而北方則以種植春小麥為主。世界范圍內(nèi)冬小麥的種植范圍及品質(zhì)要明顯好于春小麥。冬小麥要具有非常強(qiáng)的抗寒性，經(jīng)歷一個(gè)寒冷而漫長的冬季，幼苗才能在春天返青，分蘗恢復(fù)生長。黑龍江省地處中國東北部，屬北溫帶季風(fēng)氣候，冬季寒冷而且漫長，冬季溫度極低，，風(fēng)大且田間存雪量少，易使冬小麥幼苗暴露在寒冷的溫度下，幼苗不能順利過冬，是冬小麥的種植禁區(qū)，所以黑龍江省一直以種植春小麥為主。春季干旱、洪澇等環(huán)境因素對春小麥的種植嚴(yán)重制約，導(dǎo)致其產(chǎn)量不穩(wěn)，如果能在黑龍江省種植冬小麥即可解決制約春小麥產(chǎn)量的問題。東農(nóng)冬麥I號(hào)的育成使得北方地區(qū)能夠進(jìn)行冬小麥的種植，該品種是目前黑龍江省高寒地區(qū)首例可以安全越冬的冬小麥品種(返青率在85%左右)，可耐受-30°c低溫。利用植物基因工程技術(shù)對小麥進(jìn)行品質(zhì)和抗性的改良，而研究小麥離體組織培養(yǎng)體系，也成為小麥遺傳轉(zhuǎn)化能否成功的基礎(chǔ)。
[0003]目前，小麥組織培養(yǎng)多采用幼胚和幼穗作為外植體，幼胚和幼穗雖然再生頻率較高但其取材受季節(jié)限制，材料重復(fù)性差；而小麥成熟胚培養(yǎng)則可規(guī)避季節(jié)限制，常年進(jìn)行試驗(yàn)。因此以東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚為外植體，建立高效穩(wěn)定的組織培養(yǎng)植株再生體系尚無相關(guān)報(bào)道，因此急需對東農(nóng)冬麥I號(hào)組織培養(yǎng)植株再生技術(shù)進(jìn)行研究，建立高效穩(wěn)定的成熟胚組織培養(yǎng)植株再生體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種組織培養(yǎng)植株再生的方法及其應(yīng)用，使用的培養(yǎng)基配方簡單、培養(yǎng)流程簡便，提高了植株的分化及再生效率，能穩(wěn)定高效的獲得再生苗。
[0005]本發(fā)明提出的一種組織培養(yǎng)植株再生的方法，包括如下步驟:
51、滅菌與浸種處理:挑選當(dāng)年籽粒飽滿的成熟種子，置于75%乙醇溶液進(jìn)行消毒4-6min，取出，無菌水清洗后，再置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8-12%的NaClO水溶液中進(jìn)行滅菌28-32min，取出，無菌水清洗后，置于黑暗培養(yǎng)箱中浸泡于無菌水中過夜；
52、愈傷組織的誘導(dǎo):在無菌狀態(tài)下，將浸泡過夜后的種子無菌干燥后，采用胚切傷略帶胚乳法進(jìn)行取胚，將胚的盾片朝上接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到胚性愈傷組織；
53、分化培養(yǎng):將胚性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到再生苗；
54、生根移栽:將2-3cm長的再生苗置于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)18-22d后，打開瓶口煉苗3-5d，然后將植株移栽到花盆中培養(yǎng)。
[0006]優(yōu)選地，SI中，黑暗培養(yǎng)箱中溫度為25± 1°C。
[0007]優(yōu)選地，S2中，無菌干燥的具體操作為將浸泡過夜后的種子置于無菌濾紙上以吸干浸泡過夜后的種子表面水分。
[0008]優(yōu)選地，S2中，取胚的過程中在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。
[0009]優(yōu)選地，S2中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基、450-550mg/L酪蛋白、80-120mg/L谷氨酰胺、0.05-0.15mg/L NAA,0.2-0.4g/L 肌醇、0.8-1.2g/L 脯氨酸、0.4-0.6mg/L ABA、0.9-1.lmg/L 2, 4- 二氯苯氧乙酸、28_32g/L 鹿糖和 7_9g/L 瓊脂。
[0010]優(yōu)選地，S3中，分化培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基、0.05-0.15mg/L NAA,0.12-0.13g/L肌醇、0.9-1.lg/L 脯氨酸、3-5mg/L 6-BA、28_32g/L 蔗糖和 7_9g/L 瓊脂。
[0011]優(yōu)選地，S4中，生根培養(yǎng)基包括1/2 MS培養(yǎng)基、0.3-0.5mg/L NAA、28_32g/L蔗糖和7-9g/L瓊脂。
[0012]本發(fā)明還提出的上述組織培養(yǎng)植株再生的方法用于東農(nóng)冬麥I號(hào)組織培養(yǎng)植株再生的應(yīng)用。
[0013]上述“胚切傷略帶胚乳法”具體操作為:在胚部橫縱各切幾刀，切傷胚再取出，取胚時(shí)略帶一部分胚乳。
[0014]本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明建立了東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚組織培養(yǎng)植株再生體系，使用的培養(yǎng)基配方簡單、培養(yǎng)流程簡便，提高了植株的分化及再生效率，能穩(wěn)定高效的獲得再生苗。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面，通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0016]實(shí)施例1
本發(fā)明提出的一種組織培養(yǎng)植株再生的方法，包括如下步驟:
51、滅菌與浸種處理:挑選當(dāng)年籽粒飽滿的東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟種子，置于75%乙醇溶液進(jìn)行消毒4min，取出，無菌水清洗后，再置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的NaClO水溶液中進(jìn)行滅菌28min，取出，無菌水清洗后，置于黑暗培養(yǎng)箱中浸泡于無菌水中過夜，黑暗培養(yǎng)箱中溫度為26 0C ；
52、愈傷組織的誘導(dǎo):在無菌狀態(tài)下，將浸泡過夜后的種子置于無菌濾紙上以吸干浸泡過夜后的種子表面水分后，在超凈工作臺(tái)中采用胚切傷略帶胚乳法進(jìn)行取胚，將胚的盾片朝上接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到胚性愈傷組織，誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括MS培養(yǎng)基、450mg/L酪蛋白、120mg/L 谷氨酰胺、0.05mg/L ΝΑΑ、0.4g/L 肌醇、0.8g/L 脯氨酸、0.6mg/L ΑΒΑ、0.9mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸、32g/L蔗糖和7g/L瓊脂；
53、分化培養(yǎng):將胚性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到再生苗，分化培養(yǎng)基包括MS 培養(yǎng)基、0.15mg/L NAA,0.12g/L 肌醇、1.lg/L 脯氨酸、3mg/L 6_BA、32g/L 蔗糖和 7g/L 瓊月旨;
54、生根移栽:將3cm長的再生苗置于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)18d后，生根培養(yǎng)基包括1/2 MS培養(yǎng)基、0.3mg/L NAA、32g/L蔗糖和7g/L瓊脂，打開瓶口煉苗5d，然后將植株移栽到花盆中培養(yǎng)。
[0017]實(shí)施例2
本發(fā)明提出的一種組織培養(yǎng)植株再生的方法，包括如下步驟: 51、滅菌與浸種處理:挑選當(dāng)年籽粒飽滿的東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟種子，置于75%乙醇溶液進(jìn)行消毒6min，取出，無菌水清洗后，再置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的NaClO水溶液中進(jìn)行滅菌32min