專利名稱：一種增強(qiáng)抗菌肽在植物體內(nèi)表達(dá)的豐度和穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在植物體串連融合表達(dá)抗菌肽以提高抗菌肽表達(dá)豐度和穩(wěn) 定性的技術(shù)，用于增強(qiáng)農(nóng)作物抗病性。
背景技術(shù)：
抗菌肽是生物體防御系統(tǒng)中產(chǎn)生的一類對外源病菌具有高效殺滅活性的肽類物質(zhì)，特別是一些動物來源的抗菌肽，如天蠶素(Cecropins)、蜂毒素 (Melittins)、蛙皮素(Magainins)等，對細(xì)菌、真菌、病毒、螺旋體等多種病 原菌甚至癌細(xì)胞都有一定的殺滅活性，而且長期使用不會使病原菌產(chǎn)生耐藥性， 也不存在殘留污染問題，是抗生素和化學(xué)殺菌劑的理想替代品。由于抗菌肽具有高效、環(huán)保、不使病源菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，近年來，已成 為植物抗病基因工程、養(yǎng)殖飼料添加劑、新興醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。特別是 在植物抗病基因工程領(lǐng)域，抗菌肽基因資源成為最有潛力和應(yīng)用價值的資源之 一。然而，動物源抗菌肽基因轉(zhuǎn)入植物后所遇到的主要問題就是抗菌肽表達(dá)豐 度偏低，限制了抗菌肽功效的發(fā)揮。雖然基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)很復(fù)雜，與多種因 素有關(guān)，但這種動物源抗菌肽在植物細(xì)胞表達(dá)偏低的現(xiàn)象普遍認(rèn)為主要是外源 抗菌肽在植物細(xì)胞不夠穩(wěn)定，容易被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶降解的原因。1997年，Tailor等發(fā)現(xiàn)鳳仙花(Impatiens balsamina L.)種子天然抗菌肽的 前體蛋白是由引導(dǎo)肽和連續(xù)6個長度為20個氨基酸的成熟肽單元串聯(lián)融合組 成，各成熟肽單元之間由保守的蛋白酶剪切位點(diǎn)隔開，前體蛋白翻譯后可在胞 間溶膠中自動剪切為各成熟抗菌肽單元。為了驗證該剪切位點(diǎn)是否可以應(yīng)用于 其它植物和其它抗菌肽，F(xiàn)rancois等將由該剪切位點(diǎn)隔開的大麗花抗菌肽和蘿卜 抗菌肽在擬南芥中融合表達(dá)，結(jié)果證明該鳳仙花抗菌肽剪切位點(diǎn)完全可以在擬 南芥中發(fā)揮作用，大麗花抗菌肽和蘿卜抗菌肽的融合蛋白被徹底切割為有功能活性的2個抗菌肽。與其它類型的蛋白質(zhì)剪切位點(diǎn)相比，識別該位點(diǎn)的內(nèi)肽酶 天然存在于植細(xì)胞胞間溶膠，前體蛋白切割完全，切割后成熟肽兩端殘留的剪 切位點(diǎn)的氨基酸少，對成熟肽的功能影響小。本發(fā)明利用了該內(nèi)肽酶識別位點(diǎn)， 以Thanatin抗菌肽為例，設(shè)計了可自動剪切的抗菌肽基因多拷貝串聯(lián)融合表達(dá) 技術(shù)，并結(jié)合其它外源蛋白增強(qiáng)表達(dá)技術(shù)，以增強(qiáng)抗菌肽在植物體內(nèi)的表達(dá)豐 度和穩(wěn)定性，提高作物抗病效果。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)抗菌肽在植物體內(nèi)表達(dá)的豐度和穩(wěn)定性的方法，解 決了異源抗菌肽在植物體內(nèi)表達(dá)豐度偏低，易被植物內(nèi)源蛋白酶降解的問題。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下 一種通過多拷貝串聯(lián)融合表達(dá)的原理來增強(qiáng) 抗菌肽在植物體內(nèi)的表達(dá)豐度和穩(wěn)定性的方法，包含以下步驟A)以特征序列為MASERQALMLILLTTFFFTIKPSQA的大豆幾定質(zhì)酶信號肽為引導(dǎo)肽，引 導(dǎo)目標(biāo)蛋白定向積累于細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙；B )以特征序列為 SNAADEVATPEDVEPG的多肽為連接肽，連接多個抗菌肽串聯(lián)融合表達(dá)，表達(dá) 后于S丄NAADEVATPE丄DVEPG位點(diǎn)剪切為多個抗菌肽單元；C)根據(jù)目標(biāo)植 物密碼子使用頻率對編碼序列進(jìn)行優(yōu)化；D)將引導(dǎo)肽、抗菌肽、連接肽組合 成引導(dǎo)肽+抗菌肽+(連接肽+抗菌肽"N的結(jié)構(gòu)形式將抗菌肽串聯(lián)融合表達(dá)，提 高抗菌肽表達(dá)效率和穩(wěn)定性，N為任意拷貝數(shù)。上述的多拷貝抗菌肽融合表達(dá)載體構(gòu)建方法，包含以下步驟A)在引導(dǎo) 肽+抗菌肽的融合基因末端設(shè)計BglII+終止密碼+Xbal或其它切點(diǎn)，克隆構(gòu)建 Destination Vector, B)在連接肽+抗菌肽的融合基因頭部加BamH I切點(diǎn)，尾部 加BglII+終止密碼+Xba I或其它切點(diǎn)(同A步驟的末端設(shè)計)，克隆構(gòu)建Entry Vector; C)將Entry Vector的目標(biāo)序列用BamH I和Xba I切下，連接于Destination Vector用BglII和Xba I酶切產(chǎn)生的載體臂，以所得新的載體為 Destination Vector將Entry Vector目標(biāo)片段反復(fù)連接進(jìn)入Destination Vector,直至獲得所需抗菌肽基因拷貝數(shù)。以下，對本發(fā)明的技術(shù)方案做出解釋首先，根據(jù)目標(biāo)植物密碼子偏愛性設(shè) 計引導(dǎo)肽、抗菌肽和連接肽的密碼子，再按引導(dǎo)肽+抗菌肽+(連接肽+抗菌肽^N 的方法設(shè)計多拷貝抗菌肽融合表達(dá)載體，然后利用分子克隆的方法構(gòu)建含引導(dǎo)肽+抗菌肽單元的Destination Vector和含連接肽+抗菌肽單元的Entry Vector,將 Entry Vector中的目標(biāo)片段切下反復(fù)連接進(jìn)入Destination Vector即可獲得多拷貝 抗菌肽融合表達(dá)載體，N次連接可獲得N+1拷貝數(shù)抗菌肽基因融合表達(dá)載體。 利用該載體轉(zhuǎn)化植物即可增強(qiáng)抗菌肽在目標(biāo)植物內(nèi)表達(dá)的豐度和穩(wěn)定性，提高 植物抗病效果。這里引導(dǎo)肽來源于大豆幾丁質(zhì)酶信號肽，可以引導(dǎo)目標(biāo)蛋白分 泌到細(xì)胞間隙和細(xì)胞壁周圍，使抗菌肽在細(xì)胞外圍高豐度積累以增強(qiáng)抗病效果。 連接肽來源于鳳仙花抗菌肽前體肽剪切位點(diǎn)，可在植物體內(nèi)將多拷貝融合表達(dá) 的抗菌肽剪切為多個抗菌肽單元。多拷貝抗菌肽融合表達(dá)載體構(gòu)建方法，酶切 位點(diǎn)，及抗菌肽、引導(dǎo)肽、連接肽的氨基酸序列和編碼序列詳見附圖1，其中， 抗菌肽序列為Thanatin所示部分，引導(dǎo)肽序列為SP所示部分，連接肽序列為 LP所示部分，對應(yīng)的DNA編碼序列是根據(jù)油菜密碼子使用頻率優(yōu)化得來。本 發(fā)明的方法可應(yīng)用于油菜、水稻、玉米、大豆、小麥等各種可轉(zhuǎn)換植物的轉(zhuǎn)基 因改良，提高其抗病能力。


圖1~圖3為可自剪切多拷貝Thanatin抗菌肽融合表達(dá)載體設(shè)計與構(gòu) 建示意圖；其中圖1: Thanatin 1 5拷貝融合表達(dá)載體構(gòu)建過程及最終載體結(jié)構(gòu)； 圖2: SP-Thanatin序列結(jié)構(gòu)及分段合成示意圖；圖3: LP-Thanatin序列結(jié)構(gòu)及 分段合成示意圖。AFPV1 AFPV5為不同拷貝數(shù)抗菌肽融合表達(dá)的植物表達(dá)載 體。SP:大豆幾丁質(zhì)酶信號肽；LP:連接肽，來源于鳳仙花，可被植物體內(nèi)的
內(nèi)肽酶識別，識別序列為S氺NAADEVATPE丄DVEPG; TMAS:甘露堿合成酶基 因的終止子；BAR:抗除草劑basta基因；PMAS:甘露堿合成酶啟動子；P2X35S: 組成型表達(dá)強(qiáng)啟動子；Q: TMV omega翻譯增強(qiáng)序列；Toes:章魚堿合成酶基 因的終止子；① (D:分段合成的基因片斷01igo1 6。
具體實(shí)施方式
以抗菌肽Thanatin為例構(gòu)建可剪切多拷貝抗菌肽融合表達(dá)載體。設(shè)計要點(diǎn)以鳳仙花抗菌肽剪切位點(diǎn)為間隔序列，其氨基酸序列及剪切方式 為S丄NAADEVATPE;DVEPG，以大豆幾丁質(zhì)酶信號肽為引導(dǎo)序列，其序列特 征為MASERQALMLILL TTFF FTIKPSQA，將多拷貝抗菌肽融合表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)入 細(xì)胞間隙和細(xì)胞壁周圍高豐度積累，再剪切為單個有活性的抗菌肽單元。該大 豆幾丁質(zhì)酶信號肽與GFP蛋白融合表達(dá)研究表明該信號肽可將目標(biāo)蛋白特異性 導(dǎo)入細(xì)胞間隙和細(xì)胞壁。按附圖1設(shè)計抗菌肽融合表達(dá)載體結(jié)構(gòu)。融合表達(dá)的抗菌肽由一個引導(dǎo)肽， 5個Thanatin抗菌肽，和4個剪切肽組成，剪切肽分別位于5個抗菌肽之間， 使融合抗菌肽表達(dá)后得以剪切。融合表達(dá)載體由Destination Vector和Entry Vector兩個載體經(jīng)多次反復(fù)連接而來。前者克隆了引導(dǎo)肽和第一個抗菌肽基因。 后者克隆了剪切肽和后續(xù)抗菌肽基因。DestinationVector末端設(shè)計了 BamH I切 點(diǎn)，Entry Vector前端設(shè)計了BglII切點(diǎn)，兩者為同尾酶，酶切后反復(fù)連接，即 可獲得任意拷貝數(shù)的抗菌肽融合表達(dá)載體。融合表達(dá)載體結(jié)構(gòu)設(shè)計好后，將氨基酸序列按油菜等雙子葉植物密碼子傾向 轉(zhuǎn)換為適合油菜等雙子葉植物表達(dá)的基因序列。并根據(jù)該序列分段合成基因片 段① ⑥。① ctgcagccatggcttctgagagacaggctcttatgcttatccttcttactactttcttct② acaggcttcttagatccagcctgagaaggcttgatagtgaagaagaaagtagtaaga
③ ggatctaagaagcctgttcctatcatctactgtaacagaagaactggaaagtgtcagaga④ gaattctctagactaagatctcattctctgacactttccag⑤ ggatccaacgctgctgatgaggttgctactcctgaggatgtt⑥ ggaacaggcttcttagatccaggctcaacatcctcaggagtag構(gòu)建Destination Vector:將Oligo① ④用雙蒸水稀釋到10 |aM，分別 取Oligo① ④5 |iL、 0.2 uL、 0.2 fiL、 5 (iL， 25 mM Mg2+ 8 (iL， 10 mM dNTP 1.6 iaL， 10 x PCR buffer 10 pL， Taq 5 U,加水到100 pL，進(jìn)行PCR。PCR循環(huán)為94°C 5，， (94°C 30", 58°C 30", 72°C 30") x 10, (94°C 30"， 50°C 30", 72°C 30") x 20, 72°C 10，， 4°C~。 PCR產(chǎn)物于MicroconYM30過柱，濃縮于30 (iL，力B10UPstl、 10 U EcoR I 、 5 10 x Reaction Buffer于50 體系酶切3 h，再次用Microcon YM30過柱，濃縮于15 |iL。同時pUC18質(zhì)粒用Pst I 、 EcoR I雙酶切，上樣于 1%的瓊脂糖凝膠，電泳后回收目標(biāo)帶，取l pL載體與4 目標(biāo)DNA連接后 轉(zhuǎn)化大腸桿菌。構(gòu)建Entry Vector:將Oligo③ ⑥用雙蒸水稀釋到10 pM，分別取Oligo ③ ⑥0.2nL、 5|aL、 5 4、 0.2 pL， 25 mM Mg2+8 (iL， 10 mM dNTP 1.6 |iL, 10 xPCRbufferl0pL，Taq5U，力口水至Ul00iLiL,按上述同樣方法進(jìn)行PCR，產(chǎn)物 于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后回收目標(biāo)帶，克隆于pMD18-T載體。挑取Destination Vector和Entry Vector克隆測序確認(rèn)目標(biāo)片段完全正確。 將Destination Vector用Bgl II和Xba I雙酶切，Entry Vector用BamH I和 Xbal雙酶切，0.8%凝膠電泳后回收目標(biāo)片段連接。所得新載體反復(fù)如此酶切 連接，即可獲得任意拷貝數(shù)抗菌肽基因融合表達(dá)的載體。將多拷貝抗菌肽融合表達(dá)的Destination Vector用Nco I和Xba I雙酶切切 下目標(biāo)片段，連接于植物表達(dá)載體，例如pFGC5941,即可獲得可剪切多拷貝抗 菌肽融合表達(dá)載體。利用該載體轉(zhuǎn)化植物，如擬南芥、油菜等，可顯著提高抗 菌肽的表達(dá)豐度和體內(nèi)存在的半衰期，提高植物抗病效果。如轉(zhuǎn)化擬南芥后，擬南芥對菌核病的抗性大大提高，沒有轉(zhuǎn)化的擬南芥野生型ColO接種核盤菌 48h后葉片全部枯死，轉(zhuǎn)基因擬南芥接種48h后只有約一半葉片枯死，這說明 經(jīng)轉(zhuǎn)化后的擬南芥對菌核病抗菌性能得到了大大的提高。采用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn) 化油菜后，油菜葉片接種菌核病菌絲塊后病。
權(quán)利要求
1. 一種增強(qiáng)抗菌肽在植物體內(nèi)表達(dá)的豐度和穩(wěn)定性的方法，包含以下步驟A)以特征序列為MASERQALMLILLTTFFFTIKPSQA的大豆幾丁質(zhì)酶信號肽為引導(dǎo)肽，引導(dǎo)目標(biāo)蛋白定向積累于細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙；B)以特征序列為SNAADEVATPEDVEPG的多肽為連接肽，連接多個抗菌肽串聯(lián)融合表達(dá)，表達(dá)后于S↓NAADEVATPE↓DVEPG位點(diǎn)剪切為多個抗菌肽單元；C)根據(jù)目標(biāo)植物密碼子使用頻率對編碼序列進(jìn)行優(yōu)化；D)將引導(dǎo)肽、抗菌肽、連接肽組合成引導(dǎo)肽+抗菌肽+(連接肽+抗菌肽)*N的結(jié)構(gòu)形式將抗菌肽串聯(lián)融合表達(dá)，提高抗菌肽表達(dá)效率和穩(wěn)定性，N為任意拷貝數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)抗菌肽在植物體內(nèi)表達(dá)的豐度和穩(wěn)定性的方 法，其特征在于所述的多拷貝抗菌肽融合表達(dá)包含以下步驟A)在引導(dǎo)肽+抗 菌肽的融合基因末端設(shè)計BglII +終止密碼+Xbal或其它切點(diǎn)，克隆構(gòu)建 Destination Vector, B)在連接肽+抗菌肽的融合基因頭部加BamH I切點(diǎn)，尾部 加BglII+終止密碼+Xba I或其它切點(diǎn)(同A步驟的末端設(shè)計)，克隆構(gòu)建Entry Vector; C)將Entry Vector的目標(biāo)序列用BamH I和Xba I切下，連接于 Destination Vector用BglII和Xba I酶切產(chǎn)生的載體臂，以所得新的載體為 Destination Vector將Entry Vector目標(biāo)片段反復(fù)連接進(jìn)入Destination Vector,直 至獲得所需抗菌肽基因拷貝數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)抗菌肽在植物體內(nèi)表達(dá)的豐度和穩(wěn)定性的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，它通過設(shè)計了一種在植物體內(nèi)可自動剪切的多拷貝抗菌肽串聯(lián)融合表達(dá)技術(shù)，使多拷貝融合表達(dá)的抗菌肽在植物體內(nèi)可自動剪切為有功能活性的單個抗菌肽單元，以增加抗菌肽表達(dá)豐度和抗菌肽的穩(wěn)定性。
文檔編號C12N15/62GK101397559SQ20071007159
公開日2009年4月1日 申請日期2007年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月30日
發(fā)明者劉仁虎, 劉智宏, 汪小福, 王伏林, 郎春秀, 陳笑蕓, 陳錦清 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院