專利名稱：疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于對(duì)抗脊髄灰質(zhì)炎病毒1、2和3型的疫苗，特別是包含減量的單價(jià)或多價(jià)形式的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原和佐劑以引發(fā)對(duì)脊髓灰質(zhì)炎的保護(hù)性免疫的疫苗的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前注冊(cè)和使用的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(IPV)是基于非減毒(Salk)脊髄灰質(zhì)炎病毒疫苗和病毒株因此它們也指野生型IPV(WtIPV)。通過(guò)肌肉(IM)或深皮下(SC)注射傳送IPV。目前IPV既可作為無(wú)佐劑的獨(dú)立制劑，也可以多種組合，包括DT-IPV(與白喉和破傷風(fēng)類毒素)和六價(jià)DTPH印B-Hib-IPV疫苗(此外還有百日咳、B型肝炎和b型流感嗜血桿菌一起)得到。根除脊髄灰質(zhì)炎病毒后未來(lái)對(duì)IPV的全球需求可由目前的毎年8 千萬(wàn)劑的水平増加到毎年4億5千萬(wàn)劑。因此，可能需要IPV “延伸”供給的方法。另外，需要評(píng)估多種使IPV的價(jià)格更易于接受的策略。當(dāng)常規(guī)疫苗的供給不足以滿足全球需求或當(dāng)制造常規(guī)疫苗的成本阻止疫苗以發(fā)展中國(guó)家可承受的價(jià)格售賣(mài)時(shí)，需要使用低劑量的IPV抗原對(duì)抗感染的減量疫苗制劑。允許將抗原用于大流行性感冒疫苗的減量疫苗是已知的(例如參見(jiàn)WO2008/128939)。水包油型乳劑本身在本領(lǐng)域已知，并被建議用作佐劑。(EP 399843; WO95/17210)。脊髄灰質(zhì)炎疫苗的目前可接受的標(biāo)準(zhǔn)劑量包含作為40単位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型(Mahoney)、8単位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型(MEF-I)和32単位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型(Saukett)的D抗原(例如Infanrix-IPV )?，F(xiàn)有的獨(dú)立IPV的制劑不含佐劑。在結(jié)合疫苗中，已報(bào)道鋁類佐劑使IPV劑量減少3至4倍，請(qǐng)參照與0PV/IPV制造商的第八次WH0/UNICEF會(huì)議和第30屆NRA，2009年10月，日內(nèi)瓦，WH0/HQ。預(yù)計(jì)該3至4倍的減少不足以延伸全球疫苗的供應(yīng)以及顯著降低制造成本。因此在現(xiàn)有技術(shù)中急需允許顯著降低劑量(多于5倍)以便增加疫苗供應(yīng)和降低制造成本的方法。這種降低將制造發(fā)展中國(guó)家可負(fù)擔(dān)的疫苗。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過(guò)將水包油型乳劑作為佐劑與滅活脊髓灰質(zhì)炎抗原結(jié)合，可使用減量的IPV來(lái)引發(fā)足夠的或改善的對(duì)抗脊髓灰質(zhì)炎的水平。該疫苗具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，包括向需要該疫苗的個(gè)體提供更多劑量的IPV疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供多種包含抗原(可只具有IPV組分或可具有與其它抗原結(jié)合的IPV組分)和水包油型乳劑的減量IPV疫苗。因此，本發(fā)明的ー個(gè)方面提供了ー種包含大于I個(gè)D抗原単位并小于10個(gè)D抗原単位的劑量的I型滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒的本發(fā)明的IPV疫苗。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了ー種包含I至7個(gè)D抗原単位間劑量的3型滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒的本發(fā)明的IPV疫苗。在另ー個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了ー種包含0. 2至2個(gè)D抗原単位間劑量的2型滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒的本發(fā)明的IPV疫苗。在又ー個(gè)方面中，本發(fā)明提供了ー種包含滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒型和水包油型乳劑的本發(fā)明的IPV疫苗。另外根據(jù)本發(fā)明，所述佐劑的使用導(dǎo)致滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原的有效劑量減 少 5、6、7、8、9 或 10 倍。本發(fā)明的所述水包油型乳劑包含可代謝油、乳化劑和可選的生育酚，如a -生育酚。定義術(shù)語(yǔ)“疫苗”可選擇被術(shù)語(yǔ)“免疫原性組合物”代替，反之亦然。“D抗原単位”(也稱作“國(guó)際單位”或IU):脊髄灰質(zhì)炎病毒的D抗原形式誘發(fā)保護(hù)性中和抗體。此處所指的D抗原單位(例如在本發(fā)明的疫苗中)為在形成最后的疫苗前每個(gè)塊狀I(lǐng)PV抗原中測(cè)得的總的D抗原単位，該疫苗被加入每人劑量的配制疫苗中(通常0. 5mL的最終體積)?？煽康臏y(cè)量D抗原單位的方法在本領(lǐng)域是已知的，并被例如歐洲藥典公開(kāi)。例如，可使用以下實(shí)施例1( “通過(guò)ELISA定量D抗原”)描述的ELISA測(cè)試來(lái)測(cè)量D抗原單位。歐洲藥典提供了用于將制造商間的這種方法標(biāo)準(zhǔn)化(Pharmeuropa Special Issue, Bio96-2)的測(cè)試樣品(歐洲藥典生物參比制劑-可購(gòu)自Ph. Eur. Secretariat,如Code P 2160000)。因此可更好地理解本領(lǐng)域中D抗原單位值。文中術(shù)語(yǔ)“劑量”通常為本發(fā)明的疫苗的一次給藥量，通常是一次注射量。通常人劑量為0. 5mL。當(dāng)然可根據(jù)疫苗給藥計(jì)劃給藥多種劑量。文中術(shù)語(yǔ)“IPV”或包含該組分的疫苗旨在表示滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型(如作為優(yōu)選使用的Mahoney,或由國(guó)立血清研究所銷(xiāo)售的名為DiTeKiPol的Brunhilde)或2型(如MEF-I)或3型(如Saukett)，或這些類型中的兩種或全部三種的組合。用于本發(fā)明目的的全(或標(biāo)準(zhǔn))劑量(1、2和3型IPV各自的40-8-32D抗原単位)的IPV疫苗的實(shí)例可為:P0iim-kK (美國(guó)葛蘭素史克生物制品)。因此，此處所說(shuō)的存在于本發(fā)明的疫苗中的IPV的標(biāo)準(zhǔn)劑量的倍數(shù)減少，是表示在所述疫苗的每個(gè)劑量中配制分別等于1、2和/或3型IPV的40、8和/或32個(gè)D抗原単位(在每個(gè)塊狀I(lǐng)PV抗原型中測(cè)得)的至少5倍的減少，且優(yōu)選10倍的減少的D抗原単位。文中術(shù)語(yǔ)來(lái)自病原體的“組分”或本發(fā)明的疫苗中的“對(duì)這種病原體提供保護(hù)的組分” g在表示來(lái)自該病原體的ー種或更多種抗原。文中術(shù)語(yǔ)“大約”或“近似地”表示對(duì)所述數(shù)值的土 10%，但應(yīng)符合上下文的使用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了包含來(lái)自脊髓灰質(zhì)炎病毒(IPV)的抗原和水包油型乳劑的疫苗。本發(fā)明的抗原可包含IPVl型或IPV2型或IPV3型，或IPVl和2型，或IPVl和3 型，或IPV2和3型，或IPV1、2和3型。
制備滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒(IPV)的方法在本領(lǐng)域是已知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，IPV應(yīng)包含疫苗領(lǐng)域中普通的1、2和3型，并可為用甲醛滅活的Salk脊髄灰質(zhì)炎疫苗(參見(jiàn)例如，Sutter 等，2000，Pediatr. Clin. North Am. 47:287; Aimmerman &Spann 1999, AmFam Physician 59:113;Salk等，1954，Official Monthly Publication of the AmericanPublic Health Association 44 (5):563;Hennesen, 1981,Develop.Biol.Standard47:139;Budowsky, 1991, Adv. Virus Res. 39:255)。脊髄灰質(zhì)炎病毒可在細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)可為VERO細(xì)胞系或來(lái)自于猴子腎臟的連續(xù)細(xì)胞系PMKC。VERO細(xì)胞可便利地在微載體上培養(yǎng)。在病毒感染之前和期間的VERO細(xì)胞的培養(yǎng)可包括牛源性材料如小牛血清的使用，且該材料應(yīng)從不具有牛腦部海綿狀病變(BSE)的來(lái)源獲得。培養(yǎng)還可包括如乳清蛋白液的材料。在生長(zhǎng)后，可使用如超濾、滲濾和色譜的技術(shù)純化病毒粒子。在向患者給藥前，必須滅活病毒，而這可通過(guò)使用甲醛處理來(lái)實(shí)現(xiàn)。病毒可各自獨(dú)立地生長(zhǎng)、純化和滅活，之后結(jié)合以提供用于IPV疫苗的濃縮塊狀 混合物。本發(fā)明疫苗中的抗體將以“免疫有效量”存在，即無(wú)論是以單ー劑量或作為一系列中的一部分向個(gè)體給藥能有效治療或防止疾病的量。劑量治療可為單ー劑量計(jì)劃或多劑量計(jì)劃(如包括激發(fā)劑量)?，F(xiàn)今，脊髄灰質(zhì)炎疫苗的標(biāo)準(zhǔn)劑量趨于包含40個(gè)D抗原単位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型、8個(gè)D抗原単位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和32個(gè)D抗原単位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒 3 型(如 Infanrix-IPV )。然而，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過(guò)將抗原與水包油型乳劑佐劑結(jié)合，可使用減量的IPV獲得良好的免疫反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的IPV疫苗劑量可包含在IPV I型的I至10個(gè)D抗原単位間。在另ー個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗劑量可近似地或精確地包含IPV I型的標(biāo)準(zhǔn)40個(gè)D抗原單位的十分之一。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗可包含少于2個(gè)D抗原単位、0. 2 2個(gè)D抗原単位(相當(dāng)于2. 5 25%的標(biāo)準(zhǔn)8個(gè)D抗原單位劑量)或大約或精確的0. 8個(gè)D抗原單位的IPV 2型(相當(dāng)于10%的標(biāo)準(zhǔn)8個(gè)D抗原單位劑量)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗可包含大于I個(gè)且小于8個(gè)D抗原単位，例如大約或精確為3. 2個(gè)D抗原単位的IPV 3型。在另ー個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗可近似地或精確地包含IPV 3型的標(biāo)準(zhǔn)32個(gè)D抗原単位的十分之一(相當(dāng)于近似3. 2個(gè)D抗原単位)。另外，根據(jù)本發(fā)明，所述佐劑的使用可導(dǎo)致IPV抗原劑量的至少10倍的減少。在另ー個(gè)方面中，提供了用于引發(fā)對(duì)人體內(nèi)脊髄灰質(zhì)炎抗原或抗原組合物的改善的體液反應(yīng)的免疫原性組合物或試劑盒的制備方法，該組合物包含(a)如文中定義的少量的脊髄灰質(zhì)炎病毒抗原或其抗原性制劑和(b)水包油型乳劑佐劑。適合的所述水包油型乳劑包含可代謝油、乳化劑和可選的生育酚，如a生育酚。在另ー個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述水包油型乳劑佐劑包含含量為總體積的0. 5%至20%的至少ー種可代謝油，并具有按強(qiáng)度計(jì)至少70%的且直徑小于I y m的油珠。在一個(gè)實(shí)施方式中，脊髓灰質(zhì)炎抗原和水包油型乳劑佐劑包含在同一容器中。這稱為“ー瓶法(One vial approach)”。在可選的實(shí)施方式中，脊髓灰質(zhì)炎抗原和水包油型乳劑佐劑包含在獨(dú)立的容器或小瓶或単元中，并在向受試者給藥前或當(dāng)時(shí)混合。這被稱作“兩瓶法(Two vials approach)”。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)該疫苗為0. 5mL的注射劑量的總劑量體積的2組分疫苗時(shí)，脊髄灰質(zhì)炎抗原可作為在ー個(gè)小瓶中(500 yl)(抗原容器，如小瓶)分別含有近似40-8-32個(gè)D抗原単位的IPV 1、2和3型的標(biāo)準(zhǔn)脊髓灰質(zhì)炎疫苗存在，而另ー個(gè)小瓶包含佐劑(4500 ill)。將抗原容器中的內(nèi)含物與佐劑容器中的內(nèi)含物混合。典型地，脊髓灰質(zhì)炎疫苗為0. 5mL的注射劑量，而在第一個(gè)受試者之前多劑量小瓶含有1:10的小瓶混合物。水包油型乳劑佐劑
本發(fā)明的佐劑組合物包含水包油型乳劑佐劑，適合的所述乳劑包含含量為總體積的0. 5%至20%的可代謝油，并具有按強(qiáng)度計(jì)至少70%且小于I ii m直徑的油珠。為了使任何水包油型組合物適宜用于人類給藥，乳劑體系的油相必須包含可代謝油。該油可為任何對(duì)對(duì)接受者無(wú)毒且能夠通過(guò)新陳代謝轉(zhuǎn)化的植物油、魚(yú)油、動(dòng)物油或合成油。堅(jiān)果、種子和谷物為植物油的普遍來(lái)源。合成油也是本發(fā)明的一部分，并可包括可商購(gòu)油，如NEOBEE 及其它。特別適合的可代謝油為鯊烯。鯊烯(2,6, 10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是ー種在鯊魚(yú)肝油中被大量發(fā)現(xiàn)并在橄欖油、麥胚油、米糠油和酵母中被少量發(fā)現(xiàn)的不飽和油，并且是一種特別適用于本發(fā)明的油。鯊烯是ー種可代謝油，是由于它是膽固醇的生物合成中的中間體的事實(shí)(Merck index,第十版,索引號(hào)8619)。水包油型乳劑本身在本領(lǐng)域是已知的，并被認(rèn)為有效作為佐劑組合物(EP399843;W0 95/17210)?？纱x油的適合含量為免疫原性組合物總體積的0. 5%至20%(最終濃度)，適合含量為總體積的I. 0%至10%，適合含量為總體積的2. 0%至6. 0%。在具體實(shí)施方式
中，可代謝油的最終含量為免疫原性組合物總體積的約0. 5%、1%、
3.5%或5%。在另ー個(gè)具體實(shí)施方式
中，可代謝油的最終含量為免疫原性組合物的總體積的
0.5%、1%、3. 57%或5%。鯊烯的適合含量為每疫苗劑量的約10. 7mg，適合為每疫苗劑量10. 4至 11. Omg。本發(fā)明適合的水包油型乳劑體系具有在亞微米范圍內(nèi)的小油珠尺寸。適合的油珠尺寸將在120至750nm的直徑范圍內(nèi)、適宜尺寸在120至600nm的直徑范圍內(nèi)。通常水包油型乳劑含有按強(qiáng)度計(jì)至少70%的且直徑小于500nm的油珠，具體地是按強(qiáng)度劑至少80%且直徑小于300nm，適合的按強(qiáng)度計(jì)至少90%且直徑在120至200nm的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明通過(guò)強(qiáng)度表示的油珠尺寸即直徑。有幾種通過(guò)強(qiáng)度測(cè)定油珠尺寸直徑的方法。通過(guò)使用尺寸測(cè)量?jī)x器(sizing instrument),適合通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射如MalvernZetasizer 4000或適合的Marvern Zetasizer 3000HS測(cè)量強(qiáng)度。詳細(xì)過(guò)程在實(shí)施例II. 2中給出。第一個(gè)可能性是通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(PCS-光子相關(guān)光譜)確定z平均直徑ZAD ;該方法還另外給出多分散指數(shù)(PDI)，并使用累積量算法計(jì)算ZAD和roi。這些數(shù)值不需要知道顆粒的折射率。第二種途徑是通過(guò)使用另ー種算法，Contin,或NNLS,或自動(dòng)“Malvern”算法(由尺寸測(cè)量?jī)x器提供的默認(rèn)算法)確定整個(gè)粒徑分布來(lái)計(jì)算油珠的直徑。大多數(shù)時(shí)候，由于復(fù)雜組合物的顆粒折射率未知，只考慮強(qiáng)度分布，且如果必要的話考慮由該分布得來(lái)的平均強(qiáng)度。根據(jù)本發(fā)明的水包油型乳劑包含生育酚，如a -生育酚。存在適合的a生育酚或其衍生物如a生育酚琥珀酸酷。適合的a生育酚的含量為免疫原性組合物的總體積的0. 2%至5. 0%(v/v)間，適合含量為0. 5ml的疫苗劑量體積的2. 5%(v/v)，或0. 5ml的疫苗劑量體積的0. 5%(v/v)或0. 7ml疫苗劑量體積的I. 7 1.9%(v/v)，適合為1.8%。通過(guò)說(shuō)明，可通過(guò)使用以下轉(zhuǎn)換因子將以v/v給出的濃度轉(zhuǎn)換為w/v的濃度5%(v/v)的a生育酚濃度等于4. 8% (w/v)的a-生育酚濃度。適合的a生育酚的含量為每疫苗劑量約11. 9mg，適合為每疫苗劑量11. 6至12. 2mg。水包油型乳劑包含乳化剤。該乳化劑的含量可為免疫原性組合物的0.01至
5.0wt%(w/w),適合含量為0. I至2. 0wt%(w/w)。適合的濃度為總組合物的0. 5至I. 5wt%。乳化劑可適合為聚氧こ烯失水山梨醇單油酸酯(Tween 80)。在具體實(shí)施方式
中，
0.5ml的疫苗劑量體積含有l(wèi)%(w/w)的Tween 80，而0. 7ml的疫苗劑量體積含有0. 7%(w/w)的Tween 80。在另ー個(gè)具體實(shí)施方式
中，Tween 80的濃度為0. 2%(w/w)。聚山梨醇酯80的適合含量為每疫苗劑量約4. 9mg，適合為每疫苗劑量的4. 6至5. 2mg。適合的疫苗劑量包含每疫苗劑量約11. 9mg含量的a生育酚，每疫苗劑量10. 7mg含量的鯊烯，和每疫苗劑量約4. 9mg含量的聚山梨醇酯80。水包油型乳劑佐劑可與其它佐劑或免疫增強(qiáng)劑一起使用，因此本發(fā)明的重要實(shí)施方式為包含鯊烯或另ー種可代謝油、生育酚如a生育酚和Tween 80的水包油型制劑。該水包油型乳劑還可含有span 85和/或卵磷脂。通常，水包油包含免疫原性組合物總體積的2至10%的鯊烯、2至10%的a生育酚和0. 3至3%的Tween 80，并可根據(jù)WO 95/17210中所述方法制備。適合的鯊烯a生育酚的比例等于或小于1，因?yàn)檫@樣提供了更穩(wěn)定的乳劑。也可存在Span85(聚氧こ烯失水山梨醇三油酸酯)，例如以1%的水平。本發(fā)明的疫苗可包含含有脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原或由選自由脊髓灰質(zhì)炎病毒I型、2型和3型組成的組中的至少ー種滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒類型制得的抗原性制劑的單價(jià)組合物。本發(fā)明中的疫苗可包含含有脊髄灰質(zhì)炎病毒D抗原或由至少2種或至少3種滅活脊髄灰質(zhì)炎病毒類型制備的抗原性制劑的多價(jià)組合物。所述多價(jià)組合物可選自由a)作為8個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型，I. 6個(gè)単元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和6. 4個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型的D抗原；b)作為6. 6個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型，I. 3個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和5. 3個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型的D抗原；c)作為5. 7個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型，I. I個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和4. 5個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型的D抗原；d)作為5個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型，I個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和4個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型的D抗原；e)作為4. 4個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型，0. 88個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和3. 5個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型的D抗原；或f)作為4個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型，0. 8個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和3. 2個(gè)單元的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型的D抗原組成的組中。除了上述抗原和佐劑組分，本發(fā)明的疫苗通常還包含一種或多種“藥學(xué)可接受的載體或賦形劑”，包括自身不引發(fā)對(duì)接受該組合物的個(gè)體有害的抗體的產(chǎn)生的任何賦形劑。適合的賦形劑通常為大的、代謝慢的大分子，如蛋白質(zhì)、糖類、聚乳酸、聚こ醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、鹿糖(Paoletti 等,2001，Vaccine, 19:2118)、海藻糖(W0 00/56365)、乳糖和脂類聚集物(如油珠或脂質(zhì)體)。這種載體對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。該疫苗還可含有稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。另外，可存在輔助物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑或乳化剤、pH緩沖物質(zhì)等。無(wú)菌無(wú)熱原的磷酸鹽緩沖生理鹽水是典型的載體。對(duì)藥學(xué)可接受的賦形劑的詳細(xì)描述可參見(jiàn) Gennaro, 2000, Remington:科學(xué)和藥學(xué)實(shí)踐，第 20 版，ISBN:0683306472。組合物可存在于小瓶中，或它們可存在于準(zhǔn)備填充的注射器中。該注射器可具有 或不具有針頭。注射器會(huì)包含單劑量的組合物，而小瓶可包括單劑量或多劑量(如2劑量)。在一個(gè)實(shí)施方式中該劑量是用于人類。在又一個(gè)實(shí)施方式中該劑量是用于成人、青少年、兒童、嬰兒或小于ー歲的人類并可通過(guò)注射給藥。本發(fā)明的疫苗可以單位劑量形式或多劑量形式(如2劑量)包裝。所述多劑量組合物可選自由2劑量、5劑量和10劑量組成的組中。對(duì)多劑量形式來(lái)說(shuō)，小瓶?jī)?yōu)選于預(yù)填充注射器?？砂闯Ｒ?guī)建立有效劑量體積，但用于注射的該組合物的典型人劑量具有0. 5mL的體積。本發(fā)明的組合物對(duì)人類來(lái)說(shuō)是等滲的。本發(fā)明的疫苗可包括抗菌劑，特別是當(dāng)以多劑量形式包裝吋。應(yīng)避免硫柳汞，因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致IPV組分效カ的喪失?？墒褂闷渌咕RIJ，如2-苯氧基こ醇或苯甲酸酯(苯甲酸甲酷、こ酷、丙酷)。任何防腐劑都優(yōu)選以低水平存在。防腐劑可另外添加和/或?yàn)榛旌弦孕纬山M合物的塊狀抗原的組分(如作為百日咳抗原的防腐劑存在)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗不含硫柳汞或基本不含硫柳汞?！安缓蛄被颉盎静缓蛄笔侵冈谧罱K制劑中不存在足夠的以負(fù)面地影響IPV組分的效カ的硫柳汞。本發(fā)明的疫苗可包含清潔劑，如Tween(聚山梨醇酷)，如Tween 80。清潔劑通常以低水平存在，如〈O. 01%。本發(fā)明的疫苗可包括鈉鹽(如氯化鈉)以提供滲透壓。該組合物可包含氯化鈉。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物中氯化鈉的濃度在0. I至100mg/mL的范圍內(nèi)(如I 50mg/mL,2 20mg/mL,5 15mg/mL),且在又一個(gè)實(shí)施方式中，氯化鈉的濃度為10±2mg/mL NaCl,如約 9mg/mL。本發(fā)明的疫苗通常包括緩沖液。典型的是磷酸鹽、檸檬酸鹽或組氨酸緩沖液。本發(fā)明的疫苗可在溶液中包括游離的磷酸根離子(如通過(guò)使用磷酸鹽緩沖液)以防止促進(jìn)抗原的不吸收。本發(fā)明組合物中游離磷酸根離子的濃度在一個(gè)實(shí)施方式中為0. I至10. OmM間，或在另ー個(gè)實(shí)施方式中為I至5mM間，或在又一個(gè)實(shí)施方式中為約2. 5mM。通過(guò)對(duì)大鼠的血清中和試驗(yàn)測(cè)得的脊髄灰質(zhì)炎效力為了本發(fā)明的目的，應(yīng)使用單劑量疫苗并通過(guò)確定測(cè)試疫苗的幾何平均滴度(GMT)與對(duì)照疫苗的GMT的比值對(duì)本發(fā)明的含IPV的疫苗進(jìn)行疫苗效力的IPV定量評(píng)估的分析，并以相對(duì)響應(yīng)(RR)或相對(duì)效カ(RP)表示。對(duì)照GMT可為使用任何分別含40-8-32個(gè)D抗原單位的IPV 1_2_3型的任意IPV疫苗獲得的GMT，并可為通過(guò)已知疫苗;p0li0rix 獲得的GMT。通常，如下進(jìn)行RP測(cè)試通過(guò)血清中和試驗(yàn)確定脊髓灰質(zhì)炎病毒1、2和3型對(duì)大鼠的效カ對(duì)10組健康大鼠(Sprague-Dawley(OFA)或任何預(yù)先驗(yàn)證的種)肌肉注射測(cè)試樣品或?qū)φ詹牧显诹姿猁}緩沖鹽水中的稀釋液(1/1. 25; 1/3. 125; 1/7. 81)。如果必要，可通過(guò)注射未稀釋疫苗和三種上述稀釋液將稀釋范圍擴(kuò)大到4種稀釋液。將注射稀釋液的十只大鼠作為陰性對(duì)照。每周觀察一次大鼠以檢測(cè)任何異常反應(yīng)。在注射后20至22天后，對(duì)大鼠深度麻醉并放血，收集血清以通過(guò)血清中和測(cè)試進(jìn)行分析。對(duì)血清中和測(cè)試來(lái)說(shuō)，通過(guò)在56°C下在水浴中溫育30分鐘對(duì)血清滅活。使用合適的稀釋介質(zhì)在微孔板中制備血清的三種稀釋系列，每種脊髄灰質(zhì)炎類型為ー種。在+4°C下儲(chǔ)存微孔板。對(duì)三種脊髄灰質(zhì)炎病毒類型，將預(yù)定含量的病毒(30-300 CCID50)加入血清稀釋液中。根據(jù)它們各自的滴度稀釋該三種病毒懸浮液。將最終稀釋液稱作“有效稀釋液”。將每種有效稀釋液加入相應(yīng)的微孔板中。之后將板密封并在370C ±1°C下溫育16小時(shí)，之后加入H印-2細(xì)胞并將微孔板在37°C ±1°C下溫育7天。在考馬斯亮藍(lán)染色后使用倒置顯微鏡讀取病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。抗脊髓灰質(zhì)炎抗體的 存在抑制了病毒的生長(zhǎng)和相應(yīng)的CPE的出現(xiàn)?？辜顾杌屹|(zhì)炎病毒滴度(1、2和3型)對(duì)應(yīng)于不具有任何CPE的最后稀釋液的滴度。在每組中，記錄具有中和抗體的動(dòng)物并確定每個(gè)血清樣品中不同類型的脊髄灰質(zhì)炎病毒的抗體滴度。以完全抑制脊髄灰質(zhì)炎病毒在H印-2細(xì)胞中的細(xì)胞病變效應(yīng)的血清樣品的最高稀釋度的倒數(shù)的log2表示中和抗體滴度。同樣確定每組大鼠的每個(gè)稀釋度和每個(gè)病毒類型的幾何平均滴度(GMT)。本發(fā)明的疫苗的包裝可使用多種類型的容器包裝本發(fā)明的疫苗，如小瓶、注射器等。多劑量小瓶通常包含可再封的塑料ロ，通過(guò)該塑料ロ可插入無(wú)菌針頭以帶走ー劑量的疫苗，當(dāng)移除針頭后將塑料ロ再次密封?？稍诙喾N容器(如2或3種)中提供疫苗?？稍谝詥未巫⑸湎蛑黧w給藥前現(xiàn)場(chǎng)混合容器內(nèi)含物，或在不同位點(diǎn)伴隨給藥。疫苗的劑量，或如果試劑盒伴隨給藥(在兩個(gè)或更多容器中)每種疫苗的劑量通常為0. 5mL。本發(fā)明疫苗的給藥本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)的方法，包含給藥有效含量的本發(fā)明疫苗的步驟。可預(yù)防性地給藥該疫苗(即防止感染)。免疫反應(yīng)優(yōu)選是保護(hù)性的并優(yōu)選包含抗體。該方法可能引發(fā)升壓反應(yīng)。在初次接種后，可對(duì)受試者進(jìn)行一次或幾次具有充分間隔的加強(qiáng)(隨后的)接種。劑量治療可為單劑量計(jì)劃或多劑量計(jì)劃。多劑量可用在主要接種計(jì)劃和/或加強(qiáng)接種計(jì)劃中?？稍诳赡苡幸荒晷Д闹饕?jiǎng)┝坑?jì)劃后進(jìn)行加強(qiáng)劑量計(jì)劃。適合的啟動(dòng)劑量間的時(shí)間(如在4-16周之間)和啟動(dòng)與加強(qiáng)間的時(shí)間可按常規(guī)確定。在一個(gè)實(shí)施方式中，該哺乳動(dòng)物為人類。當(dāng)該疫苗用于預(yù)防時(shí)，該人類優(yōu)選為兒童(如幼童或嬰兒)或青少年；當(dāng)該疫苗用于治療吋，該人類優(yōu)選為成人。_在用于兒童的疫苗也可用于成人，例如來(lái)確定安全、劑量、免疫原性等。可使用本發(fā)明的疫苗制劑通過(guò)將所述疫苗直接給藥于患者來(lái)保護(hù)或治療易于感染的哺乳動(dòng)物。可通過(guò)非消化道給藥(肌肉、腹腔、皮內(nèi)、皮下、靜脈或組織間的空間)；或通過(guò)直腸、口腔、陰道、局部、透皮、鼻腔、眼鏡、肺或其它粘膜給藥來(lái)完成直接給藥。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)肌肉注射向大腿或上臂給藥?？赏ㄟ^(guò)針頭進(jìn)行注射(如注射針)，但也可選地使用無(wú)針注射。典型的肌肉注射劑量為0.5mL。細(xì)菌感染影響人體的多個(gè)部位，因此可本發(fā)明的組合物可以多種形式制備。例如，該組合物可被制成可注射的液體溶液或懸浮液。可制備該組合物以用于使用細(xì)粉或噴霧的肺部給藥，如吸入器。該組合物可被制成栓劑或藥拴。可制備該組合物以用于鼻腔、耳部或眼部給藥，如作為噴霧、液滴、膠體或粉末(參見(jiàn)如 Almeida & Alpar, 1996, J Drug Targeting, 3:455;Bergquist等，1998,APMIS, 106:800)。已報(bào)道DTP疫苗的成功德鼻腔給藥(Ryan等，1999，Infect.Immun. , 67:6270;Nagai et al. , 2001, Vaccine, 19:4824)。在一個(gè)實(shí)施方式中，同時(shí)將第一和第二(以及適當(dāng)?shù)牡谌?容器中的疫苗在不同部位給藥，而在可選的實(shí)施方式中本發(fā)明人設(shè)想在作為單ー疫苗給藥前將第一和第二容器中的內(nèi)含物混合(可選地現(xiàn)場(chǎng)混合)。本發(fā)明可用于引發(fā)系統(tǒng)和/或粘膜免疫。所有引用的參考和出版物通過(guò)引用合并于此。實(shí)施例
僅為了說(shuō)明的目的提供實(shí)施例，而不旨在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :制備水包油型乳劑并將該乳劑與IPV疫苗結(jié)合的方法根據(jù)文件[Ott等，The adjuvant MF59:a 10-year perspective. In-vaccineadjuvants:preparation methods and research protocols. Methoas in Molecularmedicine, vol 42, chapter 12，p211_228. Edited by D. T. 0，Hagan (2000)]中描述的方法制備水包油型乳剤。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將9. 75g鯊烯(Sigma，來(lái)自鯊魚(yú)肝臟)與I. 175g失水山梨醇三油酸酯混合。單獨(dú)將I. 175g聚山梨醇酯80與240ml的IOmM pH 6. 5的檸檬酸鹽緩沖液混合,之后加入鯊烯-失水山梨醇三油酸酯溶液中。使用臺(tái)式均質(zhì)機(jī)(Silverson)將該混合物進(jìn)一步均質(zhì)化I分鐘。之后立刻使用Microfluidics M110H微射流機(jī)(Microfluidics,MA, USA)對(duì)該材料進(jìn)行五通道的高壓微射流。使用馬爾文激光粒度儀驗(yàn)證了油珠的尺寸小于150nm。對(duì)所得乳劑進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾并在2 8°C下儲(chǔ)存。使用PBS將I瓶(I人劑量)IPV (NVI,荷蘭)稀釋五倍，之后向其中加入等量體積的乳劑，得到該疫苗的總共10倍稀釋液。實(shí)施例2 大鼠的免疫和免疫原性的評(píng)價(jià)使用0. Iml的A)全強(qiáng)度的IPV ；B)使用PBS稀釋10倍的IPV和C)使用上述乳劑稀釋10倍的IPV肌肉注射兩次(第0和28天)使大鼠(n=5)免疫。在第42天時(shí)收集血清并對(duì)IPV疫苗中的所有三種進(jìn)行脊髓灰質(zhì)炎病毒中和滴度的評(píng)價(jià)。病毒中和的幾何平均滴度如下表所示表I幾何平均滴度(N=5)_組__I型__2型__3型_
_IPV 滿則量__ 1024 (1.55)__ 1824 (1.685)__1024 (I 55) 一 —IPV 1/10 劑量__ 32 (1.55)__45.254 (1.78)__57.01 (1.976) _
IPV 1/10劑量加水
2048 (1.55)22 98.86 (1.685) 2298.80 (1.685)
—包油型乳劑__—__—__——(括號(hào)內(nèi)數(shù)值表示幾何平均偏差)這說(shuō)明當(dāng)與水包油型乳劑組合吋，1/10劑量的IPV疫苗引發(fā)的免疫反應(yīng)至少與不含佐劑的滿劑量疫苗引發(fā)的一祥有效。因此向IPV疫苗中加入佐劑允許疫苗劑量的減少并允許使用更低劑量的抗原接種。
權(quán)利要求
1.一種用于引發(fā)對(duì)脊髓灰質(zhì)炎抗原的改善的體液免疫反應(yīng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含a)少量的脊髄灰質(zhì)炎病毒抗原或抗原性制劑和b)水包油型乳劑佐劑。
2.如權(quán)利要求I所述的免疫原性組合物,其中所述水包油型乳劑包含可代謝油。
3.如權(quán)利要求3所述的免疫原性組合物，其中所述可代謝油為鯊烯。
4.如權(quán)利要求I或3所述的免疫原性組合物，其中所述可代謝油以每人劑量0.5 10、0.5 9、1 10、2 10、4 8、1 2、2 3、4.5 5.5、5 6或9 10或10 Ilmg 的含量存在。(在生育酚中的其它組合物)
5.如權(quán)利要求I所述的免疫原性組合物，其中所述乳化劑為非離子型表面活性剤。
6.如權(quán)利要求5所述的免疫原性組合物，其中所述乳化劑為聚氧こ烯失水山梨醇單油酸酯或失水山梨醇三油酸酯或兩者的混合物。
7.如權(quán)利要求6所述的免疫原性組合物，其中所述聚氧こ烯失水山梨醇單油酸酯選自由聚山梨醇酯80或Tween 80組成的組中，且所述失水山梨醇三油酸酯為Span85。
8.如權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中所述乳化劑以每人劑量0. I 5、0.2 5、0.3 5、0.4 5、0.4 1.2、0. 5 4、I 2、2 3 或4 5. 5mg 的含量存在。
9.如權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑還包含母育酚。
10.如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其中所述母育酚為a生育酚。
11.如權(quán)利要求或權(quán)利要求10所述的免疫原性組合物，其中所述母育酚以每人劑量0. 5 12、1 11、2 10、4 9、5 6、5 7、2. 5 3. 5、1 2、I 3 或 10 11 或ll-12mg的含量存在。
12.如權(quán)利要求I 11所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑選自由 i)當(dāng)存在每人劑量的11.5 12. 5mg母育酚時(shí)，每人劑量的10 Ilmg可代謝油、4.5 5. 5mg乳化劑， ii)當(dāng)存在每人劑量的11.6 12. 2mg母育酚時(shí)，每人劑量的10. 5 Ilmg可代謝油、4.6 5. 2mg乳化劑 組成的組中。
13.如權(quán)利要求I至12所述的免疫原性組合物，其中所述組合物為包含脊髄灰質(zhì)炎病毒D抗原或由選自由脊髄灰質(zhì)炎病毒I型、2型和3型組成的組中的至少ー種滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒類型制得的抗原性制劑的單價(jià)組合物。
14.如權(quán)利要求I至12所述的免疫原性組合物，其中所述組合物為包含脊髄灰質(zhì)炎病毒D抗原或由至少2種或至少3種滅活脊髄灰質(zhì)炎病毒類型制備的抗原性制劑的多價(jià)組合物。
15.如權(quán)利要求14所述的IPV劑量減少的組合物，其中所述多價(jià)組合物的劑量選自由以下組成的組中 i)作為8個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型、I.6個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和6. 4個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型的D抗原， ii)作為6.6個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型、I. 3個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和5. 3個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型的D抗原， iii)作為5.7個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型、I. I個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和4. 5個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型的D抗原， iv)作為5個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型、I個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和4個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型的D抗原， V)作為4. 4個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型、0. 88個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和3. 5個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型的D抗原， vi)作為4個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒I型、0. 8個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和3. 2個(gè)單位的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒3型的D抗原。
16.一種疫苗試劑盒，所述疫苗試劑盒包含如任一前述權(quán)利要求中限定的脊髄灰質(zhì)炎病毒D抗原組分或抗原性制劑，所述試劑盒包含(a)如文中所述的少量的脊髄灰質(zhì)炎病毒抗原或其抗原性制劑和(b)水包油型乳劑佐劑。
17.如任一前述權(quán)利要求所述的免疫原性組合物,其中所述人劑量選自0.5ml或更少，0. 5至I. 5ml間，0. 2至I. 2ml間，0. 2至0. 7ml間和精確的0. 25或0. 5或0. 7或Iml或更少。
18.如任一前述權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中所述脊髓灰質(zhì)炎抗原和所述水包油型乳劑佐劑包含在同一容器中。
19.如任一前述權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中所述脊髓灰質(zhì)炎抗原和所述水包油型乳劑佐劑包含在獨(dú)立容器或小瓶或單元中并在向受試者給藥前或當(dāng)時(shí)混合。
20.如任一前述權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其特征為所述組合物為單劑量或多劑量。
21.如權(quán)利要求20所述的免疫原性組合物，其特征為所述多劑量組合物選自由2劑量、5劑量和10劑量組成的組中。
22.如任一前述權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原的有效劑量減少至少5倍。
23.如權(quán)利要求22所述的免疫原性組合物，其中滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原的有效劑量?jī)?yōu)選減少10倍。
全文摘要
本申請(qǐng)?zhí)峁┝烁咝詢r(jià)比的免疫原性IPV制劑。所述制劑含有可減少5至10倍劑量的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的佐劑。
文檔編號(hào)A61K39/13GK102655879SQ201080057152
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者加伊羅拉·蘇尼·賈格迪什普拉薩德, 賈達(dá)夫·謝瑞克·薩卡拉姆, 高塔姆·瑪尼西·馬赫什庫(kù)馬 申請(qǐng)人:印度血清研究所