專利名稱：瞬時連接于聚合物載體的干生長激素組合物的制作方法
瞬時連接于聚合物載體的干生長激素組合物本發(fā)明涉及rhGH聚合物前體藥物的干組合物、其制備方法以及包含所述組合物的容器和試劑盒。生長激素(GH)是在人類和其他動物中刺激生長和細胞繁殖的激素。其是在垂體前葉的側(cè)翼內(nèi)通過促生長激素細胞合成、儲存和分泌的具有191個氨基酸的單鏈多肽激素。當提及由重組DNA技術產(chǎn)生的人類生長激素(hGH)時，該激素也通稱為促生長素，并簡稱為 “rhGH”。 生長激素在體內(nèi)具有多種功能，最顯著的功能是在幼年期間增加高度，并且通過GH的治療性使用可以治療幾種疾病。由于生長激素產(chǎn)生不足引起的生長激素缺乏造成了多種負面影響。在嬰兒期和幼年期，最突出的特征是生長不足，導致身材矮小，而在成年期，其會造成瘦體重降低、骨密度減少以及其他物理和生理影響。生長激素缺乏的標準治療是在皮下或者肌肉中每日注射重組人類生長激素(rhGH)。為了使兒科患者群體免于每日注射的負擔，意圖提供長效生長激素組合物，以在幼年期治療生長激素缺乏。描述了長效的或者持續(xù)釋放人類生長激素的多種組合物。第一代生長激素長效藥劑基于高度黏性液體如蔗糖醋酸異丁酸酯(W0 01/78683,Genentech)或生物可降解PLGA(聚交酯/聚乙醇酸交酯)凝膠中的人類生長激素的緩慢釋放組合物。在US 5，645，010中，Alkermes描述了鋅復合hGH在PLGA中的組合物。對應的市售產(chǎn)品(Nutropin Depot)提供為單劑量可注射的組合物。出于多種原因，Nutropin Depot并沒有顯示出明顯的市場占有，并且已經(jīng)停售。最新的基于聚合物的組合物使用透明質(zhì)酸代替PLGA(US2008/0063727，LG LifeSciences) 0其他研發(fā)集中于生長激素的PEG綴合物，以延長注射后經(jīng)由皮下組織的吸收期以及循環(huán)綴合物的終末半衰期二者(US 4，179，337描述了聚乙二醇化的促生長素，如WO03/044056，Pharmacia 和 TO 06/102659，Nektar)為目的。然而，對于如何配制聚乙二醇化的生長激素，僅可得到很少的詳細說明。由于PEG自身為高黏性物質(zhì)，與未修飾的蛋白質(zhì)比較，攜帶高分子量PEG鏈的相應蛋白質(zhì)綴合物也表現(xiàn)出強烈增強的黏性。由于期望以比每日劑量更低的頻率提供充足物質(zhì)而同時尋求最小化注射體積，該情況更為明顯。因此，長效聚乙二醇化生長激素的組合物比現(xiàn)存的未修飾生長激素的每日一次組合物更濃而且更黏稠。Ambrx的WO 2006/071840中詳述了摻入非天然氨基酸的聚乙二醇化生長激素變體的組合物。Novo的WO 2007/025988描述了通過肟鍵含有生長激素和PEG的組合物。Novo的US 26/257479詳述了 PLGA中PEG生長激素綴合物的組合物。最近，通過在前體藥物方法中使用可逆的連接體，引入了聚乙二醇化范圍的擴展。hGH的聚乙二醇化前體藥物表現(xiàn)出聚乙二醇化綴合物顯著降低的生物活性，但釋放自該綴合物的游離的生長激素表現(xiàn)出完全未受影響的生物學活性。此類hGH前體藥物的組合物，不僅僅需要考慮通過PEG組分引入的黏性，還必須提供足夠的前體藥物穩(wěn)定性，以避免儲存期間過早的hGH釋放。如果PEG部分與藥物之間的可逆連接在儲存期間降解，那么則增加了立即可用的藥物濃度，其導致了超劑量的風險。此夕卜，在儲存期間釋放的任一藥物在施用給患者后都經(jīng)歷快速的腎臟清除，因此，降低了長效組合物提供藥物的治療相關量的時間。這造成了不滿足醫(yī)療需求的風險。此外，已知rhGH在儲存條件下會經(jīng)歷分解反應，其會產(chǎn)生相應組分的雜質(zhì)。因此，應當強制鑒定合適的rhGH聚合物前體藥物組合物，其中rhGH應當顯示出可接受的雜質(zhì)譜。因此，首先需要研發(fā)hG H聚合物前體藥物的組合物，其確保了 rhGH聚合物前體藥物化合物的穩(wěn)定性。此外，期望提供此類hGH聚合物前體藥物的單劑量以及多劑量組合物。因此，本發(fā)明的目的是提供此類組合物。該目的通過包含治療有效量的rhGH聚合物前體藥物和一種或者多種凍干保護劑和任選地一種或多種可藥用賦形劑的干組合物實現(xiàn)，其中生長激素與聚合物載體瞬時連接。在本發(fā)明的上下文中，術語和短語使用如下。因為重組人類GH在序列上與天然人類GH相同，所以在本文中，術語重組人類生長激素(rhGH)也涉及所謂的生物起源等同物。因此，在本發(fā)明的含義內(nèi)，術語rhGH和hGH可以同義使用。如本領域技術人員已知，對所關注的生物學物質(zhì)(在本文中為GH)做出例如輕微氨基酸改變而不顯著影響生物學物質(zhì)的活性，是目前的一項常規(guī)工作。除重組的人類生長激素和生物起源生長激素外，在本文中術語重組人類生長激素還涉及全部可能的rhGH多肽?？赡艿膔hGH多肽的精確描述給自于Pharmacia公司的W0-A2005/079838第15頁第0043段一直到并且包括第0053段中。術語“hGH多肽或hGH蛋白質(zhì)”當在本文中使用時，包括優(yōu)選來自哺乳動物物種、更優(yōu)選來自人類和鼠類物種的全部hGH多肽，以及它們的變體、類似物、直向同系物(orthologs)、同系物和衍生物及其片段，其特征在于在生長期促進生長并維持正常的身體組成、合成代謝和脂類代謝。任選地，術語“hGH多肽或hGH蛋白質(zhì)”進一步包括與天然存在的hGH變體比較具有一個或多個其他氨基酸殘基的hGH，其中這些其他氨基酸殘基可以在氨末端、C-末端和/或內(nèi)部。應當理解，術語“hGH多肽或hGH蛋白質(zhì)”還指具有添加的、缺失的或者交換的氨基酸殘基的任意組合的hGH變體。優(yōu)選地，術語“hGH多肽或hGH蛋白質(zhì)”當在本文中使用時，包括優(yōu)選來自哺乳動物物種、更優(yōu)選來自人類和鼠類物種的全部hGH多肽，以及它們的變體、類似物、直向同系物、同系物和衍生物及其片段，其特征在于在生長期促進生長并維持正常的身體組成、合成代謝和脂類代謝。更優(yōu)選地，hGH多肽或hGH蛋白質(zhì)與以下給出的使用根據(jù)本領域技術人員已知的IUPAC-IUB的氨基酸單字母碼序列具有至少95%的同一性。FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF術語“hGH多肽或hGH蛋白質(zhì)”優(yōu)選指具有如A. L. Grigorian等人，ProteinScience (2005) 14,902-913中公開的序列的22kDa hGH多肽，以及表現(xiàn)出基本上相同的生物學活性(在生長期促進生長并維持正常的身體組成、合成代謝和脂類代謝)的其變體、同系物和衍生物。更優(yōu)選地，術語“hGH多肽或hGH蛋白質(zhì)”指正好具有上述序列的多肽。如本文中所用的術語“hGH多肽或hGH蛋白質(zhì)”指來自同一物種但不同于參考hGH多肽的多肽。通常，差異是有限的，以使參考和變體的氨基酸序列在整體上是非常類似的，并且在許多區(qū)域是相同的。優(yōu)選地，hGH多肽與參考hGH多肽具有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性，優(yōu)選地，hGH 多肽具有如 A. L. Grigorian 等人，ProteinScience (2005)，14，902-913中所示的序列。就與查詢氨基酸序列具有至少例如95%“同一性”的氨基酸序列的多肽而言，其指除所指多肽序列可以包括查詢氨基酸序列的每一百個氨基酸中至多5個氨基酸改變外，所指多肽的氨基酸序列與查詢序列是相同的。參考序列的這些改變可以發(fā)生在參考氨基酸序列的氨基端或羧基端位置，或者這些末端位置之間的任何位置、個別地分散在參考序列的殘基之間或者分散在參考序列內(nèi)一個或多個鄰近的群組中。查詢序列可以是參考序列的整個氨基酸序列或者如本文所述的任一特定片段。 此類hGH多肽變體可以是天然存在的變體，例如由占據(jù)生物體染色體上給定位置的一個或幾個交替形式的hGH編碼的天然存在的等位變體、或者由來源于單個初級轉(zhuǎn)錄物的天然存在的剪接變體編碼的同種型。備選地，hGH多肽變體可以是這樣的變體，其是已知并不天然存在的并可以使用本領域已知的誘變技術制備的變體。本領域已知，在沒有實質(zhì)上丟失生物功能的情況下，可以從生物活性肽或蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端中缺失一個或多個氨基酸(參見例如Ron等人，(1993)，Biol. Chem.，268 2984-2988，所述公開在此處以其整體引入作為參考)。本領域技術人員還公認，在沒有顯著影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能的情況下，可以改變hGH多肽的一些氨基酸序列。此類突變包括根據(jù)本領域已知的一般規(guī)則選擇的缺失、插入、倒位、重復和取代，而幾乎對活性不產(chǎn)生影響。例如，在Bowie等人(1990), Science247 =1306-1310中提供了有關如何制備表型沉默氨基酸取代的指導，在此以其整體引入作為參考，其中作者指出存在兩種主要用于研究氨基酸序列耐受改變的方法。第一種方法依賴于進化的過程，其中通過自然選擇接受或者拒絕突變。第二種方法使用基因工程在克隆的hGH的特定位置引入氨基酸改變，并選擇或篩選以鑒定維持功能的序列。這些研究已經(jīng)顯示，蛋白質(zhì)可以出乎意料地耐受氨基酸取代。作者進一步表明，在蛋白質(zhì)的某些位置處，什么樣的氨基酸改變可能是許可的。例如，大多數(shù)掩藏的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而表面?zhèn)孺湹臉O少數(shù)特征一般是保守的。其他此類表型沉默取代描述于上述Bowie等人，(1990)，以及其中所引用的參考文獻中。通常認為保守的取代是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Phe間，用一個取代另一個，互換輕基殘基Ser和Thr、交換酸性殘基Asp和Glu、在酰胺殘基Asn和Gln之間取代、交換堿性殘基Lys和Arg，以及在芳香族殘基Phe、Tyr之間取代。此外，以下氨基酸群組通常代表等效改變(I) Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn、Ser> Thr ； (2) Cys> Ser> Tyr> Thr ； (3)Val、lie、Leu、Met、Ala、Phe ； (4) Lys、Arg、His ； (5) Phe、Tyr、Trp、His。 術語hGH多肽還包括由hGH類似物、直向同系物和/物種同系物編碼的所有hGH多肽。如本文中所用的術語“hGH類似物”指不同的和不相關的生物的hGH，其在各個生物中執(zhí)行相同的功能，但其并非來源于生物祖先所共有的祖先結(jié)構(gòu)。相反，類似的hGH獨立地產(chǎn)生，然后進化以執(zhí)行相同的功能(或者類似的功能)。換言之，類似的hGH多肽是具有非常不同的氨基酸序列但執(zhí)行相同的生物學活性即在生長期促進生長并維持正常的身體組成、合成代謝和脂類代謝的多肽。如本文中所用的術語“hGH直向同系物”指兩種不同物種內(nèi)的hGH，其序列通過祖先物種中共同的同系hGH相互關聯(lián)，但已經(jīng)進化變得相互不同。如本文中所用的術語“hGH同系物”指不同生物的hGH，其在各個生物中執(zhí)行相同的功能，并來源于生物祖先所共有的祖先結(jié)構(gòu)。換言之，同系hGH多肽是具有非常類似的氨基酸序列的多肽，其執(zhí)行相同的生物學活性，即在生長期促進生長并維持正常的身體組成、合成代謝和脂類代謝。優(yōu)選地，可以將hGH多肽同系物定義為顯示出與參考hGH多肽、優(yōu)選具有如上所述序列的 hGH 多肽具有至少 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%的同一丨I"生的多肽。因此，hGH多肽可以是例如⑴其中一個或多個氨基酸殘基用保守的或者非保守
的氨基酸殘基(優(yōu)選地保守氨基酸殘基)取代的hGH多肽，并且該取代的氨基酸殘基可以是或者可以不是由遺傳密碼編碼的或者(ii)其中一個或多個氨基酸殘基包含取代基的hGH多肽或者(iii)其中hGH多肽與另一化合物、例如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合的hGH多肽或者(iv)其中其他的氨基酸與上述形式的多肽融合的hGH多肽，例如IgG Fe融合區(qū)肽，或者前導序列或分泌序列或者用于純化上述形式的多肽的序列或原蛋白序列。hGH多肽可以是單體或者多聚體。多聚體可以是二聚體、三聚體、四聚體或者包含至少5個單聚多肽單元的多聚體。多聚體還可以是同源二聚體或者異源二聚體。多聚體可以是疏水、親水、離子和/或共價結(jié)合的結(jié)果和/或可以通過例如脂質(zhì)體形成間接連接。在一個實例中，共價結(jié)合在含hGH多肽或其片段的融合蛋白質(zhì)所含的異源序列之間(參見例如美國專利號5，478，925，其公開在此處以其整體引入作為參考)。在另一實例中，hGH多肽或其片段通過肽連接體例如US. 5，073，627 (在此處引用作為參考)中所述那些與一個或多個可以為hGH多肽或者異源多肽的多肽連接。用于制備多聚體hGH多肽的另一方法涉及使用與已知促進蛋白質(zhì)多聚化的亮氨酸拉鏈或異亮氨酸拉鏈多肽序列融合的hGH多肽，其中發(fā)現(xiàn)使用本領域技術人員已知的技術，包括WO 94/10308的教導。在另一實例中，hGH多肽可以通過在含F(xiàn)lag 多肽序列的融合hGH多肽中所含的Flag 多肽序列之間的相互作用結(jié)合。還可以使用本領域已知的化學技術產(chǎn)生hGH多聚體，例如使用本領域已知的連接體分子和連接體分子長度優(yōu)化技術的交聯(lián)(參見例如US 5，478，925)、本領域已知在位于(期望含在多聚體內(nèi)的)多肽序列內(nèi)的半胱氨酸殘基之間形成一個或多個分子間交聯(lián)的技術(參見例如US 5，478，925)、將半胱氨酸或者生物素添加到hGH多肽的C-末端或N-末端，以及產(chǎn)生含有一個或多個以上這些修飾多肽的技術(參見例如US 5，478，925)或者產(chǎn)生含hGH多聚體的脂質(zhì)體的30種技術的任意一種(參見例如美國專利號5，478，925)，所述公開以其整體引用作為參考。如本文中所用的術語“hGH多肽片段”指包含hGH多肽、優(yōu)選具有上述序列的多肽的臨近跨度的一部分氨基酸序列的任意肽或者多肽，即其指與天然存在的變體比較，在N末端、C末端和/或內(nèi)部具有至少一個氨基酸殘基的一個或多個缺失的hGH多肽。眾所周知，rhGH或其變體、綴合物或者衍生物可能經(jīng)歷分解反應，其會產(chǎn)生雜質(zhì)，例如
琥珀酰亞胺和異天冬氨酸降解產(chǎn)物(雜質(zhì)):異天冬氨酰肽鍵的形成是肽和蛋白質(zhì)在溫和條件下非酶促降解的最常見形式之一。對于hGH，琥珀酰亞胺形成和隨后水解成異天冬氨酸和天冬氨酸的主要位點是ASP130。 由于脫酰胺作用產(chǎn)生的降解產(chǎn)物(雜質(zhì))在溫和條件下，hGH的主要脫酰胺位點是 ASN149 和 ASN152。 由于氧化作用產(chǎn)生的降解產(chǎn)物(雜質(zhì))在溫和條件下，hGH的主要氧化位點是MET14。為了增強藥物如rhGH的體內(nèi)物理化學或者藥物動力學性質(zhì)，可以將該藥物與載體綴合。如果藥物與載體和/或連接體瞬時結(jié)合，通常將此類系統(tǒng)指定為載體-連接的前體藥物。根據(jù) IUPAC 提供的定義(如在 http://www. chem. qmul. ac. uk/iupac. medchem 給出，在2009年7月22日獲取)，載體連接的前體藥物是含有給定活性物質(zhì)與瞬時載體基團的暫時連接的前體藥物，其產(chǎn)生改善的物理化學或者藥物動力學性質(zhì)，并且通常通過水解 切割可以在體內(nèi)容易地去除。在載體連接的前體藥物中使用的連接體是瞬時的，意為在生理學條件(pH7.4，37°C的含水緩沖液)下，其是非酶促水解可降解的(可切割的)，半衰期范圍為例如I小時至3個月。術語“瞬時的”和“可逆的”可同義使用。本領域技術人員明白，hGH聚合物前體藥物是共價綴合物，意為hGH部分通過可逆的連接體部分與聚合物共價連接。優(yōu)選地，在hGH聚合物前體藥物中使用的連接體是無痕跡的，意為它們將hGH以其游離形式釋放。合適的載體是聚合物，并可以與連接體直接綴合或者通過不可切割的間隔區(qū)與連接體綴合。術語“hGH聚合物前體藥物”指hGH的載體連接的前體藥物，其中載體是聚合物。術語聚合物描述了由通過化學鍵、以線性、環(huán)狀、分枝狀、交聯(lián)或者樹狀聚體(dendrimeric)方式或它們的組合連接的重復結(jié)構(gòu)單元組成的分子,其可以是合成來源或者生物來源或者二者的組合。通常，聚合物具有至少IkDa的分子量。聚合物優(yōu)選地選自例如2-異丁烯?；?氧乙基磷?；憠A、水凝膠、基于PEG的水凝膠、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(烷氧基)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰胺基胺)(poly (amidoamines))、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(天冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(羥基乙酸)、聚對苯二甲酸丁二醇酯、聚(己內(nèi)酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚(磷酸三乙酯)(poly (ethyl phosphates))、聚(乙基5惡唑啉)、聚(輕基乙酸)、聚(丙烯酸輕乙酯)、聚(羥基乙基^唑啉)、聚(羥基甲基丙烯酸脂)、聚(羥丙基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羥丙脂)、聚(羥丙基唑啉)、聚(亞氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-羥基乙酸共聚物)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噴唑啉)、聚(有機膦腈)、聚(原酸酯)、聚(口€唑啉)、聚(丙二醇)、聚(硅氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯甲基醚)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、硅酮、纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲殼質(zhì)、脫乙酰殼多糖、葡聚糖、糊精、明膠、透明質(zhì)酸及衍生物、甘露聚糖、果膠、鼠李半乳糖醒酸聚糖(rhamnogalacturonans)、淀粉、輕燒基淀粉、輕乙基淀粉和其他基于碳水化合物的聚合物、木聚糖及其共聚物。
本文中所用的術語“PEG”或“聚乙二醇化殘基”用于示例以重復單元為特征的合適的水溶性聚合物。合適的聚合物可以選自聚烷氧基聚合物、透明質(zhì)酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚W惡唑啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有機膦腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰丙烯酸酯和聚酯。優(yōu)選地是聚烷氧基聚合物，特別地含以重量計至少10%、更優(yōu)選地以重量計至少25%、甚至更優(yōu)選地以重量計至少50 %的環(huán)氧乙烷單元的聚乙二醇聚合物?！敖M合物”指兩種或兩種以上化學物質(zhì)的混合物。藥物組合物包含藥物活性部分，或者以其游離形式或者作為前體藥物，以及可藥用賦形劑和/或載體。“干組合物”意為hGH聚合物前體藥物組合物以干的形式在容器中提供。用于干燥的合適方法是噴霧干燥和冷凍干燥(凍干)。該hGH聚合物前體藥物的干組合物具有最大10%、優(yōu)選地小于5%和更優(yōu)選地小于2% (根據(jù)Karl Fischer測定)的殘留水含量。干燥的優(yōu)選方法是冷凍干燥?！袄鋬龈稍锏慕M合物”意為首先冷凍hGH聚合物前體藥物組合物， 隨后通過減壓進行水減少。該術語并不排除在將組合物填充入最終容器之前在制備工藝中發(fā)生的其他干燥步驟?！袄鋬龈稍铩?凍干)為脫水過程，其特征在于冷凍組合物，然后降低周圍壓力和任選地加熱，以允許組合物中冷凍的水直接從固相中升華成氣體。通常，通過凝華作用收集升華的水。“重構(gòu)”意為添加液體以使組合物回到原來的形式，例如溶液?！爸貥?gòu)溶液”指在施用給需要其的患者之前，用于重構(gòu)rhGH聚合物前體藥物的干組合物的液體?！叭萜鳌币鉃槿我馊萜?，其中包含了 rhGH聚合物前體藥物組合物并可以儲存，直到重構(gòu)?！胺€(wěn)定的”和“穩(wěn)定性”意為在指定的儲存時間內(nèi)，聚合物綴合物保持綴合并不會大量程度的水解，并表現(xiàn)出與rhGH相關的可接受的雜質(zhì)譜。為了被視為穩(wěn)定的，組合物含有少于5%的游離形式的藥物和少量的rhGH相關雜質(zhì)，例如ASP130琥珀酰亞胺和異天冬氨酸形成、ASN140和ASN152脫酰胺，以及MET14氧化?？梢詫㈦s質(zhì)定量為胰蛋白酶肽(trypticpeotides)，基于相對于相應未修飾胰蛋白酶肽的峰面積的它們的各個峰面積，并且“少量”可對應于該雜質(zhì)存在的程度不大于20 %，優(yōu)選地不大于10 %，甚至更優(yōu)選地不大于5 % (每種雜質(zhì))。藥物的“游離形式”指藥物以其未修飾的、藥理學完全活性形式，例如從聚合物綴合物中釋放后?！爸委熡行Я俊币鉃樽阋灾斡?、緩解或者部分阻止給定疾病及其并發(fā)癥的臨床表征的量。將足夠?qū)崿F(xiàn)其的量定義為“治療有效量”。每一目的的有效量取決于疾病或者損傷的嚴重程度，以及受試者的體重和一般狀態(tài)。應當理解，使用常規(guī)實驗、通過構(gòu)建數(shù)值矩陣并測試矩陣中不同的點，可以實現(xiàn)合適劑量的測定，這都落入受訓醫(yī)師的普通技術內(nèi)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，治療有效量涉及旨在實現(xiàn)長期即3天或更長、例如I周或3周的治療效果的劑量?！熬彌_液”或“緩沖劑”指維持pH在期望范圍內(nèi)的化學化合物。生理上耐受的緩沖液為例如磷酸鈉、琥珀酸鹽、組氨酸、碳酸氫鹽、檸檬酸鹽和乙酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、氯化物、丙酮酸鹽。還可以使用解酸劑，例如Mg(0H)2*ZnC03?？梢哉{(diào)整緩沖能力，以匹配對pH穩(wěn)定性最敏感的條件?！百x形劑”指與治療劑一起施用的化合物，例如緩沖劑、等滲性改性劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、抗吸收劑、氧化保護劑或者其他輔助劑。然而，在一些情況下，一種賦形劑可以具有兩種或者二種功能。“凍干保護劑”是這樣的分子，當與目的蛋白質(zhì)組合時，在一般干燥、并特別地在冷凍干燥和隨后的儲存期間，顯著防止或降低蛋白質(zhì)的化學和/或物理不穩(wěn)定性。示例性凍干保護劑包括糖，如蔗糖或海藻糖；氨基酸如谷氨酸單鈉或組氨酸或精氨酸；甲胺類，如甜菜堿；易溶鹽(lyotropic salt)，如硫酸鎂；多元醇，如三元或者更高級糖醇，例如甘油、赤蘚醇、丙三醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；乙二醇；丙二醇；聚乙二醇；普朗尼克類(pluronics);輕燒基淀粉,例如輕乙基淀粉(HES)及其組合。優(yōu)選地，“凍干保護劑”是這樣的分子，當與目的蛋白質(zhì)組合時，在一般干燥、并特別地在冷凍干燥和隨后的儲存期間，顯著防止或降低蛋白質(zhì)的化學和/或物理不穩(wěn)定性。示例性凍干保護劑包括糖，如蔗糖或海藻糖；氨基酸，如谷氨酸單鈉或組氨酸；甲胺類，如甜菜堿；易溶鹽，如硫酸鎂；多元醇，如三元的或者更高級糖醇，例如甘油、赤蘚醇、丙三醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；乙二醇；丙二醇；聚乙二醇；普朗尼克類；羥烷基淀粉，例如羥乙基淀粉(HES)及其組合。優(yōu)選地，在干燥步驟前，將凍干保護劑以“凍干保護量”加入到組合物中，其意為，在凍干保護量的凍干保護劑存在下冷凍干燥蛋白質(zhì)后，蛋白質(zhì)在冷凍干燥和儲存期間，基本上保留其物理和化學穩(wěn)定性和完整性?！氨砻婊钚詣敝附档土黧w表面張力的濕潤劑。“等滲性改性劑”指最小化由于細胞損傷產(chǎn)生的傷害的化合物，所述細胞損傷歸因于注射長效藥劑處滲透壓的差異。術語“穩(wěn)定劑”指用于穩(wěn)定聚合物前體藥物的化合物。通過加強穩(wěn)定蛋白質(zhì)的力、通過去穩(wěn)定變性狀態(tài)或者通過將賦形劑與蛋白質(zhì)直接結(jié)合，來實現(xiàn)穩(wěn)定。“抗吸收劑”主要指離子或非離子表面活性劑或者其他蛋白質(zhì)或可溶性聚合物，用于包被或者競爭性吸附于組合物容器的內(nèi)表面。賦形劑的所選濃度和類型取決于要避免的影響，但通常恰在CMC值之上在界面形成表面活性劑的單層。“氧化保護劑”指抗氧化劑，如抗壞血酸、四氫甲基嘧啶羧酸(ectoine)、谷胱甘肽、甲硫氨酸、單硫代甘油、桑色素、聚氮丙啶(PEI)、沒食子酸丙酯、維生素E、螯合劑如檸檬酸、EDTA、六磷酸鹽(hexaphosphate)、巰基乙酸。“抗微生物劑”指殺死或抑制微生物如細菌、真菌、酵母、原生動物和/或破壞病毒的化學物質(zhì)?！翱伤幱谩币鉃榘ú粫蓴_活性成分的生物學活性的有效性并且對所施用的宿主無毒的任意賦形劑和/或添加劑。“密封容器”意為以不透氣的方式封閉容器，不允許外部與內(nèi)部之間的氣體交換，并保持內(nèi)含物無菌。
以下部分進一步詳細描述了本發(fā)明。本發(fā)明組合物含有rhGH聚合物前體藥物。優(yōu)選地，rhGH聚合物前體藥物具有(AB)中顯示的通式，hGH- (NH-L-S0)n (AB)，其中n為2、3或4 ;優(yōu)選地2 ;hGH (-NH) n 表示 hGH 殘基；每個L為官能團1/，其通過自動切割誘導基團^是自身可水解的(自動可切割的)；和每個S°獨立地是聚合物鏈，具有至少5kDa的分子量，其中S°任選地通過包含至少第一分支結(jié)構(gòu)BS1而支化，所述至少第一分支結(jié)構(gòu)BS1包含具有至少4kDa分子量的至少第二聚合物鏈S1，其中S'BS1、S1的至少之一進一步包含自動切割誘導基團Ga，并且其 中無hGH-NH的前體藥物綴合物的分子量為至少25kDa和最多IOOOkDa,優(yōu)選地至少25kDa和最多500kDa，甚至更優(yōu)選地至少30kDa和最多250kDa，甚至更優(yōu)選地至少30kDa和最多120kDa,甚至更優(yōu)選地至少40kDa和最多l(xiāng)OOkDa。在優(yōu)選的實施方案中，聚合物是PEG，且每個生長激素分子的總PEG載荷達到至少25kDa。一般地，總PEG載荷為小于1000kDa。優(yōu)選地，PEG載荷為至少25kDa和最多500kDa，甚至更優(yōu)選地至少30kDa和最多250kDa，甚至更優(yōu)選地至少30kDa和最多120kDa，甚至更優(yōu)選地至少40kDa和最多IOOkDa,甚至更優(yōu)選地至少40kDa和最多90kDa。PEG可以通過一個或多個錨著點與hGH連接。在一個錨著點的情況下，hGH PEG前體藥物單綴合物中的相應PEG是分支的，并含有至少3個鏈。在一個以上錨著點的情況下，例如在雙綴合物中，hGH PEG前體藥物中的相應PEG可以是分支的或者線性的。雙綴合物可以含有線性的或者分支的PEG或者可以含有一個線性的和一個分支的PEG鏈的混合物。在使用分支的PEG的情況下，可以存在一個或多個分支單元。分支的PEG是由連接兩個或多個PEG鏈的分支點組成的PEG分子，以形成具有用于連接生長激素的一個錨著點的分子。其可以是兩個20kDaPEG鏈連接以形成一個分支的40kDa PEG分子。在其中分子含有兩個或三個分支點的情況下，該分子分別指3臂和4臂PEG?？偠灾?，并且在上述限制內(nèi)，PEG聚合物并不局限于特定的結(jié)構(gòu)，并且可以是線性的、分支的或者多臂的(例如分叉的PEG或者與多元醇核連接的PEG)、樹枝狀的或者具有可降解的連接體。天然人類GH的聚乙二醇化可以發(fā)生在幾個賴氨酸基團上或者在N末端胺(Fl)上，由Clark等人(本文中參考文獻2)在第21973頁表III描述。高反應性位置為位置Fl和LYS-140。中等反應性位置為LYS-115、LYS-38和LYS-70。低反應性位置為LYS-172、LYS-4ULYS-158和LYS-168。然而，聚乙二醇化可以發(fā)生在GH的任一賴氨酸殘基處和/或N末端胺處。本發(fā)明干組合物的rhGH聚合物前體藥物優(yōu)選地在選自Lysl58、Lysl45、Lys38、Lysl40和Lys70的一個或多個賴氨酸處聚乙二醇化。更優(yōu)選地，hGH部分的聚乙二醇化主要發(fā)生在位置Lysl58、Lysl45、Lys38和Lysl40處,甚至更優(yōu)選地主要在位置Lysl58、Lysl45和Lys38處。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物全部生長激素部分的至少30%都在位置Lysl58處聚乙二醇化。在本文中，短語“聚乙二醇化主要發(fā)生在位置LysX處”意為rhGH聚合物前體藥物的全部rhGH部分的至少10%都在氨基酸位置X處聚乙二醇化。在更一般的情況下，通過合適的選擇所述聚合物，本文中所用的PEG與瞬時連接體組合可以降低脂肪萎縮(Iipoatrophy)的風險。然而,本發(fā)明的原理也應用于除PEG外的聚合物。因此，術語PEG僅在本文中用于示例合適的聚合物。因此，在優(yōu)選的實施方案中，hGH PEG前體藥物是用其伯氨基之一綴合至自動可切割官能團La再綴合至聚合物鏈S°的單綴合物。該聚合物鏈S°具有至少5kDa的分子量，并包含至少一個分支結(jié)構(gòu)BS1。分支結(jié)構(gòu)BS1包含第二個聚合物鏈S1，其具有至少4 kDa的分子量。如上所述，需要第三個聚合物鏈S2以具有至少4kDa的分子量。聚合物鏈S2可以 是BS1的一部分或者可以是S°或S1的其他分支，產(chǎn)生其他分支結(jié)構(gòu)BS2，其包含S2。任選地，本發(fā)明的干組合物中包含的前體藥物綴合物中存在3個以上、例如4、5、6、7或8個聚合物鏈。然而，每一另外的聚合物鏈具有至少4kDa的分子量。聚合物鏈的總數(shù)受最多IOOODa(無hGH-NH)的前體藥物綴合物總重量的限制。因此，本發(fā)明干組合物中包含的rhGH聚合物前體藥物的優(yōu)選實施方案涉及前體藥物，其中分支結(jié)構(gòu)BS1AS2的至少之一包含具有至少4 kDa分子量的另外第四個聚合物鏈S3，或者S°、S\S2之一包含含有具有至少4kDa分子量的至少第四個聚合物鏈S3的第三分支結(jié)構(gòu)BS3。分支結(jié)構(gòu)或聚合物鏈之一包含對于La的自動切割必需的自動切割誘導基團Ga。任選地，將分支結(jié)構(gòu)之一用作基團G%以使分支結(jié)構(gòu)由Ga組成(而不是包含所述基團)，其也被術語“包含”所涵蓋。圖I使用示例性hGH聚合物前體藥物說明了 La、Ga、S°、S1、S2、S3、BS1、BS2和BS3的含義。前體藥物綴合物(AA)的制備通常產(chǎn)生綴合物混合物，其中hGH的幾個伯氨基被綴合產(chǎn)生不同的單綴合、不同雙綴合、不同三綴合等的前體藥物?？梢酝ㄟ^本領域已知的標準方法如柱層析等分離相應的單綴合、雙綴合或三綴合hGH PEG前提藥物。在hGH PEG前體藥物的單綴合物中，至少3個聚合物鏈S°、S1、S2含有“聚合物部分”，其特征在于一個或多個重復單元，它們可以是隨機、嵌段式或者交替分布的。此外，至少3個聚合物鏈S°、S1、S2顯示出端基，其通常是氫原子或者具有1-6個碳原子的烷基，所述端基可以是分支的或者不分支的如甲基，特別地，對于基于PEG的聚合物鏈，產(chǎn)生所謂的mPEG。如本文中所理解的術語“基于PEG的”應用于其中基于聚合物鏈的總重量PEG的質(zhì)量比例為至少10%重量，優(yōu)選地至少25%和更優(yōu)選地至少50%。應當指出，至少3個聚合物鏈S'S1、#內(nèi)的聚合物部分可以具有其他鏈樣取代基，其來源于重復單元并產(chǎn)生具有小于4kDa分子量的鏈，并且并不將其看作聚合物鏈Sc^S1A2等。優(yōu)選地，至少3個聚合物鏈Sc^S1J2攜帶小于IOOODa分子量的取代基。S0的相關結(jié)構(gòu)特點是其臨界距離。臨界距離定義了 S°與La的連接位點與第一分支結(jié)構(gòu)BS1之間的最短距離，測量為連接的原子。臨界距離的長度對如在WO-A 2009/133137中描述的化合物33所討論的殘留活性具有影響，所述專利申請在此處引用作為參考。臨界距離優(yōu)選地小于50，更優(yōu)選地小于20和最優(yōu)選的小于10。通常，至少3個聚合物鏈S°、S1和S2各自含有互連部分。Ga存在于至少一個互連部分中。對于非s°的聚合物鏈，互連部分是連接例如S1的聚合物部分與BS1和S2的聚合物部分與BS2的結(jié)構(gòu)元件。對于S°，互連部分是連接La和BS1的結(jié)構(gòu)元件。互連部分可以由C卜5(|烷基鏈組成，其是分支的或者不分支的，且其任選地被雜原子或官能團中斷或者終止，所述雜原子或官能團選自-0-;-S-;N(R) ；C(0) ；C(O)N(R)；N(R)C(O);一個或多個碳環(huán)或雜環(huán)，其中R是氫或CV2tl烷基鏈，其任選地被一個或多個上述原子或基團中斷或終止，其進一步具有作為端原子的氫；且其中碳環(huán)是苯基；萘基；茚基；茚滿基；四氫萘基(tetralinyl) ;C3_1(I環(huán)烷基；且其中雜環(huán)是4-7元雜環(huán)基；或者9-11元雜雙環(huán)基?！癈3_1(l環(huán)烷基”或“C3_1(l環(huán)烷基環(huán)”意為具有3-10個碳原子的環(huán)烷基鏈，其可以具有
碳-碳雙鍵為至少部分飽和的，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基、環(huán)癸基。環(huán)烷基碳的每個氫可以被取代基替換。術語“c3,環(huán)烷基”或“c3_1(l環(huán)烷基環(huán)”還包括橋接雙環(huán)，如降冰片烷或降冰片烯?！?-7元雜環(huán)基”或者“4-7元雜環(huán)”意為具有4、5、6或7個環(huán)原子的環(huán)，其可以含有不超過最大數(shù)目的雙鍵(完全、部分或者未飽和的芳族環(huán)或者非芳族環(huán))，其中至少I個環(huán)原子至4個環(huán)原子被選自硫(包括-S (O)-、-S (O)2-)、氧和氮(包括=N(O)-)的雜原子取代，且其中該環(huán)通過碳或氮原子與分子的剩余部分連接。4-7元雜環(huán)的實例是氮雜環(huán)丁烷、氧雜環(huán)丁烷、硫雜環(huán)丁烷(thietane)、呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、批唑啉、p惡唑、惡唑啉、異^惡唑、異⑦惡唑啉、噻唑、噻唑啉、異噻唑、異噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氫呋喃、四氫噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、'P惡唑烷、異5惡唑烷、噻唑烷、異噻唑烷、噻二唑烷、環(huán)丁砜、吡喃、二氫吡喃、四氫吡喃、咪唑烷、吡唆、噠嗪、吡嗪、嘧唆、哌嗪、哌啶、嗎啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮雜環(huán)庚烷或高哌嗪。“9-11元雜雙環(huán)基”或“9-10元雜雙環(huán)”意為具有9-11個環(huán)原子的兩個環(huán)的雜環(huán)系統(tǒng)，其中兩個環(huán)公用至少一個環(huán)原子，且其可以包含不超過最大數(shù)目的雙鍵(完全、部分或者未飽和的芳族環(huán)或者非芳族環(huán))，其中至少I個環(huán)原子至6個環(huán)原子被選自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括=N(O)-)的雜原子取代，且其中該環(huán)通過碳或氮原子與分子的剩余部分連接。9-11元雜雙環(huán)的實例是吲哚、二氫吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并13惡唑、苯并異^唑、苯并噻唑、苯并異噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氫喹唑啉、喹啉、二氫喹啉、四氫喹啉、十氫喹啉、異喹啉、十氫異喹啉、四氫異喹啉、二氫異喹啉、苯并氮雜革、嘌呤或蝶啶。術語9-11元雜雙環(huán)還包括兩個環(huán)的螺結(jié)構(gòu)如I，4-二氧雜-8-氮雜螺[4. 5]癸烷或者橋接的雜環(huán)如8-氮雜-雙環(huán)[3. 2. I]辛烷。碳環(huán)、雜環(huán)和雜雙環(huán)可以被C1J烷基取代，該C1J烷基任選地被選自-0- ；-S-；N(R) ；C(0) ；C(O)N(R) ；N(R) C(O)的雜原子或官能團中斷或者終止，其中R是氫或C1,烷基鏈，其任選地通過一個或多個上述原子或基團中斷或者終止，其進一步具有氫作為端原子。至少3個鏈S°、S1、S2的聚合物部分形成了鏈的主要部分，優(yōu)選地每鏈分子量的至少90 %，更優(yōu)選地至少95 %，甚至更優(yōu)選地至少97.5%，甚至更優(yōu)選地至少99 %。因此，鏈的基礎表現(xiàn)為聚合物部分。優(yōu)選地，至少3個鏈S°、S1、S2獨立地基于選自下組的聚合物聚烷氧基聚合物、透明質(zhì)酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚5惡唑啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有機膦腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰丙烯酸酯和聚酯。優(yōu)選地，至少3個鏈S°、S\S2基于相同的聚合物。優(yōu)選地，至少3個鏈S°、S\S2基于聚烷氧基聚合物。甚至更優(yōu)選地，至少3個鏈S°、S1、S2基于聚乙二醇。相應地，同樣地適用于其他鏈S3、S4、S5等。鏈Stl包含分支結(jié)構(gòu)BS1，以使S1與Stl連接。對于S2連接，可以使用分支結(jié)構(gòu)BS1或者存在另外的分支結(jié)構(gòu)BS2，其可以是S°或S1的一部分。因此，當存在其他鏈時，可以存在其他分支結(jié)構(gòu)。例如在存在鏈S3的情況下，其可以與BS^BS2或分支結(jié)構(gòu)BS3連接。分支結(jié)構(gòu)BS3，如果存在，可以是S°、S1或S2的一部分。總之，可以使用允許鏈分支的任意化學實體。優(yōu)選地，分支結(jié)構(gòu)獨立地選自至少3重取代的碳環(huán)、至少3重取代的雜環(huán)、叔碳原子、季碳原子和叔氮原子，其中術語碳環(huán)和雜環(huán)如上述所定義。在該領域的文獻中，有時將自動切割誘導基團稱為連接體，以將其結(jié)構(gòu)與載體區(qū)分。然而，常常很難明確分別這兩種結(jié)構(gòu)特征。因此，在本發(fā)明的含義內(nèi)，認為切割誘導基團Ga是載體S的一部分，包含至少S°、S1、S2、BS1和任選地BS2。Ga化學性質(zhì)的改變允許在很大程度上改造對應的連接載體的前體藥物的自切割特性的性質(zhì)。如上所討論，聚乙二醇化前體藥物，其中該藥物例如為在專利申請WO-A2005/099768中所述的rhGH，且具有釋放特征，其在其中被描述為1，6切割系統(tǒng)，不會產(chǎn)生有毒的芳族化合物。在該文件中概括地描述了大量本文中相關的合適瞬時連接體結(jié)構(gòu)，以得到相關的目的釋放譜。其他瞬時連接體結(jié)構(gòu)分類/概括地描述于例如其他ComplexBiosystems GmbH 申請中，如 W0-A 2005/034909,WO-A 2005/099768,WO-A 2006/003014 和WO-A 2006/136586 中。更多瞬時連接體結(jié)構(gòu)概括地描述于如WO-A 99/30727 (Enzon Inc)中。為了解決如本文中所述GH的當前問題，本發(fā)明人已經(jīng)選擇了合適的優(yōu)選瞬時連接體結(jié)構(gòu)，以得到本文所述的rhGH聚乙二醇化前體藥物的相關功能特性?；诒疚脑敿毭枋龅膬?yōu)選連接體結(jié)構(gòu)，在技術人員的知識范圍內(nèi)可以制備其他合適的優(yōu)選瞬時連接體結(jié)構(gòu)，其給予rhGH聚乙二醇化前體藥物以本文所述的相關功能特性。 特別地，可以選擇可自身水解的(可自動切割的)合適瞬時連接體結(jié)構(gòu)用于摻入到Sci中。本文中所選擇的連接體結(jié)構(gòu)詳述如下。為了將水解不穩(wěn)定性引入官能團L如酰胺或氨基甲酸酯中，必需將結(jié)構(gòu)性化學組分改造成載體，以例如作為接近官能團的鄰基發(fā)揮功能。將對前體藥物酰胺鍵的切割性進行控制的此類自動切割誘導化學結(jié)構(gòu)稱為自動切割誘導基團Ga。自動切割誘導基團對給定官能團La的水解速率具有強烈的影響。優(yōu)選的La選自C (0) -0-和C (0) _，其與hGH的伯氨基一起形成氨基甲酸酯或酰胺基。因此，優(yōu)選本發(fā)明組合物，其中La選自C(O)-O-和C(O)-，其與hGH的伯氨基一起形成氨基甲酸酯或酰胺基，產(chǎn)生通式(AAl)或(AA2)hGH-NH-C (0) O-S0 (AAl)，hGH-NH-C (0)-S° (AA2)。
以下部分列出了可作為切割誘導基團Ga發(fā)揮功能的多種結(jié)構(gòu)組分?；鶊FGa表示自動切割誘導基團。Ga可以就此存在或者作為級聯(lián)自動切割誘導基團，其通過其他水解或者酶促切割步驟去屏蔽而生效。如果Ga就此存在，那么其控制La的限速自動水解。Ga的實例A. J. Garman等人(A. J. Garman, S. B. Kalindjan, FEBS Lett. 1987,223(2) ,361-3651987)使用PEG5000-馬來酸酐用于組織型纖溶酶原激活物和尿激酶中氨基的可逆修飾。經(jīng)在PH7. 4的緩沖液中溫育、通過切割馬來酰胺酸連接而從PEG-uPA綴合物再生功能性酶，遵循一級動力學，半衰期為6. lh。簡單的芳族部分可能將不穩(wěn)定性賦予連接的氨基甲酸酯鍵(W0-A01/47562)。例如，將取代的或未取代的芴基甲基基團用于活化前體藥物方法中多種生物活性劑的氨基甲酸酯連接體(Tsubery 等人，J Biol Chem279 (2004) 38118-24)。在 W0-A 2007/075534 中， 兩個PEG鏈與芴基部分連接。因此，Ga是與氨基甲酸酯官能團La直接連接的芳族環(huán)或芴基甲基。因此，優(yōu)選本發(fā)明組合物，其中Ga是與由La和hGH的伯氨基形成的氨基甲酸酯官能團直接連接的芳族環(huán)或芴基甲基。備選地，Ga的轉(zhuǎn)化可以誘導S°內(nèi)分子重排，例如1，4_或1，6_消除。重排使得La更不穩(wěn)定，從而誘導其切割。Ga的轉(zhuǎn)化在級聯(lián)機制中是限速步驟。理論上，臨時連接的切割速率與給定治療情況中藥物分子的期望釋放速率相同。在該基于1，6_消除的級聯(lián)系統(tǒng)中，期望的是La的切割在其不穩(wěn)定性受Ga的轉(zhuǎn)化誘導后是基本上瞬時的。此外，期望的是限速切割動力學在治療有用的時間范圍內(nèi)進行，不需要其他酶促作用，以避免與上述主要酶促切割相關的缺點。R. B. Greenwald, A. Pendri, C. D. Conover, H. Zhao, Y. H. Choe，A. Martinez, K. Shum,S. Guan, J. Med. Chem.，1999，42，3657-3667 &PCT 專利申請 WO-A 99/30727 描述了基于 1，4-或1，6-芐基消除來合成含氨基小分子化合物的聚(乙二醇)前體藥物的方法。在該方法中，藥物分子的氨基通過氨基甲酸酯基與聚乙二醇化芐基部分連接。聚(乙二醇)通過酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺鍵與芐基連接。PEG從藥物分子中的釋放通過自動水解聯(lián)合酶促切割而發(fā)生。在該方法中，引發(fā)釋放的掩蔽基團的切割后是經(jīng)典和快速的1，4_或1，6-芐基消除。還可以將該連接體系統(tǒng)用于蛋白質(zhì)的可釋放聚(乙二醇)綴合物(S.Lee，R. B. Greenwald 等人，Bioconj. Chem. 2001，12(2)，163-169)。將溶菌酶用作模式蛋白質(zhì)，因為當聚乙二醇化在賴氨酸殘基的￡ -氨基上發(fā)生時，其失去了其活性。將多種量的PEG連接體與蛋白質(zhì)綴合。天然蛋白質(zhì)自PEG綴合物的再生發(fā)生在大鼠血漿中或者非生理性高pH緩沖液中。還參見 F. M. H. DeGroot 等人(TO-A2002/083180 和 WO-A 2004/043493)和 D. Shabat等人(W0-A 2004/019993)。因此，La是氨基甲酸酯官能團，所述基團的切割通過S°的1，4_或1，6芐基消除、由Ga的羥基或氨基誘導，其中Ga含經(jīng)歷限速轉(zhuǎn)化的酯鍵、碳酸酯鍵、氨基甲酸酯鍵或酰胺鍵。實際上，Ga可以通過水解切割。因此，優(yōu)選本發(fā)明組合物，其中La與hGH的氨基一起形成氨基甲酸酯官能團，所述基團的切割通過S°的1，4_或1，6芐基消除、由Ga的羥基或氨基誘導，其中Ga含經(jīng)歷限速轉(zhuǎn)化的酯鍵、碳酸酯鍵、氨基甲酸酯鍵或酰胺鍵。^可以含有級聯(lián)切割系統(tǒng)，其通過由代表前述前體的結(jié)構(gòu)組合組成的Ga的組分啟動。Ga的前體可以含有其他臨時連接，例如酰胺、酯或氨基甲酸酯。前體的臨時連接(例如氨基甲酸酯)的穩(wěn)定性或者對水解的敏感性可以通過自動水解特性控制或者可能要求酶的活性。
Antczak等人(Bioorg Med Chem 9 (2001) 2843-48)描述了形成含胺藥物分子的大分子級聯(lián)前體藥物系統(tǒng)的基礎的試劑。在該方法中，將抗體用作為載體，用穩(wěn)定的鍵連接抗體和活化基團，攜帶可切割的掩蔽基團。在去除酯連接的掩蔽基團后，La切割并釋放藥物化合物。D. Shabat 等人(Chem. Eur. 3. 2004，10,2626-2634)描述了基于扁桃酸活化基團的聚合物前體藥物系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，掩蔽基團通過氨基甲酸酯鍵與活化基團連接。活化基團通過酰胺鍵與聚丙烯酰胺聚合物永久綴合。通過催化抗體活化掩蔽基團后，掩蔽基團通過環(huán)化被切割，并釋放藥物。藥物釋放后，活化基團仍與聚丙烯酰胺聚合物連接。M. -R. Lee 等人描述了(Angew. Chem. 2004，116，1707-1710)基于扁桃酸活化基團和酯連接的掩蔽基團的類似前體藥物系統(tǒng)。然而，在這些連接中，1，6_消除步驟仍產(chǎn)生了高反應性的芳族中間物。即使芳族部分仍與聚合物載體永久連接，也可能產(chǎn)生具有潛在毒性或免疫原性影響的副反應。Greenwald等人在2000年公布了基于三甲基鎖內(nèi)酯化作用的含氨基前體藥物的聚(乙二醇)藥物遞送系統(tǒng)(R. B. Greenwald 等人，J. Med. Chem. 2000,43 (3)，457-487 ；W0~A02/089789)。在該前體藥物系統(tǒng)中，取代的鄰羥苯基_ 二甲基丙酸通過酰胺鍵與藥物分子的氨基偶聯(lián)。羥基通過酯基、碳酸酯基或氨基甲酸酯基與PEG連接。藥物釋放中的決速步是這些官能團的酶促切割、繼之以通過內(nèi)酯化作用的快速酰胺切割，釋出芳族內(nèi)酯副產(chǎn)物。最近，R.B. Greenwald 等人(Greenwald 等人，J. Med. Chem. 2004,47, 726-734)描述了基于二-(N-2-羥乙基)甘氨酸酰胺(N-2-(羥乙基)甘氨酸酰胺)連接體的PEG前體藥物系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，兩個PEG分子與偶聯(lián)至藥物分子的氨基的N-2-(羥乙基)甘氨酸分子連接。前體藥物活化的前兩個步驟是兩個PEG分子的酶促切割。描述了 PEG和N-2-(羥乙基)甘氨酸之間的不同連接，產(chǎn)生了不同的前體藥物活化動力學。該系統(tǒng)的主要缺點是與藥物分子綴合的N-2-(羥乙基)甘氨酸酰胺較慢的水解速率(在磷酸緩沖液中t1/2 = 3h)，導致N-2-(羥乙基)甘氨酸修飾的前體藥物中間物的釋放，其與母體藥物分子比較可能顯示出不同的藥物動力學和藥效學特性。更特別地，下文描述了 S°的具有特定間隔區(qū)部分的優(yōu)選基團La和Ga。根據(jù)WO-A 2005/099768的優(yōu)選結(jié)構(gòu)選自通式(I)和(II)
權利要求
1.干組合物，其包含治療有效量的rhGH聚合物前體藥物和一種或多種凍干保護劑，其中所述生長激素與聚合物載體瞬時連接。
2.根據(jù)權利要求I的組合物，其特征在于所述組合物是通過冷凍干燥干燥的。
3.根據(jù)權利要求I或2的干組合物，其特征在于所述干組合物當儲存在2-25°C時穩(wěn)定至少I年。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述凍干保護劑是海藻糖。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一項的組合物，其特征在于所述組合物作為單劑量組合物提供。
6.根據(jù)權利權利要求1-4中任一項的組合物，其特征在于所述組合物作為多劑量組合物提供。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一項的組合物，其中所述rhGH聚合物前體藥物具有(A)中所示的化學結(jié)構(gòu)，
8.權利要求7的組合物，其中所述通式(K)的部分PEG—X+具有以下結(jié)構(gòu)
9.根據(jù)權利要求1-8中任一項的組合物，其特征在于其含有一種或多種其他的生物學活性劑，或者以其游離形式或者作為前體藥物，且其中一種或多種其他的生物學活性劑選自IGF-1、促生長激素釋放肽或促生長激素釋放肽樣化合物、促性腺激素釋放激素激動劑和/或類似物、生長激素釋放因子和類似物、性腺類固醇、抗雄激素類、非留類芳香酶抑制劑、HIV聯(lián)合療法、游離脂肪酸調(diào)節(jié)物、促蛋白合成類固醇、雌激素激動劑/拮抗劑、普萘洛爾、食欲抑制劑、骨質(zhì)疏松癥藥物、包括雙膦酸類化合物、骨形成劑、雌激素類、甲狀旁腺激素和選擇性受體調(diào)節(jié)劑和/或抗糖尿病藥物如胰島素、噻唑烷二酮類、磺酰脲類、腸降血糖素模擬物、美各里替尼類、雙胍類、α -葡糖苷酶抑制劑和糊精類似物。
10.根據(jù)權利要求1-9中任一項的組合物，其特征在于所述hGH聚合物前體藥物在組合物中的劑量足以在一次應用中提供用于至少3天的治療性有效量的rhGH劑量。
11.根據(jù)權利要求10的組合物，其特征在于所述hGH聚合物前體藥物的一次應用足以維持I周。
12.權利要求1-11中任一項的組合物，其中所述組合物包含一種或多種賦形劑。
13.權利要求1-12中任一項的組合物，其中所述組合物包含rhGH聚合物前體藥物1.1-92.1 %(w/w)號 白酸0.1-14.4 %(w/w)海藻糖，任選地作為二水合物 7.3_98.7%(w/w)三羥甲基氨基曱烷0.01-25.4%(w/w)。
14.權利要求1-13中任一項的組合物，其中所述組合物包含rhGH聚合物前體藥物7.8-85.5%(w/w)琥珀酸0.1-8.9%(w/w)海藻糖，任選地作為二水合物 13.6-90.3%(w/w)三羥曱基氨基曱烷0.03-15.7%(w/w).
15.權利要求1-14中任一項的組合物，其中所述組合物包含rhGH聚合物前體藥物25.3-46.5%(w/w)琥珀酸0.8-1.2%(w/w)海藻糖，任選地作為二水合物 52.4-72.8%(w/w)三羥甲基氨基曱烷0.4-2.3%(w/w)。
16.權利要求1-15中任一項的組合物，其中所述組合物的全部生長激素部分的至少30%是在位置Lysl58聚乙二醇化的。
17.包含權利要求1-16中任一項的組合物的容器。
18.根據(jù)權利要求17的容器，其特征在于所述容器是雙腔注射器。
19.權利要求18的雙腔注射器，其特征在于根據(jù)權利要求1-16中任一項的干組合物提供在所述雙腔注射器的第一個腔中，且重構(gòu)溶液在雙腔注射器的第二個腔中提供。
20.制備根據(jù)權利要求1-16中任一項的組合物的方法，包括步驟(i)將rhGH聚合物前體藥物與一種或多種凍干保護劑和任選地一種或多種賦形劑混Π， (ii)將與期望數(shù)量的劑量等同的量的步驟(i)的混合物轉(zhuǎn)移到容器的合適的腔中， (iii)干燥該混合物，并 (iv)密封該容器。
21.制備根據(jù)權利要求1-16中任一項的組合物的方法，包括步驟 (i)將rhGH聚合物前體藥物與海藻糖二水合物和琥珀酸混合，以產(chǎn)生包含 rhGH聚合物前體藥物10-300mg/ml 琥珀酸5-50mM 海藻糖二水合物25-850mg/ml 的組合物， (ii)將步驟(i)的組合物的PH用三羥甲基氨基甲烷調(diào)整到pH4.O至pH6. 5， (iii)將與期望數(shù)量的劑量等同的量的步驟(i)的混合物轉(zhuǎn)移到容器的合適的腔中， (iv)干燥該混合物，并 (v)密封該容器； 其中可以改變步驟(ii)和(iii)的順序。
22.權利要求21的方法，其中所述步驟(i)的組合物包含 rhGH聚合物前體藥物10-300mg/ml 琥珀酸5-50mM 海藻糖二水合物30-150mg/ml。
23.權利要求21或22的方法，其中所述步驟(i)的組合物包含 rhGH聚合物前體藥物10-300mg/ml 琥珀酸5-50mM 海藻糖二水合物50-100mg/ml。
24.權利要求21或23中任一項的方法，其中所述步驟(i)的組合物包含 rhGH聚合物前體藥物30-60mg/ml 琥珀酸IOmM 海藻糖二水合物70-85mg/ml。
25.權利要求21或24中任一項的方法，其中在步驟(ii)中將pH調(diào)整至pH4.5至pH5. 5。
26.根據(jù)權利要求20-25中任一項的方法，其中所述容器是雙腔注射器，第一個腔具有所述混合物，所述方法進一步包括步驟 在密封容器前用重構(gòu)溶液填充第二腔。
27.試劑盒，其包含針和含有根據(jù)權利要求1-16中任一項的組合物和任選地還含有重構(gòu)溶液的容器，所述容器適合于與針一起使用。
28.根據(jù)權利要求27的試劑盒，其特征在于所述容器是雙腔注射器。
29.制備包含治療有效量的rhGH聚合物前體藥物和一種或多種凍干保護劑的重構(gòu)組合物的方法，其中所述生長激素與聚合物載體瞬時連接，所述方法包括步驟 將權利要求1-16中任一項的組合物與重構(gòu)溶液接觸。
30.重構(gòu)組合物，其包含治療有效量的rhGH聚合物前體藥物和一種或多種凍干保護齊U，其中生長激素與聚合物載體瞬時連接，所述組合物可通過權利要求20的方法獲得。
31.權利要求30的重構(gòu)組合物，其中所述重構(gòu)組合物包含 rhGH聚合物前體藥物10-300mg/ml 琥珀酸5-50mM 海藻糖二水合物25-850mg/ml， 并具有ρΗ4· 5至ρΗ6的pH。
32.權利要求30或31的重構(gòu)組合物，其中所述重構(gòu)組合物包含 rhGH聚合物前體藥物10-300mg/ml 琥珀酸5-50mM 海藻糖二水合物30-150mg/ml， 并具有ρΗ4· 5至ρΗ6的pH。
33.權利要求30至32中任一項的重構(gòu)組合物，其中所述重構(gòu)組合物包含 rhGH聚合物前體藥物30-60mg/ml 琥珀酸IOmM 海藻糖二水合物70-85mg/ml， 并具有ρΗ4· 5至ρΗ5· 5的pH。
34.權利要求30-33中任一項的重構(gòu)組合物，其中所述重構(gòu)組合物還包含一種或多種防腐劑和/或抗微生物劑。
35.權利要求30或34的重構(gòu)組合物，其中所述重構(gòu)組合物還包含一種或多種賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有凍干保護劑和任選地一種或一種以上賦形劑的rhGH聚合物前體藥物的干組合物。此類組合物當儲存在2-8℃時穩(wěn)定至少1年。本發(fā)明還涉及制備所述組合物的方法、包含此類組合物的容器，以及試劑盒。
文檔編號A61K9/00GK102711733SQ201080057256
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權日2009年12月15日
發(fā)明者G·N·拉斯姆森, H·拉烏, S·金德曼, T·韋格 申請人:阿森迪斯藥物股份有限公司