專利名稱：一種植物雙元表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物雙元表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
植物表達(dá)載體是在植物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因過程中，將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞并整合于植物染色體上的DNA介質(zhì)。在植物基因工程上應(yīng)用最廣泛的是雙元表達(dá)載體，含有根癌農(nóng)桿菌來源的T-DNA序列，可實(shí)現(xiàn)外源基因與植物染色體的整合。目前，已有一系列的植物表達(dá)載體得到應(yīng)用，如pCambia系列載體。這些雙兀表達(dá)載體一般含有標(biāo)記基因、報(bào)告基因和多克隆位點(diǎn)。但所使用的報(bào)告基因大多為GUS。相對(duì)GUS而言，報(bào)告基因GFP的檢測(cè)比較簡(jiǎn)便，只需熒光顯微鏡或激發(fā)光源，無需反應(yīng)底物或其它輔助因子材料；GFP檢測(cè)時(shí)無需前處理，可進(jìn)行活體觀察。植物表達(dá)載體上常用的標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶(neomycin phosphotransfe-rase, NPT II)基因、鏈霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶(streptomycinphosphotransferase, SPT)基因、潮霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin phosphotransferase,HPT)基因和抗除草劑基因等。相對(duì)而言，卡那霉素抗性的NPTII基因使用卡那霉素進(jìn)行篩選，是相對(duì)比較安全的一種標(biāo)記基因。RNA干涉技術(shù)(RNA interference, RNAi)是近年來發(fā)展起來的一種特異基因阻斷技術(shù)，是將雙鏈RNA (double strained RNA, dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)引起特異靶基因mRNA降解的一種細(xì)胞反應(yīng)過程，它是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(PTGS)現(xiàn)象。在植物中，觸發(fā)RNAi的主要方法是構(gòu)建可轉(zhuǎn)錄 為發(fā)卡RNA(hairpin RNA, hpRNA)的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物來產(chǎn)生RNAi，因此構(gòu)建高效的RNAi表達(dá)載體是利用轉(zhuǎn)基因RNAi的關(guān)鍵。研究表明:在啟動(dòng)子下游插入反向重復(fù)片段的重組雙元載體，是產(chǎn)生RNAi的基本結(jié)構(gòu)。而用含內(nèi)含子的發(fā)夾RNA(intron-contain-1ng hairpin RNA, ihpRNA)結(jié)構(gòu)表達(dá)dsRNA 的植物,其沉默效率更高。通過構(gòu)建及優(yōu)化各種RNAi載體，可大大方便植物的RNA干涉研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物雙元表達(dá)載體。本發(fā)明提供的植物雙元表達(dá)載體，是按照如下方法得到:在出發(fā)載體PBI121中構(gòu)建熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)盒和外源基因表達(dá)盒；所述外源基因表達(dá)盒由啟動(dòng)子、內(nèi)含子和終止子依次連接而成，所述啟動(dòng)子與所述內(nèi)含子之間具有若干個(gè)酶切位點(diǎn)，所述內(nèi)含子與所述終止子之間具有若干個(gè)酶切位點(diǎn)；構(gòu)建得到的植物雙元表達(dá)載體中其它位置的酶切位點(diǎn)與所述內(nèi)含子兩側(cè)的酶切位點(diǎn)均不相同。上述植物雙元表達(dá)載體中，所述啟動(dòng)子與所述內(nèi)含子間的若干個(gè)酶切位點(diǎn)為:XbaKAge I,Kpn 1.Avr II和BamH I，所述內(nèi)含子與所述終止子之間的若干個(gè)酶切位點(diǎn)為:EcoR 1、Sac 1、Sal I 和 SnaB I。上述任一所述植物雙元表達(dá)載體中，所述外源基因表達(dá)盒的核苷酸序列如序列4所示。
上述任一所述植物雙兀表達(dá)載體中，所述構(gòu)建突光蛋白報(bào)告基因的表達(dá)盒的方法為用熒光蛋白報(bào)告基因替換所述出發(fā)載體PBI121中的GUS基因表達(dá)盒中的GUS基因，得到所述熒光蛋白報(bào)告基因的表達(dá)盒。上述任一所述植物雙元表達(dá)載體中，所述熒光蛋白報(bào)告基因的為EGFP報(bào)告基因。上述任一所述植物雙元表達(dá)載體中，所述外源基因表達(dá)盒的表達(dá)方向與所述熒光蛋白報(bào)告基因的表達(dá)盒的表達(dá)方向相反。上述任一所述植物雙元表達(dá)載體在將目的基因?qū)氤霭l(fā)植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述植物雙元表達(dá)載體在使出發(fā)植物中的目的基因功能喪失中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述應(yīng)用中，所述使出發(fā)植物中的目的基因功能喪失是通過RNA干擾實(shí)現(xiàn)的。上述任一所述應(yīng)用中，所述出發(fā)植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為煙草或棉花；所述單子葉植物具體為洋蔥。本發(fā)明所構(gòu)建的植物雙元表達(dá)載體可用于植物轉(zhuǎn)基因過表達(dá)研究和RNAi研究，可以將所述載體上TUB intron基因替換成目的基因，改造成含目的基因的植物表達(dá)載體，也可以在TUB intron基因片段兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)上分別加上目的基因片段的正反向片段，改造成目的RNAi載體。所 述植物雙元表達(dá)載體具有GFP報(bào)告基因，可以方便的進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)；所述植物雙元表達(dá)載體具有卡那霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因較為安全，可以高效的進(jìn)行篩選和生產(chǎn)的應(yīng)用。


圖1是載體pCRI1210的酶切位點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果示意圖。圖2是載體pCRI1210的圖譜示意圖。圖3是質(zhì)粒載體pCRI1210和pBI121雙酶切結(jié)果示意圖。圖4是GUS基因的特異性檢測(cè)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)擴(kuò)增的結(jié)果示意圖。圖5是⑶S基因的雙酶切檢測(cè)結(jié)果示意圖。圖6是載體在洋蔥表皮中的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)報(bào)告基因GFP表達(dá)的結(jié)果示意圖。圖7是載體的在棉花愈傷組織中的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)GUS表達(dá)的結(jié)果示意圖。圖8是轉(zhuǎn)化V煙早幼牙⑶S染色結(jié)果不思圖。圖9是轉(zhuǎn)化煙草葉片⑶S染色結(jié)果示意圖。圖10是轉(zhuǎn)化煙草根部⑶S染色結(jié)果示意圖。圖11是用轉(zhuǎn)化棉花愈傷組織檢測(cè)報(bào)告基因EGFP的表達(dá)結(jié)果示意圖。圖12是轉(zhuǎn)化煙草⑶S基因組DNA特異性檢測(cè)引物PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖。圖13是轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化煙草幼苗生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1、構(gòu)建雙元表達(dá)載體pCRI1210一、構(gòu)建干涉表達(dá)框以含有CaMV 35S啟動(dòng)子的pBI121載體(GenBank:AF485783.1)為模板，分別用引物35S1/35S2和35S1/35S3通過兩次PCR擴(kuò)增獲得了兩端添加了酶切位點(diǎn)的CaMV35S啟動(dòng)子片段(其核苷酸序列如序列表中序列I所示，5'端添加的酶切位點(diǎn)為Hind II1、SmaI和XmaI, 3;端添加的酶切位點(diǎn)為BglII,KpnI,XbaI和XhoI)，并連接到pMD19_T simple載體(該載體購(gòu)自大連TAKARA公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為:D104A)上，得到中間載體pMD19T_35S。引物序列如下:35S1:5，-AAgCTTCCCgggTATTggCTAgAgCAgCTT_3，，35S2:5， -TACCggTgATCTAgAAgCTCgAgAgAgATAgAT-3，，35S3:5， -CCgAgATCTATAggTACCTgACCggTgATCTAgAAgC-3，。以含有Ca MV 35SpolyA終止子的pCADS1341載體為模板，用引物35SpolyAl/35SpolyA2和35SpolyAl/35SpolyA3通過兩次PCR擴(kuò)增獲得了兩端添加了酶切位點(diǎn)的CaMV 35SpolyA終止子(其核苷酸序列如序列表中序列2所示，5^端添加的酶切位點(diǎn)為Sac1.Sal I和SnaBI, 3;端添加的酶切位點(diǎn)為BglII)并連接到pMD19-Tsimple載體上,得到中間載體pMD19T-polyA。引物序列如下:35SpolyAl:5，-TTgCTAgATCTCCgTACTgAATTAACgCCgAAT-3，，35SpolyA2:5， -gTCgACTCTACgTATCTgTCgATCgACAAgCT-3，，35SpolyA3:5， -ATgAgCTCTCTTgTCgACTCTACgTATCTgT-3，。從陸地棉的基因組DNA中用引物AF1/AF3通過PCR擴(kuò)增得到TUB intron內(nèi)含子片段，用引物AF2/AF4通過PCR擴(kuò)增在TUB intron片段兩端添加酶切位點(diǎn)(其核苷酸序列如序列表中序列3所示，5'端添加的酶切位點(diǎn)為Kpnl、AvrII和BamHI，3'端添加的酶切位點(diǎn)為 Bglll、SacI 和 EcoRI)，T/A 克隆到 pMD19_T simple 中，得到中間載體 pMD19T_AF。引物序列如下:AFl:5’ -CCTAggTATggATCCACTCCAAgTTgTAAgTAT-3’ 和AF3:5， -gAgCTCACTgAATTCTgAACATCAAACATTACA_3，；AF2:5， -TAggTACCAATTACCTAggTTATggATCCACT-3’ 和AF4:5，-AgATCTTgAgAgCTCACTgAATTCTgAACAT_3，。Kpn Ι/BglII分別雙酶切上述中間載體pMD19T-35S和pMD19T-AF，分別回收3.5kb和590bp的片段，連接后得到的中間載體再進(jìn)行Sac Ι/BglII雙酶切，回收4.1kb片段，所回收的片段與Sac Ι/BglII雙酶切載體pMD19T-polyA得到的240bp的片段進(jìn)行連接，得到含有干涉表達(dá)框的中間載體PMD19T-35SAP。將載體pMD19T_35SAP進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果在PMD19-T的HindIII和BglII酶切位點(diǎn)間含有干涉表達(dá)框，干涉表達(dá)框結(jié)構(gòu)如下:自上游至下游依次為:CaMV 35S啟動(dòng)子(序列表中序列I)、TUB intron內(nèi)含子(序列表中序列3)和CaMV 35SpolyA終止子(序列表中序列2)，并在TUB intron內(nèi)含子兩端含有多克隆位點(diǎn)，在 TUB intron 的 5’ 端具有 5 個(gè)酶切位點(diǎn):Xba I, Age I, Kpn I, Avr 11, BanH I，在 3’端具有 4 個(gè)酶切位點(diǎn):EcoR 1、Sac 1、Sal 1、SnaB I。二、修飾 pBI121 載體用Sac !/BamH I雙酶切pBI 121載體，得到的載體片段與報(bào)告基因EGFP (GenBank:AF323988.1，其序列見序列表中的序列5)連接，得到pBI121_EGFP表達(dá)載體。pBI121_EGFP載體用EcoR I單酶切，進(jìn)行平末端化后連接，去除載體上的EcoR I酶切位點(diǎn)。用與去除EcoR I酶切位點(diǎn)同樣的方法，分別去除PBI121-EGFP載體上的Sac 1.BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)，得到中間載體PBI121-GFPQ。EcoR 1、Sac 1、BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)位于pBI121載體中GUS基因的兩側(cè)。驗(yàn)證:通過Sac I/BamH I雙酶切pBI121_EGFP表達(dá)載體，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，能夠得到大約720bp的條帶，說明EGFP已經(jīng)正確連接到pBI121-EGFP表達(dá)載體中。采用Sac Ι/BglII雙酶切質(zhì)粒，以未去除酶切位點(diǎn)前的質(zhì)粒做對(duì)照來驗(yàn)證pBI121上相應(yīng)酶切位點(diǎn)的去除效果。由于PBI121載體上有2個(gè)Bgl II酶切位點(diǎn)，而所去除的4個(gè)酶切位點(diǎn)均位于這2個(gè)Bgl II位點(diǎn)之間。如果酶切位點(diǎn)被去除后，雙酶切只能切開2個(gè)Bgl II位點(diǎn)，得到5.6k和8.0k的兩個(gè)條帶。如果酶切位點(diǎn)沒有去除，則會(huì)切開3條帶。根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果，EcoR 1、Sac 1.BamH I和Xba I四個(gè)酶切位點(diǎn)均已去除。三、構(gòu)建pCRI1210載體用HindIII單酶切載體pBI121_GFPQ，回收載體片段，進(jìn)行平末端化反應(yīng)和去磷酸化反應(yīng)；用HindIII/BglII雙酶切載體pMD19T_35SAP，回收1.7kb片段，進(jìn)行平末端化反應(yīng)后，與上述單酶切載體PBI121-GFPQ后回收的載體片段進(jìn)行連接，得到雙元載體pCRI 1210(圖2)。利用載體pCRI1210兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行酶切驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證。酶切組合為A:Avr II/EcoR I ；B:Age I/EcoR I ；C:Kpn I/Sal I ；D:Xba I/SacI ；E =SnaB I/BamH I，酶切效果見圖1(圖1 A^dtASAvr II/EcoR I的酶切驗(yàn)證結(jié)果，B為Age I/EcoR I酶切驗(yàn)證 結(jié)果，C Kpn I/Sal I酶切驗(yàn)證結(jié)果，D Xba I/Sac酶切驗(yàn)證結(jié)果，E SnaB I/BamH I酶切驗(yàn)證結(jié)果)，每一對(duì)酶切組合均得到了 550bp的酶切片段，表明構(gòu)建的載體中只在內(nèi)含子左右具有以上多克隆酶切位點(diǎn)外，其余位置沒有以上多克隆酶切位點(diǎn)，說明該載體得到了正確的連接，其上的多克隆位點(diǎn)也是可用的。并送測(cè)序公司，結(jié)果干涉表達(dá)框的序列為序列4所示，進(jìn)一步驗(yàn)證該表達(dá)載體正確。實(shí)施例2、植物雙元表達(dá)載體的功能驗(yàn)證一、表達(dá)載體pCRI1210-GUS的構(gòu)建用BamHI/SacI雙酶切質(zhì)粒pBI121中的⑶S基因片段和質(zhì)粒pCRI1210中的TUBintron部分，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果如圖3所示(圖3:1號(hào)泳道為MakerIII，2號(hào)泳道為質(zhì)粒PBI121的BamHI/SacI雙酶切圖譜，3號(hào)泳道為質(zhì)粒pCRI1210的BamHI/SacI雙酶切圖譜。)，分別在約1.9kb和15kb處出現(xiàn)了擴(kuò)增條帶。將回收到的1.9kb和15kb的兩部分DNA片段連接起來，得到含有GUS和GFP基因的載體pCRI 1210-GUS。其中，該載體的抗性篩選基因?yàn)榭敲顾乜剐曰?。將連接產(chǎn)物pCRI 1210-GUS加入到裝有剛剛?cè)诨拇竽c桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自Tiangen公司)的離心管中，輕彈混勻，冰浴30分鐘；將該離心管置于42°C水浴鍋中熱激90秒，取出后立即冰浴2-3分鐘，期間不要晃動(dòng)離心管；向離心管中加入250-500ul不含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，150rpm, 37°C震蕩培養(yǎng)45分鐘；將離心管中的菌液混勻，吸取IOOul菌液加入到含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻璃棒輕輕將菌液涂開，待平板表面干燥后，倒置平板；37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)后，挑取單菌落于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，搖菌約12小時(shí)；同時(shí)，設(shè)計(jì)未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(空白對(duì)照)和轉(zhuǎn)化pBI121載體的大腸桿菌(陽(yáng)性對(duì)照);利用TIANprep Mini Plasmid Kit(購(gòu)自Tiangen公司)提取質(zhì)粒，用GUS基因的特異性檢測(cè)引物對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)，特異性GUS引物序列為:上游引物⑶SFl:5’ -CTACACCACGCCGAACACCT-3，和下游引物⑶SRl:5，-CACGCTTGGGTGGTTTTTGTC-3，。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化pCRI1210-GUS載體的大腸桿菌I號(hào)和2號(hào)單克隆與轉(zhuǎn)化PBI121載體的大腸桿菌(陽(yáng)性對(duì)照)在690bp處出現(xiàn)了擴(kuò)增條帶(圖4:1號(hào)泳道為MakerIII, 2號(hào)泳道為未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(空白對(duì)照)，3號(hào)泳道為I號(hào)單克隆，4號(hào)泳道為2號(hào)單克隆，5號(hào)泳道為轉(zhuǎn)化pBI 121載體的大腸桿菌(陽(yáng)性對(duì)照)，表明目的基因GUS已成功構(gòu)建到載體PCRI1210中。同時(shí)，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)，用BamHI/SacI雙酶切提取的質(zhì)粒，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示I號(hào)和2號(hào)單克隆在1.9kb處出現(xiàn)了擴(kuò)增條帶(圖5:1號(hào)泳道為Makerlll，2號(hào)泳道為I號(hào)單克隆，3號(hào)泳道為2號(hào)單克隆)，表明gus基因已經(jīng)連接到PCRI1210-GUS載體上。檢測(cè)后再送交測(cè)序公司，，確定陽(yáng)性單克隆，所保存的對(duì)應(yīng)菌落即為目的轉(zhuǎn)化子。二、表達(dá)載體pCRI1210-GUS的功能驗(yàn)證(一)表達(dá)載體的瞬時(shí)表達(dá)分析(I)將上述步驟一得到的陽(yáng)性單克隆的菌液，利用TIANprep Mini Plasmid Kit提取 pCRI 1210-GUS 質(zhì)粒。(2)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化利用基因槍轉(zhuǎn)化法將PCRI1210-GUS質(zhì)粒導(dǎo)入棉花胚性愈傷組織和洋蔥表皮中。棉花胚性愈傷組織在轉(zhuǎn)化 前28°C高滲預(yù)培養(yǎng)4h(添加0.6mol.Γ1甘露醇和0.6mol.Γ1山梨醇)，采用Bio-RadPDS 1000/He基因槍進(jìn)行轟擊，可裂膜壓力為1.1kPa0將基因槍轟擊后的棉花胚性愈傷組織在MS培養(yǎng)基上37°C暗培養(yǎng)48h后進(jìn)行GUS染色；洋蔥表皮在MS培養(yǎng)基上28.(TC弱光下培養(yǎng)24h后熒光顯微觀察。結(jié)果如圖6所示(圖6:A為轟擊了載體pCRI1210-GUS質(zhì)粒的洋蔥表皮熒光顯微成像圖片，B為轟擊了載體pBI121_GUS質(zhì)粒的洋蔥表皮熒光顯微圖片，a為A圖視野的相應(yīng)白光視野圖片，b為B圖視野的相應(yīng)白光視野圖片)，從結(jié)果可知，報(bào)告基因EGFP在載體pCRI1210-GUS中得到較強(qiáng)的表達(dá)，證明表達(dá)載體中的EGFP報(bào)告基因能有較好的表達(dá)效果。同時(shí)以轉(zhuǎn)化PCRI1210的棉花胚性愈傷組織和洋蔥表皮作為空載體對(duì)照，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的棉花胚性愈傷組織和洋蔥表皮作為空白對(duì)照。結(jié)果:空載體對(duì)照未見綠色熒光蛋白；空白對(duì)照中未見綠色熒光蛋白。(3)愈傷組織的⑶S染色⑶S染色程序?yàn)?將愈傷組織浸泡于⑶S染色液(0.1mol磷酸鈉緩沖液，pH 7.0 ；Ig.171 X-Gluc ;2% DMF;0.2%吐溫20)中，37 °C溫育12h，再在⑶S洗液中漂洗，然后用95%乙醇37°C脫色8 10h，漂洗后重復(fù)一次，保存于75%乙醇中，室溫儲(chǔ)存。同時(shí)以轉(zhuǎn)化PBI121的棉花胚性愈傷組織和洋蔥表皮作為空載體對(duì)照(即陽(yáng)性對(duì)照)，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的棉花胚性愈傷組織和洋蔥表皮作為空白對(duì)照(即陰性對(duì)照)。結(jié)果如圖7所示，(圖7:A為轉(zhuǎn)化pCRI11210-GUS的胚性愈傷，B為轉(zhuǎn)化pBI121的胚性愈傷(陽(yáng)性對(duì)照)，而C為未轉(zhuǎn)化任何載體的胚性愈傷(陰性對(duì)照))，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化PCRI11210-GUS的胚性愈傷與轉(zhuǎn)化pBI121的胚性愈傷(陽(yáng)性對(duì)照)中⑶S的表達(dá)效率相當(dāng)。( 二)含有pCRI1210-GUS載體的農(nóng)桿菌對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備:①用接種針在YEB固體培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)農(nóng)桿菌LBA4404單菌落；②挑取單菌落接種于5ml含適當(dāng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28 °C，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜；③按1: 25-50接種于IOOml含適當(dāng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)4_6h ;④將菌液冰浴30min，期間不斷搖動(dòng)；⑤轉(zhuǎn)入2個(gè)50ml離心管，重懸沉淀，4°C，4000rpm, IOmin 去上清，加入10_15ml滅菌蒸懼水，重懸沉淀，4°C, 4000rpm, IOmin ;⑦去上清，加入IOml滅菌10%甘油，重懸沉淀，4°C,4000rpm, IOmin !⑧去上清,加入IOml滅菌10%甘油，重懸沉淀,4. ,4000Γρπι, IOmin !⑨去上清,用回流的甘油重懸沉淀；⑩用0.5ml離心管分裝，每管20 μ 1，_70°C保存?zhèn)溆?。向農(nóng)桿菌LB4404感受態(tài)細(xì)胞中，加入步驟2(1)中從陽(yáng)性單克隆中所提取的質(zhì)粒10ul，冰上放置30分鐘；浸入液氮中5分鐘，迅速取出37°C水浴5分鐘，然后冰浴2分鐘；加入500ul YEB液體培養(yǎng)基，280C，175rpm震蕩培養(yǎng)3_5小時(shí)；利用無菌的彎頭玻璃棒將菌液均勻涂布在含有鏈霉素、利福平和卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)直至生長(zhǎng)出單菌落；挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，各泳道均出現(xiàn)目標(biāo)條帶。將陽(yáng)性單菌落搖菌過夜，培養(yǎng)至0D600 = 0.3-0.6用于侵染。2、含有pCRI1210-GUS載體的農(nóng)桿菌對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化用上述步驟I得到的 含有PCRI1210-GUS載體的農(nóng)桿菌侵染用升汞消毒后的煙草葉片(剪成0.5X0.5cm)3分鐘，移入到共培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+6_BA(2mg/L)+IAA(0.2mg/L)中避光28°C共培養(yǎng)48小時(shí)。設(shè)計(jì)未轉(zhuǎn)化任何載體的煙草葉片為空白對(duì)照、轉(zhuǎn)化PBI121載體的煙草葉片為陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)化PCRI1210的為空載體對(duì)照。將葉片轉(zhuǎn)入幼芽增殖固體培養(yǎng)基中(MS基本培養(yǎng)基+6-BA(2mg/L)+IAA(0.2mg/L)+Kan(lOOmg/L)+CB(500mg/L))，置于28°C人工氣候箱中誘導(dǎo)幼芽分化。十天后，出現(xiàn)幼芽?？剐院Y選:在幼芽增殖固體培養(yǎng)基中加入卡那霉素(100mg/L)篩選陽(yáng)幼芽，陽(yáng)性幼芽生長(zhǎng)正常，呈嫩綠色，未轉(zhuǎn)化成功幼芽則明顯分化遲緩，呈淺白色。EGFP篩選:撕取轉(zhuǎn)基因煙草幼芽葉片制成水裝片，直接在熒光顯微鏡下觀察EGFP突光，顯微鏡型號(hào):Axioskop 40突光顯微鏡(Zeiss, Germany),激發(fā)波長(zhǎng)(ExcitationWavelength:480±20nm),發(fā)射波長(zhǎng)(Emission Wavelength):510±20nm,利用 CCD 進(jìn)行圖像的采集。葉脈呈現(xiàn)亮綠色熒光的為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率。結(jié)果:轉(zhuǎn)PCRI1210-GUS載體的幼芽中生長(zhǎng)正常且葉脈呈現(xiàn)亮綠色熒光的幼芽213個(gè)，不正常且無熒光的幼芽19個(gè)，陽(yáng)性幼芽占總幼芽的91.8%;轉(zhuǎn)陽(yáng)性對(duì)照載體PBI121的幼芽中生長(zhǎng)正常的幼芽241個(gè)，不正常幼芽20個(gè)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為92.3% ；轉(zhuǎn)空載體PCRI1210的幼芽中正常的幼芽235個(gè)，不正常幼芽23個(gè)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為91.1%。三種載體的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率相當(dāng)，均達(dá)到90%以上。將抗性篩選陽(yáng)性的幼芽切下放入Gus染液中染色，37°C保溫培養(yǎng)過夜后用70%酒精脫色，組織呈現(xiàn)深藍(lán)色的為⑶S檢測(cè)陽(yáng)性。結(jié)果顯示，pCRI1210-GUS載體轉(zhuǎn)化的煙草幼芽與pBI121載體轉(zhuǎn)化的煙草幼芽(陽(yáng)性對(duì)照)均呈現(xiàn)深藍(lán)色，而未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的煙草幼芽(空白對(duì)照)和轉(zhuǎn)化PCRI1210的煙草幼芽變?yōu)闊o色半透明狀(圖8:A號(hào)管為未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的煙草幼芽(空白對(duì)照)，B和C為pBI121載體轉(zhuǎn)化的煙草幼芽(陽(yáng)性對(duì)照)，D和E為PCRI1210-GUS載體轉(zhuǎn)化的煙草幼芽)，結(jié)果說明pCRI1210_GUS載體中的CaMV 35S能夠正常啟動(dòng)其下游⑶S基因在煙草幼芽中正常表達(dá)。對(duì)上述培養(yǎng)的煙草幼芽十五天一個(gè)周期更換培養(yǎng)基，直至幼芽生長(zhǎng)到4cm左右的幼苗，將幼苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，同時(shí)取葉片進(jìn)行Gus染色。結(jié)果顯示，pCRI1210-GUS載體轉(zhuǎn)化的煙草葉片與PBI121載體轉(zhuǎn)化的煙草葉片(陽(yáng)性對(duì)照)均呈現(xiàn)深藍(lán)色，而未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的煙草葉片(空白對(duì)照)和轉(zhuǎn)化PCRI1210的煙草葉片沒有呈現(xiàn)深藍(lán)色(圖9:A為PCRI1210-GUS載體轉(zhuǎn)化的煙草葉片，B為pBI121載體轉(zhuǎn)化的煙草葉片(陽(yáng)性對(duì)照)，C為未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的煙草葉片(空白對(duì)照)；為提高染色效果，葉片均剪去邊緣并用毛細(xì)玻璃管打孔)，結(jié)果說明pCRI 1210-GUS載體中的CaMV 35S能夠正常啟動(dòng)其下游⑶S基因在煙草葉片中正常表達(dá)。上述煙草幼苗七天后出現(xiàn)不定根，20天后出現(xiàn)大量不定根，打開瓶蓋煉苗24小時(shí)，將苗取出后用水沖洗根部，去除培養(yǎng)基，移栽到盆中。同時(shí)，取部分根放入Gus染液中染色。結(jié)果顯示，PCRI1210-GUS載體轉(zhuǎn)化的煙草根與pBI121載體轉(zhuǎn)化的煙草根(陽(yáng)性對(duì)照)均呈現(xiàn)深藍(lán)色，而未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的煙草根(空白對(duì)照)和轉(zhuǎn)化PCRI1210的煙草根沒有呈現(xiàn)深藍(lán)色(圖10:A為pCRI1210-GUS載體轉(zhuǎn)化的煙草根，B為pBI121載體轉(zhuǎn)化的煙草根(陽(yáng)性對(duì)照)，C為未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的煙草根(空白對(duì)照)；為提高觀察效果，采用不同的背景色)，結(jié)果說明PCRI1210-GUS載體中的CaMV 35S能夠正常啟動(dòng)其下游⑶S基因在煙草根部中正常表達(dá)。5、pCRI1210-GUS載體轉(zhuǎn)化煙草的分子生物學(xué)檢測(cè)分別取步 驟4中pCRI1210-GUS載體轉(zhuǎn)化的煙草植株、pBI121載體轉(zhuǎn)化的煙草植株(陽(yáng)性對(duì)照)、未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的煙草植株(空白對(duì)照)和轉(zhuǎn)化pCRI 1210的為空載體對(duì)照的幼嫩葉片，提取DNA，分別用⑶S基因的特異性檢測(cè)弓I物⑶SF2和⑶SR2進(jìn)行PCR檢測(cè)。⑶S引物序列為:⑶SF2:5’ -GAAAGCCGGGCAATTGCT-3’ 和⑶SR2:5， -CACATCACCACGCTTGGGT-3，。檢測(cè)結(jié)果顯示(圖12:A號(hào)泳道為Makerlll，B號(hào)泳道為未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的煙草植株(空白對(duì)照)，C-E號(hào)泳道為pCRI1210-GUS載體轉(zhuǎn)化的煙草的不同單株，F(xiàn)-G號(hào)泳道為pBI121載體轉(zhuǎn)化的煙草的不同單株(陽(yáng)性對(duì)照))，PCRI1210-GUS載體轉(zhuǎn)化的煙草與PBI121載體轉(zhuǎn)化的煙草(陽(yáng)性對(duì)照)在IlOObp處均出現(xiàn)了擴(kuò)增條帶，而未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的煙草植株(空白對(duì)照)和轉(zhuǎn)化PCRI1210的為空載體對(duì)照在此處沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，此結(jié)果表明目的基因⑶S所在的載體pCRI1210已成功整合到煙草基因組DNA中，同時(shí)pCRI1210_GUS載體轉(zhuǎn)化的煙草植株生長(zhǎng)良好(圖13:A為未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的煙草植株(空白對(duì)照)，B為PCRI1210-GUS載體轉(zhuǎn)化的煙草植株，C為pBI121載體轉(zhuǎn)化的煙草植株)。(三)含有RI1210-GUS載體的農(nóng)桿菌對(duì)棉花無菌苗下胚軸切段的轉(zhuǎn)化用上述(二)中步驟3得到的含有RI1210-GUS載體的農(nóng)桿菌侵染棉花無菌苗下胚軸切段3分鐘，移入到共培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+6-BA (2mg/L) +IAA (0.2mg/L))中28°C共培養(yǎng)48小時(shí)(同時(shí)設(shè)計(jì)空白對(duì)照)。將下胚軸轉(zhuǎn)至脫分化培養(yǎng)基(MSB培養(yǎng)基、IAA、KT、2，4-D各0.lmg/L, 25g/L葡萄糖，2.2g/L Gel, pH = 6.5)上暗培養(yǎng)約20天，在超凈工作臺(tái)上用鑷子提取少量的愈傷組織，制成水裝片，直接在熒光顯微鏡下觀察EGFP熒光，激發(fā)波長(zhǎng)(Excitation Wavelength)為 480±20nm,發(fā)射波長(zhǎng)(Emission Wavelength)為 510±20nm，利用CCD進(jìn)行圖像的采 集。結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織(空白對(duì)照)相比，轉(zhuǎn)化PCRI1210-GUS載體的棉花愈傷組織中報(bào)告基因EGFP得到較強(qiáng)表達(dá)(圖11:A為未轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織(空白對(duì)照)，B為轉(zhuǎn)化pCRI1210-GUS載體的棉花愈傷組織)。
權(quán)利要求
1.一種植物雙元表達(dá)載體，是按照如下方法得到:在出發(fā)載體PBI121中構(gòu)建熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)盒和外源基因表達(dá)盒；所述外源基因表達(dá)盒由啟動(dòng)子、內(nèi)含子和終止子依次連接而成，所述啟動(dòng)子與所述內(nèi)含子之間具有若干個(gè)酶切位點(diǎn)，所述內(nèi)含子與所述終止子之間具有若干個(gè)酶切位點(diǎn)；構(gòu)建得到的植物雙元表達(dá)載體中其它位置的酶切位點(diǎn)與所述內(nèi)含子兩側(cè)的酶切位點(diǎn)均不相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物雙元表達(dá)載體，其特征在于:所述啟動(dòng)子與所述內(nèi)含子間的若干個(gè)酶切位點(diǎn)為=Xba 1、Age 1、Kpn 1、AvrII和BamH I，所述內(nèi)含子與所述終止子之間的若干個(gè)酶切位點(diǎn)為:EcoR 1、Sac 1、Sal I和SnaB I。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物雙元表達(dá)載體，其特征在于:所述外源基因表達(dá)盒的核苷酸序列如序列4所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的植物雙元表達(dá)載體，其特征在于:所述構(gòu)建熒光蛋白報(bào)告基因的表達(dá)盒的方法為用熒光蛋白報(bào)告基因替換所述出發(fā)載體PBI121中的GUS基因表達(dá)盒中的GUS基因，得到所述熒光蛋白報(bào)告基因的表達(dá)盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物雙元表達(dá)載體，其特征在于:所述熒光蛋白報(bào)告基因的為EGFP報(bào)告基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的植物雙元表達(dá)載體，其特征在于:所述外源基因表達(dá)盒的表達(dá)方向與所述熒光蛋白報(bào)告基因的表達(dá)盒的表達(dá)方向相反。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述植物雙元表達(dá)載體在將目的基因?qū)氤霭l(fā)植物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-6中任一所述植物雙元表達(dá)載體在使出發(fā)植物中的目的基因功能喪失中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述使出發(fā)植物中的目的基因功能喪失是通過RNA干擾實(shí)現(xiàn)的。
10.根據(jù)權(quán)利要求7、8或9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述出發(fā)植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為煙草或棉花；所述單子葉植物具體為洋蔥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物雙元表達(dá)載體。該植物雙元表達(dá)載體是按照如下方法得到在出發(fā)載體pBI121中構(gòu)建熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)盒和外源基因表達(dá)盒；所述外源基因表達(dá)盒由啟動(dòng)子、內(nèi)含子和終止子依次連接而成，所述啟動(dòng)子與所述內(nèi)含子之間具有若干個(gè)酶切位點(diǎn)，所述內(nèi)含子與所述終止子之間具有若干個(gè)酶切位點(diǎn)；構(gòu)建得到的植物雙元表達(dá)載體中其它位置的酶切位點(diǎn)與所述內(nèi)含子兩側(cè)的酶切位點(diǎn)均不相同。本發(fā)明所構(gòu)建的植物雙元表達(dá)載體可用于植物轉(zhuǎn)基因過表達(dá)研究和RNAi研究；所述植物雙元表達(dá)載體具有EGFP報(bào)告基因，可以方便的進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)；所述植物雙元表達(dá)載體具有卡那霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因較為安全，可以高效的進(jìn)行篩選和生產(chǎn)的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103205456SQ20121001080
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者李付廣, 尹國(guó), 洪偉東, 張朝軍, 張雪妍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所