一種紫斑牡丹快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種紫斑牡丹快速繁殖方法，具體是采用胚培養(yǎng)技術(shù)在室內(nèi)人工控制條件下獲得紫斑牡丹再生完整植株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紫斑牡丹[Paeoniarockii(S.G.Haw et L.A.Lauener) T.Hong et J.J.Li]屬于芍藥科芍藥屬牡丹組，我國特有的觀賞及藥用植物，花大色美、花梗長且挺直，因花瓣基部有明顯的大塊紫斑而得名，也是所有野生牡丹中受威脅程度最高的種類，在1987年被列為國家三級保護植物。紫斑牡丹根皮藥用，其籽油含有極其豐富的不飽和脂肪酸，產(chǎn)油量高，2011年被認定為我國新一代木本油料作物，集中分布在甘肅蘭州、臨夏、臨洮等地，其種植規(guī)模、品種數(shù)量以及在國內(nèi)外的影響使之成為中國牡丹中僅次于中原牡丹的第二大品種群，同時也是我國園藝牡丹育種和遺傳改良工作中極其珍貴的野生種質(zhì)資源。但由于資源過度采伐以及生態(tài)環(huán)境的惡化，使紫斑牡丹的種質(zhì)資源受到嚴重破壞，無法滿足市場實際需求，種苗的快速繁育成為是優(yōu)良品種產(chǎn)業(yè)化的瓶頸，解決這一難題并降低繁育成本，滿足市場需要，對促進紫斑牡丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。
[0003]紫斑牡丹在繁殖過程中只能進行種子專性繁殖，但其種子屬于頑拗性種子并具有典型的上胚軸休眠特性，存在萌發(fā)率極低、萌發(fā)極不整齊、及隔年萌發(fā)的現(xiàn)象，萌芽需要至少6個月時間。因此，長期以來生產(chǎn)上均采用嫁接繁殖的快速方法，但該方法存在受季節(jié)影響并且耗費大量人力及財力等缺點。為此，如何破除技術(shù)瓶頸，建立一種萌發(fā)率和生根率高、成苗周期短的紫斑牡丹快速繁殖技術(shù)已成為一項具有挑戰(zhàn)且頗有市場應(yīng)用前景的研究課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供了一種紫斑牡丹快速繁殖方法，該方法采用胚培養(yǎng)技術(shù)在室內(nèi)人工控制條件下獲得紫斑牡丹再生完整植株，其具有種子萌發(fā)率和生根率高，成苗出圃周期短，且成苗生長健壯、無病蟲害等優(yōu)點。
[0005]本發(fā)明為解決上述問題所采用的技術(shù)方案是:一種紫斑牡丹快速繁殖方法，包括如下步驟:
[0006]I)將紫斑牡丹的胚接種于I號培養(yǎng)基，誘導(dǎo)紫斑牡丹離體胚萌芽；培養(yǎng)時間為15?20天，培養(yǎng)條件:光照時間12?16h/d，光照培養(yǎng)溫度:20?25°C，黑暗培養(yǎng)溫度:18 ?20。。；
[0007]2)將步驟I)培養(yǎng)所得牡丹苗移入2號培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)紫斑牡丹苗生根；培養(yǎng)時間為30?40天，培養(yǎng)條件:光照時間8?10h/d，光照培養(yǎng)溫度:25?30°C，黑暗培養(yǎng)溫度:20 ?25°C ；
[0008]3)將步驟2)培養(yǎng)所得牡丹苗接種到3號培養(yǎng)基中，進行生根培養(yǎng)；培養(yǎng)時間為10?25天，培養(yǎng)條件:室內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)，光照時間12?16h/d左右，培養(yǎng)溫度:18°C?25°C;
[0009]4)將步驟3)培養(yǎng)所得生根完整的離體胚苗室內(nèi)煉苗5?6d，移植于土壤中培養(yǎng)15?20天后，移出苗圃用于大田生產(chǎn)；
[0010]其中，
[0011]I 號培養(yǎng)基為:B5+6-BA 2mg/L ?2.5mg/L+CH 0.5g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 4g/L ?6g/L ；
[0012]2 號培養(yǎng)基為:B5+IBA 0.lmg/L ?0.5mg/L+CH 0.5g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 4g/L ?6g/L ；
[0013]3 號培養(yǎng)基為:1/2WPM+IBA 0.05mg/L ?0.lmg/L+AC 0.3g/L ?0.6g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 4g/L ?6g/L ；
[0014]其中，步驟I)至步驟3)中空氣相對濕度為70%?80%，光照培養(yǎng)時光強為2000 ?25001xo
[0015]本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，在繁殖培養(yǎng)過程中需要先對種子進行一定的清洗處理，這是生物學(xué)領(lǐng)域通用的。作為示例，本發(fā)明采用的預(yù)處理方式為取紫斑牡丹健康種子，清水浸泡后剝除種皮，胚乳用75%酒精消毒，然后用升汞消毒后，無菌水沖洗干凈，切開胚乳，挑出胚進行接種。
[0016]申請人通過試驗研究了幾種培養(yǎng)基組分、含量和各步驟培養(yǎng)條件對紫斑牡丹離體胚萌芽率和紫斑牡丹苗生根率的影響，得到如下結(jié)論:
[0017]首先，步驟I)中優(yōu)選如下組分配比的I號培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，紫斑牡丹離體胚萌芽至少超過90%。該優(yōu)選I號培養(yǎng)基為:B5+6-BA 2.5mg/L+CH 0.5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L ;優(yōu)選培養(yǎng)條件為:光照時間15h/d，光照培養(yǎng)溫度:25°C，黑暗培養(yǎng)溫度:20°C，空氣相對濕度為70%?80%。
[0018]同樣地，步驟2)中優(yōu)選如下組分配比的2號培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，紫斑牡丹苗生根率可達78.48%。該優(yōu)選2號培養(yǎng)基為:B5+IBA 0.5mg/L+CH 0.5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L，優(yōu)選培養(yǎng)條件為:光照時間10h/d，光照培養(yǎng)溫度:30°C，黑暗培養(yǎng)溫度:25°C，空氣相對濕度為70%?80%。
[0019]同樣地，步驟3)中優(yōu)選如下組分配比的3號培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件:1/2WPM+IBA0.lmg/L+AC 0.5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L，培養(yǎng)條件為:室內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)，光照時間15h/d左右，培養(yǎng)溫度:18°C?25°C，空氣相對濕度為70%?80%。
[0020]在步驟4)中，煉苗采用植物繁殖領(lǐng)域常用條件，通過采取放風(fēng)、降溫、控水等措施對幼苗強行鍛煉，所用具體操作是在室內(nèi)環(huán)境將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開放置2?3天，再取出幼苗并清洗掉根部培養(yǎng)基，種植于栽培基質(zhì)中放置2?3天。栽培環(huán)境要求通風(fēng)良好，盡量少澆水。
[0021]在步驟4)中，優(yōu)選所用土壤是森林土與園土的混合基質(zhì)，二者的混合比例取決于后期的真實生長環(huán)境中土壤類型，以便其能更好的生長。培養(yǎng)15?20天，將其移出苗圃用于大田生產(chǎn)。
[0022]本發(fā)明公開的一種紫斑牡丹快速繁殖方法，采用胚培養(yǎng)技術(shù)在室內(nèi)人工控制條件下獲得紫斑牡丹再生完整植株，有效提高其種子萌發(fā)率至91.11%，生根率為78.48%。該方法成苗出圃周期短，僅需12?15周即可完成培養(yǎng)成苗出圃，且成苗生長健壯、無病蟲害等優(yōu)點，具有良好的市場應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0023]在下述實施例中，申請人提供了本發(fā)明的一種具體實現(xiàn)。如下所公開的培養(yǎng)條件是優(yōu)選的，但并不對本發(fā)明構(gòu)成特別限制。本發(fā)明的保護范圍涵蓋于其權(quán)利要求及其等同變換。
[0024]實施例1紫斑牡丹快速繁殖方法
[0025]紫斑牡丹快速繁殖方法，包括如下步驟:
[0026]I)取紫斑牡丹健康種子(新采摘及陳年種子均可)，清水浸泡2-3天使種皮吸水變軟，剝除種皮，取完整胚乳放入超凈工作臺上用75%的酒精消毒30s，無菌水沖洗3次；再用升汞消毒1min,無菌水沖洗3次。
[0027]2)用解剖刀切開胚乳從中取出種胚，接種到I號培養(yǎng)基:B5+6-BA2.5mg/L+CH0.5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L，以誘導(dǎo)紫斑牡丹離體胚萌芽。放置于人工氣候室內(nèi)，培養(yǎng)條件:光照強度為2000?25001x，光照時間15h/d，培養(yǎng)間(恒溫箱)溫度在20°C和25°C之間進行光暗變溫調(diào)節(jié)(光照培養(yǎng)溫度:25°C，黑暗培養(yǎng)溫度:20°C )，空氣相對濕度為70%?80%。接種后第二天即可觀察到子葉展開生長，萌發(fā)率為91.11%，七天后子葉逐漸轉(zhuǎn)為綠色，兩周后真葉萌動。
[0028]3) 2周后將長至3-4cm高的紫斑牡丹苗移入2號培養(yǎng)基:B5+IBA0.5mg/L+CH0.5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L，以誘導(dǎo)生根，放置于人工氣候室內(nèi)，更改培養(yǎng)條件:溫度在25°C和30°C之間進行光暗變溫調(diào)節(jié)(光照培養(yǎng)溫度:30°C，黑暗培養(yǎng)溫度:25°C )。接種5?10天下胚軸伸長生根，種胚苗生根率為78.48%。
[0029]4)7周后將已經(jīng)生根的完整的苗子接種于3號培養(yǎng)基:1/2WPM+IBA0.lmg/L+AC0.5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L，進入生根培養(yǎng)階段，放置于室內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)即可，培養(yǎng)條件:室內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)，光照強度為2000?25001x，溫度為18?25°C，空氣相對濕度為70%?80%。培養(yǎng)15?20天萌發(fā)的根即可伸長至5?6cm，其中20%分生側(cè)根。
[0030]5)9?10周后將已經(jīng)萌發(fā)生根完整的離體胚苗進行煉苗，并種植于森林土與園土的混合基質(zhì)中，15?20天即可出圃用于大田生產(chǎn)。
【主權(quán)項】
1.一種紫斑牡丹快速繁殖方法，其特征在于包括如下步驟: 1)將紫斑牡丹的胚接種于I號培養(yǎng)基，誘導(dǎo)紫斑牡丹離體胚萌芽；培養(yǎng)時間為15?20天，培養(yǎng)條件:光照時間12?16h/d，光照培養(yǎng)溫度:20°(:?25°(:，黑暗培養(yǎng)溫度:18°C?20 0C ； 2)將步驟I)培養(yǎng)所得牡丹苗移入2號培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)紫斑牡丹苗生根；培養(yǎng)時間為30?40天，培養(yǎng)條件:光照時間8?10h/d，光照培養(yǎng)溫度:25°C?30°C，黑暗培養(yǎng)溫度:20°C?25°C ； 3)將步驟2)培養(yǎng)所得牡丹苗接種到3號培養(yǎng)基中，進行生根培養(yǎng)；培養(yǎng)時間為10?25天，培養(yǎng)條件:室內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)，光照時間12?16h/d，培養(yǎng)溫度:18°C?25°C ； 4)將步驟3)培養(yǎng)所得生根完整的離體胚苗室內(nèi)煉苗5?6d，移植于土壤中培養(yǎng)15?20天后，移出苗圃用于大田生產(chǎn)； 其中，I 號培養(yǎng)基為:B5+6-BA 2mg/L ?2.5mg/L+CH 0.5g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 4g/L ?6g/L ； 2號培養(yǎng)基為:B5+IBA 0.lmg/L ?0.5mg/L+CH 0.5g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 4g/L ?6g/L ； 3號培養(yǎng)基為:1/2WPM+IBA 0.05mg/L ?0.lmg/L+AC 0.3g/L ?0.6g/L+ 蔗糖 20g/L+瓊脂4g/L?6g/L ; 其中，步驟I)至步驟3)中空氣相對濕度為70%?80%，光照培養(yǎng)時光強為2000?25001χο2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述I號培養(yǎng)基為:B5+6-BA2.5mg/L+CH0.5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L ;培養(yǎng)條件:光照時間15h/d，光照培養(yǎng)溫度:25°C，黑暗培養(yǎng)溫度:20°Co3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述2號培養(yǎng)基為:B5+IBA0.5mg/L+CH0.5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L，培養(yǎng)條件:光照時間10h/d，光照培養(yǎng)溫度:30°C，黑暗培養(yǎng)溫度:25°Co4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述3號培養(yǎng)基為:1/2WPM+IBA0.1mg/L+AC 0.5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L，培養(yǎng)條件:室內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)，光照時間15h/d，培養(yǎng)溫度:18°C?250C ο5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所用的土壤為森林土與園土組成的混合土壤基質(zhì)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紫斑牡丹快速繁殖方法，包括如下步驟：1)將紫斑牡丹的胚接種于1號培養(yǎng)基，誘導(dǎo)紫斑牡丹離體胚萌芽；2)將步驟1)培養(yǎng)所得牡丹苗移入2號培養(yǎng)基中誘導(dǎo)紫斑牡丹苗生根；3)將步驟2)培養(yǎng)所得牡丹苗接種到3號培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)；4)將步驟3)培養(yǎng)所得生根完整的離體胚苗煉苗后在土壤中培養(yǎng)15～20天，將其移出苗圃用于大田生產(chǎn)。本發(fā)明公開的高效穩(wěn)定的紫斑牡丹成苗體系，即采用胚培養(yǎng)技術(shù)在室內(nèi)人工控制條件下獲得紫斑牡丹再生完整植株，該方法具有種子萌發(fā)率和生根率高，成苗出圃周期短，且成苗生長健壯、無病蟲害等優(yōu)點，具有良好的市場應(yīng)用前景。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105075863
【申請?zhí)枴緾N201510486055
【發(fā)明人】唐紅, 張健欣, 張珊
【申請人】甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 唐紅, 張健欣, 張珊
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月10日