專利名稱：疫苗組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及革蘭氏陰性細菌疫苗組合物，其制備以及此組合物在藥物中的應用。更具體的，本發(fā)明涉及新的外膜小泡(或囊泡)疫苗領域，以及賦予這些疫苗更有效和安全的有益方法。
背景技術：
革蘭氏陰性細菌通過兩個連續(xù)的膜結構層與外部介質分隔。這些結構是指細胞質膜和外膜(OM)，二者的結構和功能均有區(qū)別。外膜在病原菌和其宿主的相互作用中起到重要的作用。所以，表面暴露的細菌的分子是宿主免疫應答的重要靶點，使得外膜組分有望用來提供疫苗、診斷和治療劑。
全細胞細菌疫苗(滅活或減毒的)具有在其自然微環(huán)境中提供多重抗原的優(yōu)點。此方法的缺點為由細菌組分例如內毒素和肽聚糖片段誘導產生的副作用。另一方面，含有純化的來自外膜的組分的無細胞亞單位疫苗僅提供有限的保護且不提供對宿主免疫系統(tǒng)的適當的抗原。
蛋白，磷脂和脂多糖為所有革蘭氏陰性菌的外膜中的發(fā)現的三種主要的成分。這三種成分不對稱分布膜磷脂(大部分在內部小葉)，脂肪寡糖(只存在于外部小葉)以及蛋白(內部和外部小葉脂蛋白，整合或多中心膜蛋白)。對于很多種影響人類健康的細菌病原體而言，脂多糖以及外層膜蛋白表現免疫原性并且能夠通過免疫預防相應的疾病。
革蘭氏陰性細菌OM是動態(tài)可變的且，根據環(huán)境條件的不同進行劇烈的形態(tài)變化。在這些變化中，外層膜泡或稱作″囊泡″的形成已被深入研究并且很多革蘭氏陰性細菌都有這樣的記載(Zhou，L et al.1998.FEMS Microbiol.Lett.163223-228)。在這些記載中，據報道產生囊泡的細菌病原體的不完全記載包括百日咳博德特氏桿菌(Bordetella pertussis)，布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)，袋鼠疏螺旋體(Borrelia melitensis)，綿羊布魯氏菌(Brucella ovis)，鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)，砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)，大腸桿菌(Escherichia coli)，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)，嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)，腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)。雖然產生OM膜泡的生化機制尚不完全明了，但是這些外層膜泡已被廣泛的研究因為它們提供了一種有力的方法從其天然生物體中提取外層膜蛋白制備物。在上下文中，外層膜蛋白制備物的應用的目標在于開發(fā)疫苗抗奈瑟氏菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血桿菌，銅綠假單胞菌和衣原體。此外，外層膜囊泡結合復合蛋白以及其可能賦予抗種內變種的延展保護性的非蛋白抗原。
與其它更廣泛的被應用的細菌疫苗的類型(完整的細胞細菌和純化的亞單位疫苗)相比較，發(fā)明人表明了外層膜囊泡疫苗(如以特定的方式修飾)可以為理想的方式。
細菌亞單位疫苗的廣泛應用使得研究集中在已被發(fā)現對疫苗應用有用的細菌表面蛋白上[例如百日咳博德特氏桿菌pertactin]。這些蛋白與細菌外膜松散結合且可被純化自培養(yǎng)基上清液或很容易的提取自細菌細胞。然而，也顯示結構的，整合的外膜蛋白也是保護性的抗原。腦膜炎奈瑟氏菌血清型B的例子為PorA；流感嗜血桿菌的例子為D15；粘膜炎莫拉氏菌的例子為OMP CD；銅綠假單胞菌的例子為OMP F。然而這些蛋白具有顯著的特異性結構特征，特定的復合兩親β-折疊，使得其直接被用作純化的(重組的)亞單位疫苗復雜化。
此外，很顯然需要復合成分的疫苗(依據細菌表面蛋白和整合的膜蛋白)以提供適當的的保護水平。例如，如為百日咳博德特氏桿菌亞單位疫苗，復合疫苗優(yōu)于單成分或二成分疫苗。
為了將整合的外層膜蛋白結合到此種亞單位產物中，蛋白的天然(或接近天然的)構象折疊必須存在于產物中來產生有用的免疫學作用。分泌的外層膜小泡或囊泡的用途可為較好的解決包括保護性的整合膜蛋白到亞單位疫苗同時確保其適當地折疊問題的方法。
腦膜炎奈瑟氏菌血清型B(menB)分泌足夠量的外層膜皰來滿足其工業(yè)化規(guī)模的生產。這種來自自然產生的menB菌株的多成分外膜蛋白疫苗已被發(fā)現有效的保護患menB疾病的十幾歲的少年且已在拉丁美洲注冊。可選擇的制備外膜蛋白小泡的方法是通過細菌細胞的表面活性劑提取法(EP 11243)。
可由其制備囊泡疫苗的細菌的種類如下。
腦膜炎奈瑟氏菌腦膜炎奈瑟氏菌是一種革蘭氏陰性菌，經常分離自人上呼吸道。其通常引起侵染性細菌病例如菌血癥和腦膜炎。腦膜炎球菌疾病的發(fā)生率顯示地域季節(jié)性以及每年之間的差異(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.；Clin.Microbiol.Rev.2(增刊)，S18-S24，1989).。大多數溫帶國家的疾病取決于血清型B菌株且發(fā)生率在1-10/100,000/年總人口之間變化，有時達到較高的值(Kaczmarski，E.B.(1997)，Commun.Dis.Rep.Rev.7R55-9，1995；Scholten，R.J.P.M.，Bijlmer，H.A.，Poolman，J.T.et al.Clin.Infect.Dis.16237-246，1993；Cruz，C.，Pavez，G.，Aguilar，E.，et al.Epidemiol.Infect.105119-126，1990)。嬰兒和十幾歲的少年兩個高危人群的年齡特異性的發(fā)生率達到較高的水平。
血清型A腦膜炎球菌引起的傳染病主要發(fā)生在中非，有時高達1000/100,000/年(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.Clin.Microbiol.Rev.2(增刊)，S18-S24，1989)。幾乎所有的腦膜炎球菌性疾病由血清型A，B，C，W-135和Y粘膜炎球菌引起。一種四價的A，C，W-135，Y莢膜多糖疫苗可以被獲得(Armand，J.，Arminjon，F.，Mynard，M.C.，Lafaix，C.，J.Biol.Stand.10335-339，1982)。
目前，多糖疫苗通常通過化學結合其到載體蛋白上的方式被改進(Lieberman，J.M.，Chiu，S.S.，Wong，V.K.，et al.JAMA 2751499-1503，1996)。一種血清型B疫苗沒有被采用，因為B莢膜多糖是非免疫原性的，最可能是因為其與宿主成分具有結構相似性(Wyle，F.A.，Artenstein，M.S.，Brandt，M.L.et al.J.Infect.Dis.126514-522，1972；Finne，J.M.，Leinonen，M.，Makela，P.M.Lancet ii.355-357，1983)。
很多年來，努力開發(fā)基于腦膜炎球菌外膜的疫苗已成為人們的焦點(de Moraes，J.C.，Perkins，B.，Camargo，M.C.et al.Lancet 3401074-1078，1992；Bjune，G.，Hoiby，E.A.Gronnesby，J.K.et al.3381093-1096，1991)。此種疫苗在年齡較大的小孩(＞4歲)和青少年中具有57％-85％的效果。大多數的這些效果試驗用獲自野生型的腦膜炎奈瑟氏菌B菌株的OMV(外膜小泡，通過從囊泡缺失LPS來獲得)來進行。
很多細菌外膜成分存在于這些疫苗中，例如PorA，PorB，Rmp，Opc，Opa，FrpB且這些所觀察到的保護性的成分的作用仍需要進一步的明確。其他的細菌外膜成分已被明確(通過動物或人抗體)為可能與誘導保護性免疫有關，例如TbpB，NspA(Martin，D.，Cadieux，N.，Hamel，J.，Brodeux，B.R.，J.Exp.Med.1851173-1183，1997；Lissolo，L.，Maitre-Wilmotte，C.，Dumas，p.et al.，Inf.Immun.63884890，1995)。保護性免疫的機制包括抗體介導的殺菌活性和調理吞噬。
腦膜炎奈瑟氏菌感染的頻率在過去的幾十年間突然地增加。此取決于復合抗生素抗性菌株的出現，和增加的取決于增加的社會活動的暴露(例如游泳池或電影院)。因為分離對一些或所有的標準抗生素有抗性的腦膜炎奈瑟氏菌菌株已不再罕見。這種現象產生對新的抗微生物藥物，疫苗，藥物篩選方法，以及此種微生物的診斷方法的尚待滿足的需求。
粘膜炎莫拉氏菌粘膜炎莫拉氏菌(也稱為粘膜炎布蘭漢氏菌)是一種革蘭氏陰性菌，通常分離自人上呼吸道。其是引起一些病癥的原因，主要的一種是嬰兒和小孩的中耳炎，以及成年人的肺炎。其也引起鼻竇炎，醫(yī)院內感染以及，偶爾引起侵入性疾病。
殺菌抗體已在大多數檢驗無病的成人中被鑒定(Chapman，AJ et al.(1985)J.Infect.Dis.151878)。粘膜炎莫拉氏菌菌株抗血清殺菌活性的能力各異通常，分離自患病個體的比單純定居的更具抗性(Hol，C et al.(1993)Lancet 3411281，Jordan，KL et al.(1990)Am.J.Med.88(suppl.5A)28S)。血清抗性因此被認為是細菌的毒性因子。調理活性已在患過中耳炎恢復的小孩的血清中被觀察到。
這些作為人體中不同的免疫應答的靶的抗原除了84kDa蛋白OMPB1尚未被鑒定，OMP B1的表達被鐵調控，且被肺炎患者(Sethi，S，et al.(1995)Infect.Immun.631516)，UspA1和UspA2患者(Chen D.et al.(1999)，Infect.Immun.671310)的血清識別。
其它的一些存在于粘膜炎莫拉氏菌表面的膜蛋白已被通過生化方法檢測其在誘導保護性免疫中的可能性(參見Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60267)。在一個小鼠肺炎模型中，產生抵抗肺炎(UspA，CopB)的抗體的存在使得肺感染的恢復加。另一種多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌菌株中大量存在，且與銅綠假單胞菌的孔蛋白具有同源性，其中的孔蛋白已被驗證在動物模型中有效的抵抗細菌。
粘膜炎莫拉氏菌產生外膜小泡(囊泡)。這些囊泡已被通過不同的方法分離或提取(Murphy T.F.，Loeb M.R.1989.Microb.Pathog.6159-174；Unhanand M.，Maciver，I.，Ramillo O.，Arencibia-Mireles O.，Argyle J.C.，McCracken G.H.Jr.，Hansen E.J.1992.J.Infect.Dis.165644-650)。這種囊泡制劑的保護能力已在消除粘膜炎莫拉氏菌肺炎的小鼠模型試驗中測試。在此模型中顯示了囊泡疫苗的主動免疫或抗囊泡抗體的被動轉移誘導顯著的保護(Maciver I.，Unhanand M.，McCracken G.H.Jr，Hansen，E.J.1993.J.Infect.Dis.168469-472)。
流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌是一種不能游動的革蘭氏陰性菌。人類是其唯一的天然宿主。流感嗜血桿菌通常依據其多糖莢膜被分類。六種從“a”到“f”的不同的莢膜類型已被鑒定。不能與抗六種血清型之一的抗血清結合的分離物被歸類于非典型的，且不表達莢膜。
流感嗜血桿菌b(Hib)與其它的類型明顯的不同，其主要引起細菌腦膜炎和全身性疾病。流感嗜血桿菌的非典型菌株(NTHi)僅僅偶爾分離于患全身性疾病患者的血液中。NTHi通常引起肺炎，慢性支氣管炎的惡化，鼻竇炎和中耳炎。NTHi菌株通過克隆分析鑒定證明具有很大的變異性，而Hib菌株則具有更多的同源性。
流感嗜血桿菌的各種蛋白已顯示與致病有關或已顯示在動物模型中接種疫苗時具有保護性。
NTHi對人鼻咽上皮細胞的粘附已被報道(Read RC.et al.1991.J.Infect.Dis.163549)。除了菌毛和F菌毛(Brinton CC.et al.1989.Pediatr.Infect.Dis.J.8S54；Kar S.et al.1990.Infect.Immun.58903；Gildorf JR.etal.1992.Infect.Immun.60374；St.Geme JW et al.1991.Infect.Immun.593366；St.Geme JW et al.1993.Infect.Immun.612233)，很多的粘附已在NTHi中被鑒定。其中兩種表面暴露的被稱為HMW1和HMW2的大分子量蛋白被顯示調節(jié)NTHi粘附到上皮細胞上(St.Geme JW.et al.1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902875)。另一家族的大分子量蛋白被鑒定在缺乏屬于HMW1/HMW2家族的蛋白的NTHi菌株中。NTHi 115-kDa Hia蛋白(Barenkamp SJ.，St Geme S.W.1996.Mol.Microbiol.In press)高度相似于由流感嗜血桿菌b型菌株表達的Hsf粘附素(St.Geme JW.et al.1996.J.Bact.1786281)。另一種蛋白，Hap蛋白與IgA1絲氨酸蛋白酶顯示出相似性并且被表明與粘附和細胞侵入有關(St.Geme JW.et al.1994.Mol.Microbiol.14217)。
五種主要的外膜蛋白(OMP)已被鑒定和用數字編號。最初使用流感嗜血桿菌b型菌株的研究顯示對P1和P2 OMPs特異的抗體保護隨后受攻擊的幼鼠(Loeb MR.et al.1987.Infect.Immun.552612；Musson RS.Jr.et al.1983.J.Clin.Invest.72677)。P2被發(fā)現能夠誘導殺菌和調理抗體，其針對存在于暴露此完整OMP的環(huán)結構的表面上的可變區(qū)域(HaaseEM.et al.1994 Infect.Immun.623712；Troelstra A.et al.1994 Infect.Immun.62779).。脂蛋白P4也可誘導殺菌抗體(Green BA.et al.1991.Infect.Immun.593191)。
OMP P6是一種保守的糖脂相關脂蛋白其組成1-5％的外膜(Nelson MB.et al.1991.Infect.Immun.592658)。隨后大約相同分子重的脂蛋白被識別稱為PCP(P6交叉反應蛋白)(Deich RM.et al.1990.Infect.Immun.583388)。保守的脂蛋白P4，P6和PCP的混合物沒有顯示在灰鼠中耳炎模型鑒定到的保護(Green BA.et al.1993.Infect.immun.611950)。P6單獨顯示出在灰鼠模型中誘導保護(Demaria TF.et al.1996.Infect.Immun.645187)。
一種絲束蛋白(Miyamoto N.，Bakaletz，LO.1996.Microb.Pathog.21343)也被描述與OMP P5有同源性，其本身與完整的大腸桿菌OmpA有序列同源性(Miyamoto N.，Bakaletz，LO.1996.Microb.Pathog.21343；Munson RS.Jr.et al.1993.Infect.Immun.611017)。NTHi好像通過菌毛的方式粘附到粘液上。
與用淋病雙球菌和腦膜炎球菌性觀察的相符，當在限制鐵的情況下生長時NTHi表達一種由TbpA和TbpB組成的二價人轉鐵蛋白受體?？?TbpB抗體保護幼鼠(Loosmore SM.et al.1996.Mol.Microbiol.19575)。血紅蛋白/親血色球蛋白受體也被描述于NTHi(Maciver I.et al.1996.Infect.Immun.643703)。一種血紅素血紅素結合蛋白受體也已被鑒定(Cope LD.et al.1994.Mol.Microbiol.13868)。乳鐵蛋白受體也存在于NTHi中，但仍未被鑒定(Schryvers AB.et al.1989.J.Med.Microbiol.29121)。一種奈瑟氏菌FrpB-蛋白未被描述在NTHi中。
一種80kDa OMP，D15表面抗原，在小鼠受攻擊模型中提供抗NTHi保護。(Flack FS.et al.1995.Gene 15697).一種42kDa外膜脂蛋白，LPD在流感嗜血桿菌中保守且誘導殺菌的抗體(Akkoyunlu M.et al.1996.Infect.Immun.644586)。一種次要的98kDa OMP(Kimura A.et al.1985.Infect.Immun.47253)，被發(fā)現是一個保護性抗原，此OMP可能是一個非常好的Fe-限制性誘導OMPs或高分子量粘附素，其在后面已被鑒定。流感嗜血桿菌產生IgAl-蛋白酶活性(Mulks MH.，Shoberg RJ.1994.Meth.Enzymol.235543)。NTHi的IgAl-蛋白酶具有高度的抗原變異性(Lomholt H.，van Alphen L.，Kilian，M.1993.Infect.Immun.614575)。
NTHI的另一種OMP，OMP26，一種26-kDa蛋白已顯示在小鼠模型中增強肺清除率(Kyd，J.M.，Cripps，A.W.1998.Infect.Immun.662272)。NTHi HtrA蛋白已顯示是一個保護性抗原。的確，這種蛋白保護灰鼠抵抗中耳炎并且保護幼鼠抵抗流感嗜血桿菌b型菌血癥(LoosmoreS.M.et al.1998.Infect.Immun.66899)。
外膜小泡(或囊泡)已從流感嗜血桿菌中分離(Loeb M.R.，Zachary A.L.，Smith D.H.1981.J.Bacteriol.145569-604；Stull T.L.，Mack K.，Haas J.E.，Smit J.，Smith A.L.1985.Anal.Biochem.150471-480)。小泡與誘導血-腦屏障滲透性(Wiwpelwey B.，Hansen E.J.，Scheld W.M.1989 Infect.Immun.572559-2560)，腦膜炎的誘導(Mustafa M.M.，Ramilo O.，Syrogiannopoulos G.A.，Olsen K.D.，McCraken G.H.Jr.，Hansen，E.J.1989.J.Infect.Dis.159917-922)以及DNA吸收(Concino M.F.，Goodgal S.H.1982 J.Bacteriol.152441-450)相關聯。這些小泡能夠結合和被鼻粘膜上皮吸收(Harada T.，Shimuzu T.，Nishimoto K.，Sakakura Y.1989.ActaOtorhinolarygol.246218-221)表明粘附素和/或定居因子能夠存在于囊泡中。對外膜小泡中存在的蛋白的免疫應答已被在患有不同的流感嗜血桿菌疾病的患者中發(fā)現到(Sakakura Y.，Harada T.，Hamaguchi Y.，Jin C.S.1988.Acta Otorhinolarygol.Suppl.(Stockh.)454222-226；HaradaT.，Sakakura Y.，Miyoshi Y.1986.Rhinology 2461-66)。
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)假單胞菌屬包括革蘭氏陰性的，極性鞭毛的，直或微彎曲桿狀好氧生長且不形成孢子。因為其有限的代謝需求，假單胞菌亞種是普遍存在的且廣泛分布在土壤，空氣，污水和植物中。大多數的假單胞菌例銅綠假單胞菌，假鼻疽假單胞菌(P.pseudomallei)，鼻疽假單胞菌(P.mallei)，嗜麥芽假單胞菌(P.maltophilia)和蔥頭假單胞菌(P.cepacia)已顯示對人類致病。在上述列表中，銅綠假單胞菌被認為是重要的人類病原因為其與無免疫應答的宿主的機會感染相關聯且導致住院病人的高發(fā)病率。醫(yī)院感染銅綠假單胞菌使得患者延長治療并接受免疫抑制劑，皮質類固醇，抗代謝物，抗生素或放療。
假單胞菌，特別是銅綠假單胞菌，產生多種毒素(溶血素，纖維蛋白溶酶，酯酶，促凝酶，磷脂酶內-和外毒素)賦予這些細菌致病性。然而，這些微生物對抗生素具有高度的固有的抗性使得出現了復合的藥物排出泵。后一特性通常使得疾病惡化。
由于抗菌劑化學療法的不受控制的使用，由銅綠假單胞菌引起的醫(yī)院傳染的頻率在過去30年中急劇地增加。在美國，例如銅綠假單胞菌醫(yī)院感染的經濟負擔據估計每年為45億US$。因此，用于主動或被動免疫抵抗銅綠假單胞菌的疫苗被強烈的需求(參見Stanislavsky et al.1997.FEMS Microbiol.Lett.21243-277)。
銅綠假單胞菌的不同的細胞結合和分泌的抗原已成為疫苗開發(fā)的主體。在假單胞抗原中，類粘蛋白物質，其是細胞外主要由藻酸鹽組成的粘液，依據大小和免疫原性被發(fā)現是異源的。高分子量藻酸鹽組分(30-300kDa)顯示出含有保守的表面決定簇而低分子量組分(10-30kDa)除了特有的表面決定簇之外含有保守的表面決定簇。在表面相關蛋白中，PcrV，其是III型分泌-易位元件的一部分，也已被表明是一個用于接種的目的靶(Sawa et al.1999.Nature Medicine 5392-398)。
表面暴露抗原包括O-抗原(LP S的O-特異性多糖)或H-抗原(鞭毛抗原)已被用作血清型來決定其高度的免疫原性特性。O-特異性多糖的重復單位的嵌合結構已被闡明并且這些數據使得鑒定了銅綠假單胞菌的31種化學型。在所有銅綠假單胞菌血清型中的保守表面決定簇位于核心低聚糖和LPS的類脂A區(qū)域中，且含有這些表面決定簇的免疫原在小鼠中誘導交叉保護性免疫抵抗不同的銅綠假單胞菌免疫類型。LPS的外核被推斷是一個配體用于結合銅綠假單胞菌到動物氣管和眼上皮細胞上。然而，在不同血清型的外核區(qū)域中存在不均勻性。內核中的表面決定簇是高度保守的并且已被證明是表面可進入的，且不被O-特異性多糖掩蔽。
為了檢測OM蛋白的保護性特性，一種含有銅綠假單胞菌的分子量從20到100kD的OM蛋白的疫苗被用于臨床前和臨床試驗。此種疫苗在動物模型中有效的抵抗銅綠假單胞菌的攻擊且在人志愿者體內誘導高水平的特異性抗體。來自含有抗銅綠假單胞菌抗體的人自愿者的血漿提供被動的保護并有助于87％的患有嚴重銅綠假單胞菌感染的患者恢復。最近，一種含有來自銅綠假單胞菌的部分外膜蛋白OprF(氨基酸190-342)和OprI(氨基酸21-83)融合到谷胱甘肽-S-轉移酶上的雜交蛋白被證實保護小鼠抵抗銅綠假單胞菌的975-倍的50％致死劑量(Knapp et al.1999.Vaccine.171663-1669)。
發(fā)明人已意識到上述的野生型囊泡疫苗(天然產生的或化學產生的)具有多種缺點。
這些問題的例子如下-在囊泡(PorA；TbpB，Opa[腦膜炎奈瑟氏菌B]；P2，P5[非典型性流感嗜血桿菌])上存在免疫顯勢但可變的蛋白，此種囊泡僅僅有效的抵抗有限的細菌種類。類型特異的殺菌抗體應答阻礙此種疫苗在嬰兒期的應用。
-非保護性(非相關的)抗原(Rmp，H8，…)在囊泡-抗原上的存在誘騙了免疫系統(tǒng)。
-缺乏重要的條件化產生的分子(例如鐵-調控的外膜蛋白，IROMP′s，體內調節(jié)表達機制)-此種情況很難控制囊泡產量來達到表面上抗原的最佳量-保護性(特別是保守的)抗原(NspA，P6)的低水平表達-LPS在囊泡的表面仍保留毒力-因為宿主完全相同的結構產生的潛在的自身免疫應答的誘導(例如腦膜炎奈瑟氏菌血清型B的莢膜，奈瑟氏菌LPS的乳-N-新丁糖，ntHiLPS的糖結構，Pili的糖結構)。
這些問題阻礙了囊泡疫苗作為人疫苗藥物的應用。特別是兒科(＜4歲)的應用，其中抵抗囊泡的反應尤其重要，且其中的囊泡疫苗(例如前面所述的市售的MenB囊泡疫苗)已顯示對于免疫保護無效。因此，本發(fā)明利用遺傳工程改造的細菌菌株提供了減少上述問題的方法，結果得到了改進的囊泡疫苗。此方法將被特別用于生產新的抵抗細菌病原體的方法，例如腦膜炎奈瑟氏菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血桿菌，銅綠假單胞菌，和其它細菌。
本發(fā)明的囊泡疫苗依據對配制在復合成分疫苗中的一些保護性(優(yōu)選保守的)抗原或表面決定簇的免疫應答來設計。其中的抗原為完整的OMPs，囊泡疫苗的外膜小泡將確保它們的適當折疊。本發(fā)明提供了優(yōu)化OMV(囊泡)疫苗的OMP和LPS組分的方法，是通過以下方法實現的刪除免疫顯勢可變的以及非保護性OMPs，增加保守的OMPs，以及刪除可變區(qū)，保護性OMPs表達的上調，以及除去保護性OMPs表達(例如鐵限制性)的調控機制。另外，本發(fā)明提供了減少類脂A的毒性的方法，是通過修飾脂部分或通過改變磷?；M成且保留其輔助活性或通過掩蔽實現的。每一種這樣的新方法分別改進了囊泡疫苗，然而一或更多這些方法的組合使得產生優(yōu)化的工程囊泡疫苗，其為免疫保護性的且無毒性，特別適于兒科使用。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種來自革蘭氏陰性細菌菌株的基因工程囊泡制劑，其特征在于所述的制劑通過采用一或多個選自以下的方法被獲得a)一種減少囊泡制劑中的免疫顯性可變的或非保護性抗原的方法，包括以下步驟確定此抗原的身份，工程改造一種細菌菌株來產生較少的或不產生所述的抗原，并且從所述菌株生產囊泡；b)一種上調囊泡制劑中的保護性，內源(且優(yōu)選保守的)OMP抗原的表達的方法，包括以下步驟鑒定所述的抗原，工程改造一種細菌菌株來導入強啟動子序列到編碼所述抗原的基因的上游使得所述基因以比在非修飾的囊泡中更高的水平表達，且從所述的菌株制備囊泡；c)一種上調囊泡制劑中的條件化表達的保護性(且優(yōu)選保守的)OMP抗原的表達的方法，包括以下步驟鑒定所述的抗原，工程改造一種細菌菌株來去除其表達的抑制調控機制(例如鐵限制性)，且從所述的菌株制備囊泡；d)一種修飾囊泡制劑中的細菌LPS的脂A部分的方法，包括以下步驟鑒定與LPS類脂A部分的毒性有關的基因，工程改造一種細菌菌株來減少或關閉所述基因的表達，并從所述的菌株制備囊泡；e)一種修飾囊泡制劑中的細菌LPS的脂A部分的方法，包括以下步驟鑒定與使得LPS的類脂A部分毒性降低有關的基因，工程改造一種細菌菌株來導入強啟動子序列到編碼所述抗原的基因的上游使得所述基因以比在非修飾的囊泡中更高的水平表達，且從所述的菌株制備囊泡；f)一種減少囊泡制劑中脂類A毒性和增加保護性抗原的水平的方法，包括以下步驟工程改造細菌菌株的染色體來結合一個編碼融合到保護性抗原上的多粘菌素A肽，或其衍生物或類似物的基因，并從所述的菌株制備囊泡；g)一種在囊泡制劑中生成保守的OMP抗原的方法，包括以下步驟鑒定所述的抗原，改造細菌菌株來缺失編碼所述抗原的基因的可變區(qū)，并從所述的菌株制備囊泡；h)一種減少抗原在囊泡制劑中表達的方法，其中的抗原結構與人的結構類似且可以在人體中誘導自身免疫應答(例如腦膜炎奈瑟氏菌B的莢膜多糖)，包括以下步驟鑒定涉及抗原的生物合成的基因，改造細菌菌株來減少或關閉所述基因的表達，并從所述的菌株制備囊泡；i)一種上調囊泡制劑中保護性，內源(且優(yōu)選保守的)OMP抗原的表達的方法，包括以下步驟鑒定所述的抗原，工程改造一種細菌菌株來導入編碼所述由異源強啟動子序列調控的抗原的基因的一或多個拷貝至染色體，并從所述的菌株制備囊泡。
本發(fā)明的其它方面包括，優(yōu)選的用于獲得上述囊泡制劑的方法，包括優(yōu)化強啟動子的位置來上調囊泡中抗原的表達，優(yōu)選的用于不同的細菌菌株的上調和下調的抗原來獲得特別適用于疫苗的囊泡制劑。優(yōu)選的含有本發(fā)明囊泡的制劑也被提供，其特別適用于抵抗特定的疾病狀態(tài)的全球性疫苗。生產本發(fā)明囊泡的載體，以及用來制備本發(fā)明囊泡的修飾細菌菌株也是本發(fā)明的的進一步的一個方面。
本發(fā)明第一次提供了一種囊泡疫苗當其用于4歲以下的兒童時是免疫保護性的且無毒。
附圖簡述附

圖1735mAb在不同克隆上的反應性。
附圖2通過全細胞酶聯免疫吸附測定(ELISA)的特異性單克隆抗體的反應性。
附圖3用于傳遞腦膜炎奈瑟氏菌基因組的基因，操縱子和/或表達盒的pCMK載體的圖解描述。
附圖4重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型B(H44/76衍生物)的總蛋白中PorA表達的分析。總蛋白回收自cps-(泳道3和4)，cps-porApCMK+(泳道2和5)以及cps-porAnspA(泳道1和6)重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株并且在SDS-PAGE條件下在12％聚丙烯酰胺凝膠上分析。凝膠用考馬斯藍染色(泳道1到3)或轉到硝化纖維膜上用抗-PorA單克隆抗體免疫染色。
附圖5分析重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株(H44/76衍生物)的蛋白提取物的NspA表達。蛋白提取自整個細菌(泳道1到3)或外膜囊泡制劑(泳道4到6)，在12％丙烯酰胺凝膠上通過SDS-PAGE分離并且通過免疫印跡反應利用抗-NspA多克隆血清分析。對應于cps-(泳道1和6)，cps-porapCMK+(泳道3和4)以及cps-porAnspA(泳道2和5)的樣品被分析。兩種形式的NspA被檢測一種與重組純化的NspA共遷移的成熟形式(18kDa)，一種較短的形式(15kDa)。
附圖6在重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株(H44/76衍生物)的蛋白提取物中D15/omp85的表達分析。蛋白提取自外膜囊泡制劑，在12％丙烯酰胺凝膠上通過SDS-PAGE分離并且通過利用抗-omp85多克隆血清進行免疫印跡反應分析。對應于cps-(泳道2)和cps-，PorA+，pCMK+Omp85/D15(泳道1)重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株的樣品被分析。
附圖7通過啟動子傳遞調控基因表達的常規(guī)方法(RS代表限制性位點)。
附圖8分析由重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型Bcps-菌株(H44/76衍生物)產生的外膜囊泡。蛋白被提取自外膜囊泡制劑并在還原條件在4-20％梯度聚丙烯酰胺凝膠上通過SDS-PAGE分離，凝膠用考馬斯亮藍R250染色。泳道2，4，6對應于5ug的總蛋白，而泳道3，5和7為10μg蛋白。
附圖9用于在腦膜炎奈瑟氏菌H44/76中上調Omp85/D15的表達/產生的啟動子替換質粒的構建。
附圖10重組NmB(H44/76衍生物)的總蛋白提取物中的OMP85表達的分析。凝膠用考馬斯亮藍染色(A)或轉到硝化纖維膜上并用鼠抗-OMP85(N.gono)單克隆抗體免疫染色(B)。
附圖11來自重組NmB(H44/76衍生物)的OMV制劑中的OMP85表達的分析。凝膠用考馬斯亮藍染色(A)或轉到硝化纖維膜上并用鼠抗-OMP85多克隆抗體免疫染色(B)。
附圖12用于刪除嵌合porA/lacO啟動子的重組PCR方法的圖示。
附圖13重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型B(H44/76衍生物)總蛋白提取物的Hsf表達的分析。總蛋白獲自Cps-PorA+(泳道1)，和Cps-PorA+/Hsf(泳道2)重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株并在12％聚丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE分析。凝膠用考馬斯亮藍染色。
附圖14重組腦膜炎奈瑟氏菌(H44/76衍生物)總蛋白提取物的GFP表達的分析?？偟鞍撰@自Cps-，PorA+(泳道1)，Cps-，PorA-GFP+(泳道2和3)重組菌株。蛋白在12％聚丙烯酰胺凝膠上通過SDS-PAGE分離然后用考馬斯藍染色。
附圖15在通過SDS-PAGE分析(考馬斯藍染色)的不同重組囊泡制劑表面上的主要蛋白的模式的圖解。
附圖16純化的重組Hsf蛋白對不同的囊泡和重組囊泡制劑的特異性抗Hsf應答。
附圖17重組NmB(血清型B衍生物)的總蛋白提取物中的NspA表達的分析。凝膠用考馬斯藍染色(A)或轉到硝化纖維膜上并用鼠抗-PorA單克隆抗體(B)或抗-NspA多克隆抗體(C)免疫染色。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及一系列常規(guī)的能被用于生產改進的基因改造的來自革蘭氏陰性細菌菌株的囊泡的工具和方法。本發(fā)明包括用于生產具有更多免疫原性，更少毒性安全地用于人和/或動物疫苗的重組囊泡的方法。此外，本發(fā)明也描述了特異性的方法用于構建，生產，獲得和使用來自不同革蘭氏陰性菌的重組，工程改造的囊泡，用于疫苗，治療和/或診斷目的。通過本發(fā)明的方法，細菌囊泡的生化組分可通過調控/改變編碼存在于或與細菌外膜囊泡(外膜蛋白或OMPs)結合的產物的細菌基因被操縱。通過遺傳修飾來增加，減少或有條件的表現一或多個編碼外膜組分的基因表達的方法的囊泡生產也包含在本發(fā)明的范圍之中。
為了清楚地闡述，術語“表達盒”在此將指所有的表達基因或操縱子以及產生和靶向相應的目的蛋白到得自所給的細菌宿主的外膜囊泡所必需的元件。這些特征的非窮盡列舉包括調控元件(轉錄和/或翻譯)，蛋白編碼區(qū)和靶信號，其之間的適當的間隔。啟動子序列的插入是指，為達到本發(fā)明的目的，插入帶有至少一個啟動子功能的序列且優(yōu)選一或多個其它包含在表達盒中的遺傳調控元件。此外，術語″整合盒″在此是指所有的在所給細菌宿主中整合DNA片段必需的遺傳元件。。這些特征的非窮盡列舉包括傳遞載體(或載體)，帶有重組遺傳區(qū)域，以及可選擇的和反向可選擇的標記。
術語“改造細菌菌株產生較少量的所述抗原”是指任意減少目的抗原表達的方式，相對應非修飾(例如，天然產生的)囊泡其表達至少低于10％的非修飾囊泡的表達。優(yōu)選的至少低于50％?！皬妴幼有蛄小笔侵冈黾泳幋a目的抗原的基因轉錄的調控元件?！吧险{表達”是指任意的增強目的抗原相對于非修飾(例如，天然產生的)囊泡的表達?？梢岳斫狻吧险{”的量依據特定的目的抗原而變化但不會超出破壞囊泡的膜完整性的量?？乖纳险{是指表達至少10％高于非修飾囊泡的的表達。優(yōu)選至少高于50％。更優(yōu)選至少高于100％(2倍)本發(fā)明的一個方面涉及生產改進的工程囊泡的獨特方法，這些方法的組合，以及涉及這些方法產生的囊泡組合物。本發(fā)明的另一個方面涉及遺傳學工具用于遺傳修飾所選的細菌菌株來從所述菌株提取改進的工程改造囊泡。
本發(fā)明方法的工程改造步驟可以以技術人員公知的方式來進行。例如，序列(例如，啟動子或開放閱讀框架)可以被插入，啟動子/基因可被通過轉座子插入技術分裂。例如，為了上調基因的表達，一個強啟動子可通過插入轉座子到基因起始密碼子的2kb上游(更優(yōu)選200-600bp上游，最優(yōu)選大約400bp上游)。點突變或缺失也可以被使用(特別用于基因的下調表達)。
此種方法，然而，可能是非常不穩(wěn)定的或不確定的，因此優(yōu)選通過同源重組處理進行工程改造步驟[尤其是下面所述的方法a)，b)，c)，d)，e)，h)和i)]。優(yōu)選的，此種處理發(fā)生在細菌染色體的至少30個核苷酸的序列(重組遺傳區(qū)域)以及轉化菌株的載體的至少30個核苷酸的序列之間。優(yōu)選區(qū)域為40-1000個核苷酸，更優(yōu)選的100-800個核苷酸，最優(yōu)選為500個核苷酸。這些重組遺傳區(qū)域與能夠和另一個在高度嚴緊條件下雜交的重組遺傳區(qū)域足夠的相似(如后面所定義的)。
重組可以通過利用染色體和載體上的單個重組遺傳區(qū)域，或通過雙重交換染色體來進行(在染色體和載體上帶有兩個區(qū)域)。為了進行單一重組處理，載體應為環(huán)狀的DNA分子(參見附圖7)。優(yōu)選進行雙重重組處理且使用線性的載體，當如此產生的修飾的細菌在回復時更加穩(wěn)定。優(yōu)選染色體上(以及在載體上的)的重組遺傳區(qū)域具有相似(更優(yōu)選為相同)的長度使得促進了雙重染色體的交換。雙重的染色體交換功能使得在染色體上的兩個重組遺傳區(qū)域(用核苷酸序列‘X’表示)和載體上的兩個重組遺傳區(qū)域(用核苷酸序列‘Y’表示)結合除了X和Y交換外余下未被改變的染色體。重組遺傳區(qū)域可位于目的閱讀框架的上游或下游或側面。這些區(qū)域可包括編碼，非編碼，或編碼和非編碼序列的混合物。X和Y的特性依據目的效果。X可以為全部或部分的開放閱讀框架，Y根本沒有核苷酸，其將產生從染色體刪除的序列X?？蛇x擇的，Y可以時一個強啟動子用于開放閱讀框架的上游的插入，且X可能根本沒有核苷酸。
合適的載體在組合物種將依據將被進行的重組處理的類型和重組的最終目的而變化。用于傳遞區(qū)域Y的正和載體可以是有條件復制型或自殺性質粒，噬菌體，轉座子或通過限制性水解或PCR擴增的線性DNA片段。重組事件的選擇通過選擇性遺傳標記的方式例如賦予基因抗生素(例如卡那霉素，紅霉素，氯霉素或慶大霉素)抗性，賦予基因對重金屬和/或有毒化合物的抗性或營養(yǎng)缺陷互補型突變的基因(例如，pur，leu，met，aro)。
方法a)和f)-可變和非保護性免疫顯性抗原的下調/去除很多表面抗原在細菌菌株中是可變異的并且結果是僅僅抵抗有限的親密相關的菌株。本發(fā)明的一個方面包括減少表達，或優(yōu)選的，刪除編碼產生囊泡的細菌菌株的可變表面蛋白的基因，其中的囊泡當配制成疫苗時，具有強烈的抵抗不同的通過疫苗免疫系統(tǒng)的保守蛋白(保留在外膜上)發(fā)揮較高影響的菌株交叉反應的可能性。這種可變抗原的例子包括發(fā)生抗原變異的奈瑟氏菌-pili(PilC)，PorA，Opa，TbpB，FrpB；流感嗜血桿菌-P2，P5，pilin，IgAl-蛋白酶；以及Moraxella-CopB，OMP106。
其它類型的能被下調或關閉的基因是在體內能夠很容易被細菌開放(表達)或關閉的基因。由于此種基因編碼的外膜蛋白并不經常存在于細菌上，此種蛋白在囊泡制劑中的存在因為上述原因對疫苗的有效性也是有害的。優(yōu)選的下調或刪除的例子是奈瑟氏菌Opc蛋白。由含有囊泡疫苗的Opc誘導的抗-Opc免疫僅具有有限的保護能力，因為感染的生物很容易地變成Opc-。流感嗜血桿菌HgpA和HgpB是另外的此種蛋白的例子。
在方法a)中，這些可變的或非保護性基因在表達上被下調，或最終被關閉。此具有上述令人吃驚的優(yōu)點即將免疫系統(tǒng)的研究集中于存在于囊泡外表面上低量的最好的抗原上。
菌株可通過大量的策略被工程改造包括轉座子插入來干擾基因的編碼區(qū)或啟動子區(qū)，或點突變或點缺失來獲得相似的結果。同源重組也可被用來從染色體刪除基因(其中的序列X包括部分(優(yōu)選全部的)目的基因的編碼序列)。此外可以改變基因啟動子區(qū)弱(或無)啟動子為強啟動子(其中的核苷酸序列X包括部分(優(yōu)選全部的)目的基因的編碼序列，且核苷酸序列Y包含弱啟動子[結果減少了目的基因/操縱子的表達]，或無啟動子區(qū)域)。在此情況下，優(yōu)選重組事件發(fā)生在目的基因的染色體1000bp上游的區(qū)域。
可選擇的，Y可能賦予有條件的轉錄活性，導致目的基因/操縱子有條件的表達(下調)。此有助于有毒的或不被細菌宿主很好地支持的分子的表達。
大多數的上述例證的蛋白為完整的OMPs并且其變異性可能被限制于一或一些其表面暴露的環(huán)。本發(fā)明的另一個方面[方法g)]包括刪除編碼這些表面暴露的環(huán)的DNA導致含有保守的表面暴露的環(huán)的整合OMP的表達。流感嗜血桿菌P2和P5的表面暴露環(huán)的優(yōu)選的例子是能夠被通過此方法轉化到交叉反應抗原中的蛋白。
方法b)-啟動子傳遞和調節(jié)本發(fā)明的另一個方面涉及通過原位改變調控目的基因/操縱子表達的調控區(qū)來修飾囊泡組合物。此種改變可包括用一個具有顯著轉錄活性的啟動子替換部分或全部的調控目的基因表達的內源啟動子。此顯著轉錄活性可能是內源調控區(qū)的變體，天然產生的或修飾的異源啟動子或二者組合(點突變，缺失和/或插入)。此種改變優(yōu)選賦予比內源的更強的轉錄活性(導入強啟動子)，產生增強的目的基因/操縱子的表達(上調)。此方法尤其有助于增強免疫學相關的Bleb組分例如外膜蛋白和脂蛋白(優(yōu)選保守的OMPs，通常低濃度的存在于囊泡中)的生產。
可被整合在奈瑟氏菌中的代表性的強啟動子是porA[SEQ ID NO24]，porB[SEQ ID NO26]，lgtF，Opa，p110，lst和hpuAB。PorA和PorB是優(yōu)選的組成型的強啟動子。PorB啟動子的活性已被確定(實施例9)包含在與porB的起始密碼子的核苷酸-1到-250上游對應的片段中。在摩拉克氏菌中，優(yōu)選使用ompH，ompG，ompE，OmpB1，ompB2，ompA，OMPCD以及Omp106啟動子，且在流感嗜血桿菌，優(yōu)選整合P2，P4，P1，P5和P6啟動子。
利用優(yōu)選的交叉互換同源重組技術來在1000bp上游區(qū)域中導入啟動子，啟動子可在將被上調的基因的距離起始密碼子的30-970bp上游區(qū)域的任意處被替換。盡管依據常規(guī)啟動子區(qū)域應當相對地靠近開放閱讀框架來獲得基因的最佳表達，但本發(fā)明令人吃驚的發(fā)現啟動子更遠離啟動密碼子的替換導致表達水平的大大地增加。因此優(yōu)選啟動子被插入到距離基因的起始密碼子的200-600bp，更優(yōu)選的為300-500bp，最優(yōu)選距離起始ATG大約400bp處。
方法c)-條件化產生的囊泡組分一些編碼特定囊泡組分的基因的表達被較好的調控。組分的生產被不同的新陳代謝和/或環(huán)境信號條件化調控。此信號包括，例如，鐵-限制性，氧化還原電位的調節(jié)，pH和溫度差異，營養(yǎng)改變。一些已知被有條件產生的囊泡組分的例子包括來自奈瑟氏菌和莫拉氏菌(例如TbpB，LbpB)的鐵-調節(jié)的外膜蛋白，以及底物誘導型外膜蛋白。本發(fā)明包括前面所述的遺傳方法的應用(方法a)或b))來提供此種分子的組成型表達。這樣，環(huán)境信號對目的基因表達的影響可被克服通過修飾/取代基因的相應調控區(qū)使其變成組成型活性的(例如通過刪除部分[優(yōu)選全部]或阻遏性調控序列-例如操縱基因區(qū))，或插入一個組成型的強啟動子。為了鐵調控基因，fur操縱基因可被去除?？蛇x擇的，方法i)可被用于傳遞在組成型啟動子調節(jié)下被人工替代的染色體中的基因/操縱子的另外的拷貝。
方法d)和e)-LPS的脫毒作用囊泡疫苗的毒性是囊泡在疫苗中應用的一個最大的問題。本發(fā)明的另一個方面涉及囊泡中LPS的遺傳學脫毒的方法。脂A是LPS的主要成分其起到細胞激活的作用。很多在此途徑涉及的基因的突變引起基本的表現型。然而，負責末端修飾步驟的基因中的突變產生溫度敏感型(htrB)或允許(msbB)表現型。導致這些基因的表達減少(或沒有)的突變產生脂A的改變的毒性。事實上，非月桂?；?htrB突變體)或非肉豆蔻酰化(msbB突變體)脂A比野生型脂A具有更少的毒性。脂A4`-激酶編碼基因(lpxK)的突變也減少了脂A的毒性。
方法d)因此涉及一或多個上述開放閱讀框架或啟動子部分(或優(yōu)選全部)的刪除。可選擇的，啟動子可被弱啟動子取代。優(yōu)選上述的同源重組技術被用于實施上面的方法。
來自腦膜炎奈瑟氏菌B，粘膜炎莫拉氏菌，和流感嗜血桿菌的htrB和msbB基因的序列被提供用于此目的。
LPS毒性可以通過在涉及多粘菌素B抗性的基因/位點導入突變來改變(此抗性與脂A的4`磷酸鹽的氨基阿拉伯糖有關)。這些基因/位點可能是編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的pmrE，或與很多與氨基阿拉伯糖合成和傳遞相關的腸道細菌共有的抗菌肽抗性基因的區(qū)域。存在于此區(qū)域的基因pmrF編碼dolicol-磷酸鹽manosyl轉移酶(Gunn J.S.，Kheng，B.L.，Krueger J.，Kim K.，Guo L.，Hackett M.，Miller S.I.1998.Mol.Microbiol.271171-1182)。
PhoP-PhoQ調控系統(tǒng)的突變，導致氨基阿拉伯糖在4`-磷酸鹽和2-羥基豆蔻酸鹽取代肉豆蔻酸鹽(肉豆蔻酸鹽的羥基化)中的增加，其中的系統(tǒng)是二氧磷基-交換的二成分調控系統(tǒng)(f.i.PhoP組成行表現型，PhoP)，或低Mg′環(huán)境的或培養(yǎng)條件(其激活PhoP-PhoQ調控系統(tǒng))。此種修飾的脂A顯示出減少的對人內皮細胞E-selectin表達和人單核細胞的TNF-a分泌的刺激能力。
方法e)涉及這些基因通過上述的方法的上調(強啟動子被插入，優(yōu)選使用同源重組技術實施上面的方法)。
可選擇的，進行任意的這種突變，多粘菌素B抗性菌株可被用作疫苗生產菌株(與一或多個本發(fā)明的其他方法結合)，因為來自此菌株的囊泡具有減少的LPS毒性(for instance as shown for meningococcus-van der Ley，P，Hamstra，HJ，Kramer，M，Steeghs，L，Petrov，A and Poolman，JT.1994.In.Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conferenceThe Guildhall，Winchester，England)。
可選擇的(本發(fā)明的另一個方面)本發(fā)明提供了一種革蘭氏陰性菌的脫毒的方法包括以下步驟在含有0.1mg-100g的氨基阿拉伯糖/升培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株。
另外的可選擇的方面，其模擬多粘菌素B的結合活性(描述在下)合成的肽可被加入到Bleb制劑中來降低LPS的毒性(Rustici，A，Velucchi，M，Faggioni，R，Sironi，M，Ghezzi，P，Quataert，S，Green，B and Porro M 1993.Science 259361-365；Velucchi，M，Rustici，A，Meazza，C，Villa，P，Ghezzi，P and Porro，M.1997.J.Endotox.Res.4)。
方法f)-結合同源或異源蛋白到外膜囊泡上同時降低了LPS的毒性本發(fā)明的另一個方面包括利用編碼多粘菌素B肽(或其類似物)的遺傳序列來靶向融合蛋白到外膜上。多粘菌素B是由非tRNA編碼的氨基酸(革蘭氏陽性放線菌產生的)組成的環(huán)形肽其緊密的結合于外膜LPS的脂A部分。此種結合較少了LPS(內毒素活性)的內在毒性。模擬多粘菌素B的結構且由正則(tRNA編碼的)氨基酸組成的肽已被改進且結合帶有親和力的脂A。這些多肽被用于LPS脫毒。其中的一個肽SAEP-2(N末端-Lys-Thr-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys-C末端)在此方面顯示出較大的潛力(Molecular Mapping and detoxifying of the Lipid A binding site bysynthetic peptides(1993).Rustici，A.，Velucchi，M.，Faggioni，R.，Sironi，M.，Ghezzi，P.，Quataert，S.，Green，B.and M.Porro.Science 259，361-365)。
本發(fā)明的方法f)提供了應用的改進。人們發(fā)現利用編碼SEAP-2肽(或其衍生物)的DNA融合到目的基因(編碼例如例如通常被分泌的T細胞抗原或保護性抗原，例如毒素，或胞質或周質蛋白)上是一種靶向相關的重組蛋白到優(yōu)選的細菌宿主的外膜上的方法(且同時減少了LPS的毒性)。
本系統(tǒng)適用于不穩(wěn)定的不能夠直接暴露在囊泡外面的蛋白。囊泡因此充當傳遞載體其當囊泡被T細胞吞沒時暴露蛋白于免疫系統(tǒng)?？蛇x擇的遺傳融合應包含一個信號肽或轉膜區(qū)使得重組蛋白可能通過外膜暴露于宿主免疫系統(tǒng)。
靶向策略特別的適應于編碼通常不靶向外膜的蛋白的基因。此方法也允許重組目的蛋白中的豐富囊泡的分離。優(yōu)選的，此肽靶向信號允許外膜囊泡在一種或一些目的蛋白中較為富集，其并為天然的發(fā)現在所給的亞細胞位置。可被用作受體宿主用來生產重組囊泡的細菌的非窮盡列舉包括腦膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血桿菌，銅綠假單胞菌，砂眼衣原體和肺炎衣原體。
盡管用于構建的基因優(yōu)選被工程改造到細菌的染色體中[通過方法i)]，可選的優(yōu)選的實施方案是SAEP-2-標記的重組蛋白被單獨地制備，并吸附于囊泡制劑。
另一個實施方案是此種構建物在蛋白純化方法中的應用。系統(tǒng)通常可被用作生產重組蛋白的表達系統(tǒng)的一部分。SAEP-2肽標記物可被用于通過含有固定的脂A分子的柱吸附的蛋白的純化。
方法h)-交叉反應的多糖分離有莢膜的革蘭氏陰性菌的細菌外膜囊泡通常導致莢膜多糖的共純化。在一些情況下，這種“污染物”可能證明是有效的因為多糖可增強由其它囊泡組分引起的免疫應答。在其他的情況下，然而，污染的多糖物質在細菌囊泡制劑中的存在被證實在疫苗囊泡的應用是有害的。例如，已經顯示至少在為腦膜炎奈瑟氏菌的情況下血清型B莢膜多糖沒有保護性的免疫且在人體中容易引起抵抗自動免疫的應答。所以，本發(fā)明的方法h)為用于生產不具有莢膜多糖的囊泡制劑的細菌菌株的改造。此囊泡適于人體使用。一個特定優(yōu)選的此種囊泡制劑的例子來自腦膜炎奈瑟氏菌血清型B且沒有莢膜多糖的。
通過利用修飾其莢膜合成和運輸所必需的基因已被削弱的囊泡生產菌株可以實現上述的目的。編碼莢膜合成和運輸的基因的失活可以通過突變(點突變，缺失或刪除)調控區(qū)，編碼區(qū)或二者(優(yōu)選利用上述的同源重組技術)來獲得。此外，莢膜合成基因的失活可通過反義超表達或轉座子誘變來實現。優(yōu)選的方法是缺失一些多糖合成和運輸所需要的一些或所有的腦膜炎奈瑟氏菌cps基因。為到達此目的，可替換質粒pMF121(described in Frosh et al.1990，Mol.Microbiol.41215-1218)實現缺失cpsCAD(+galE)基因簇的突變?？蛇x擇的，siaD基因可被缺失，或下調其表達(編碼莢膜多糖和LOS合成必需的α-2，3-唾液酸轉移酶的腦膜炎球菌siaD基因)。此突變也可以去除細菌LPS的糖部分的宿主相似結構。
方法i)-宿主染色體中一或多個基因和/或操縱子的傳遞，或宿主染色體中異源基因和/或操縱子的傳遞有效的調制囊泡制劑的組分的方法是傳遞一或多個含有表達盒的DNA片段的拷貝到革蘭氏陰性細菌的染色體組中。優(yōu)選的可被用此盒的受體的細菌中的非窮盡列舉包括腦膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血桿菌，銅綠假單胞菌，砂眼衣原體，肺炎衣原體。含在表達盒中的基因可以是同源的(或內源的)(例如，自然存在于被處理細菌的染色體中)或異源的(例如不自然存在于被處理細菌的染色體中)。再次描述的表達盒可包括未修飾的，″天然的″啟動子/基因/操縱子序列或其啟動子區(qū)和/或編碼區(qū)或二者已被改變的工程改造的表達盒。優(yōu)選的可被用于表達的啟動子的非窮盡列舉包括來自腦膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌的啟動子porA，porB，lbpB，tbpB，p110，Ist，hpuAB，來自流感嗜血桿菌的啟動子p2，p5，p4，ompF，pl，ompH，p6，hin47，粘膜炎莫拉氏菌的啟動子ompH，ompG，ompCD，ompE，ompB1，ompB2，ompA，大腸桿菌的啟動子RpL，lac，tac，araB或被噬菌體RNA聚合酶特例如大腸桿菌噬菌體T7異性識別的的啟動子。能在此系統(tǒng)中表達的優(yōu)選基因的非窮盡列舉包括奈瑟氏菌NspA，Omp85，PilQ，TbpA/B復合物，Hsf，PldA，HasR；衣原體MOMP，HMWP；Moraxella OMP106，HasR，PilQ，OMP85，PIDA；百日咳博德特氏桿菌FHA，PRN，PT。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，表達盒通過同源的和/或位點特異性重組的方式被傳遞和整合在細菌染色體中。用于傳遞此基因和/或操縱子的整合載體可以是條件復制型或自殺質粒，噬菌體，轉座子或通過限制性水解PCR擴增得到的線性DNA片段。整合通常優(yōu)選在對體外生長非必要的染色體區(qū)域。優(yōu)選用于靶向DNA整合的位置的非窮盡列舉包括腦膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌的porA，porB，opa，opc，rmp，omp26，lecA，cps，IgtB基因，NTHi的PI，P5，hmw1/2，IgA蛋白酶，fimE基因，粘膜炎莫拉氏菌的lecA1，lecA2，omplO6，uspAI，uspA2基因。可選擇的，用于調節(jié)囊泡成分的表達的表達盒可被傳遞到所選的細菌中通過游離型載體例如環(huán)狀的/線性復制載體，粘粒，噬菌粒，溶解型噬菌體或細菌的人工染色體等方式來進行。重組結果的篩選可通過選擇性遺傳標記例如賦予抗生素(例如卡那霉素，紅霉素，氯霉素，或慶大霉素)抗性的基因，賦予對重金屬和/或對有毒化合物抗性的基因或營養(yǎng)缺陷互補突變的基因(例如pur，leu，met，aro)。
異源基因-外來蛋白在外膜囊泡中的表達外膜細菌囊泡表現為生產，分離和傳遞重組蛋白的非常吸引人的系統(tǒng)用于疫苗，治療和/或診斷。本發(fā)明的另一個方面為表達，產生以及靶向外來的，異源蛋白到外膜上，以及利用細菌生產重組囊泡。
達到上述目的優(yōu)選的方法包括以下步驟通過同源重組導入由強啟動子調控的異源基因到革蘭氏陰性菌株的染色體中。可由產生修飾的菌株生產囊泡。
被用于受體宿主生產重組囊泡的細菌的非窮盡列舉包括腦膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血桿菌，銅綠假單胞菌，砂眼衣原體，肺炎衣原體。在此系統(tǒng)中表達的基因可以是病毒，細菌，真菌，寄生或高等真核來源的。
本發(fā)明的優(yōu)選的應用包括摩拉克氏菌，嗜血桿菌屬和/或假單胞菌外膜蛋白(整合的，廣泛存在的和/或脂蛋白)在腦膜炎奈瑟氏菌重組囊泡中表達的方法。優(yōu)選的整合位點如上所述，優(yōu)選被導入的基因是那些提供抵抗分離這些基因的細菌的保護性的基因。優(yōu)選的來自每一細菌的保護性基因被描述在下面。
另外的優(yōu)選的應用包括產生自修飾的流感嗜血桿菌菌株的囊泡，其中菌株的異源基因是來自粘膜炎莫拉氏菌的保護性OMP；以及產生自修飾的粘膜炎莫拉氏菌菌株的囊泡，其中菌株的異源基因是來自流感嗜血桿菌的保護性OMP(優(yōu)選的基因插入的位點如上面所示的，且優(yōu)選的保護性抗原如下面所描述)。
此方面的特別優(yōu)選的應用是用在性傳播疾病(STDs)的預防或治療領域。通常很困難來檢測STD的主要原因是淋病球菌或砂眼衣原體感染。這兩種微生物是輸卵管炎疾病的主要原因其可以導致宿主不育。因此，如果STD能夠被預防接種抵抗或用聯合疫苗治療有效抵抗由此兩種微生物引起的疾病將是有用的。砂眼衣原體的主要的外膜蛋白(MOMP)已被證實是保護性抗體的靶。然而此整合膜蛋白的結構整體性對于誘導此種抗體是重要的。此外，被抗體識別的表面決定簇是可變且超過10個血清型變種。本發(fā)明前面所述的部分允許囊泡外膜制劑中一個或多個膜蛋白正確的折疊。在外膜中表達復合砂眼衣原體MOMP血清型變種的淋病雙球菌菌株的工程改造，以及由此的囊泡的生產，提供了簡單的解決正確折疊膜蛋白，提供足夠的MOMP血清型變種來保護抵抗廣譜的血清型變種，以及淋病雙球菌的感染的同時預防/治療(所以不必在最初判斷哪一種微生物是引起臨床癥狀的原因-兩種微生物可被預防接同時抵抗，因此使得在非常早的階段進行STD治療)等多種問題。優(yōu)選的淋病球菌染色體中基因插入的位點如上所示。其它優(yōu)選的可以被合并的保護性砂眼衣原體基因為HMWP，PmpG且這些OMPs公開在WO 99/28475中。
異源蛋白到外膜囊泡上的靶向一些異源蛋白在細菌囊泡中的表達可能需要外膜靶向信號的加入。優(yōu)選的解決此問題的方法是通過在異源基因和編碼自己OMP的基因間產生一個遺傳融合作為一個特異性途徑來靶向重組蛋白到囊泡上。更優(yōu)選的，異源基因被融合到此OMP的信號肽序列上。
奈瑟氏菌囊泡制劑一或多個下述的基因(編碼保護性抗原)優(yōu)選通過方法b)和/或i)被上調當處理奈瑟氏菌菌株，包括淋病球菌，和腦膜炎球菌(特別是腦膜炎奈瑟氏菌B)時NspA(WO 96/29412)，Hsf-樣(WO 99/31132)，Hap(PCT/EP99/02766)，PorA，PorB，OMP85(WO 00/23595)，Pil Q(PCT/EP99/03603)，PldA(PCT/EP99/06718)，FrpB(WO 96/31618)，TbPA(US 5,912,336)，TbpB，FrpA/FrpC(WO 92/01460)，LbpA/LbpB(PCT/EP98/05117)，FhaB(WO 98/02547)，HasR(PCT/EP99/05989)，lipo02(PCT/EP99/08315)，Tbp2(WO 99/57280)，MltA(WO 99/57280)，以及ctrA(PCT/EP00/00135)。其也優(yōu)選為被異源導入到其它革蘭氏陰性細菌的基因。
一個或多個下述的基因優(yōu)選通過方法a)被下調PorA，PorB，PilC，TbpA，TbpB，LbpA，LbpB，Opa和Opc。
一個或多個下述的基因優(yōu)選通過方法d)被下調htrB，msbB和lpxK。
一個或多個下述的基因優(yōu)選通過方法e)被上調pmrA，pmrB，pmrE和pmrF。
優(yōu)選的用于c)的抑制調控序為fur操縱基因區(qū)(特特別是TbpB或LbpB基因或二者)；以及DtxR操縱基因區(qū)。
一個或多個下述的基因優(yōu)選通過方法h)被下調galE，siaA，siaB，siaC，siaD，ctrA，ctrB，ctrC和ctrD。
銅綠假單胞菌囊泡制劑一個或多個下述的基因(編碼保護性抗原)優(yōu)選通過方法b和/或i)被上調PcrV，OprF，OprI。其也優(yōu)選為被異源導入到其它革蘭氏陰性細菌的基因。
粘膜炎莫拉氏菌囊泡制劑一個或多個下述的基因(編碼保護性抗原)優(yōu)選通過方法b和/或i)被上調OMP106(WO 97/41731 & WO 96/34960)，HasR(PCT/EP99/03824)，PilQ(PCT/EP99/03823)，OMP85(PCT/EP00/01468)，lipoO6(GB9917977.2)，lipo10(GB 9918208.1)，lipo11(GB 9918302.2)，lipo18(GB9918038.2)，P6(PCT/EP99/03038)，ompCD，CopB(Helminen ME，et al(1993)Infect.Immun.612003-2010)，D15(PCT/EP99/03822)，OmplA1(PCT/EP99/06781)，Hly3(PCT/EP99/03257)，LbpA和LbpB(WO 98/55606)，TbpA和TbpB(WO 97/13785 & WO 97/32980)，OmpE，UspA1和UspA2(WO 93/03761)，和Omp21。其也優(yōu)選為被異源導入到其它革蘭氏陰性細菌的基因。
一個或多個下述的基因優(yōu)選通過方法a)用于下調CopB，OMP106，OmpB1，TbpA，TbpB，LbpA和LbpB。
一個或多個下述的基因優(yōu)選通過方法d)用于下調htrB，msbB和lpxK。
一個或多個下述的基因優(yōu)選通過方法e)用于上調pmrA，pmrB，pmrE和pmrF。
流感嗜血桿菌囊泡制劑一個或多個下述的基因(編碼保護性抗原)優(yōu)選通過方法b和/或i)被上調D15(WO 94/12641)，P6(EP 281673)，TbpA，TbpB，P2，P5(WO94/26304)，OMP26(WO 97/01638)，HMW1，HMW2，HMW3，HMW4，Hia，Hsf，Hap，Hin47和Hif(此操縱子中的所有基因應被上調來上調菌毛蛋白)。其也優(yōu)選為被異源導入到其它革蘭氏陰性細菌的基因。
一個或多個下述的基因優(yōu)選通過方法a)用于下調P2，P5，Hif，IgAI-蛋白酶，HgpA，HgpB，HMW1，HMW2，Hxu，TbpA，和TbpB。
一個或多個下述的基因優(yōu)選通過方法d)用于下調htrB，msbB和lpxK。
一個或多個下述的基因優(yōu)選通過方法e)用于上調pmrA，pmrB，pmrE和pmrF。
疫苗配劑本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案是本發(fā)明疫苗中囊泡制劑的配劑也可含有藥理上可接受的賦形劑。
可通過技術人員公知的任意方法來從任意上述被修飾的菌株制備囊泡制劑。優(yōu)選的使用公開在EP 301992，US 5,597,572，EP 11243或US4,271,147上的方法。更優(yōu)選的，利用公開在實施例8中的方法。
疫苗制劑通常被描述在Vaccine Design(″The subunit and adjuvantapproach″(eds Powell M.F.& Newman M.J.)(1995)Plenum Press NewYork)上。
本發(fā)明疫苗配劑中的囊泡制劑可被加入佐劑。合適的佐劑包括鋁鹽例如氫氧化鋁凝膠(明礬)磷酸鋁，但也可以是鈣鹽(特別是碳酸鈣)，鐵鹽或鋅鹽，或為酰基化酪氨酸，或酰基化糖，陽離子或陰離子衍生多糖或含磷氮鏈聚合物的不溶解的懸浮液。
可被使用的合適的Th1佐劑系統(tǒng)包括，單磷?；珹，尤其是3-脫-O-酰基化單磷?；珹，單磷?；珹，優(yōu)選3-脫-O-?；瘑瘟柞；珹(3DMPL)與鋁鹽的組合物。增強的系統(tǒng)包括單磷酰基脂A和皂草苷衍生物的組合物，尤其是公開在WO 94/00153中的QS21和3D-MPL的組合物，或較小反應遺傳因子的成分其中的QS21如WO96/33739所述的被用膽固醇淬火。一種尤其有效的佐劑配劑包括在水包油乳濁液中的QS213D-MPL以及維生素E被描述在WO95/17210中并且是一種優(yōu)選的配劑。
疫苗可含有皂草苷，更優(yōu)選的含有QS21。其也可含有水包油乳濁液和維生素E。含有寡核苷酸的未甲基化CpG(WO 96/02555)也是優(yōu)選的TH1應答的誘導物且適合用于本發(fā)明中。
本發(fā)明的疫苗制劑可被用于保護或治療哺乳動物易感的的感染，通過全身或粘膜的途徑給藥所述的疫苗。這些給藥可包括通過肌內，腹膜內，真皮內或皮下途徑的注射；或通過口服/飲食，呼吸道，泌尿生殖器道給藥。因此本發(fā)明的一個方面是一種免疫人宿主抵抗由革蘭氏陰性細菌感染引起的疾病，其中的方法包括給藥于宿主有效量的本發(fā)明的囊泡宿主。
每一種疫苗劑量中的抗原的量被選擇依據其誘導在典型的疫苗中無顯著副作用的免疫保護性應答的量。此量將依據被采用的特異性免疫原以及其如何呈遞而變化。通常，人們期望每一劑量含有1-100Lg的蛋白抗原，優(yōu)選5-5011g，更典型的在5-2511g的范圍內。
特定疫苗的最佳的量可通過標準的研究包括受試者的適當免疫應答的觀察來確定。在首次接種疫苗后，受驗者可間隔地接受一或幾次加強免疫。
空胞(ghots)或滅活全細胞疫苗發(fā)明人設想上述的囊泡制劑和疫苗的改進可被擴展到空胞或滅活全細胞制劑和疫苗(帶有相同的優(yōu)點)。本發(fā)明修飾的用于制備囊泡制劑的革蘭氏陰性菌菌株也可被用于制備空胞或滅活全細胞制劑。從革蘭氏陰性菌制備空胞制劑(帶有完整外殼的空細胞)的方法是本領域公知的(參見例如WO 92/01791)。滅活全細胞來生產失活細胞制劑用于疫苗的方法也是已知的。為了本發(fā)明的目的，術語′囊泡制劑′和和′囊泡疫苗′貫穿此文獻的方法因此分別地適用于術語′空胞制劑′和‘空胞疫苗’，和′滅活全細胞制劑′和′滅活全細胞疫苗′。
方法a)-i)的組合可以理解一個或多個上述的方法可被用于產生修飾的菌株由其來制備本發(fā)明的改進的囊泡制劑。優(yōu)選的一個此種方法被使用，更優(yōu)選兩種或多種(2，3，4，5，6，7，8或9)方法被使用來制造囊泡疫苗。如同每一另外的方法被用在囊泡疫苗的生產中一樣，每一種改進的工作與其它的所使用的方法結合來制備最佳的工程改造囊泡制劑。
優(yōu)選的腦膜炎球菌(特別是腦膜炎奈瑟氏菌B)囊泡制備包括使用方法a)，b)，d)和/或e)，和h)。此囊泡制劑是安全的(沒有與宿主結構相似的結構)，無毒，且有結構的使得宿主免疫應答將集中在高水平的保護性(且優(yōu)選保守的)抗原上。所有上述原理共同作用提供最佳的囊泡疫苗。
類似于粘膜炎莫拉氏菌和非-典型的流感嗜血桿菌，優(yōu)選的囊泡制備包括方法a)，b)和d)和/或e)的應用。
本發(fā)明的另一個方面因此是適用于兒科使用的免疫保護性和無毒的革蘭氏陰性囊泡，空胞，或滅活全細胞疫苗。
兒科使用是指用于小于4歲的嬰幼兒。
免疫保護性是指至少40％(且優(yōu)選50，60，70，80，90和100％)的嬰幼兒血清轉化(在殺菌活性上增加4倍[在50％細菌死亡時的抗血清的滴度-參見例如PCT/EP98/05117])抵抗選自主要已知克隆組的一系列異源菌株。對于腦膜炎球菌B而言這些菌株應當具有不同于囊泡生產菌株的PorA型，并且應當優(yōu)選是2，3，4或，最優(yōu)選，所有的5種菌株H44/76，M97/252078，BZ10，NGP165和CU385。對于非典型的流感嗜血桿菌而言，菌株應優(yōu)選為2，3，4或最優(yōu)選所有的5種菌株3224A，3219C，3241A，640645和A840177。對于粘膜炎莫拉氏菌而言，菌株應優(yōu)選是2，3，4或，最優(yōu)選，為所有的5種菌株ATCC 43617，14，358，216和2926。
無毒是指內毒素活性通過公知的LAL和熱源性試驗測定有顯著的減少(2-4倍，優(yōu)選10倍)。
疫苗組合物本發(fā)明的另一個方面為含有本發(fā)明囊泡制劑和其它被用于抵抗特定疾病狀態(tài)的抗原的疫苗組合物。人們已發(fā)現囊泡特別適用于與其它抗原配劑，因為對其被混合的抗原有有益的佐劑作用。
在本發(fā)明優(yōu)選的組合的，meningoccocus B囊泡制劑與1，2，3或優(yōu)選所有的4種下列簡單的或結合于蛋白載體的腦膜炎球菌莢膜多糖一起配劑A，C，Y或W。此疫苗可被有益的用作通用的腦膜炎球菌疫苗。使用本發(fā)明的腦膜炎球菌B囊泡制劑，也可想象配劑可選擇的含有來自2或更多(優(yōu)選幾個)屬于一些亞型/血清型(例如選自P1.15，P1.7，16，P1.4，和P1.2)的菌株的野生型腦膜炎球菌B囊泡制劑。
在另外一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明腦膜炎球菌B囊泡制劑[或上述的2或多個野生型腦膜炎球菌B囊泡制劑的混合物]優(yōu)選的與，1，2，3或優(yōu)選所有的4種下列簡單的或結合于蛋白載體的腦膜炎球菌莢膜多糖一起配劑A，C，Y或W，與結合的流感嗜血桿菌b莢膜多糖，以及一或多個結合肺炎球菌莢膜多糖配劑?？蛇x擇的，疫苗也可含有一或多個可保護宿主抵抗肺炎鏈球菌感染的蛋白抗原。此疫苗可被有益地用作通用的腦膜炎疫苗。
肺炎球菌莢膜多糖抗原優(yōu)選的選自血清型1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F(最優(yōu)選的來自1，3，4，5，6B，7F，9V，14，18C，19F和23F)。
優(yōu)選的肺炎球菌蛋白抗原為這些肺炎球菌的蛋白其暴露在肺炎球菌的外表面(在至少肺炎球菌的部分生活周期能夠被宿主的免疫系統(tǒng)識別的)，或為肺炎球菌分泌或釋放的蛋。最優(yōu)選的，蛋白為毒素，粘附素，2-組分信號轉導蛋白，或肺炎鏈球菌的脂蛋白，或其片段。特別優(yōu)選的蛋白包括，但不限于肺炎球菌自溶酶(優(yōu)選通過嵌合處理或突變減毒)[Mitchell et al.Nucleic Acids Res.1990 Jul 11；18(13)4010″來自肺炎鏈球菌基因和蛋白1和2型的比較″，Mitchell et al.Biochim Biophys Acta 1989Jan 23；1007(1)67-72″肺炎球菌自溶酶基因在Escherichia coli中的表達快速純化和生物學特性″，WO 96/05859(A.Cyanamid)，WO 90/06951(Paton et al)，WO 99/03884(NAVA)]；PspA及其轉膜缺失變體(US5804193-Briles et al.)；PspC及其轉膜缺失變體(WO 97/09994-Briles et al)；PsaA及其轉膜缺失變體(Berry & Paton，Infect Immun 1996 Dec；64(12)5255-62″PsaA的序列異質性，推定的37-千道爾頓的肺炎鏈球菌的毒力所必需的粘附素″)；肺炎球菌膽堿結合蛋白及其轉膜缺失變體；CbpA及其轉膜缺失變體(WO 97/41151；WO 99/51266)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Infect.Immun.1996 643544)；HSP70(WO 96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato et al.FEMS Microbiol Lett 1998，164207-14)；M類蛋白，SB專利申請EP 0837130；以及粘附素18627，SB專利申請EP0834568。其它優(yōu)選的肺炎球菌蛋白抗原為公開在WO98/18931，尤其在WO 98/18930和PCT/US99/30390篩選的。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的粘膜炎莫拉氏菌囊泡制劑與與一或多種簡單的或結合肺炎球菌莢膜多糖以及一或多個可以保護宿主抵抗非典型的流感嗜血桿菌感染的抗原配劑?？蛇x擇的，疫苗也可含有一或多個可保護宿主抵抗肺炎鏈球菌感染的蛋白抗原。疫苗也可可選擇的含有能保護宿主抵抗RSV和/或一或多個可保護抗原抵抗流感病毒的抗原。此疫苗可被有益的用作通用的中耳炎疫苗。
優(yōu)選的非典型的流感嗜血桿菌蛋白抗原包括Fimbrin蛋白(US5766608)及其含有來自(例如LB1融合物)(US 5843464-俄亥俄州研究基金會)，OMP26，P6，蛋白D，TbpA，TbpB，Hia，Hmw1，Hmw2，Hap，和D15的肽的融合物。
優(yōu)選的流感病毒抗原包括完整的，活的或滅活的病毒，分裂的流感病毒，生長未成熟的或MDCK細胞，或Vero細胞或全流感病毒體(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所描述的)或其純化的或重組蛋白，例如HA，NP，NA，或M蛋白，或其重組物。
優(yōu)選的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白，G糖蛋白，HN蛋白，或其衍生物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明非典型的流感嗜血桿菌囊泡制劑與一或多個簡單的或結合的肺炎球菌莢膜多糖，以及一或多個可保護宿主抵抗粘膜炎莫拉氏菌感染的抗原配劑。可選擇的，疫苗可包含一或多個保護宿主抵抗Streptococcus pneumoni感染的蛋白抗原。疫苗也可選擇的含有一或多個保護宿主抵抗RSV的抗原和/或一或多個保護宿主抵抗流感病毒的抗原。此疫苗可被有益的用作通用的中耳炎疫苗。
本發(fā)明的核苷酸序列本發(fā)明的另一個方面涉及可被用于本發(fā)明方法中的新核苷酸序列。來自不同菌株的不同基因的特異性上游區(qū)域被提供其可被用于例如方法a)，b)，d)和h)。此外，編碼序列被提供用于實施方法d)。
用于細菌基因的非編碼側接區(qū)分析的常規(guī)方法，且其用于囊泡中的基因的調控表達特異性基因的非編碼側接區(qū)含有在基因的表達中重要的調控序列。此調控發(fā)生在轉錄和翻譯的水平上。這些區(qū)域的序列，基因開放閱讀框架的上游或下游序列，可被通過DNA測序來獲得。此序列信息允許可能的調控元件的測定例如不同的啟動子元件，終止子序列，誘導型序列元件，阻抑物，對位相變易起作用的元件，Shine-Dalgamo序列，帶有與調控有關的潛在次級結構的的區(qū)域，以及其他類型的調控元件或序列。
此序列信息允許被研究的基因的天然表達的調節(jié)?；虮磉_額上題可被完成通過改變啟動子，Shine-Dalgarno序列，潛在的阻抑物或操縱子元件，或任意其它有關的元件。同樣地，表達的下調可通過類似類型的調控來獲得?？蛇x擇的，通過改變位相變易序列，基因的表達可被置于位相變易的調控下，或脫離此種調控。在另一種方法中，基因的表達可被置于一或多種允許調控表達的誘導元件的調節(jié)下。此種調節(jié)的例子包括，但不限于，通過溫度轉換的誘導，誘導底物象所選的碳水化合物或其衍生物，痕量元素，維生素，輔因子，金屬離子等的加入。
此修飾如上所述可被通過一些不同的方式被導入。與基因表達有關的序列的修飾可被體內通過隨機的突變進行然后篩選所需的表型。另一種方法包括目的區(qū)域的分離和通過隨機突變修飾，或位點直接替換，插入或缺失突變。修飾區(qū)然后被重新導入到細菌染色體組通過同源重組，對基因表達的影響可被評定。在另一個方法中，目的區(qū)域的序列信息可被用于替換或缺失所有或部分的天然調控序列。在此情況下，調控序列靶被分離和修飾來含有來自另一個基因的調控元件，來自不同基因的調控元件的組合物，合成的調控區(qū)，或任意其它的調控區(qū)，或刪除野生型調控序列的所選部分。這些修飾的序列可然后被導入細菌中通過同源重組到染色體組中。
在方法b)中，例如，基因的表達可通過用強啟動子交換其啟動子被調節(jié)(通過基因上游序列的分離，體外修飾此序列，并通過同源重組重新導入到染色體組中)。上調表達可被獲得在細菌中和在細菌脫落(或產生的)外膜載體中。
在另一個有選的實施例中，所描述的方法可被用于產生帶有改進特性的重組細菌菌株中用于疫苗的應用。這些可以是，但不限于，減毒菌株，增加所選抗原表達的菌株，帶有干擾免疫應答的基因的敲除(或降低表達)的菌株，以及帶有免疫顯性蛋白的調節(jié)表達的菌株。
SEQ ID NO2-23，25，27-38為所有奈瑟氏菌上游序列(各種優(yōu)選基因的起始密碼子的上游)每一個含有大約1000bp。SEQ ID NO39-62為所有粘膜炎莫拉氏菌上游序列(各種優(yōu)選基因的起始密碼子的上游)每一個含有大約1000bp。SEQ ID NO63-75為所有流感嗜血桿菌上游序列(各種優(yōu)選基因的起始密碼子的上游)每一個含有大約1000bp。所有這些序列可被用于遺傳學方法中(特別是同源重組)用于上調或下調其結合的開放閱讀框架(如上所述)。SEQ ID NO76-81為來自奈瑟氏菌，粘膜炎莫拉氏菌，和流感嗜血桿菌的HtrB和MsbB基因的編碼區(qū)。這些序列可被用于遺傳學方法中(特別是同源重組)用于下調(特別是刪除)這些基因的一部分(優(yōu)選全部)[方法d]。
本發(fā)明的另一個方面是分離多核苷酸序列其在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO2-23，25，27-81或其互補鏈的至少30個核苷酸部分的核苷酸雜交。優(yōu)選的，分離的序列應足夠長來與染色體序列進行同源重組，如果染色體序列是合適的雜體的一部分-也即至少30個核苷酸(優(yōu)選至少40，50，60，70，80，90，100，200，300，400，或500個核苷酸)。更優(yōu)選的，分離的核苷酸應含有SEQ ID NO2-23，25，27-81或其互補鏈的至少30個核苷酸(優(yōu)選至少40，50，60，70，80，90，100，200，300，400，或500個核苷酸)。
此處所用的高度嚴謹雜交條件包括，例如6X SSC，5X Denhardt，0.5％SDS和100g/mL斷裂和退火的鮭精DNA雜交，65℃過夜并用2X SSC洗滌，室溫0.1％SDS一次大約10分鐘然后65℃一次大約15分鐘然后至少0.2X SCC洗滌一次，0.1％SDS室溫下至少3-5分鐘。
另一個方面是本發(fā)明分離的多核苷酸序列的應用在遺傳學改造(例如轉座子插入，或位點特異性突變或缺失，但優(yōu)選同源重組事件)革蘭氏陰性菌染色體基因的1000bp上游來增加或較少基因的表達。優(yōu)選的，將進行重組的菌株與獲得本發(fā)明上游序列的菌株相同。然而，腦膜炎球菌A，B，C，Ya和W以及淋病球菌染色體組足夠的相似使得來自這些菌株的上游序列可適用于設計用于在其它菌株中進行此事件的載體。此也適用于流感嗜血桿菌和非典型的流感嗜血桿菌的情況。
實施例下面的實施例通過標準方法來進行，其是本領域技術人員公知的和常規(guī)的，除非其另有具體描述。實施例是用來說明但并非限制本發(fā)明。
實施例1沒有莢膜多糖的腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株的構建質粒pMF121(Frosch et al.，1990)被用于構建沒有莢膜多糖的腦膜炎奈瑟氏菌B菌株。此質粒含有用于編碼B組多糖(B PS)的生物合成途徑的基因位點的側接區(qū)，以及紅霉素抗性基因。B PS的刪除導致B型莢膜多糖表達的減少同樣galE的活性拷貝的缺失導致半乳糖缺陷的LPS的合成。
菌株轉化腦膜炎奈瑟氏菌B H44/76菌株(B15P1.7，16；Los3，7，9)被選擇用于轉化。MH平皿(不含紅霉素)上CO2溫育過夜，用含10mM MgCl2(2ml were used per MH plate)的液態(tài)MH收集細胞并稀釋到OD為0.1(550nm)。加入4gl的質粒pMF121母液(0.5μg/ml)到2ml溶液中，37℃溫育6小時(振蕩)。對照組為相同量的腦膜炎奈瑟氏菌B細菌，單不加入質粒。在培養(yǎng)一段時間后，100μl培養(yǎng)物，本身，1/10，1/100和1/1000稀釋度，在37℃培養(yǎng)48小時前，被置于含有5，10，20，40或80μ紅霉素/的MH平皿中。
菌落印跡平皿培養(yǎng)后，20個菌落生長和選自10和20μg紅霉素/ml MH平皿，而在沒有質粒轉化的對照組中沒有菌落生長。H44/76野生型菌株不能夠在選擇性紅霉素平皿上生長(10到80μg紅霉素/ml)。然后，將所有的明顯的菌落置于新的不含紅霉素的MH平皿上來使其生長。后來，被轉到硝化纖維紙上(菌落印跡雜交)來檢驗B多糖的存在。扼要地，菌落被印跡到硝化纖維紙用PBS-0.05％Tween 20直接漂凈然后56℃在PBS-0.05％Tween 20(稀釋的緩沖液)細胞失活1小時。然后，膜室溫(RT)下在稀釋的緩沖液中覆蓋1小時。然后，紙被再次洗滌3次5分鐘在稀釋的緩沖液中然后用抗-B PS 735 Mab(Boerhinger)在稀釋度為1/3000的稀釋的緩沖液中RT下溫育2小時。在新的洗滌步驟后(3次5分鐘)，單克隆抗體被用來自Amersham(RPN 1001)在稀釋緩沖液中稀釋500倍的生物素?；目?鼠Ig篩選(RT下1小時)然后進行下一次的洗滌步驟(如上所述)。然后，紙被在RT下用被在稀釋緩沖液稀釋1/1000的鏈霉抗生素-過氧化物酶復合物的溶液溫育1個小時。在最后的3次利用相同方法的洗滌后，硝酸纖維素紙在黑暗中利用revelation溶液溫育15分鐘(10ml甲醇中加入30mg的4氯-1-萘酚溶液，40ml PBS和30mcl的來自Merck的H202 37％)。反應用蒸餾水洗滌步驟終止。
全細胞酶聯免疫吸附測定(Elisas)利用兩種轉化的菌落(″D″和″R″)以及野生型菌株(H44/76)作為包被細菌(20μg蛋白/ml)，且一系列用于鑒定腦膜炎奈瑟氏菌菌株的不同單克隆抗體進行全細胞Elisas。下面的Mabs被測定抗-B PS(735來自Dr Frosch)，以及其他的來自NIBSC的Mabs抗-B PS(Ref95/750)抗-Pl.7(A-PorA，Ref4025)，抗-Pl.16(A-PorA，Ref95/720)，抗-Los3，7，9(A-LPS，Ref4047)，抗-Los8(A-LPS，Ref4048)，以及抗-P1.2(A-PorA Ref95/696)。
100gl的重組腦膜炎球菌B細胞溶液覆蓋的微量滴定板(Maxisorp，Nunc)37℃在大約2μg/ml的PBS中過夜(ON)。然后，滴定板用300μl的150mM NaCI-0.05％Tween20洗滌3次，用100μl的PBS-0.3％Casein覆蓋并在室溫下振蕩溫育30分鐘。然后與抗體溫育前再次用相同的方法洗滌滴定板單克隆抗體。在下一次關鍵的洗滌步驟之前，單克隆抗體(100μl)以在PBS-0.3％Casein 0.05％Tween 20的不同稀釋度(如附圖2所示)被使用且在室溫振蕩溫育30分鐘前被置于微量培養(yǎng)板上。結合生物素且在PBS-0.3％Casein-0.05％Tween20中稀釋到1/2000的100μl的抗鼠Ig(來自小兔，Dakopatts E0413)被加到小孔中檢測結合的單克隆抗體。在洗滌步驟后(如上)，滴定板被與在相同溶液中稀釋到1/4000的鏈霉抗生素-過氧化物酶復合物的溶液(100μl的AmershamRPN 1051)室溫下振蕩溫育30分鐘。在此溫育和最后的洗滌步驟之后，滴定板與100μl的色原溶液(含有4mg正亞苯基二胺(OPD)的10ml 0.1M檸檬酸鹽緩沖液，pH4.5含有5μl H2O2)黑暗中溫育15分鐘。滴定板然后用分光光度計在490/620nm處進行讀數。
結果附圖1顯示了在能夠在帶有紅霉素的選擇培養(yǎng)基上生長的20個分離的菌落中，僅有2個(“D”和“R”)菌落的不存在B多糖。在其他的菌落中，有16個顯著的P BS陽性的且仍具有紅霉素抗性。此表明整合了質粒到其染色體組中，但在錯誤的方向，且仍保留完整的B PS和LPS基因(沒有雙重的交叉互換)。陽性和陰性的對照也被在滴定板上測定。且顯示了H44/76野生型NmB菌株顯著的多對B多糖陽性，而腦膜炎球菌A(A1)和腦膜炎球菌C(C11)菌株顯著的抗-B PS 735 Mab呈陰性。這些結果表明大約10％的所選的菌落被正確的整合質粒在其染色體組中通過產生雙重的交叉互換，而其它的菌株/菌落在簡單的交叉互換后被獲得，保留了B PS和LPS基因的完整和表達。
利用全細胞Elisa，結果(附圖2和下表2)清楚地表明了兩個″D″和″R″轉化(獲自D和R菌落)不能被抗-B PS Mabs(735和95/750)識別，也不能被抗-Los3，7，9和抗-Los8 Mabs識別。然而，當利用特異性抗-PorAMabs時，在細胞上，與抗-P1.7和抗-P1.16 Mabs有明顯的反應，同時也被在野生型菌株中觀察到。與非特異性抗-PorA Mab(抗-P1.2mab)沒有觀察到反應。這些結果證明PorA蛋白，和特異性PI.7和PI.16表面決定簇在轉化后仍然存在，而B多肽Los3.7，9和Los8表面決定簇(LPS不存在不存在。
表被檢驗的單克隆抗體的特異性

實施例2靶向腦膜炎奈瑟氏菌的porA位點的整合的多用途基因傳遞載體(pCMK系列)的構建使得外源DNA在腦膜炎奈瑟氏菌的porA位點同源重組和穩(wěn)定插入的質粒被構建。此傳遞載體(基因，操縱子和/或表達盒)有用于構建腦膜炎奈瑟氏菌菌株生產重組改進的囊泡。典型的，此種載體至少包括(1)在大腸桿菌中能復制但不在腦膜炎奈瑟氏菌中復制的質粒骨架(一個自殺質粒)，(2)在至少一個，優(yōu)選兩個靶向染色體組位點例如porA的整合的同源區(qū)，(3)在腦膜炎奈瑟氏菌中行使功能的有效的轉錄(啟動子，調控區(qū)和終止子)和翻譯(最佳的核糖體結合位點和起始密碼子)信號，(4)多克隆位點和(5)允許質粒維持在大腸桿菌中以及腦膜炎奈瑟氏菌中整合子的選擇的可選擇的基因。其它的元件包括，例如，促進外源DNA進入腦膜炎奈瑟氏菌的攝取序列，以及反向選擇的標記例如增強雙重交叉互換頻率的sacB，rpsL，gltS。
此實施例中的載體構建和指定的的圖表說明被描述在附圖3中。其相應的完整核苷酸序列被顯示于SEQ.ID NO1。獲自pSL 1180骨架的pCMK(PharmaciaBiotech，Sweeden)，在大腸桿菌中的高拷貝數質粒，攜帶bla基因(因此賦予氨芐青霉素抗性)。此外，pCMK功能地含有兩個同源重組必需的porA側接區(qū)(porA5′和porA3′含有一個轉錄終止子)，一個帶有卡那霉素抗性的選擇性標記，兩個攝取序列，一個被阻抑在表達lacIq的大腸桿菌宿主中但在腦膜炎奈瑟氏菌中有轉錄活性的porA/lacO嵌合啟動子，以及一個外源DNA在pCMK的插入所必需的復合克隆位點(5個位點為NdeI，XpnI，NheI，PinAl，和SphI)。
pCMK被構建如下porA5′和porA3′重組區(qū)，porA/lacO啟動子被利用下表所列舉的寡核苷酸PCR擴增，在pTOPO中克隆和測序。這些DNA片段被從pTOPO連續(xù)地切除并在pSL1180中再次克隆?？敲顾乜剐院斜粡膒UC4K切除(PharmaciaBiotech，Sweeden)病導入到porA5′側接區(qū)和porA/lacO啟動子區(qū)之間。
表此操作中所用的寡核苷酸 實施例3缺乏莢膜多糖和主要免疫顯性抗原PorA的腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株的構建外膜囊泡的抗原內含物的調節(jié)可有利于改進其在疫苗，或診斷或治療應用中的安全性和有效性。內容物例如腦膜炎奈瑟氏菌血清型B莢膜多糖應被去除來排除誘導自身免疫的危險(參見實施例1)。類似地，有益于抑制主要免疫抗原例如誘導菌株特異性殺菌抗體但不賦予其交叉保護的免疫顯性。為了闡明此種方法我們使用哦尼能夠我們使用pCMK(+)載體來構建缺乏莢膜多糖和主要免疫顯性PorA外膜蛋白抗原的腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株。為實現此目的，porA基因的一個缺失被導入到H44/76cps-菌株中，通過實施例1中所描述的同源重組的方式。
H44/76cps-菌株被有效地的制備并用兩個2μg的超螺旋pCMK(+)質粒DNA轉化。等分試樣的轉化混合物(100μl)被置于帶有卡那霉素(200μg/ml)的Mueller-Hinton平皿上病37℃培養(yǎng)24到48小時?？敲顾?抗性菌落被選擇，在MH-Kn上37℃重新劃線培養(yǎng)24個小時。在細菌培養(yǎng)的一半階段時，被用于制備甘油原液(15％vol./vol.)被-70℃保存。另一部分試樣(估計108個細菌)被重懸浮在15μl蒸餾水中，煮沸10分鐘用作PCR篩選的模板。兩個porA內引物，PPA1和PPA2，被合成并用于在制造商提供的條件下PCR擴增煮沸的細菌溶解產物(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。所用熱循環(huán)如下25次(94℃1min.，52℃1min.，72℃3min.)以及1次1(72℃10min.，4℃適于恢復)。pCMK DNA和和染色體porA位點之間的雙重交叉互換刪除#1和#2退火所需的區(qū)域，缺少1170bp PCR擴增片段的克隆被篩選作為porA缺失突變體。這些PCR結果被進一步的證實通過相應的細菌蛋白提取物的PorA存在的并列分析。為實現此目的，另一細菌的等分試樣(估計5.108細菌)被重懸浮在50μl的PAGE-SDS緩沖液中(SDS 5％，甘油30％，β-氫硫基乙醇15％，溴酚藍0.3mg/ml，Tris-HCI 250mM pH6.8)，煮沸(100℃)冰凍(-20℃)/煮沸(100℃)3次并通過在12.5％凝膠上PAGE-SDS電泳分離，凝膠然后被考馬斯亮藍R250染色或轉到硝化纖維膜上并用Maniatis等人所描述的抗-PorA單克隆抗體探測。如附圖4所述，考馬斯和免疫染色證明porA PCR陰性克隆不產生可檢測的PorA的水平。此結果證明pCMK載體是有功能的且可以成功的靶向DNA在porA基因中的插入，終止了PorA外膜蛋白抗原的同時的產生。
實施例4來自重組的缺少功能性PorA和cps基因的腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株的囊泡產生NspA外膜蛋白的上調帶有保護性抗原的囊泡水皰有益于提高基于外膜蛋白的疫苗的效率和范圍。在上下文中，重組的缺少功能性PorA和cps基因的腦膜炎奈瑟氏菌被工程改造使得外膜蛋白NspA的表達水平被上調。為實現此目的，編碼Nspa的基因被使用N01-full-NdeI和NdeI-3`寡核苷酸引物進行PCR擴增(參見實施例2的表)。PCR所用的條件如生產商所述(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。所用熱循環(huán)如下25次(94℃1min.，52℃1min.，72℃3min.)以及1次1(72℃10min.，4℃適于恢復)。相應的擴增子用NdeI降解并插入到pCMK(+)傳遞載體的NdeI限制性位點。插入的方向被檢查且重組質粒，設計的pCMK(+)-NspA，被通過QIAGEN maxiprep試劑盒被大規(guī)模純化且2μg的此種物質被用于轉化缺少缺少功能性cps基因的腦膜炎奈瑟氏菌B型菌株(菌株被描述在實施例1中)。pCMK(+)-NspA載體和染色體porA位點之間的雙重交叉互換產生的整合通過PCR和實施例3中所述的Western印跡雜交篩選方法的結合被篩選。
細菌(相應的大約5.108個細菌)被重懸浮在50μl的PAGE-SDS緩沖液中，冰凍(-20℃)/煮沸(100℃)3次且然后在12.5％凝膠上通過PAGE-SDS電泳分離。凝膠然后被考馬斯亮藍R250染色或轉到硝化纖維膜上并用抗-NspA多克隆血清探測?？捡R斯(無數據顯示)和免疫染色(見附圖4)證明porA PCR陰性克隆不產生可檢測的PorA的水平。檢測全細胞溶解產物(WCBL)或來自NmB[cps-，porA-]or NmB[cps-，porA-，Nspa+]的外膜囊泡制劑的NspA的表達。盡管考馬斯染色沒有觀察到差別，用抗-NspA多克隆血清進行的免疫印跡檢測到3-5倍的NspA在WCBL和外膜囊泡制劑(見附圖5)中表達的增加(與內源NspA水平相比)。此結果證明pCMK(+)-NspA載體是有功能的且可被用于成功的上調外膜蛋白例如NspA的的表達，去除PorA外膜蛋白抗原的同時生產。
實施例5來自重組的缺少功能性cps基因但表達PorA的腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株的囊泡的D15/Omp85外膜蛋白抗原的上調特定的獨立的人群(例如古巴)被屬于一或一些外膜蛋白的有限數目的腦膜炎奈瑟氏菌分離物感染。由于PorA是主要的誘導保護性和菌株特異性殺菌抗體的外膜蛋白抗原，其有可能通過有限量的疫苗中的porA血清型賦予疫苗保護性。在此上下文中，PorA在外膜水皰中的存在可能是有益于加強此種重組改進囊泡的疫苗效力。此含有疫苗的PorA，然而可通過增加其它的交叉反應OMPs例如omp85/D 15的水平被進一步的提高。
在下面的實施例中，pCMK(+)載體被用于上調Omp85/D15外膜蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表達porAde de菌株中的表達。為實現此目的，編碼Omp85/D15的基因通過利用D15-NdeI和D15-NotI寡核苷酸引物進行PCR擴增。PCR所用的條件如生產商所述(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。進行如下熱循環(huán)25次(94℃1min.，52℃1min.，72℃3min.)以及1次(72℃10min.，4℃適于恢復)。相應的擴增子依據生產商的說明被插入到pTOPO克隆載體中并進行測序證實。此Omp85/D 15 DNA片段被利用NdeI/NsiI限制性水解從pTOPO上切除隨后在pCMK(+)傳遞載體的相應限制性位點處克隆。重組質粒，試驗用pCMK(+)-D15通過QIAGEN maxiprep試劑盒被大規(guī)模純化且2μg的此種物質被用于轉化缺少缺少功能性cps基因的腦膜炎奈瑟氏菌B型菌株(菌株被描述在實施例1中)。為了保持porA的表達，單交叉互換(在Omp85/D15或在porA)產生的整合被通過PCR和Western印跡篩選方法的結合來篩選。PorA-特異性PCR和western印跡陽性的卡那霉素抗性克隆被-70℃保存作為甘油原種用于進一步的研究。
細菌(相應的大約5.108個細菌)被重懸浮在50μl的PAGE-SDS緩沖液中，冰凍(-20℃)/煮沸(100℃)3次且然后在12.5％凝膠上通過PAGE-SDS電泳分離。凝膠然后被考馬斯亮藍R250染色或轉到硝化纖維膜上并用抗-PorA單克隆血清探針檢測。如附圖6所示，考馬斯和免疫染色證明porA PCR陽性克隆產生PorA。
D15的表達被通過來自NmB[cps-，porA-]或NmB[cps-，porA+，D15+]的外膜囊泡制劑檢測?？捡R斯檢測到D15制劑，(附圖6)表達的顯著的增加(與內源D15的水平相比)。此結果證明pCMK(+)-D15載體載體是有功能的且可被用于成功的上調外膜蛋白例如D15的表達，沒有去除主要PorA外膜蛋白抗原的同時的產生。
實施例6多用途啟動子傳遞載體的構建合理的此方法的合理性表示在附圖7中且可被概述在7個必要的步驟中。這些步驟中的一些在下面用于上調NspA和D15/Omp85表達的載體的構建來闡述。
上調NspA基因表達的載體步驟1.一個位于NspA編碼基因的上游的DNA區(qū)(997bp)被發(fā)現(SEQ.ID NO2)在含有腦膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC 13090的未成熟染色體組DNA序列的個人Incyte PathoSeq數據庫中。兩個寡核苷酸PNS1和PNS2(見實施例2的表)被使用此序列設計和合成。這些引物被通過利用獲自H44/76菌株的染色體組進行PCR擴增。步驟2.相應的擴增子通過Wizard PCR試劑盒(Promega，USA)被清除并且用EcoRI/XaI限制性酶降解24小時，使用的條件如供應商所述(BoehringerMannheim，Germany)。相應的DNA片段被凝膠純化并插入到pUC18克隆載體的相應位點。步驟3重組質粒被大規(guī)模制備且等分試樣被用作模板用于反向PCR擴增。反向PCR利用PNS4和PNS5進行，采用下述的熱循環(huán)條件25次(94℃1min.，50℃1min.，72℃3min.)以及1次(72℃10min.，4℃恢復)。在NspA上游區(qū)插入攜帶缺失的線性化pUC 18載體被獲得。
上調D15/omp85基因表達的載體步驟1.一個位于D15/omp85編碼基因的上游的DNA區(qū)(1000bp)被發(fā)現(SEQ.ID NO3)在含有腦膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC 13090的未成熟染色體組DNA序列的個人Incyte PathoSeq數據庫中。兩個寡核苷酸PromD15-51X和PromD15-S2(見實施例2的表)被使用此序列設計和合成。這些引物被通過利用獲自H44/76菌株的染色體組進行PCR擴增。步驟2.相應的擴增子通過Wizard PCR試劑盒(Promega，USA)被清除并且用EcoRI/XaI限制性酶降解24小時，使用的條件如供應商所述(Boehringer Mannheim，Germany)。相應的DNA片段被凝膠純化并插入到pUC18克隆載體的相應位點。步驟3重組質粒被大規(guī)模制備且等分試樣被用作模板用于反向PCR擴增。反向PCR利用PromD15-51X和PromD15-S2進行，采用下述的熱循環(huán)條件25次(94℃1min，50℃1min.，72℃3min.)以及1次(72℃10min.，4℃恢復)。在NspA上流區(qū)插入攜帶缺失的線性化pUC 18載體被獲得。
實施例7生產重組囊泡的發(fā)酵方法。
本實施例列舉了下述的生產缺少莢膜多糖或莢膜多糖和PorA的重組囊泡的方法。此方法可被用于廣泛的腦膜炎奈瑟氏菌重組菌株并且可在延展的范圍上被修改。
培養(yǎng)基腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株在固體(FNE 004 AA，FNE010 AA)或液體(FNE 008 AA)培養(yǎng)基上繁殖。這些新的用于腦膜炎球菌生長的培養(yǎng)基不含動物產物是有利的，且可被認為是本發(fā)明的一個方面。

腦膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-重組囊泡的搖瓶培養(yǎng)進行兩步法培養(yǎng)包括在固體培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)然后進行液體培養(yǎng)。固體預培養(yǎng)。從冰庫(-80℃)取出一小瓶種子，室溫下解凍且0.1mL被劃線培養(yǎng)在含有15mL的FNE004AA(參見上述的)的陪替氏培養(yǎng)皿上。陪替氏培養(yǎng)皿37℃下培養(yǎng)18±2小時。表面生長物被重懸浮在8mL的添加15mg/L紅霉素的FNE008AA(參見上述的)中。搖瓶培養(yǎng).2mL的懸浮的固體預培養(yǎng)物被加到2升的含有400mL添加了15mg/L紅霉素的FNE008AA的搖瓶中。搖瓶被置于搖床(200rpm)上且37℃培養(yǎng)16±2個小時。通過4℃下5000g離心15分鐘從培養(yǎng)基中分離細胞。
腦膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-重組囊泡的分批培養(yǎng)培養(yǎng)包括在固體培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)，液體培養(yǎng)和分批培養(yǎng)。固體預培養(yǎng)。從冰庫(-80℃)取出一小瓶種子，室溫下解凍且0.1mL被劃線培養(yǎng)在含有15mL的FNE004AA(參見上述的)的陪替氏培養(yǎng)皿上。陪替氏培養(yǎng)皿37℃下培養(yǎng)18±2小時。表面生長物被重懸浮在8mL的添加15mg/L紅霉素的FNE008AA(參見上述的)中。液體預培養(yǎng)培養(yǎng).2mL的懸浮的固體預培養(yǎng)物被加到2升的含有400mL添加了15mg/L紅霉素的FNE008AA的搖瓶中。搖瓶被置于搖床(200rpm)上且37℃培養(yǎng)16±2個小時。搖瓶的內容物被用于20升發(fā)酵罐的接種。在發(fā)酵罐中的分批培養(yǎng)。接種物(400mL)被加到預先消毒的20升(總體積)含有10L的添加了15mg/L紅霉素的FNE008AA的發(fā)酵罐中。通過自動裝置加入NaOH(25％w/v)和H3PO4(25％v/v)調pH且維持在7.0。溫度被控制在37℃。通風速率維持在20L空氣/分鐘且可溶氧通過控制攪拌速度被維持在20％的飽和度。發(fā)酵的超壓被維持在300g/cm2。在培養(yǎng)9±1小時后，培養(yǎng)物處于不變的狀態(tài)。通過4℃下5000g離心15分鐘從培養(yǎng)基中分離細胞。
腦膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-，PorA-，重組囊泡的搖瓶培養(yǎng)進行兩步法培養(yǎng)包括在固體培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)然后進行液體培養(yǎng)。固體預培養(yǎng)。從冰庫(-80℃)取出一小瓶種子，室溫下解凍且0.1mL被劃線培養(yǎng)在含有15mL的FNE004AA(參見上述的)的陪替氏培養(yǎng)皿上。陪替氏培養(yǎng)皿37℃下培養(yǎng)18±2小時。表面生長物被重懸浮在8mL的添加200mg/L紅霉素的FNE008AA(參見上述的)中。搖瓶培養(yǎng).2mL的懸浮固體預培養(yǎng)物被加到2升的含有400mL添加了200mg/L紅霉素的FNE008AA的搖瓶中。搖瓶被置于搖床(200rpm)上且37℃培養(yǎng)16±2個小時。通過4℃下5000g離心15分鐘從培養(yǎng)基中分離細胞。
實施例8來自缺乏莢膜多糖的腦膜炎球菌的囊泡的分離和純化重組囊泡被純化如下所述。細胞團(42gr)被懸浮在211ml的pH8.6含有10mM EDTA和0.5％脫氧膽酸鈉(DOC)的0.1M Tris-Cl緩沖液中。緩沖液與生物質的比例為5/1(V/W)。通過在室溫下磁攪拌30分鐘提取生物質?？偟奶崛∥锶缓?℃20,000g離心30分鐘(A-20轉子13,000rpm，Beckman J2-HS離心機)。顆粒狀物被丟棄。上清液4℃，125,000g超離心2兩小時(50.2Ti轉子40,000rpm，Beckman L8-70M超速離心機)來收集水皰。上清液被丟棄。顆粒狀物然后懸浮在25ml的pH8.6含有2mM EDTA，1.2％DOC和20％蔗糖的50mM Tris-CI緩沖液中。在4℃，125,000g的第二次超離心兩小時步驟后，水皰被溫和地懸浮在44ml的3％蔗糖中且4℃下儲存。用于囊泡提取和純化的所有溶液含有0.01％硫柳汞鈉。如附圖8所闡明的，此方法產生高度富含于外膜蛋白例如PorA和PorB中的蛋白制劑。
實施例9適于抗原編碼基因的細菌啟動子的鑒定強細菌啟動子元件的應用對于獲得編碼外膜蛋白基因的上調是必需的。在上下文中，我們在前面顯示腦膜炎奈瑟氏菌nspA，hsf，和omp85基因利用porA啟動子的上調允許我們分離富含在相應的NspA，Hsf和Omp85蛋白中的重組囊泡?？蛇x擇的，porA啟動子可被用于獲得上調的不同水平，來克服可能的porA相變和/或來獲得有條件的基因表達(鐵調控的啟動子)。在此我們描述了一種方法允許可能在細菌中賦予高水平表達的強啟動子元件的正確轉錄起始位點的鑒定。由于啟動子調控元件典型的包含在+1位點的200bp上游和50bp下游之間(Collado Vides J，Magasanik B，Gralla JD，1991，Microbiol Rev55(3)371-94)，此實驗的結果允許我們來鑒定大約250bp的攜帶強啟動子活性的DNA片段。主要的外膜蛋白例如腦膜炎奈瑟氏菌PorA，PorB & Rmp，流感嗜血桿菌PI，P2，P5 & P6，粘膜炎莫拉氏菌OmpCD，OmpE，以及這些細菌的胞質和/或鐵調控的蛋白具有強啟動子元件。作為此基本方法的驗證，我們通過cDNA元件的快速擴增圖繪了強腦膜炎奈瑟氏菌porA和porB啟動子的轉錄位點(5′RACE)。
5′RACE的原理如下1)利用QIAGEN″RNeasy″試劑盒的總RNA提取。染色體組DNA通過Dnase處理去除然后QIAGEN純化；2)用porA特異性3`末端引物(porA 3)進行mRNA逆轉錄。期望的cDNA大小307nt。通過堿水解去除RNA；3)通過T4 RNA連接酶結合單鏈DNA寡錨鉤(稱為DT88)到cDNA的3`末端。理想的產物大小335nt。A利用hemi-巢式PCR的組合擴增錨鉤結合的cDNA；4)利用互補序列錨定引物作為5`末端引物(稱為DT89)和其在3`末端RT引物porA 3中的3`末端引物(稱為p1-2)PCR擴增錨鉤結合的cDNA。理想的產物大小292bp；5)PCR擴增前面的PCR產物通過使用DT89作為5′末端引物以及pl-1(pl-2內)作為3′末端引物。理想的產物大小21lbp；以及6)用pl-1引物進行測序(期望的產物大小可被計算因為在“ATG”翻譯起始位點的porA轉錄起始位點是已知的59)。
實驗步驟總RNA從腦膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-porA+菌株的大約109個細胞提取。通過QIAGEN″RNAeasy″試劑盒按照生產商的說明書進行提取1ml的適當的光學密度(OD600＝1)的液體培養(yǎng)物。染色體DNA被除去通過加入10U的不含RNase的Dnase(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)到30μl的洗脫RNA中且37℃培養(yǎng)15分鐘。不含DNA的RNA被用相同的QIAGEN試劑盒按照說明書純化。
通過使用引物porA3和200U的SUPERSCRIPT II逆轉錄酶(LifeTechnologies)進行逆轉錄反應。RT反應在含有5gl的2mM dNTP，20pmol的porA3引物，5μl的10X SUPERSCRIPT II緩沖液，9μl的25mM MgCl2，4μl的0.1M DTT，40U的重組核糖核酸酶抑制劑和1μg的總RNA的50μl體積溶液中反應。在加入SUPERSCRIP II之前porA3引物被逐步退火(70℃2min，65℃1min，60℃1min，55℃1min，50℃1min和45℃1min)。RT反應被進行42℃30min，然后5個循環(huán)(50℃1min，53℃1min以及56℃1min)來改變RNA次級結構。進行兩個平行的反應，其中的一個反應不加逆轉錄酶作為陰性對照。
在68℃溫育5分鐘前通過加入1μl的0.5MEDTA然后加入12.5μl的0.2MNaOH的堿性水解來除去RNA。反應通過加入12.5μl的1MTris-HCI(pH7.4)中和。并通過加入20μg的糖原(Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，Germany)，5μl的3M醋酸鈉以及60μ的異丙醇被沉淀。兩個樣品均被重懸浮在20μl的10∶1 TE(10mM Tris-HCI，pH7.4；1mM EDTA，pH8)中。
T4 RNA連接酶被用于錨定5′-磷?；模?′末端ddCTP阻抑的錨定寡核苷酸DT88(見下表)。兩個平行的實驗在室溫下進行且每一含有1.3μl的10X RNA連接酶緩沖液(Roche Molecular Biochemicals)，0.4μM DT88，10μl的cDNA或RT對照試樣以及3U的T4 RNA連接酶。作為陰性對照，進行第二組的結合試驗，省略T4 RNA連接酶，產生的未直接純化的連接反應混合物被用在隨后的PCR中。
錨鉤連接的cDNA通過使用hemi-巢式和熱啟動的PCR方法的聯合被擴增來增加特異性和產物產量。RT/連接酶反應液和對照被進行四個獨立的第一循環(huán)PCR且在30μl的體積中進行，每一含有3μl的10X TaqPlatinium緩沖液，3μl的25mM MgCl2，1μl的10mM dNTP，10pmol的每種引物以及1μl的RNA結合反應液。PCR通過使用Taq Platinium(Life Technologies)DNA聚合酶(加入2U)被熱啟動。第一次連接錨定的PCR(LA-PCR)通過使用10pmol的錨鉤特異性引物DT89和3`末端RT引物porA 3內的轉錄特異性引物pl-2(見下表)來進行。PCR被進行通過采用起始95℃5min步驟(用于DNA聚合酶激活)然后10個循環(huán)95℃10s和70℃1min(每個循環(huán)減少1度)，15循環(huán)的95℃10s和60℃1min。第二組hemi-巢式LA-PCR在相同條件下進行使用引物DT89和pl-2內部的引物，加之10pmol的p1-1(見下表)和1μl的第一循環(huán)的PCR。在送至測序前，擴增的產物通過使用QIAGEN″QIAquickPCR purification″試劑盒按照生產商的說明書進行純化。
CEQTMDye Terminator Cycle測序試劑盒(Beckman，France)被用于RACE PCR產物的測序采用10pmol引物pl-1。測序反應被通過按照說明書進行且測序產物被通過Ceq2000 DNA分析系統(tǒng)(Beckman-Coulter)分析。

腦膜炎奈瑟氏菌porA啟動子的結果采用所述的通過5′RACE操作圖繪了腦膜炎奈瑟氏菌血清型B(菌株H44/76)porA-mRNA的轉錄起始的ATG起始密碼子的59bp上游。此結果證實了通過引物延伸進行且被van der Ende等人(1995)公開的繪圖。此結果支持含有porA ATG的-9到-259核苷酸的DNA片段適于推動腦膜炎奈瑟氏菌和可能的在其它細菌例如嗜血桿菌屬，摩拉克氏菌屬，假單胞菌屬中的強基因表達。
腦膜炎奈瑟氏菌porB啟動子的結果相同的試驗策略被用于腦膜炎奈瑟氏菌血清型B(菌株H44/76)porB轉錄起始位點的圖繪。下列表中的與3′末端RT引物(porB3)，轉錄特異性引物對應的對應的引物在porB2(porB1)內。porB3，porB2和porB1分別位于ATG起始密碼子的265bp，195bp和150bp下游。

利用porB1和DT89引物進行5′-RACE繪圖獲得了一個～200bp的PCR擴增子。由于porBlis位于距離porB ATG起始密碼子150bp處，此結果支持porB t轉錄起始位點位于porB ATG的大約50bp(+/-30bp)上游處。
對應于轉錄起始的準確的核苷酸目前通過DNA測序被測定。上述的PCR結果支持含有相對于porBATG起始密碼子的-1到-250處核苷酸的DNA片段適于推動腦膜炎奈瑟氏菌和可能的在其它細菌例如嗜血桿菌屬，摩拉克氏菌屬，假單胞菌屬中的強基因表達。
實施例10通過啟動子替換上調腦膜炎奈瑟氏菌血清型B的Omp85基因實驗的目的是要用強porA啟動子替換D15/Omp85基因的內源啟動子區(qū)來上調D15/Omp85抗原的產生。為實現此目的，利用大腸桿菌克隆方法構建啟動子替換質粒。位于D15/omp85編碼基因的上游的DNA區(qū)(1000bp)被發(fā)現(SEQ ID NO3)在含有腦膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC13090的未成熟染色體組DNA序列的private Incyte PathoSeq數據庫中。此方法的主要步驟被闡述在附圖9中。簡要的，包含相對于D15/Omp85基因起始密碼子(ATG)為核苷酸-48到-983的DNA片段(1000bp)被利用分別含有EcoRI和XbaI限制性位點(加下劃線)的寡核苷酸ProD15-51X 和Pro15-52( )進行PCR擴增。此片段被限制并被插入到用相同酶限制的pUC18質粒中。獲得的構建物被使用由New England Biolabs(MA，USA)商業(yè)生產的Genome Priming系統(tǒng)(使用pGPS供體質粒)在體外進行突變。已被插入微轉座子(來自Tn7且攜帶氯霉素抗性基因)的克隆被篩選。一個含有在距離EcoRI位點下游的401bp處的D15/Omp85 5`側接區(qū)插入微轉座子的克隆被分離并用于進一步的研究。此質粒被遞交循環(huán)PCR突變(Jones & Winistofer(1992)，Biotechniques12528-534)來(i)來刪除轉座過程產生的重復DNA序列(Tn7R)，(ii)插入用于轉化的腦膜炎球菌吸收序列，以及(iii)插入合適的允許外源DNA物質例如啟動子克隆的限制性位點。循環(huán)的PCR被進行利用含有吸收序列和合適的加下劃線的限制性位點(KpnI和XbaI)TnRDlS-KpnI/Xbal+US( AGC CGT CTG AAC CAC TCG TGG ACA ACC C-3′)& TnR03Cam(KpnI) 的寡核苷酸。產生的PCR片段被凝膠純化，用Asp718(KpnI的同切點酶)降解并連接到含有porA啟動子的184bp DNA片段上并通過利含有KpnI限制性位點的PorA-01( 和PorA02( 3′)寡核苷酸進行PCR獲得的。攜帶在正確方向(轉錄從EcoRI到XbaI的方向進行)插入porA啟動子的重組克隆被選擇并用于轉化缺少莢膜多糖和一種主要的外膜蛋白PorA(porA-)的腦膜炎奈瑟氏菌血清型B的菌株。產生于雙重交叉互換事件的重組的腦膜炎奈瑟氏菌克隆(利用寡核苷酸Cam-05(5′-GTA CTG CGA TGA GTG GCA GG-3′)& proD15-52的PCR篩選)被置于含有5μl/ml氯霉素的GC培養(yǎng)基上篩選并分析D15/Omp85的表達。如附圖10所描述的，與親本菌株(cps-)相比，D15/Omp85的產生顯著的增加了由啟動子替換產生的Nm菌株的總蛋白提取物。當分析由相同菌株制備的外膜囊泡時也觀察到此結果(參見附圖17)。這些結果得益于內源D15啟動子被強porA啟動子的替換。此外，令人吃驚地發(fā)現當porA啟動子被導入到起始密碼子上游的大約400bp處時，表達是啟動子被替換在大約100bp的上游時的50倍。總而言之，這些實驗支持了啟動子替換策略并允許整合的外膜蛋白在外膜囊泡中合成的上調。
特定的獨立人群(例如古巴)被屬于一或一些外膜蛋白的有限數目的腦膜炎奈瑟氏菌分離物感染。由于PorA是主要的誘導保護性和菌株特異性殺菌抗體的外膜蛋白抗原，其可能通過有限量的porA血清型賦予疫苗保護性。此外，PorA與其他的外膜蛋白相互作用或使其更加穩(wěn)定。在此上下文中，PorA在外膜水皰中的存在可能是有益于加強此種重組改進囊泡的疫苗效力。
因為此原因，D15/Omp85外膜蛋白蛋白在缺少功能性cps基因但表達PorA染色體組DNA的腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株中的表達的上調是人們所期望的。染色體組DNA從重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-，porA-，D15/Omp85+菌株中通過使用QIAGEN Genomic Tips 100-G試劑盒提取。10μg此物質被線性化并通過典型的轉化方法用于轉化腦膜炎奈瑟氏菌血清組B cps-。在含有5μgr/ml氯霉素的GC瓊脂平皿上獲得重組奈瑟氏菌。
D15基因的上游的雙重交叉互換產生的整合被通過前面所述的PCR篩選。因為同源重組克在染色體的任意處發(fā)生，第二種PCR篩選方法被進行來控制重組菌株中的porA部位的整合。為實現此目的，內部的porA引物PPA1(5-GCG GCC GTT GCC GAT GTC AGC C-3′)和PpA2(5-GGCATA GCT GAT GCG TGG AAC TGC-3′)被用在PCR篩選試驗中。1170bp片段的擴增證明了porA基因在重組細菌中的存在。
重組細菌(相應的大約5.108個細菌)可被重懸浮在50μl的PAGE-SDS緩沖液中，冰凍(-20℃)/煮沸(100℃)3次然后通過PAGE-SDS電泳在12.5％凝膠上分離。凝膠用考馬斯亮藍R250染色或轉到硝化纖維膜上用抗-porA單克隆抗體或抗-D15/Omp85兔多克隆抗體探針檢測。由相同菌株制備的外膜囊泡的分析也被進行。
實施例11缺少功能性cps基因但表達PorA的重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型組B菌株的Hsf蛋白抗原的上調如上所述，在特定的國家中，PorA在外膜囊泡中的存在可能是有益的，且可加強重組改進囊泡的疫苗效力。在下面的實施例中，我們使用修飾的pCMK(+)載體來上調Hsf蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表達PorA的菌株中的表達。原始的pCMK(+)載體含有一個嵌合的在表達lacIq的大腸桿菌宿主中被抑制但在腦膜炎奈瑟氏菌有轉錄活性的porA/lacO啟動子。在修飾的pCMK(+)，天然的porA啟動子被用于推動hsf基因的轉錄。編碼Hsf的基因被利用列在下表中的HSF 01-NdeI和HSF 02-NheI寡核苷酸引物PCR擴增。因為用HSF 01-NdeI作為引物，表達的Hsf蛋白將在5`末端含有兩個甲硫氨酸殘基。PCR擴增的條件是供應商所描述的(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。采用下述的熱循25次(94℃1min.，50℃1min.，72℃3min.)以及1次(72℃10min.，4℃恢復)。相應的擴增子然后被被克隆到相應的pCMK(+)傳遞載體的限制性位點中。在此重組質粒，設計的pCMK(+)-Hsf中，我們刪除了存在于嵌合porA/lacO中的lacO通過一個重組PCR策略(見附圖12)。pCMK(+)-Hsf質粒被用作模板來PCR擴增2個獨立的DNA片段。
-片段1含有porA5′重組區(qū)，卡那霉素抗性基因和porA啟動子。所用的寡核苷酸引物，RP1(SacII)和RP2，被列在下列的表中。RP1引物剛好與lac操縱子的上游序列同源。
-片段2含有來自porA基因的Shine-Dalgarno序列，hsf基因和porA3′重組遺傳區(qū)。所用的寡核苷酸，RP3和RP4(ApaI)，被顯示于下表中。RP3引物與lac啟動子的下游序列同源。片段1的3`末端和片段2的5`末端具有48個核苷酸的重疊。500ng的每一PCR(1和2)被用作使用引物RP1和RP4的最后的PCR。最后獲得的擴增子被亞克隆到用SacII和ApaI限制的pSL 1180載體中。修飾的質粒pCMK(+)-Hsf被大規(guī)模的純化利用QIAGEN maxiprep試劑盒和2μg的此種物質被用于轉化缺少功能性cps基因的腦膜炎奈瑟氏菌血清組B菌株(在實施例1中描述的菌株)。為了維持porA的表達，單交叉互換產生的整合通過PCR和Western印跡篩選法的聯合被篩選。porA-特異性PCR和western印跡的聯合測試陽性的卡那霉素抗性克隆在-70℃保存作為甘油原種并用于進一步的研究。細菌(相應的大約5.108個細菌)被重懸浮在50μl的PAGE-SDS緩沖液中，冰凍(-20℃)/煮沸(100℃)3次且然后被通過PAGE-SDS電泳在12.5％的凝膠上分離。Hsf的表達被檢測在來自NmB[Cps-，PorA+]或NmB[Cps-，PorA+，Hsf+]的全細胞細菌溶解產物(WCBL)中。考馬斯染色檢測Hsf表達的顯著增加(與內源Hsf的水平相比)(參見附圖13)。此結果證明修飾的pCMK(+)-Hsf載體是功能性的且可被用于成功的上調外膜蛋白的表達，沒有去除主要的PorA外膜蛋白抗原的產生。
此操作中所用的寡核苷酸

實施例12綠色熒光蛋白蛋白在重組的缺乏功能性cps基因但表達PorA的重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株中的表達。
在下述實施例中，pCMK載體被用于測定胞質異源蛋白在腦膜炎奈瑟氏菌中的表達。從pKen-Gfpmut2質粒用引物GFP-Asnmut2和GFP-Spe擴增綠色熒光蛋白(參見實施例11的表)。AsnI提供了與NdeI相容的粘性末端，SpeI提供了與NheI相容的粘性末端。PCR擴增的條件是供應商所描述的(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。采用下述的熱循25次(94℃1min.，50℃1min.，72℃3min.)以及1次(72℃10min.，4℃恢復)。相應的擴增子然后被被克隆到相應的用NdeI和NheI限制性酶降解的pCMK(+)傳遞載體中。在此重組質粒，設計的pCMK(+)-GFP中，我們通過重組PCR策略刪除了存在于嵌合porA/lacO中的lacO。pCMK(+)-GFP質粒被用作模板來PCR擴增2個獨立的DNA片段。
-片段1含有porA5′重組區(qū)，卡那霉素抗性基因和porA啟動子。所用的寡核苷酸引物，RP1(SacII)和RP2(參見實施例11的表)。RP1引物剛好與lac操縱子的上游序列同源。
-片段2含有來自porA Shine-Dalgarno序列，gfp基因和porA3′重組遺傳區(qū)。所用的寡核苷酸，RP3和RP4(ApaI)，被顯示于實施例11的表中。RP3引物與lac啟動子的下游序列同源。片段1的3`末端和片段2的5`末端具有48個核苷酸的重疊。500ng的每一PCR(1和2)被用作使用引物RP1和RP4的最后的PCR。20μg的此種PCR片段被用于轉化缺少功能性cps基因的腦膜炎奈瑟氏菌血清組B菌株。
用線性DNA進行的轉化的效率低于用環(huán)狀質粒DNA進行的轉化，但所有的重組子通過雙重交叉互換被獲得(通過PCR和Western印跡篩選法的聯合被證實)?？敲顾乜剐钥寺≡?70℃保存作為甘油原種并用于進一步的研究。細菌(相應的大約5.108個細菌)被重懸浮在50μl的PAGE-SDS緩沖液中，冰凍(-20℃)/煮沸(100℃)3次且然后被通過PAGE-SDS電泳在12.5％的凝膠上分離。
GFP的表達被檢測在來自NmB[Cps-，PorA+]或NmB[Cps-，PorA+，GFP+]的全細胞細菌溶解產物(WCBL)中?？捡R斯染色檢測GFP表達的缺失在受體腦膜炎奈瑟氏菌菌株中(參見附圖14)。
實施例13通過啟動子替換上調腦膜炎奈瑟氏菌血清型B的NspA基因本實驗的目的是通過強porA啟動子替換NspA基因的內源啟動子區(qū)來上調NspA抗原的產生。為實現此目的，利用大腸桿菌克隆方法構建啟動子替換質粒。位于NspA編碼基因的上游的DNA區(qū)(924bp)被發(fā)現(SEQ ID NO7)在含有腦膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC 13090的未成熟染色體組DNA序列的private Incyte PathoSeq數據庫中。一個包含相對于NspA基因起始密碼子(ATG)為核苷酸-115到-790的DNA片段(675bp)被利用分別含有EcoRI和XbaI限制性位點(加下劃線)的寡核苷酸PNS1′( )和PNS2( )進行PCR擴增。此片段被限制并被插入pUC18質粒中。此質粒被進行循環(huán)PCR突變(Jones & Winistofer(1992)，Biotechniques12528-534)來插入用于轉化的腦膜炎球菌吸收序列，以及合適的允許CmR/PorA啟動子盒的克隆的限制性位點。循環(huán)的PCR被進行利用含有吸收序列和合適的加下劃線的限制性位點(XmaI和XhoI)BAD01-2( CGA TGG AAA ACG CAG C-3′)&BAD02-2( GTT CAG ACG GCG CGC TTA TAT AGT GGA TTA AC-3′)的寡核苷酸。產生的PCR片段被凝膠純化he用XhoI降解。CmR/PorA啟動子盒被從前面所述的pUC D15/Omp85質粒擴增，使用含有合適的限制性位點(XmaI，XbaI，SpeI和XhoI)加下劃線的引物BAD15-2( )& BAD03-2(5′- 獲得的PCR片段被降解并插入到用相應的酶限制的環(huán)狀PCR質粒中。10μg的重組質粒被線性化并用于轉化缺少莢膜多糖(cps-)和一種主要的外膜蛋白PorA(porA-)的腦膜炎奈瑟氏菌血清型B的菌株。產生于雙重交叉互換事件的重組的腦膜炎奈瑟氏菌克隆(利用寡核苷酸BAD25(5′-GAG CGA AGC CGT CGA ACG C-3′)& BAD08(5′-CTT AAG CGT CGGACA TTT CC-3′)的PCR篩選)被置于含有5μl/ml氯霉素的GC培養(yǎng)基上篩選并分析NspA的表達。重組細菌(相應的大約5.108個細菌)可被重懸浮在50μl的PAGE-SDS緩沖液中，冰凍(-20℃)/煮沸(100℃)3次然后通過PAGE-SDS電泳在12.5％凝膠上分離。凝膠用考馬斯亮藍R250染色或轉到硝化纖維膜上用抗-porA單克隆抗體或抗-NspA多克隆抗體探針檢測(參見附圖17)。如同Omp85，令人吃驚的發(fā)現了啟動子在NspA起始密碼子的大約400bp上游的插入比在大約100bp上游處插入表達更多的蛋白。
相同重組質粒pUC質?？杀挥糜谏险{NspA在缺乏功能性cps基因但仍表達NspA的腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株中的表達。
實施例14通過啟動子替換上調腦膜炎奈瑟氏菌血清型B的pldA4(OmplA)基因本實驗的目的是通過強porA啟動子替換pldA4(OmplA)基因的內源啟動子區(qū)來上調pldA4(OmplA)抗原的產生。為實現此目的，利用大腸桿菌克隆方法構建啟動子替換質粒。位于pldA編碼基因的上游的DNA區(qū)(373bp)被發(fā)現(SEQ ID NO18)在腦膜炎奈瑟氏菌菌株的privateIncyte PathoSeq數據庫中。此DNA含有編碼推定的rpsT基因的序列。RpsT的終止密碼子位于plda ATG的上游169bp處。為避免此可能地重要基因的干擾，我們決定在pldA ATG的上游插入CmR/PorA啟動子盒。為實現此目的，對應于rpsT基因的992bp的DNA片段，169bp基因間序列以及pldA基因的499個最初的核苷酸被從腦膜炎奈瑟氏菌血清型B染色體組DNA使用含有吸收序列(加下劃線)的寡核苷酸PLA1 Amo5 和PLA1Amo3( AC-3′)進行PCR擴增。PLA1 Amo3也含有XbaI限制性位點。此PCR片段被用High Pure試劑盒(Roche，Mannheim，Germany)純化并直接在克隆在pGemT vector(Promega，USA)中。此質粒被進行循環(huán)PCR突變(Jones & Winistofer(1992))來插入合適的允許CmR/PorA啟動子盒的克隆的限制性位點。此循環(huán)PCR被進行利用含有合適的限制性位點(BgIII和XhoI)加下劃線的CIRC1-Bgl( TTG TCG-3′)& CIRC1-XH-RBS/2( AAG CCG ATA TGA ATA TAC GGA ATA TGC G-3′)或CIRC2-XHO/2 寡核苷酸。CmR/PorA啟動子盒被擴增自先前描述的pUC D15/Omp85質粒，利用含有合適的限制性位點(BgIII用和XhoI)加下劃線的引物BAD20(5′-TCC CCC GGG AGATCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3′)和CM-PORA-3(5′-CCG 。此PCR片段被克隆在用引物CIRCI-Bgl和CIRC1-XH-RBS/2獲得的循環(huán)PCR質粒中。此質?？杀挥糜谵D化腦膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-)和(cps-porA-)菌株。通過pldA的上游區(qū)域雙重交叉互換的整合將直接插入porA啟動子到pldA ATG的上游。另一個盒被從通過啟動子替換超表達D15/Omp85的重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-，porA-，D15/Omp85+)的染色體組DNA擴增。此盒含有cmR基因，porA啟動子和400bp的D15/Omp85基因的5`側接序列。此序列已被證明有效的上調D15/Omp85在奈瑟氏菌中的表達并且將被試驗其它奈瑟氏菌抗原的上調。用于擴增的引物是含有AhoI限制性位點(加下劃線)的BAD 20和CM-PORA-D15/3(5′-CGGCTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3′)。此PCR片段被克隆在用引物CIRCI-Bgl和CIRC2-XHO/2獲得的循環(huán)PCR質粒中。此質粒被用于轉化腦膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-)和(cps-，porA-1菌株。通過pldA上游區(qū)域的雙重交叉互換產生的整合將直接插入porA啟動子到pldAATG的400bp上游。
實施例15通過啟動子替換上調腦膜炎奈瑟氏菌血清型B的tbpA基因本實驗的目的是通過強porA啟動子替換tbpA基因的內源啟動子區(qū)來上調TbpA抗原的產生。為實現此目的，利用大腸桿菌克隆方法構建啟動子替換質粒。位于tbpA編碼基因的上游的DNA區(qū)(731bp)被發(fā)現(SEQ ID NO17)在含有腦膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC 13090的private Incyte PathoSeq數據庫中。此DNA含有編碼TbpB抗原的序列?；蛟诓倏v子中是有組織的。TbpB基因將被刪除或通過CmR/porA啟動子盒取代。為達到此目的，對應于tbpB的509bp5`側接區(qū)的3218bp的DNA片段，2139bp tbpB編碼序列，87bp基因間序列以及tbpA編碼序列的483個最初核苷酸被從腦膜炎奈瑟氏菌血清型B染色體組DNA擴增利用含有吸收序列和NheI和HindIII限制性位點(加下劃線)的寡核苷酸BAD16(5′GGC CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTTCAA AAT TTA TTC3′)和BAD17(5′-GGC CAA GCT TCA GAC GGCGTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3′)。此PCR片段用High Pure試劑盒(Boerhinger Mannheim，Germany)純化并直接克隆在pGemT載體(Promega，USA)。此質粒被進行循環(huán)PCR突變(Jones & Winistofer(1992))來(i)插入合適的允許CmR/PorA啟動子盒克隆的限制性位點和(ii)刪除tbpB和tbpB編碼序列的5`側接序列的209bp。循環(huán)PCR被進行利用含有合適的限制位點XmaI，BglII和XhoI(加下劃線)的BAD 18(5′-TCC &BAD 19( AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G-3′)寡核苷酸。CmR/PorA啟動子盒被從前面所述的pUC D 5/Omp85質粒擴增，利用含有合適的限制性位點XmaI，SpeI，BglII和SoI(加下劃線)的引物BAD21 &BAD20( CC-3′)。此PCR片段被克隆在循環(huán)PCR質粒中。此質粒將被用于轉化腦膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-)和(cps-porA-)菌株。通過tbpA上游區(qū)域的雙重交叉互換產生的整合將直接插入porA啟動子到tbpA ATG的400bp上游。
實施例16通過啟動子取代上調腦膜炎奈瑟氏菌血清型B pilQ的基因本實驗的目的是通過強porA啟動子替換pilQ基因的內源啟動子區(qū)來上調pilQ抗原的產生。為實現此目的，利用大腸桿菌克隆方法構建啟動子替換質粒。位于pilQ編碼基因的上游的DNA區(qū)(772bp)被發(fā)現(SEQ ID NO12)在含有腦膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC 13090的privateIncyte PathoSeq數據庫中。此DNA含有編碼PilP抗原的序列。PilQ基因是我們不期望干擾的操縱子的一部分，菌毛蛋白是細菌的必要元件。CmR/porA啟動子盒被按照pldA基因表達的上調所述的相同的策略導入到pilQ基因的上游。為達到此目的。對應于菌毛蛋白編碼序列的3`部分的866bp的DNA片段，18bp基因間序列以及392個pilQ基因的最初核苷酸從奈瑟氏菌血清型B染色體組DNA利用含有吸收序列和NheI和HindIII限制性位點(加下劃線)的PQ-rec5-Nhe(5′-CTA GCT AGC GCCGTC TGA ACG ACG CGA AGC CAA AGC-3′)和PQ-rec3-Hin(GCC AAGCTT TTC AGA CGG CAC GGT ATC GTC CGA TTC G-3′)寡核苷酸擴增而來。此PCR片段被直接克隆在pGemT載體(Promega，USA)中。此質粒被進行循環(huán)PCR突變(Jones & Winistofer(1992))來插入合適的允許CmR/PorA啟動子盒克隆的限制性位點。循環(huán)PCR被進行利用含有合適的限制位點BglII和XhoI(加下劃線)的PCR CIRC1-PQ-Bgl(5′-GGA & CIRC1-PQ-XHO(5′- TGA CAA AAA TC-3′)或CIRC2-PQ-X( ACC AAA CTG ACA AAA ATC-3′)寡核苷酸。CmR/PorA啟動子盒被從上述的pUC D15/Omp85質粒擴增，使用含有合適的限制性位點BgIII和XhoI(加下劃線)的引物BAD20( TAT TAC CCT GTT ATC CC-3′)和CM-PORA-3( AAA ACC TAA AAA CAT CGG GCA AAC ACC C-3′)。此PCR片段被克隆在用引物CIRC1-PQ-Bgl和CIRC1-PQ-XHO獲得的循環(huán)PCR質粒中。此質粒將被用于轉化腦膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-)和(cps-porA-)菌株。通過pilQ上游區(qū)域的雙重交叉互換產生的整合將直接插入porA啟動子到pilQ ATG的上游。
另一個盒被從通過啟動子替換超表達D15/Omp85的重組腦膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-，porA-，D15/Omp85+)的染色體組DNA擴增。此盒含有cmR基因，porA啟動子和400bp的D15/Omp85基因的5`側接序列。此序列已被證明有效的上調D15/Omp85在奈瑟氏菌中的表達并且將被試驗其它奈瑟氏菌抗原的上調。用于擴增的引物是含有XhoI限制性位點(加下劃線)的BAD 20和CM-PORA-D15/3(5′-CGG CTC GAG TGTCAG TTC CTT GTG GTG C-3′)。此PCR片段被克隆在用引物CIRCI-Bgl和CIRC2-PQ-X獲得的循環(huán)PCR質粒中。此質粒被用于轉化腦膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-)和(cps-，porA-l)菌株。通過pilQ上游區(qū)域的雙重交叉互換產生的整合將直接插入porA啟動子到pilQ ATG的400bp上游。
實施例17用于在腦膜炎奈瑟氏菌的染色體中導入“干凈的”，未標記的突變的kanR/sacB盒。
本實驗的目的是構建含有用于腦膜炎奈瑟氏菌(例如kanR基因)的染色體重組的陽性篩選的選擇性標記以及從重組后的染色體(例如sacB基因)刪除盒的反向選擇性標記的多用途DNA盒。通過此方法，任意在同源重組中被導入的異源DNA將從奈瑟氏菌染色體上去除。
一個含有在其自身啟動子調控下表達的neoR基因和sacB基因的DNA片段通過pIB 279質粒(Blomfield IC，Vaughn V，Rest RF，EisensteinBI(1991)，Mol Microbiol 51447-57)用BamHI限制性酶限制來獲得。受體載體來自質粒pCMK，前面所描述的。pCMK的kanR基因通過酶NruI和EcoRV限制被刪除。質粒被稱為pCMKs。NeoRlsacB盒被插入到pCMKs中在與BamHI末端相容的BglII的限制性位點。
攜帶質粒的大腸桿菌不能在含有2％蔗糖的培養(yǎng)基上生長，證實了sacB啟動子的功能。此質粒含有允許盒在腦膜炎奈瑟氏菌血清型B染色體的porA處插入的重組遺傳序列。重組的奈瑟氏菌在含有200μg/ml卡那霉素的GC瓊脂平皿上獲得。不幸的是，sacB啟動子在腦膜炎奈瑟氏菌中沒有功能在含有2％蔗糖的GC瓊脂平皿上無生長差異。
一個新的和被構建含有在kanR啟動子調控下的sacB基因。利用帶有包含NcoI和XbaI限制性位點(加下劃線)的CtRC-Kan-Nco(5′-CAT &CIRC-Kan-Xba (5′ 寡核苷酸的質粒pUC4K((Amersham Pharmacia Biotech，USA))作為模板進行循環(huán)PCRA。產生PCR片段被凝膠純化，用NcoI降解并連接到通過從帶有含有NcoI限制性位點(加下劃線)的SAC/NCO/NEW5( GGA GGA TGA ACG ATG AAC ATC AAA AAG TTT GCA A-3′)寡核苷酸以及含有NcoI限制性位點(加下劃線)的RBS(粗體)&SAC/NCO/NEW3( GTC-3′)寡核苷酸的pIB279質粒的PCR產生的sacB基因上。重組的大腸桿菌克隆可被在含有2％蔗糖的瓊脂平皿上測定其敏感性。新的kanR/sacB盒可被亞克隆在pCMKs中并用于轉化腦膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-菌株。獲得的蔗糖敏感性在奈瑟氏菌中被證實。pCMKs質粒被用于轉化重組的kanR/SacB奈瑟氏菌來刪除被插入到染色體的porA位點處的全部的盒。干凈的重組奈瑟氏菌將在含有2％蔗糖的GC瓊脂平皿上被獲得。
實施例18小重組遺傳庫列(43bp)的應用允許腦膜炎奈瑟氏菌染色體中的同源重組本實驗的目的是利用小重組遺傳序列(43bp)推動奈瑟氏菌染色體的插入，修飾或刪除。本實驗的完成將大大推動將來的工作，在避免大腸桿菌的；同源序列的亞克隆步驟(43bp的重組遺傳序列可很容易地被添加在PCR擴增引物中)。KanR基因被從帶有含有與NmB porA基因(黑體)的5`側接序列同源的43bp和吸收序列(加下劃線)的寡核苷酸Kan-PorA-5( AAT CCA GTC CGT TCA GTT TCG GGA AAG CCA CGT TGT GTC-3′)和含有與NmB porA基因(黑體)的5`側接序列同源的43bp和吸收序列(加下劃線)的寡核苷酸Kan-PorA-3( AAT TTA TCG GAA ATA ACT GAA ACC GAA CAG ACT AGG CTGAGG TCT GCC TCG-3′)的質粒pUC4K進行PCR擴增而來。獲得1300bpDNA片段被克隆在pGemT載體(Promega，USA)中。此質?？杀挥糜谵D化腦膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-菌株。在含有200μg/ml卡那霉素的GC平皿上獲得重組奈瑟氏菌。porA位點的雙重交叉互換產生的整合將通過采用引物PPA1 & PPA2的PCR來篩選如前面所述。
實施例19小鼠用WT和重組腦膜炎奈瑟氏菌囊泡免疫的主動保護動物在0，14和28天用5μg不同的被吸附在Al(OH)3上的OMVs免疫3次(IP途徑)。在第28(II后14天)和35(III后7天)天進行取血，在第35(IP途徑)被攻擊。攻擊的劑量為20xLD50(-10′CFU/鼠)。在共計7天后監(jiān)測致死率。
被注射的OMVs組1Cps-，PorA+囊泡組2Cps-，PorA-囊泡組3Cps-，PorA-，NspA+囊泡組4Cps-，PorA-，Omp85+囊泡組5Cps-，PorA-，Hsf+囊泡附圖15闡明這些OMVs的模式通過分析的SDS Page(考馬斯染色)。
在攻擊24小時后，在陰性對組中(僅用Al(OH)3免疫的)的致死率為100％(8/8)而用5中不同的OMVs制劑免疫的小鼠仍然活著(7到8/8各小鼠存活)。在7天中病情也被控制且用NSPA超表達囊泡免疫的小鼠比其它的組表現出較少的疾病。存在PorA+囊泡中的PorA可能賦予延伸的抗同源菌株感染的保護。然而，PorA-上調囊泡誘導的保護至少在某些程度上取決于NspA，Omp85或Hsf的增加量的存在。
實施例20通過全細胞和特異性ELISA測定重組囊泡的免疫原性為了測定抗體識別存在于MenB細胞表面的抗原的能力，采集的小鼠血清(來自實施例19)被通過全細胞ELISA(使用四環(huán)素滅活細胞)檢測，且滴度表示為中間。所有類型的囊泡抗體誘導高度的全細胞Ab滴度而陰性對照組為明顯的陰性。

對可獲得的重組HSF蛋白的特異性Ab反應被進行。微滴定板用1μg/ml的全長HSF分子覆蓋。
附圖16中的結果表明當HSF超表達的OMVs被用于免疫小鼠時(使用平皿上的純化的重組HSF)產生好的特異性HSF應答。HSF超表達的囊泡誘導理想水平的特異性抗體。
SEQ.ID NO1pCMK(+)載體核苷酸序列TCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCAAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTACTATGGTTGCTTTGACGTATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCCGTCTGAATACATCCCGTCATTCCTCAAAAACAGAAAACCAAAATCAGAAACCTAAAATCCCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGTCCGTTCAGTTTCGGTCATTTCCGATAAATTCCTGCTGCTTTTCATTTCTAGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGGCGGAAGGGTTTTGGTTTTTTCCGATAAATTCTTGAGGCATTGAAATTCTAGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGGCTGTAGATGCCCGATGGTCTTTATAGCGGATTAACAAAAATCAGGACAAGGCGACGAAGCCGCAGACAGTACAGATAGTACGGAACCGATTCACTTGGTGCTTCAGCACCTTAGAGAATCGTTCTCTTTGAGCTAAGGCGAGGCAACGCCGTACTTGTTTTTGTTAATCCACTATAAAGTGCCGCGTGTGTTTTTTTATGGCGTTTTAAAAAGCCGAGACTGCATCCGGGCAGCAGCGCATCGGCCCGCACGAGGTCTCTGGAGTCGCGAGCATCAAGGGCGAATTCTGCAGGGGGGGGGGGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAGATCACGCATCTTCCCGACAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGGTCCACCTACAACAAAGCTCTCATCAACCGTGGCTCCCTCACTTTCTGGCTGGATGATGGGGCGATTCAGGCCTGGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGCCCCCCCCCCCCTGCAGGAGGTCTGCGCTTGAATTGTGTTGTAGAAACACAACGTTTTTGAAAAAATAAGCTATTGTTTTATATCAAAATATAATCATTTTTAAAATAAAGGTTGCGGCATTTATCAGATATTTGTTCTGAAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGTATAATTGAAGACGTATCGGGTGTTTGCCCGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCGATGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTACAAAAGGAAGCCCATATGCATCCTAGGCCTATTAATATTCCGGAGTATACGTAGCCGGCTAACGTTAACAACCGGTACCTCTAGAACTATAGCT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NO2腦膜炎奈瑟氏菌血清型A菌株Z2491種NspA基因上游(997bp)DNA區(qū)核苷酸序列GGAACCGAACACGCCGTTCGGTCATACGCCGCCGAAAGGTTTGCCGCAAGACGAAGCCGCCCTCGACATCGAAGACGCGGTACACGGCGCGCTGGAAAGCGCGGGTTTTGTCCACTACGAAACATCGGCTTTTGCGAAACCAGCCATGCAGTGCCGCCACAATTTGAACTACTGGCAGTTCGGCGATTATTTAGGCATAGGCGCGGGCGCGCACGGCAAAATTTCCTATCCCGACCGCATCGAGCGCACCGTCCGCCGCCGCCACCCCAACGACTACCTCGCCTTAATGCAAAACCGACCGAGCGAAGCCGTCGAACGCAAAACCGTCGCCGCCGAAGATTTGCCGTTCGAATTCATGATGAACGCCCTGCGCCTGACCGACGGCGTACCCACCGCGATGTTGCAGGAGCGCACGGGCGTACCGAGTGCCAAAATCATGGCGCAAATCGAAACGGCAAGGCAAAAAGGCCTGCTGGAAACCGACCCCGCCGTATTCCGCCCGACCGAAAAAGGACGCTTGTTTTTAAACGATTTGCTGCAGTGTTTTTTATAGTGGATTAACAAAAACCAGTACGGCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGTGAATCGGTTCCGTACTATCTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTATATAAGCGCAAACAAATCGGCGGCCGCCCGGGAAAACCCCCCCGAACGCGTCCGGAAAATATGCTTATCGATGGAAAACGCAGCCGCATCCCCCGCCGGGCGTTTCAGACGGCACAGCCGCCGCCGGAAATGTCCGACGCTTAAGGCACAGACGCACACAAAAAACCGTATGCCTGCACCTGCAACAATCCGACAGATACCGCTGTTTTTTCCAAACCGTTTGCAAGTTTCACCCATCCGCCGCGTGATGCCGCCACCACCATTTAAAGGCAACGCGCGGGTTAACGGCTTTGCCGSEQ.ID NO3腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株ATCC13090 D15/Omp85上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列ACCATTGCCGCCCGCGCCGGCTTCCAAAGCGGCGACAAAATACAATCCGTCAACGGCACACCCGTTGCAGATTGGGGCAGCGCGCAAACCGAAATCGTCCTCAACCTCGAAGCCGGCAAAGTCGCCGTCGGGTTCAGACGGCATCAGGCGCGCAAACCGTCCGCACCATCGATGCCGCAGGCACGCCGGAAGCCGGTAAAATCGCAAAAAACCAAGGCTACATCGGACTGATGCCCTTTAAAATCACAACCGTTGCCGGTGGCGTGGAAAAAGGCAGCCCCGCCGAAAAAGCAGGCCTGAAACCGGGCGACAGGCTGACTGCCGCCGACGGCAAACCCATTACCTCATGGCAAGAATGGGCAAACCTGACCCGCCAAAGCCCCGGCAAAAAAATCACCCTGAACTACGAACGCGCCGGACAAACCCATACCGCCGACATCCGCCCCGATACTGTCGAACAGCCCGACCACACCCTGATCGGGCGCGTCGGCCTCCGTCCGCAGCCGGACAGGGCGTGGGACGCGCAAATCCGCCGCAGCTACCGTCCGTCTGTTATCCGCGCATTCGGCATGGGCTGGGAAAAAACCGTTTCCCACTCGTGGACAACCCTCAAATTTTTCGGCAAACTAATCAGCGGCAACGCCTCCGTCAGCCATATTTCCGGGCCGCTGACCATTGCCGACATTGCCGGACAGTCCGCCGAACTCGGCTTGCAAAGTTATTTGGAATTTTTGGCACTGGTCAGCATCAGCCTCGGCGTGCTGAACCTGCTGCCCGTCCCCGTTTTGGACGGCGGCCACCTCGTGTTTTATACTGCCGAATGGATACGCGGCAAACCTTTGGGCGAACGCGTCCAAAACATCGGTTTGCGCTTCGGGCTTGCCCTCATGATGCTGATGATGGCGGTCGCCTTCTTCAACGACGTTACCCGGCTGCTCGGTTAGATTTTACGTTTCGGAATGCCGTCTGAAACCGCATTCCGCACCACAAGGAACTGACASEQ.ID NO4腦膜炎奈瑟氏菌Hsf樣基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列ATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACGCAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACCTCACCGCCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCTAGAAACACAACGCGGCAGGACTTTATCAGAAAAAACAGAAACCCCACCGCCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCCAGACCCGTCGGCACGGAAACTTACCGGATAAAACAGTTTCCTTAGATTCCACGTCCTAGATTCCCGCTTTCGCGGGAATGACGAGATTTTAGATTATGGGAATTTATCAGGAATGATTGAATCCATAGAAAAACCACAGGAATCTATCAGAAAAAACAGAAACCCCCACCGCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGCGGCAGGACTTTATCGGAAAAAACCGAAACCCCACCGACCGTCATTCCCGCAAAAGTTGGAATCCAAAAACGCAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACCCCCACCGCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACCCCACCGACCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCCAGCAACCGAAAAACCACAGGAATCTATCAGCAAAAACAGAAACCCCCACCGACCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGCGGCAGGACTTTATCGGAAAAAACAGAAACCCCACCGACCGTCATTCCCGCAAAAGCTGGAATCCAAAAACGCAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACCCCACCGCCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCCAGACCCGTCGGCACGGAAACTTACCGGATAAAACAGTTTCCTTAGATTCCACGTCCCAGATTCCCGCCTTCGCGGGAATGACGAGATTTTAAGTTGGGGGAATTTATCAGAAAACCCCCAACCCCCAAAAACCGGGCGGATGCCGCACCATCCGCCCCCAAACCCCGATTTAACCATTCAAACAAACCAAAAGAAAAAACAAASEQ.ID NO5腦膜炎奈瑟氏菌PilQ基因上游(772bp)DNA區(qū)核苷酸序列GCGATGTCGGGAAGCCTTCTCCCGAATCATTACCCCTTGAGTCGCTGAAAATCGCCCAATCTCCGGAAAACGGCGGCAATCATGACGGCAAGAGCAGCATCCTGAACCTCAGTGCCATTGCCACCACCTACCAAGCAAAATCCGTAGAAGAGCTTGCCGCAGAAGCGGCACAAAATGCCGAGCAAAAATAACTTACGTTAGGGAAACCATGAAACACTATGCCTTACTCATCAGCTTTCTGGCTCTCTCCGCGTGTTCCCAAGGTTCTGAGGACCTAAACGAATGGATGGCACAAACGCGACGCGAAGCCAAAGCAGAAATCATACCTTTCCAAGCACCTACCCTGCCGGTTGCGCCGGTATACAGCCCGCCGCAGCTTACAGGGCCGAACGCATTCGACTTCCGCCGCATGGAAACCGACAAAAAAGGGGAAAATGCCCCCGACACCAAGCGTATTAAAGAAACGCTGGAAAAATTCAGTTTGGAAAATATGCGTTATGTCGGCATTTTGAAGTCTGGACAGAAAGTCTCCGGCTTCATCGAGGCTGAAGGTTATGTCTACACTGTCGGTGTCGGCAACTATTTGGGACAAAACTACGGTAGAATCGAAAGCATTACCGACGACAGCATCGTCCTGAACGAGCTGATAGAAGACAGCACGGGCAACTGGGTTTCCCGTAAAGCAGAACTGCTGTTGAATTCTTCCGACAAAAACACCGAACAAGCGGCAGCACCTGCCGCAGAACAAAATTAAGAAGAGGATTACTCCATTSEQ.ID NO6腦膜炎奈瑟氏菌Hap上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GTGCGGCAAAAAACAGCAAAAGCCCGCTGTCGATTGCCTGACCGTCCGCGTCCGTAAAATCAGCATAGGTTGCCACGCGCGGCTTGGGCGTTTTCCCACACAAAGCCTCTGCCATCGGCAGCAGGTTTTTCCCCGATATGCGTATCACGCCCACGCCGCCGCGCCCGGGTGCGGTAGCGACTGCCGCAATCGTTGGAACGTTATCCGACATAAAACCCCCGAAAATTCAAAACAGCCGCGATTATAGCAAATGCCGTCTGAAGTCCGACGGTTTGGCTTTCAGACGGCATAAAACCGCAAAAATGCTTGATAAATCCGTCCGCCTGACCTAATATAACCATATGGAAAAACGAAACACATACGCCTTCCTGCTCGGTATAGGCTCGCTGCTGGGTCTGTTCCATCCCGCAAAAACCGCCATCCGCCCCAATCCCGCCGACGATCTCAAAAACATCGGCGGCGATTTTCAACGCGCCATAGAGAAAGCGCGAAAATGACCGAAAACGCACAGGACAAGGCGCGGCAGGCTGTCGAAACCGTCGTCAAATCCCCGGAGCTTGTCGAGCAAATCCTGTCCGACGAGTACGTGCAAATAATGATAGCCCGGCGTTTCCATTCGGGATCGTTGCCGCCGCCGTCCGACTTGGCGCAATACAACGACATTATCAGCAACGGGGCAGACCGCATTATGGCAATGGCGGAAAAAGAACAAGCCGTCCGGCACGAAACCATACGGCAAGACCAAACCTTCAACAGGCGCGGGCAACTGTACGGCTTCATCAGCGTCATCCTGATACTGCTTTTTGCCGTCTTCCTCGTATGGAGCGGCTACCCCGCAACCGCCGCCTCCCTTGCCGGCGGCACAGTGGTTGCCTTGGCGGGTGCTTTCGTGATTGGAAGAAGCCGAGACCAAGGCAAAAATTAATTGCAAATCCTAGGGCGTGCTTCATATCCGCCCGAACGCCGAACCGCACATATAGGCACATCCCGCGCGCCGCCGGAAGCGGAAGCCGCGCCCTCCCAAACAAACCCGAATCCCGTCAGATAAGGAAAAATASEQ.ID NO7腦膜炎奈瑟氏菌NspA基因(血清型B)(ATCC13090)上游(924bp)DNA區(qū)核苷酸序列GGAACCGAACACGCCGTTCGGTCATACGCCGCCGAAAGGTTTGCCGCAAGACGAAGCCGCCCTCGACATCGAAGACGCGGTACACGGCGCGCTGGAAGGCGCGGGTTTTGTCCACTACGAAACATCGGCTTTTGCGAAACCAGCCATGCAGTGCCGCCACAATTTGAACTACTGGCAGTTCGGCGATTATTTAGGCATAGGCGCGGGCGCTCACGGCAAAATTTCCTATCCCGACCGCATCGAGCGCACCGTCCGCCGCCGCCACCCCAACGACTACCTCGCCTTAATGCAAAGCCAACCGAGTGAAGCCGTCGAACGCAAAACCGTTGCCGCCGAAGATTTGCCGTTTGAGTTCATGATGAACGCCCTGCGCCTGACCGACGCGTACCCGCCGCGATGTTGCAGGAGCGCACGGGCGTACCGAGTGCCAAAATCATGGCGCAAATCGAAACGGCAAGGCAAAAAGGCCTGCTGGAAACCGACCCCGCCGTATTCCGCCCGACCGAAAAAGGACGCTTGTTTTTAAACGATTTGCTGCAGTGTTTTTTATAGTGGATTAACAAAAACCAGTACGGCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGTGAATCGGTTCCGTACTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTATATAAGCGCAAACAAATCGGCGGCCGCCCGGGAAAACCCGCCCCGAACGCGTCCGGAAAATATGCTTATCGATGGAAAACGCAGCCGCATCCCCCGCCGGGCGTTTCAGACGGCACAGCCGCCGCCGGAAATGTCCGACGCTTAAGGCACAGACGCACACAAAACCGTATGCCTGCACCTGCAACAATCCGACAGATACCGCTGTTTTTTCCAAACCGTTTGCASEQ.ID NO8腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)FrpB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列AAGTGGGAATCTAAAAATGAAAAGCAACAGGAATTTATCGGAAATGACCGAAACTGAACGGACTGGATTCCCGCTTTCGCGGGAATGACGGCGACAGGGTTGCTGTTATAGTGGATGAACAAAAACCAGTACGTCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGTGAATCGGTTCCGTCCTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCTGATTTCTGTTCGTTTTCGGTTATTCCCGATAAATTACCGCCGTTTCTCGTCATTTCTTTAACCCTTCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGTTTTTTTGAGTTCCAGTTGTTTCTGATAAATTCTTGCAGCTTTGAGTTCCTAGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGGTGGAAAAGTTGCCGTGATTTCGGATAAATTTTCGTAACGCATAATTTCCGTTTTACCCGATAAATGCCCGCAATCTCAAATCCCGTCATTCCCCAAAAACAAAAAATCAAAAACAGAAATATCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGACCTTAGAACAACAGCAATATTCAAAGATTATCTGAAAGTCCGAGATTCTAGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGAATTTTAGGTTTCTGTTTTTGGTTTTCTGTCCTTGCGGGAATGATGAAATTTTAAGTTTTAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACCGCTCCGCCGTCATTCCCGCACAGGCTTCGTCATTCCCGCGCAGGCTTCGTCATTCCCGCATTTGTTAATCCACTATATTCCCGCCGTTTTTTACATTTCCGACAAAACCTGTCAACAAAAAACAACACTTCGCAAATAAAAACGATAATCAGCTTTGCAAAAATCCCCCCCCCCTGTTAATATAAATAAAAATAATTAATTAATTATTTTTCTTATCCTGCCAAATCTTAACGGTTTGGATTTACTTCCCTTCATACACTCAAGAGGACGATTGASEQ.ID NO9腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)FrpA基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列CTATAAAGATGTAAATAAAAATCTCGGTAACGGTAACACTTTGGCTCAGCAAGGCAGCTACACCAAAACAGACGGTACAACCGCAAAAATGGGGGATTTACTTTTAGCAGCCGACAATCTGCACAGCCGCTTCACGAACAAAATGCTATCCATTAGCCATGTTCGGGAAAACACGATTTCCCCGTTTGTTTTAGGCTGTCTAAACAAATAACCATAAATGTATATCATTATTTAAAATAAATAAAAGTATTTAACTATTATTGACGAAATTTTAGAGAAAGAGTAGACTGTCGATTAAATGACAAACAATAGTGAGAAAGGAAATATTTACTATCCGAGCACAGAGCATATTTTAGGTAGCCTGTAACTGTTCCTGCTGGCGGAAGAGGATGAAGGTGGACTTACCCGAGAATAAATGTCCTGTTGTGTGATATGGATGCCATGCCGCGAAGCAATTGATGCAATCACGGCAGTCCTACTTGAATGAAACCTGTCGTTGCAGAATTTGAAAACGCTATTTTTAAGAAAGGATAAAGGGAGAAAGAATTTTTGGTTTTTAAGCTGCATGAAACCGTGTTGGAATAAATGCACACCTACGATAATTAATAATTTTCGTTTTTTATTCTACAAGCTATTTATATATGATTGCTAAAAGTTTATTTTTTAGATGCCAAAAAATATATTTTATATACTTCATATTGTTTATATGTCTTTATTTGAATATATCTTACGATGGGGAAATATTTATATATTTTATAATAAATTTTACTCATTTGCTAATATGTCATGGAATATTACTTGTATTTTGTAGAATTTTTCCATATGAAAATATTCCATTTACTATTTTTCTGAACTTTATTAGTTTATTTTTAATATTTTTACCTCTTATATTTACCATAAGAGAGCTAATTGATTCATATTATATTGAGTCGATAATTAATTTATTCTTAATTTTAATTCCTCACGTTATTTTTTTAATTTACTTGAAAGGAAAGCAGATSEQ.ID NO10腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)FrpC基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GGAAACAGAGAAAAAAGTTTCTCTTCTATCTTGGATAAATATATTTACCCTCAGTTTAGTTAAGTATTGGAATTTATACCTAAGTAGTAAAAGTTAGTAAATTATTTTTAACTAAAGAGTTAGTATCTACCATAATATATTCTTTAACTAATTTCTAGGCTTGAAATTATGAGACCATATGCTACTACCATTTATCAACTTTTTATTTTGTTTATTGGGAGTGTTTTTACTATGACCTCATGTGAACCTGTGAATGAAAAGACAGATCAAAAAGCAGTAAGTGCGCAACAGGCTAAAGAACAAACCAGTTTCAACAATCCCGAGCCAATGACAGGATTTGAACATACGGTTACATTTGATTTTCAGGGCACCAAAATGGTTATCCCCTATGGCTATCTTGCACGGTATACGCAAGACAATGCCACAAAATGGCTTTCCGACACGCCCGGGCAGGATGCTTACTCCATTAATTTGATAGAGATTAGCGTCTATTACAAAAAAACCGACCAAGGCTGGGTTCTTGAGCCATACAACCAGCAAAACAAAGCACACTTTATCCAATTTCTACGCGACGGTTTGGATAGCGTGGACGATATTGTTATCCGAAAAGATGCGTGTAGTTTAAGTACGACTATGGGAGAAAGATTGCTTACTTACGGGGTTAAAAAAATGCCATCTGCCTATCCTGAATACGAGGCTTATGAAGATAAAAGACATATTCCTGAAAATCCATATTTTCATGAATTTTACTATATTAAAAAAGGAGAAAATCCGGCGATTATTACTCATCGGAATAATCGAATAAACCAAACTGAAGAAGATAGTTATAGCACTAGCGTAGGTTCCTGTATTAACGGTTTCACGGTACAGTATTACCCGTTTATTCGGGAAAAGCAGCAGCTCACACAGCAGGAGTTGGTAGGTTATCACCAACAAGTAGAGCAATTGGTACAGAGTTTTGTAAACAATTCAAATAAAAAATAATTTAAAGGATCTTATTSEQ.ID NO11腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)Omp85基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列ACGTCCGAACCGTGATTCCGCAACGCCGCGCCCAAAACCAAAGCCCAAGCCAAAATGCCGATATAGTTGGCATTGGCAATCGCGTTAATCGGGTTGGCGACCAGGTTCATCAGCAGCGATTTCAACACTTCCACAATGCCGGAAGGCGGCGCGGCGGACACATCGCCCGCGCCCGCCAAAACAATGTGCGTCGGGAAAACCATACCGGCGATGACGGCGGTCAGGGCTGCGGAAAACGTACCAATGAGGTAAAGGATGATAATCGGCCTGATATGCGCCTTGTTGCCTTTTTGGTGCTGCGCGATTGTGGCCGCCACCAAAATAAATACCAAAACCGGCGCGACCGCTTTGAGCGCGCCGACAAACAGGCTGCCGAACAAGCCTGCCGCCAAGCCCAGTTGCGGGGAAACCGAACCGATTACGATGCCCAACGCCAAACCGGCGGCAATCTGCCTGACCAGGCTGACGCGGCCGATCGCATGAAATAAGGATTTGCCGAACGCCATAATTCTTCCTTATGTTGTGATATGTTAAAAAATGTTGTATTTTAAAAGAAAACTCATTCTCTGTGTTTTTTTTATTTTTCGGCTGTGTTTTAAGGTTGCGTTGATTTGCCCTATGCAGTGCCGGACAGGCTTTGCTTTATCATTCGGCGCAACGGTTTAATTTATTGAACGAAAATAAATTTATTTAATCCTGCCTATTTTCCGGCACTATTCCGAAACGCAGCCTGTTTTCCATATGCGGATTGGAAACAAAATACCTTAAAACAAGCAGATACATTTCCGGCGGGCCGCAACCTCCGAAATACCGGCGGCAGTATGCCGTCTGAAGTGTCCCGCCCCGTCCGAACAACACAAAAACAGCCGTTCGAAACCCTGTCCGAACAGTGTTAGAATCGAAATCTGCCACACCGATGCACGACACCCGTACCATGATGATCAAACCGACCGCCCTGCTCCTGCCGGCTTTATTTTTCTTTCCGCACGCATACGCGCCTSEQ.ID NO12腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)(ATCC13090)PilQ基因(772bp)上游DNA區(qū)核苷酸序列GCGATGTCGGGAAGCCTTCTCCCGAATCATTACCCCTTGAGTCGCTGAAAATCGCCCAATCTCCGGAAAACGGCGGCAATCATGACGGCAAGAGCAGCATCCTGAACCTCAGTGCCATTGCCACCACCTACCAAGCAAAATCCGTAGAAGAGCTTGCCGCAGAAGCGGCACAAAATGCCGAGCAAAAATAACTTACGTTAGGGAAACCATGAAACACTATGCCTTACTCATCAGCTTTCTGGCTCTCTCCGCGTGTTCCCAAGGTTCTGAGGACCTAAACGAATGGATGGCACAAACGCGACGCGAAGCCAAAGCAGAAATCATACCTTTCCAAGCACCTACCCTGCCGGTTGCGCCGGTATACAGCCCGCCGCAGCTTACAGGGCCGAACGCATTCGACTTCCGCCGCATGGAAACCGACAAAAAAGGGGAAAATGCCCCCGACACCAAGCGTATTAAAGAAACGCTGGAAAAATTCAGTTTGGAAAATATGCGTTATGTCGGCATTTTGAAGTCTGGACAGAAAGTCTCCGGCTTCATCGAGGCTGAAGGTTATGTCTACACTGTCGGTGTCGGCAACTATTTGGGACAAAACTACGGTAGAATCGAAAGCATTACCGACGACAGCATCGTCCTGAACGAGCTGATAGAAGACAGCACGGGCAACTGGGTTTCCCGTAAAGCAGAACTGCTGTTGAATTCTTCCGACAAAAACACCGAACAAGCGGCAGCACCTGCCGCAGAACAAAATTAAGAAGAGGATTACTCCATTSEQ.ID NO13腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)Hsf-like基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TTTGTTTTTTCTTTTGGTTTGTTTGAATGGTTAAATCGGGGTTTGGGGGCGGATGGTGCGGCATCCGCCCGGTTTTTGGGGGTTGGGGGTTTTCTGATAAATTCCCCCAACTTAAAATCTCGTCATTCCCGCGAAGGCGGGAATCTGGGACGTGGAATCTAAGGAAACTGTTTTATCCGGTAAGTTTCCGTGCCGACGGGTCTGGATTCCCGCTTTTGCGGGAATGACGGCGGTGGGGTTTCTGTTTTTTCCGATAAATTCCTGTTGCGTTGCGTTTTTGGATTCCAGCTTTTGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGTTTCTGTTTTTTCCGATAAAGTCCTGCCGCGTTGTGTTTCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGGTTTCTGTTTTTGCTGATAGATTCCTGTGGTTTTTCGGTTGCTGGATTCCCGCTTTTGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGTTTCTGTTTTTTCCGATAAATTCCTGTTGCGTTGTGTTTCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGCGGTGGGGGTTTCTGTTTTTTCCGATAAATTCCTGTTGCGTTGCGTTTTTGGATTCCAACTTTTGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGTTTCGGTTTTTTCCGATAAAGTCCTGCCGCGTTGTGTTTCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGCGGTGGGGGTTTCTGTTTTTTCTGATAGATTCCTGTGGTTTTTCTATGGATTCAATCATTCCTGATAAATTCCCATAATCTAAAATCTCGTCATTCCCGCGAAAGCGGGAATCTAGGACGTGGAATCTAAGGAAACTGTTTTATCCGGTAAGTTTCCGTGCCGACGGGTCTGGATTCCCGCTTTTGCGGGAATGACGGCGGTGGGGTTTCTGTTTTTTCTGATAAAGTCCTGCCGCGTTGTGTTTCTAGATTCCCGCTTTTGCGGGAATGACGGCGGTGAGGTTTCTGTTTTTTCCGATAAATTCCTGTSEQ.ID NO14腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)Hap基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列AATCAGCATAGGTTGCCACGCGCGGCTTGGGCGTTTTCCCACACAAAGCCTCTGCCATCGGCAGCAGGTTTTTCCCCGATATGCGTATCACGCCCACGCCGCCGCGCCCGGGTGCGGTAGCGACTGCCGCAATCGTTGGAACGTTATCCGACATAAAACCCCCGAAAATTCAAAACAGCCGCGATTATAGCAAATGCCGTCTGAAGTCCGACGGTTTGGCTTTCAGACGGCATAAAACCGCAAAAATGCTTGATAAATCCGTCCGCCTGACCTAATATAACCATATGGAAAAACGAAACACATACGCCTTCCTGCTCGGTATAGGCTCGCTGCTGGGTCTGTTCCATCCCGCAAAAACCGCCATCCGCCCCAATCCCGCCGACGATCTCAAAAACATCGGCGGCGATTTTCAACGCGCCATAGAGAAAGCGCGAAAATGACCGAAAACGCACAGGACAAGGCGCGGCAGGCTGTCGAAACCGTCGTCAAATCCCCGGAGCTTGTCGAGCAAATCCTGTCCGACGAGTACGTGCAAATAATGATAGCCCGGCGTTTCCATTCGGGATCGTTGCCGCCGCCGTCCGACTTGGCGCAATACAACGACATTATCAGCAACGGGGCAGACCGCATTATGGCAATGGCGGAAAAAGAACAAGCCGTCCGGCACGAAACCATACGGCAAGACCAAACCTTCAACAGGCGCGGGCAACTGTACGGCTTCATCAGCGTCATCCTGATACTGCTTTTTGCCGTCTTCCTCGTATGGAGCGGCTACCCCGCAACCGCCGCCTCCCTTGCCGGCGGCACAGTGGTTGCCTTGGCGGGTGCTTTCGTGATTGGAAGAAGCCGAGACCAAGGCAAAAATTAATTGCAAATCCTAGGGCGTGCTTCATATCCGCCCGAACGCCGAACCGCACATATAGGCACATCCCGCGCGCCGCCGGAAGCGGAAGCCGCGCCCTCCCAAACAAACCCGAATCCCGTCAGATAAGGAAAAATASEQ.ID NO15腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)LbpA基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GATTTTGGTCATCCCGACAAGCTTCTTGTCGAAGGGCGTGAAATTCCTTTGGTTAGCCAAGAGAAAACCATCAAGCTTGCCGATGGCAGGGAAATGACCGTCCGTGCTTGTTGCGACTTTTTGACCTATGTGAAACTCGGACGGATAAAAACCGAACGCCCGGCAAGTAAACCAAAGGCGGAAGATAAAAGGGAGGATGAAGAGAGTGCAGGCGTTGGTAACGTCGAAGAAGGCGAAGGCGAAGTTTCCGAAGATGAAGGCGAAGAAGCCGAAGAAATCGTCGAAGAAGAACCCGAAGAAGAAGCTGAAGAGGAAGAAGCTGAACCCAAAGAAGTTGAAGAAACCGAAGAAAAATCGCCGACAGAAGAAAGCGGCAGCGGTTCAAACGCCATCCTGCCTGCCTCGGAAGCCTCTAAAGGCAGGGACATCGACCTTTTCCTGAAAGGTATCCGCACGGCGGAAGCCGACATTCCAAGAACCGGAAAAGCACACTATACCGGCACTTGGGAAGCGCGTATCGGCACACCCATTCAATGGGACAATCAGGCGGATAAAGAAGCGGCAAAAGCAGAATTTACCGTTAATTTCGGCGAGAAATCGATTTCCGGAACGCTGACGGAGAAAAACGGTGTACAACCTGCTTTCTATATTGAAAACGGCAAGATTGAGGGCAACGGTTTCCACGCAACAGCACGCACTCGTGAGAACGGCATCAATCTTTCGGGAAATGGTTCGACCAACCCCAGAACCTTCCAAGCTAGTGATCTTCGTGTAGAAGGAGGATTTTACGGCCCGCAGCGGAGGAATTGGGCGGTATTATTTTCAATAAGGATGGGAAATCTCTTGGTATAACTGAAGGTACTGAAAATAAAGTTGAAGTTGAAGCTGAAGTTGAAGTTGAAGCTGAAACTGGTGTTGTCGAACAGTTAGAACCTGATGAAGTTAAACCCCAATTCGGCGTGGTATTCGGTGCGAAGAAAGATAATAAAGAGGTGGAAAASEQ.ID NO16腦膜炎奈瑟氏菌(血清型A)LbpB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列CGGCGTTAGAGTTTAGGGCAGTAAGGGCGCGTCCGCCCTTAGATCTGTAAGTTACGATTCCGTTAAATAACTTTTACTGACTTTGAGTTTTTTGACCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGCTTAAAGTCCAACGACAAAAACCAAAAGACAAAAACACTTTTATTACCCTAAAATCGAACACCCATAAATGACCTTTTTTGTCTTTGGCGAGGCGGCAGTAAGGGCGCGTCCGCCCTTAGATCTGTAAGTTATGATTCCGTTAAATAGCCTTTACTGACTTTGAGTTTTTTGACCTAAGGGCGGACGCGCCCTTACTGCTTCACCTTCAATGGGCTTTGAATTTTGTTCGCTTTGGCTTGCTTGACCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGCCGCCTCGCCAAAGACGAAAAGGGTTATTTACGGGGGTTGGATTTTAGGCAGTAAGGGCGCGTCCGCCCTTAGATCTGTAAGTTATGATTCCGTTAAATAGCCTTTACTGACTTTGAGTTTTTTGACCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGCTTCACCTTCAATGGGCTTTGAATTTTGTTCGCTTTGGCTTGCTTGATCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGCCGTCTCGCCGAAGACAACGAGGGCTATTTACGGCGTTAGAGTTTAGGGCAGTAAGGGCGCGTCCGCCCTTAGATCCAGACAGTCACGCCTTTGAATAGTCCATTTTGCCAAAGAACTCTAAAACGCAGGACCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGCCTTACATCCAAGCACCCTTACTGCACCACGTCCACGCACCCTTACTGCCCTACGTCCACGCACCCTTACTGCCCTACATCCAAGCACCCTTACTGCCTTACATAGACATGACAGACGCCGAGCAGCGGAACAGGACTAAAAACAATTAAGTGATATTTTTGCCCAACTATAATAGACATGTATAATTATATTACTATTAATAATAATTAGTTTATCCTCCTTTTCATCCCSEQ.ID NO17腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)(ATCC13090)TbpA基因(731bp)上游DNA區(qū)核苷酸序列TATGAAGTCGAAGTCTGCTGTTCCACCTTCAATTATCTGAATTACGGAATGTTGACGCGCAAAAACAGCAAGTCCGCGATGCAGGCAGGAGAAAGCAGTAGTCAAGCTGATGCTAAAACGGAACAAGTTGGACAAAGTATGTTCCTCCAAGGCGAGCGCACCGATGAAAAAGAGATTCCAAACGACCAAAACGTCGTTTATCGGGGGTCTTGGTACGGGCATATTGCCAACGGCACAAGCTGGAGCGGCAATGCTTCCGATAAAGAGGGCGGCAACAGGGCGGACTTTACTGTGAATTTCGGTACGAAAAAAATTAACGGCACGTTAACCGCTGACAACAGGCAGGCGGCAACCTTTACCATTGTGGGCGATATTGAGGGCAACGGTTTTTCCGGTACGGCGAAAACTGCTGACTCAGGTTTTGATCTCGATCAAAGCAATAACACCCGCACGCCTAAGGCATATATCACAAACGCCAAGGTGCAGGGCGGTTTTTACGGGCCCAAAGCCGAAGAGTTGGGCGGATGGTTTGCCTATTCGGACGATAAACAAACGAAAAATGCAACAGATGCATCCGGCAATGGAAATTCAGCAAGCAGTGCAACTGTCGTATTCGGTGCGAAACGCCAAAAGCCTGTGCAATAAGCACGGTTGCCGAACAATCAAGAATAAGGCCTCAGACGGCACCGCTCCTTCCGATACCGTCTGAAAGCGAAGAGTAGGGAAACACTSEQ.ID NO18腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)(ATCC13090)OmplA基因(373bp)上游DNA區(qū)核苷酸序列CGTACCGCATTCCGCACTGCAGTGAAAAAAGTATTGAAAGCAGTCGAAGCAGGCGATAAAGCTGCCGCACAAGCGGTTTACCAAGAGTCCGTCAAAGTCATCGACCGCATCGCCGACAAGGGCGTGTTCCATAAAAACAAAGCGGCTCGCCACAAAACCCGTTTGTCTCAAAAAGTAAAACCTTGGCTTGATTTTTGCAAAACCTGCAATCCGGTTTTCATCGTCGATTCCGAAAACCCCTGAAGCCCGACGGTTTCGGGGTTTTCTGTATTGCGGGGACAAAATCCCGAAATGGCGGAAAGGGTGCGGTTTTTTATCCGAATCCGCTATAAAATGCCGTCTGAAAACCAATATGCCGACAATGGGGGTGGAGSEQ.ID NO19腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)Pla1基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TTTTGGCTTCCAGCGTTTCATTGTTTTCGTACAAGTCGTAAGTCAGCTTCAGATTGTTGGCTTTTTTAAAGTCTTCGACCGTACTCTCATCAACATAGTTCGACCAGTTGTAGATGTTCAGAGTATCGGTGGCAGCGGCTTCGGCATTGGCAGCAGACGCAGCGTCTGCTTGAGGTTGCACGGCGTTTTTTTCGCTGCCGCCGCAGGCTGCCAGAGACAGCGCGGCCAAAACGGCTAATACGGATTTTTTCATACGGGCAGATTCCTGATGAAAGAGGTTGGAAAAAAAGAAATCCCCGCGCCCCATCGTTACCCCGGCGCAAGGTTTGGGCATTGTAAAGTAAATTTGTGCAAACTCAAAGCGATATTGGACTGATTTTCCTAAAAAATTATCCTGTTTCCAAAAGGGGAGAAAAACGTCCGCCCGATTTTGCCGTTTTTTTGCGCTGTCAGGGTGTCCGACGGGCGGATAGAGAGAAAAGGCTTGCATATAATGTAAACCCCCTTTAAAATTGCGCGTTTACAGAATTTATTTTTCTTCCAGGAGATTCCAATATGGCAAACAGCGCACAAGCACGCAAACGTGCCCGCCAGTCCGTCAAACAACGCGCCCACAATGCTAGCCTGCGTACCGCATTCCGCACCGCAGTGAAAAAAGTATTGAAAGCAGTCGAAGCAGGCGATAAAGCTGCCGCACAAGCGGTTTACCAAGAGTCCGTCAAAGTCATCGACCGCATCGCCGACAAGGGCGTGTTCCACAAAAACAAAGCGGCACGCCACAAAAGCCGTCTGTCTGCAAAAGTAAAAGCCTTGGCTTGATTTTTGCAAAACCGCCAAGGCGGTTGATACGCGATAAGCGGAAAACCCTGAAGCCCGACGGTTTCGGGGTTTTCTGTATTGCGGGGGCAAAATCCCGAAATGGCGGAAAGGGTGCGATTTTTTATCCGAATCCGCTATAAAATGCCGTTTGAAAACCAATATGCCGACAATGGGGGCGGAGSEQ.ID NO20腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)FhaB基因(1000bp)上游DNA區(qū)核苷酸序列TACGGAAACTGCAAGCGGATCCAGAAGTTACAGCGTGCATTATTCGGTGCCCGTAAAAAAATGGCTGTTTTCTTTTAATCACAATGGACATCGTTACCACGAAGCAACCGAAGGCTATTCCGTCAATTACGATTACAACGGCAAACAATATCAGAGCAGCCTGGCCGCCGAGCGCATGCTTTGGCGTAACAGACTTCATAAAACTTCAGTCGGAATGAAATTATGGACACGCCAAACCTATAAATACATCGACGATGCCGAAATCGAAGTGCAACGCCGCCGCTCTGCAGGCTGGGAAGCCGAATTGCGCCACCGTGCTTACCTCAACCGTTGGCAGCTTGACGGCAAGTTGTCTTACAAACGCGGGACCGGCATGCGCCAAAGTATGCCTGCACCGGAAGAAAACGGCGGCGATATTCTTCCAGGTACATCTCGTATGAAAATCATTACTGCCGGTTTGGACGCAGCCGCCCCATTTATTTTAGGCAAACAGCAGTTTTTCTACGCAACCGCCATTCAAGCTCAATGGAACAAAACGCCGTTGGTTGCCCAAGATAAATTGTCAATCGGCAGCCGCTACACCGTTCGCGGATTTGATGGGGAGCAGAGTCTTTTCGGAGAGCGAGGTTTCTACTGGCAGAATACTTTAACTTGGTATTTTCATCCGAACCATCAGTTCTATCTCGGTGCGGACTATGGCCGCGTATTTGGCGAAAGTGCACAATATGTATCGGGCAAGCAGCTGATGGGTGCAGTGGTCGGCTTCAGAGGAGGGCATAAAGTAGGCGGTATGTTTGCTTATGATCTGTTTGCCGGCAAGCCGCTTCATAAACCCAAAGGCTTTCAGACGACCAACACCGTTTACGGCTTCAACTTGAATTACAGTTTCTAACCTCTGAATTTTTTACTGATATTTAGACGGTCTTTCCTTATCCTCAGACCGTCAAACTTTACCTACGTACTTGGCGCGCAGTACGTTCATCTTCAAAATGGAATAGACSEQ.ID NO21腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)Lipo02基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TTATCTTGGTGCAAAACTTTGTCGGGGTCGGACTGGCTACGGCTTTGGGTTTGGACCCGCTCATCGGTCTGATTACCGGTTCGGTGTCGCTGACGGGCGGACACGGTACGTCAGGTGCGTGGGGACCTAATTTTGAAACGCAATACGGCTTGGTCGGCGCAACCGGTTTGGGTATTGCATCGGCTACTTTCGGGCTGGTGTTCGGCGGCCTGATCGGCGGGCCGGTTGCGCGCCGCCTGATCAACAAAATGGGCCGCAAACCGGTTGAAAACAAAAAACAGGATCAGGACGACAACGCGGACGACGTGTTCGAGCAGGCAAAACGCACCCGCCTGATTACGGCGGAATCTGCCGTTGAAACGCTTGCCATGTTTGCCGCGTGTTTGGCGTTTGCCGAGATTATGGACGGCTTCGACAAAGAATATCTGTTCGACCTGCCCAAATTCGTGTGGTGTCTGTTTGGCGGCGTGGTCATCCGCAACATCCTCACTGCCGCATTCAAGGTCAATATGTTCGACCGCGCCATCGATGTGTTCGGCAATGCTTCGCTTTCGCTTTTCTTGGCAATGGCGTTGCTGAATTTGAAACTGTGGGAGCTGACCGGTTTGGCGGGGCCTGTAACCGTGATTCTTGCCGTACAAACCGTGGTGATGGTTTTGTACGCGACTTTTGTTACCTATGTCTTTATGGGGCGCGACTATGATGCGGCAGTATTGGCTGCCGGCCATTGCGGTTTCGGCTTGGGTGCAACGCCGACGGCGGTGGCAAATATGCAGTCCGTCACGCATACTTTCGGCGCGTCGCATAAGGCGTTTTTGATTGTGCCTATGGTCGGCGCGTTCTTCGTCGATTTGATTAATGCCGCGATTCTCACCGGTTTTGTGAATTTCTTTAAAGGCTGATTTTCCGCCTTTCCGACAAAGCACCTGCAAGGTTTACCGCCTGCAGGTGCTTTTGCTATGATAGCCGCTATCGGTCTGCACCGTTTGGAAGGAACATCSEQ.ID NO22腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)Tbp2基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列CCTACTCCACCGATTCCAATATGCTCGGCGCGACCCACGAAGCCAAAGACTTGGAATTTTTGAACTCGGGCATCAAAATCGTCAAACCCATTATGGGCGTTGCCTTTTGGGACGAAAACGTTGAAGTCAGCCCCGAAGAAGTCAGCGTGCGCTTTGAAGAAGGCGTGCCGGTTGCACTGAACGGCAAAGAATACGCCGACCCCGTCGAACTCTTCCTCGAAGCCAACCGCATCGGCGGCCGCCACGGCTTGGGTATGAGCGACCAAATCGAAAACCGCATCATCGAAGCCAAATCGCGCGGCATCTACGAAGCCCCGGGTATGGCGTTGTTCCACATCGCCTACGAACGCTTGGTGACCGGCATCCACAACGAAGACACCATCGAACAATACCGCATCAACGGCCTGCGCCTCGGCCGTTTGCTCTACCAAGGCCGCTGGTTCGACAGCCAAGCCTTGATGTTGCGCGAAACCGCCCAACGCTGGGTCGCCAAAGCCGTTACCGGCGAAGTTACCCTCGAACTGCGGCGCGGCAACGACTACTCGATTCTGAACACCGAATCGCCCAACCTGACCTACCAACCCGAACGCCTGAGTATGGAAAAAGTCGAAGGTGCGGCGTTTACCCCGCTCGACCGCATCGGACAGCTCACGATGCGCAACCTCGACATCACCGACACCCGCGCCAAACTGGGCATCTACTCGCAAAGCGGTTTGCTGTCGCTGGGCGAAGGCTCGGTATTACCGCAGTTGGGCAATAAGAAATAAGGTTTGCTGTTTTGCATCATTAGCAACTTAAGGGGTCGTCTGAAAAGATGATCCCTTATGTTAAAAGGAATCCTATGAAAGAATACAAAGTCGTCATTTATCAGGAAAGCCAGTTGTCCAGCCTGTTTTTCGGCGCGGCAAAGGTCAACCCCGTCAATTTCAGCGCGTTCCTCAACAAACAAACCCCCCGAAGGCTGGCGGGTCGAGACCTTTGCAATAACATAGGTTACTAASEQ.ID NO23腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)PorA基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GAATGACAATTCATAAGTTTCCCGAAATTCCAACATAACCGAAACCTGACAATAACCGTAGCAACTGAACCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCCAGTCCGTTCAGTTTCGGTCATTTCCGATAAATGCCTGTTGCTTTTCATTTCTAGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGGCGGAAGGGTTTTGGTTTTTTCCGATAAATTCTTGAGGCATTGAAATTCCAAATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGGCTGCAGATGCCCGACGGTCTTTATAGTGGATTAACAAAAATCAGGACAAGGCGACGAGCTGCAGACAGTACAGATAGTACGGAACCGATTCACTTAGTGCTTCAGTATCTTAGAGAATCGTTCTCTTTGAGCTAAGGCGAGGCAACGTCGTACTGGTTTTTGTTCATCCACTATATATGACACGGAAAACGCCGCCGTCCAAACCATGCCGTCTGAAGAAAACTACACAGATACCGCCGCTTATATTACAATCGCCGCCCCGTGGTTCGAAAACCTCCCACACTAAAAAACTAAGGAAACCCTATGTCCCGCAACAACGAAGAGCTGCAAGGTATCTCGCTTTTGGGTAATCAAAAAACCCAATATCCGGCCGAATACGCGCCCGAAATTTTGGAAGCGTTCGACAACAAACATCCCGACAACGACTATTTCGTCAAATTCGTCTGCCCAGAGTTCACCAGCCTCTGCCCCATGACCGGGCAGCCCGACTTCGCCACCATCGTCATCCGCTACATTCCGCACATCAAAATGGTGGAAAGCAAATCCCTGAAACTCTACCTCTTCAGCTTCCGCAACCACGGCGATTTTCATGAAGACTGCGTCAACATCATCATGAAAGACCTCATTGCCCTGATGGATCCGAAATACATCGAAGTATTCGGCGAGTTCACACCGCGCGGCGGCATCGCCATTCATCCTTTCGCCAATTACGGCAAAGCAGGCACCGAGTTTGAAGCATTGGCGCGTAASEQ.ID NO24腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)PorA啟動子區(qū)GATATCGAGGTCTGCGCTTGAATTGTGTTGTAGAAACACAACGTTTTTGAAAAAATAAGCTATTGTTTTATATCAAAATATAATCATTTTTAAAATAAAGGTTGCGGCATTTATCAGATATTTGTTCTGAAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGTATAATTGAAGACGTATCGGGTGTTTGCCCGATGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTACAAAAGGAAGCCCATSEQ.ID NO25腦膜炎奈瑟氏菌(血清型A)PorB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列gttttctgtttttgagggaatgacgggatgtaggttcgtaagaatgacgggatataggtttccgtgcggatggattcgtcattcccgcgcaggcgggaatctagaacgtggaatctaagaaaccgttttatccgataagtttccgtgcggacaagtttggattcccgcctgcgcgggaatgacgggattttaggtttctaattttggttttctgtttttgagggaatgacgggatgtaggttcgtaggaatgacgggatataggtttccgtgcggatggattcgtcattcccgcgcaggcgggaatctagaccttagaacaacagcaatattcaaagattatctgaaagtccgagattctagattcccgcctgagcgggaatgacgaaaagtggcgggaatgacggttagcgttgcctcgccttagctcaaagagaacgattctctaaggtgctgaagcaccaagtgaatcggttccgtactatttgtactgtctgcggcttcgtcgccttgtcctgatttttgttaatccactatctcctgccgcaggggcgggttttgcatccgcccgttccgaaagaaaccgcgtgtgcgttttttgccgtctttataacccccggtttgcaatgccctccaataccctcccgagtaagtgttgtaaaaatgcaaatcttaaaaaatttaaataaccatatgttataaaacaaaaaatacccataatatctctatccgtccttcaaaatgcacatcgaattccacacaaaaacaggcagaagtttgttttttcagacaggaacatctatagtttcagacatgtaatcgccgagcccctcggcggtaaatgcaaagctaagcggcttggaaagcccggcctgcttaaatttcttaaccaaaaaaggaatacagcaatgaaaaaatccctgattgccctgactttggcagcccttcctgttgcagcaatggctgacgttaccctgtacggcaccatcaaaaccggcgtaSEQ.ID NO26腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)PorB啟動子區(qū)GTTTTCTGTTTTTGAGGGAATGACGGGATGTAGGTTCGTAAGAATGACGGGATATAGGTTTCCGTGCGGATGGATTCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGAACGTGGAATCTAAGAAACCGTTTTATCCGATAAGTTTTCCGTGCGGACAAGTTTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGGGATTTTAGGTTTCTAATTTTGGTTTTCTGTTTTTGAGGGAATGACGGGATGTAGGTTCGTAGGAATGACGGGATATAGGTTTCCGTGCGGATGGATTCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGACCTTAGAACAACAGCAATATTCAAAGATTATCTGAAAGTCCGAGATTCTAGATTCCCGCCTGAGCGGGAATGACGAAAAGTGGCGGGAATGACGGTTAGCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACTAAGTGAATCGGTTCCGTACTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTATSEQ.ID NO27腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)siaABC基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列ATACGGCCAATGGCTTCAGAAAGCGATAAGCCTCTGGCTGAAAAACCGATTTCTTGTGTTCTCCCCACCGCACCCATAGACGTAAAGGTATAGGGATTGGTAATCATGGTAACCACATCACCGCGACGCAGCAAAATATTTTGTCGCGGATTTGCAACTAAATCTTCCAAGGCAACAGTTCGTACTACATTGCCACGTGTCAGCTGCACATTCGTATCCTGCACATTTGCCGTTGAACCACCTACCGCAGCCACCGCATCCAACACACGCTCACCGGCTGCCGTCAGCGGCATACGCACACTATTCCCAGCACGAATCACCGACACATTCGCCGCATTATTCTGCACCAAACGCACCATCACTTGTGGCTGATTGGCCATTTTTTTCAGGCGGCCTTTAATAATTTCCTGAACCTGACCAGGCGTTTTACCGACCACCGAAATATCGCCAACAAACGGCACAGAAACCGTACCACGTGCCGTGACCAACTGCTCTGGCAACTTAGTTTGATGCGCACTACCCGAGCCCATCGAAGAAAGGCCACCACCAAACAATACTGCCGGCGGCGCTTCCCAAATCATAATATCCAATACATCACCAATATTTAGCGTACCAGCCGAAGCATAACCATCGCCAAACTGAGTGAATGACTGATTTATCTGAGCCTTATATAATAACTGAGCAACCGTATGATTCACATCAATCAGCTCCACTTCAGGAATTTGAACTTCAGATTGTTGCCCTAAAGAGACAATTTTTTTTGCGCTGGGGCCTGATGAAGGAATCGCAGAGCATCCTACAATTAAACTTCCACACAATAATAATACTGCGTGACGAATATAAAATTTCACTTTAAACACAAGCCAAATCCTAATATAATTATAAATGGCCTAATTATAGCACTTAATCGAAATAAATTTATGAGTACGTAGAGTATAATTAGTATTCTTCTTTCCAACTTCCTTATACTTATATATATATACTTATAGATTCTAAAATCSEQ.ID NO28腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)lgt基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列from thefromGCCAAAGCATTGGGCGCGGATGCCGCCGCTGCCGAACGCGCCGCGCGTCTTGCCAAAGCCGACTTGGTAACCGAAATGGTCGGCGAGTTCCCCGAACTGCAAGGCACGATGGGCAAATACTATGCCTGTTTGGACGGCGAAACCGAAGAAATTGCCGAAGCCGTCGAGCAGCACTATCAGCCGCGTTTTGCCGGCGACAAGCTGCCCGAAAGCAAAATTGCCGCCGCCGTGGCACTGGCCGACAAACTAGAAACCTTGGTCGGCATTTGGGGCATCGGTCTGATTCCGACCGGCGACAAAGACCCCTACGCCCTGCGCCGCGCTGCCTTGGGTATTTTGCGTATGCTGATGCAGTATGGTTTGGACGTGAACGAACTGATTCAGACGGCATTCGACAGCTTCCCCAAAGGTTTGCTCAACGAAAAAACGCCGTCTGAAACCGCCGACTTTATGCAGGCGCGCCTTGCCGTGTTGCTGCAAAACGATTATCCGCAAGACATCGTTGCCGCCGTACTCGCCAAACAGCCGCGCCGTTTGGACGATTTGACCGCCAAACTGCAGGCCGTTGCCGCGTTCAAACAACTGCCCGAAGCCGCCGCGCTCGCCGCCGCCAACAAACGCGTGCAAAACCTGCTGAAAAAAGCCGATGCCGAGTTGGGCGCGGTTAACGAAAGCCTGTTGCAACAGGACGAAGAAAAAGCCCTCTTTGCCGCCGCGCAAGGCTTGCAGCCGAAAATCGCCGCCGCCGTCGCCGAAGGCAATTTCCAAACCGCCTTGTCCGAACTGGCTTCCGTCAAACCGCAAGTCGATGCATTCTTTGACGGCGTGATGGTAATGGCGGAAGATGCCGCCGTAAAACAAAACCGCCTGAACCTGCTGAACCGCTTGGCAGAGCAAATGAACGCGGTAGCCGACATCGCGCTTTTGGGCGAGTAACCGTTGTACAGTCCAAATGCCGTCTGAAGCCTTCAGACGGCATCGTGCCTATCGGGAGAATAAASEQ.ID NO29腦膜炎奈瑟氏菌(菌株MC58)TbpB基因(1000bp)上游DNA區(qū)核苷酸序列GAACGAACCGGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGAATTTCAGGTTACTGTTTTTGGTTTTCTGTTTTTGTGAAAATAATGGGATTTCAGCTTGTGGGTATTTACCGGAAAAAACAGAAACCGCTCCGCCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGGTCTGTCGGTGCGGAAACTTATCGGATAAAACGGTTTCTTGAGATTTTTCGTCCTGGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGCGAACAGAAACCGCTCCGCCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGACATTCAATGCTAAGGCAATTTATCGGGAATGACTGAAACTCAAAAAACTGGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGTGGTGCAGGTTTCCGTATGGATGGATTCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGACCTTCAATACTAAGGCAATTTATCGGAAATGACTGAAACTCGAAAAACTGGATTCCCACTTTTGTGGGAATGACGCGATTAGAGTTTCAAAATTTATTCTAAATAGCTGAAACTCAACACACTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGAAGTGGAAGTTACCCGAAACTTAAAACAAGCGAAACCGAACGAACTGGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGGAATGTAGGTTCGTGGGAATGACGGCGGAGCGGTTTCTGCTTTTTCCAATAAATGACCCCAACTTAAAATCCCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGGTCTGTCGGTGCGGAAACTTATCGGGTAAAACGGTTTCTTGAGATTTTGCGTCCTGGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGGAATGTAGGTTCGTGGGAATGACGGGATATAGGTTTCCGTGCGGACGCGTTCGGATTCATGACTGCGCGGGAATGACGGGATTTTGGTGTATTCCCTAAAAAAATAAAAAAGTATTTGCAAATTTGTTAAAAATAAATAAAATAATAATCCTTATCATTCTTTAATTGAATTGGATTTATTSEQ.ID NO30腦膜炎奈瑟氏菌(血清型A)opc基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列CAAAGGCTACGACAGTGCGGAAAACCGGCAACATCTGGAAGAACATCAGTTGTTGGACGGCATTATGCGCAAAGCCTGCCGCAACCGTCCGCTGTCGGAAACGCAAACCAAACGCAACCGGTATTTGTCGAAGACCCGTTATAGTGGATTAAATTTAAATCAGGACAAGGCGACGAAGCCGCAGACAGTACAAATAGTACGGCAAGGCGAGGCAACGCCGTACTGGTTTAAATTTAATCCACTATATGTGGTCGAACAGAGCTTCGGTACGCTGCACCGTAAATTCCGCTATGCGCGGGCAGCCTATTTCGGACTGATTAAAGTGAGTGCGCAAAGCCATCTGAAGGCGATGTGTTTGAACCTGTTGAAAGCCGCCAACAAGCTAAGTGCGCCCGCTGCCGCCTAAAAGGAGACCGGATGCCTGATTATCGGGTATCCGGGGAGGGTTAAGGGGGTATTTGGGTAAAATTAGGAGGTATTTGGGGCGAAAATAGACGAAAACCTGTGTTTGGGTTTCGGCTGTCGGGAGGGAAAGGAATTTTGCAAAGATCTCATCCTGTTATTTTCACAAAAACAGAAAACCAAAAACAGCAACCTGAAATTCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGACCCCCAACGCGGCAGGAATCTATCGGAAATAACCGAAACCGGACGAACCTAGATTCCCGCTTTCGCGGGAATGACGGCAGAGTGGTTTCAGTTGCTCCCGATAAATGCCGCCATCTCAAGTCTCGTCATTCCCTTAAAACAGAAAACCGAAATCAGAAACCTAAAATTTCGTCATTCCCATAAAAAACAGAAAACCAAGTGAGAATAACAATTCGTTGTAAACAAATAACTATTTGTTAATTTTTATTAATATATGTAAAATCCCCCCCCCCCCCCCCCGAAAGCTTAAGAATATAATTGTAAGCGTAACGATTATTTACGTTATGTTACCATATCCGACTACAATCCAAATTTTGGAGATTTTAACTSEQ.ID NO31腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)siaD基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列ATAATGCAGGCGCTGAAGTTGTTAAACATCAAACACACATCGTTGAAGACGAAATGTCTGATGAGGCCAAACAAGTCATTCCAGGCAATGCAGATGTCTCTATTTATGAAATTATGGAACGTTGCGCCCTGAATGAAGAAGATGAGATTAAATTAAAAGAATACGTAGAGAGTAAGGGTATGATTTTTATCAGTACTCCTTTCTCTCGTGCAGCTGCTTTACGATTACAACGTATGGATATTCCAGCATATAAAATCGGCTCTGGCGAATGTAATAACTACCCATTAATTAAACTGGTGGCCTCTTTTGGTAAGCCTATTATTCTCTCTACCGGCATGAATTCTATTGAAAGCATCAAAAAGTCGGTAGAAATTATTCGAGAAGCAGGGGTACCTTATGCTTTGCTTCACTGTACCAACATCTACCCAACCCCTTACGAAGATGTTCGATTGGGTGGTATGAACGATTTATCTGAAGCCTTTCCAGACGCAATCATTGGCCTGTCTGACCATACCTTAGATAACTATGCTTGCTTAGGAGCAGTAGCTTTAGGCGGTTCGATTTTAGAGCGTCACTTTACTGACCGCATGGATCGCCCAGGTCCGGATATTGTATGCTCTATGAATCCGGATACTTTTAAAGAGCTCAAGCAAGGCGCTCATGCTTTAAAATTGGCACGCGGCGGCAAAAAAGACACGATTATCGCGGGAGAAAAGCCAACTAAAGATTTCGCCTTTGCATCTGTCGTAGCAGATAAAGACATTAAAAAAGGAGAACTGTTGTCCGGAGATAACCTATGGGTTAAACGCCCAGGCAATGGAGACTTCAGCGTCAACGAATATGAAACATTATTTGGTAAGGTCGCTGCTTGCAATATTCGCAAAGGTGCTCAAATCAAAAAAACTGATATTGAATAATGCTTATTAACTTAGTTACTTTATTAACAGAGGATTGGCTATTACATATAGCTAATTCTCATTAATTTTTAAGAGATACAATASEQ.ID NO32腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)ctrA基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列ATACCTGCACTTGAGTTGCCGACCATAAATTTAGCATGTTTCAATAAGACTAAAAAATATTCAAATCGAATGGAAGGAAATGCAATAAATTTATCAGATTGATATTTTAATAATTCTTGCAGAATACTTTCAGTGCCAGTGTCATTATTAGGGTAGATGCTAATGATATTTTGGCCACTTAATTCTAATGCTTTGAAATATTGGGCCGCATATTGTGGCATTAAATGTGCTTCTGTAGTCACGGGGTGAAACATAGAAATACCATAATTTTCGTATGGTAAACCGTAATATTCTTTGACTTCTTCTAAGGATGGGAGGGTGGAAGAGGCCATAACATCTAAATCGGGGGAGCCGATGATGTGAATATGCTTTCTTTTTTCTCCCATTTGCACTAGGCGAGTGACAGCTTGTTCATTTGCTACCAAGTGGATATGAGAAAGTTTACTAATAGAATGACGAATGGAGTCATCTACTGTACCAGATAGTTCACCACCTTCGATATGGCAAACTAAACGGCTGCTTAATGCACCTACAGCTGCGCCTGCTAGTGCTTCTAAACGGTCGCCGTGAATCATGACCATATCAGGTTCAATTTCATCAGATAGACGAGAGATAAACGTAATGGTATTGCCTAAAACGGCACCCATTGGTTCACCTTGGATTTGATTTGAAAACAGATATGTATGTTGATAGTTTTCTCGAGTTACTTCCTTGTAGGTTCTGCCATATGTTTTCATCATATGCATACCAGTTACAATCAAATGCAATTCAAGGTCTGGGTGATTTTCAATATAGGCTAATAAAGGTTTTAGCTTGCCGAAGTCGGCTCTGGTACCTGTAATGCAAAGAATTCTTTTCATGATTTTAGAATCTATAAGTATATATATATAAGTATAAGGAAGTTGGAAAGAAGAATACTAATTATACTCTACGTACTCATAAATTTATTTCGATTAAGTGCTATAATTAGGCCATTTATAATTATATTAGGATTTGGCTTSEQ.ID NO33腦膜炎奈瑟氏菌(血清型A)lgtF基因上游(1000 bp)DNA區(qū)核苷酸序列from thefromTCTTTTTCGGACTGAAAGGACGCATCATCCCGACATCGAGCGCGTGTTCGTCCGGCAGCCAAGGCATAGGTTATGCCTACGAAGCCATCAAATACGGTCTGACCGATATGATGCTGGCGGGCGGAGGCGAAGAATTTTTCCCGTCCGAAGTGTATGTTTTCGACTCGCTTTATGCCGCCAGCCGCCGCAACGGCGAACCGGAAAAAACCCCGCGCCCATACGACGCGAACCGCGACGGGCTGGTCATCGGCGAAGGCGCGGGGATTTTCGTGCTGGAAGAATTGGAACACGCCAAACGGCGCGGTGCGATAATTTACGCCGAACTCGTCGGCTACGGAGCCAACAGCGATGCCTACCATATTTCCACGCCCCGCCCCGACGCGCAAGGCGCAATCCTTGCCTTTCAGACGGCATTGCAACACGCAGACCTTGCGCCCGAAGACATCGGCTGGATTAATCTGCACGGCACCGGGACGCACCACAACGACAGTATGGAAAGCCGCGCCGTTGCAGCGGTTTTCGGCAACAATACGCCCTGCACGTCCACCAAGCCGCAAACCGGACACACGCTGGGCGCGGCGGGCGCAATCGAAGCCGCGTTCGCGTGGGGCATTGCTGACCGGAAAAGCAATCCCGAAGGGAAACTTCCGCCCCAGCTTTGGGACGGGCAGAACGATCCCGACCTTCCCGCCATCAACCTGACCGGCAGCGGCAGCCGCTGGGAAACCGAAAAACGCATTGCCGCCAGCTCGTCGTTTGCCTTCGGAGGAAGCAACTGCGTTTTACTCATCGGATGAAATAAGTTTGTCAATCCCACCGCTATGCTATACAATACGCGCCTACTCTTGATGGGTCTGTAGCTCAGGGGTTAGAGCAGGGGACTCATAATCCCTTGGTCGTGGGTTCGAGCCCCACCGGACCCACCAATTCCCAAGCCCGGACGTATGTTTGGGCTTTTTTGCCGCCCTGTGAAACCAAAATGCTTTGAGAAACCTTGATASEQ.ID NO34腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)lgtB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TAGAAAAATATTTCGCCCAATCATTAGCCGCCGTCGTGAATCAGACTTGGCGCAACTTGGAGATTTTGATTGTCGATGACGGCTCGACAGACGGTACGCTTGCCATTGCCAAGGATTTTCAAAAGCGGGACAGCCGTATCAAAATCCTTGCACAAGCTCAAAATTCCGGCCTGATTCCCTCTTTAAACATCGGGCTGGACGAATTGGCAAAGTCAGGAATGGGGGAATATATTGCACGCACCGATGCCGACGATATTGCCGCCCCCGACTGGATTGAGAAAATCGTGGGCGAGATGGAAAAAGACCGCAGCATCATCGCGATGGGCGCGTGGCTGGAAGTTTTGTCGGAAGAAAAGGACGGCAACCGGCTGGCGCGGCATCACAGGCACGGCAAAATTTGGAAAAAGCCGACCCGGCACGAAGATATTGCCGACTTTTTCCCTTTCGGCAACCCCATACACAACAACACGATGATTATGAGGCGCAGCGTCATTGACGGCGGTTTGCGTTACAACACCGAGCGGGATTGGGCGGAAGATTACCAATTTTGGTACGATGTCAGCAAATTGGGCAGGCTGGCTTATTATCCCGAAGCCTTGGTCAAATACCGCCTTCACGCCAATCAGGTTTCATCCAAATACAGCATCCGCCAACACGAAATCGCGCAAGGCATCCAAAAAACCGCCAGAAACGATTTTTTGCAGTCTATGGGTTTTAAAACCCGGTTCGACAGCCTTGAATACCGCCAAATAAAAGCAGTAGCGTATGAATTGCTGGAGAAACATTTGCCGGAAGAAGATTTTGAACGCGCCCGCCGGTTTTTGTACCAATGCTTCAAACGGACGGACACGCTGCCCGCCGGCGCGTGGCTGGATTTTGCGGCAGACGGCAGGATGCGGCGGCTGTTTACCTTGAGGCAATACTTCGGCATTTTGCACCGATTGCTGAAAAACCGTTGAAAAACGCCGCTTTATCCAACAGACAAAAAACAGGATAAATTSEQ.ID NO35腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)lst基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GCGCACGGCTTTTTCTTCATCGGTTTGAGGGTCGGCAGGATAATCGGGGACGGCAAAGCCTTTAGACTGCAATTCTTTAATCGCGGCGGTCAGTTGAGGTACGGATGCGCTGATGTTCGGCAGTTTGATTACGTTTGCATCGGGCTGTTTCACCAGTTCGCCCAATTCGGCAAGCGCGTCGGGTACGCGCTGCGCTTCGGTCAGATATTCGGGGAATGCCGCCAAAATACGGCCGGACAGGGAAATGTCGGCAGTTTTGACATCAATATCGGCGTGGCGGGCAAACGCCTGCACAATCGGCAGCAGCGATTGGGTCGCCAGCGCGGGGGCTTCGTCGGTATGGGTATAAACAATGGTGGATTTTTGAGTCATAGGATTATTCTCTTGTAGGTTGGTTTTTTCTTTTGGAACACATTGCGCGGGGAATGTGCGCGGCTATTATGGCATATTTTGGCGGCTTTGTTCGCGCTTTGTTCGATCTTGGCGTGTTTGAACGCGGCAGCGTGAAAGGAAGGGGGAAATGGTTTTCCCGCGTTTGGCGGCGGTGTCGGAGGTGCTGTGCCTGATGTGCGGCGGCATATTTTCGGTGAAATTGATTTTATAGTGGTTTAAATTTAAACCAGTACAGCGTTGCCTCGCCTTGTCGTACTATCTGTACTGTCTGCGGCTTCGTTGCCTTGTCCTGATTTAAATTTAAACCACTATAATATTCGGTAACTGTCGGAATATCTGCTAAAATTCCGCATTTTTCCGCCTCGGGACACTCGGGGCGTATGTTTAATTTGTCGGAATGGAGTTTTAGGGATSEQ.ID NO36腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)msbB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GCCCGACGGCGAACAGACACGTCGTGAAATCAACCGCTTGGACAGTACGGCGGCGCAATACGACATGCTTGCAGGTTATCTTGAAAGACTTGCCGGAAAAACCGACCGTTGGGCGTGCGCCTACCGCCAAAATGCCGTCTGAACACCCGATTATCCTTTTGAAAGCGCGATTATGCCCCATACCCTTCCCGATATTTCCCAATGTATCAGACAAAATTTGGAACAATATTTCAAAGACCTGAACGGTACCGAACCTTGCGGCGTGTACGATATGGTCTTGCATCAGGTGGAAAAACCGCTGCTGGTGTGCGTGATGGAACAATGCGGCGGCAACCAGTCCAAAGCCTCCGTCATGTTGGGACTGAACCGCAATACTTTGCGTAAAAAACTGATTCAACACGGTTTGCTGTGAATATGTCGGCAACCGTCCGTATCTTGGGTATTGACCCGGGCAGTCGCGTAACGGGTTTCGGTGTCATCGATGTCAGGGGGCGCGATCATTTTTACGTCGCCTCCGGCTGCATCAAAACGCCTGCCGATGCGCCTCTGGCAGACAGGATTGCCGTGATTGTGCGGCATATCGGCGAAGTCGTTACCGTTTACAAGCCTCAACAGGCGGCAGTGGAACAGGTGTTCGTCAACGTCAATCCGGCATCGACGCTGATGCTCGGTCAGGCTAGGGGCGCGGCATTGGCGGCATTGGTCAGCCATAAGCTGCCCGTTTCGGAATACACGGCCTTGCAGGTCAAACAGGCGGTAGTCGGCAAGGGCAAGGCGGCAAAAGAACAGGTGCAGCATATGGTGGTGCAGATGCTGGGGCTTTCGGGAACGCCGCAGGANTGGCGGCGGACGGTCTTGCCGTCGCGCTGACCCACGCCTTACGCAACCACGGGCTTGCCGCCAAACTCAATCCTTCGGGGATGCAGGTCAAGCGCGGCAGGTTTCAATAGTTTCAGACGGCATTTGTATTTTGCCGTCTGAAAAGAAAATGTGTATCGAGSEQ.ID NO37腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)htrB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列CCGCCAAGCGTTTCCCCCTTTGTCGGGCTTAACATTTGCTTTGTACGGCAGACTTTTTCCCTTCATAACGCCGCCTTTCCGAAAAGACGATGGTAGGCGCGACGTAATTCTCAACCCTTAAGGTACGGTTGGACGAAAAGTTTTCCTTTTCATTCCACCTGCCAACTTTTCGGCTACACCGAGTGGTCTCGTTAGGTTTGGGCGAACTACGCCCTTAAAAAAACGGACATTCTTTGCATGCCCGTCTCTAAGGTTTCACGGTAAGTTTACCCTTATAAAGAGTTGACTTACCATACTTATCCCTTTAAAACGATATAAAGGGCGACAGCTGTAATACAAGTATGTTGTACGGCAGACTTCTTCTACCAAACAAAAAGTTCCTTTTAGAGTTACTCGCTTATAGACAAATGAAGGCTTAGCCATAGGCTTCCGGTAGGCCTATTTCAACGGCTGGTTCACAGGCTACGCTAAAACCTACGGTAGAACCGCGTTCTGGGGTTTCGCGCACAGCGGCGTCTTTGGAACCAGTTGTGTCCGAACACGCATAACCGCCCGCTTTAATGGTGGTGGCGGGTTCACCTGATGTAGTTTCAGCGTGCGCTTTGGTAGTTTGCGTAGCCGATGTTGAGGAGGCTCGACCCGAAACTACGGTTGCCGACGCGCCAGCCGCACATGATGCTGGTCGTTAGAGGCCTGTAGCGGGTTCCGCACTTGCTTCCGCTTCCGTAACTGAACTTGGTTCCGCGACCGCTGGTTCCAAACTACAAGCCGATACGGACGCTGCTTTGGGGCTGGGACTACGGCAAACGGTAGATAATGTCGGTGGCGGACTACGTCGCAGTTTCGCTTAATGCGTTTCTGCCGGAGGACGGAACCGACGCAGGGCTGCGTTTTCGGGTTGACTGGCACCAAATGCTATCGCTTAGGCCGTTTCATTTTGCGTAACTATGGCAGCAGGAGAGATACGTTGTGCTGGGCCTTTAGCCAATACTTCTCAACTSEQ.ID NO38腦膜炎奈瑟氏菌(血清型B)MltA基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列CACAAAAACCAAGTTATGACGGGAATAAGGTACAGCAGCCAAACCAAGGCCTCGCCCTGCGTCGGATGGTCGGTATAGCCGAAAAATCCGCCGAGCAGCACGCCCAACGGGCTGTCTTCGTGCAAATATTTTGATGAGTCGAACACAATGTCCTGAAGCGCGTTCCAAATGCCTGCTTCGTGCAGCGCACGCAGCGAACCGGCAAGCAGACCAGCGGCAACGATAATCAGAAACGCCCCTGTCCAACGGAAAAACTTCGCCAGATTCAGGCGCATCCCACCCTGATAAATCAACGCGCCAATCACGGCGGCAGCCAAAACCCCCGCTACCGCACCGGCCGGCATCTGCCACGTCGGGCTCTGTTTGAATACGGCAAGCAGGAAAAAAACGCTCTCCAAACCTTCGCGCGCCACGGCAAGAAACGCCATACCGACCAAGGCCCATCCTTGACCGCTGCCACGGTTCAAAGCCGCCTGCACAGAATCCTGAAGCTGCCGCTTCATCGAACGGGCGGCTTTTTTCATCCATAAAATCATATAAGTCAGCATCGCGACAGCAACCAAACCGATAATGCCGACGACGAACTCCTGCTGCTTCTGGGGAATCTCGCCCGTTGCCGAATGGATTCCGTACCCCAGCCCCAAACACATCAAAGAAGCAAGAACAACCCCGAACCAGACCTTAGGCATCAGTTTGGAATGTCCGGACTGTTTCAGAAAACCGGCAACGATGCCGACGATGAGCGCGGCTTCGATACCCTCGCGCAACATAATTAAAAAAGCGACCAGCATAAACGCGAACGAACAAGGATGATGAATAATATATTATCGGAATATTTTCATTGCTTGTAAATACAAATGCAAGTTATTTTTATCTGCAGTACCGCGCGGCGGAAAGTTCCGCAGCTGCAGCTGCGCCCTGTGTTAAAATCCCCTCTCCACGGCTGCCGCAACGCCGCCCGAAACCATCTTTCTTATTACTGCCGGCAACATTGTCCATTSEQ.ID NO39粘膜炎莫拉氏菌ompCD基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GCTGATTTGTGAGCAAGCGGGCGCATCAGGGATTACCTTGCATTTGCGAGAAGATCGTCGACATATTCAAGATGAAGATGTTTATGAATTGATTGGGCAATTGACAACACGCATGAATCTTGAGATGGCAGTCACTGATGAGATGCTAAATATTGCCCTAAAGGTACGACCAGCATGGGTGTGTTTAGTACCAGAAAAACGCCAAGAGCTGACTACAGAAGGTGGGCTTGATATCGCCAATTTATCAAATATTCAAGCATTTATACACAGTCTTCAGCAGGCGGATATTAAGGTTTCTTTATTCATCGATCCAGATCCGCATCAAATTGATGCTGCAATTGCTTTGGGTGCTGATGCGATTGAGCTGCATACGGGAGCTTATGCTCAAGCGACTTTACAAAATAATCAAAAGCTTGTTGATAAAGAGCTTGACCGTATTCAAAAAGCCGTTGCAATGGCACAAAAAAAATCATCATTATTGATTAATGCAGGTCATGGTTTGACGCGTGATAATGTTGCAGCGATTGCCCAAATTGATGGTATTCATGAGCTGAATATCGGGCATGCATTGATTTCAGATGCGATATTTATGGGGCTTGATAATGCAGTCAAGGCAATGAAAATGGCTTTTATTCAAGATAAAACGACCAATCATTGATGCGTTAGAAAGAAAATCGTAAATAATGATGACTATTGTGTAATATTATGTATTTTTGTTCAAAAAAAGGTTGTAAAAAAATTCATTTACCATTAAGCTAAGCCCACAAGCCACAATGAATACCTATTGGTTTGACTCATTAGTCACTAAGAATCTGCAAAATTTTGTAACAGATTATTGGCAGGTCTTGGATCGCTATGCTAAAATAGGTGCGGTAATCTTGAAAAACCAACCATTCCTTGGAGGAATTTATGAAAAAGGGATATAAACGCTCTTGCGGTCATCGCAGCCGTTGCAGCTCCAGTTGCAGCTCCAGTTGCTGCTCAAGCTGGTGTGACAGTCSEQ.ID NO40粘膜炎莫拉氏菌copB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GATGCTGTTAAAGTGGGTATTGGTCCTGGTTCTATTTGTACAACCCGTATTGTTGCAGGCATTGGCGTCCCGCAGATAAGTGCCATTGATAGTGTGGCAAGTGCGTTAAAAGATCGCATTCCTTTGATTGCCGATGGCGGTATTCGTTTTTCGGGTGATATCGCCAAAGCCATCGCAGCAGGCGCTTCATGTATTATGGTGGGTAGCTTGTTGGCAGGTACCGAAGAAGCACCTGGTGAGGTGGAATTATTCCAAGGTCGTTATTATAAGGCTTATCGTGGTATGGGCAGCTTGGGGGCAATGTCTGGTCAAAATGGCTCATCGGATCGTTATTTTCAAGATGCCAAAGATGGTGTTGAAAAACTGGTTCCAGAGGGTATCGAAGGCCGTGTTCCTTATAAAGGCCCTGTGGCAGGCATCATCGGTCAATTGGCAGGTGGTCTAAGATCATCCATGGGTTATACAGGTTGCCAGACCATCGAACAGATGCGTAAGAATACCAGCTTTGTCAAAGTGACTTCCGCAGGCATGAAGGAATCGCATGTACACGATGTACAGATTACCAAAGAAGCACCCAATTATCGCCAAAATTAACTCTATTAATAGCAAATACAAGCACTCATTAGATAGGGTGGGTGCTTTTTAGAGCATAAAAAATAAACTGACACATGACTTATTGTCATATTTTTAAAATGCTTTTAATTTAGATTTTTAATTTAGATAATGGCTAAAAATAACAGAATATTAATTTAAAGTTTTCAAAATCAAGCGATTAGATGAAATTATGAAAATAAATAACAATAATTCTGATTTATTTTAACCAATAATATCAATTATCATTTACAAGAAAAATTTTTTTTGATAAAATTCTTACTTGTACCTTGCTATTTTTTCTTATTTATCATTTTTGGCGGTATTTTCGTTGATTTTAGTAAGTAGATGAGCAAGGGATAATTTGACAAAAACAAATTTGATTTCAAGCCTCATAATCGGAGTTATTSEQ.ID NO41粘膜炎莫拉氏菌D15基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列AAAACTGGTGATGTCTTCACTGCTATTCATGGTGAACCAATCAATGATTGGCTAAGTGCCACCAAGATTATTCAGGCAAATCCAGAAACCATGCTTGATGTGACAGTCATGCGTCAAGGTAAGCAGGTTGATTTAAAATTAATGCCCCGTGGTGTAAAGACACAAAACGGCGTAGTCGGTCAACTGGGTATTCGCCCCCAGATTGATATCGATACGCTCATTCCTGATGAATATCGTATGACGATTCAATATGATGTCGGTGAGGCATTTACTCAAGCCATCCGACGAACTTATGATTTATCAATAATGACCTTAGATGCGATGGGTAAGATGATTACAGGATTGATTGGCATTGAAAATCTATCAGGTCCCATTGCCATTGCCGATGTTTCTAAGACCAGTTTTGAGTTGGGATTTCAAGAAGTGTTATCGACAGCCGCAATCATCAGTTTAAGCTTGGCAGTACTGAATCTTTTACCCATTCCAGTGTTAGATGGCGGGCATTTGGTATTTTATACTTATGAATGGATTATGGGCAAATCTATGAATGAAGCGGTGCAGATGGCAGCATTTAAAGCGGGTGCGTTATTGCTTTTTTGTTTCATGTTACTTGCAATCAGTAACGATATCATGCGATTTTTTGGCTAAGTTCTGATTTATCGTACCATTAACAAAATTTTTGGCTTTTTTAAGCTGAAATACTTGCCAAATTTAACTTTTTGGCTTACCTTTACACAATATAAATTTGGGTGTAGAAAATTTTGGATACATTTTTATACCTTATTTTTAGAAATTTTAAAAATTAAGTTTGGATAGACTTATGCGTAATTCATATTTTAAAGGTTTTCAGGTCAGTGCAATGACAATGGCTGTCATGATGGTAATGTCAACTCATGCACAAGCGGCGGATTTTATGGCAAATGACATTGCCATCACAGGACTACAGCGAGTGACCATTGAAAGCTTACAAAGCGTGCTGCCGTTTCGCTTGGGTCAAGTGSEQ.ID NO42粘膜炎莫拉氏菌omplA基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列ACTTGGCGAAAATACCATTTATATCGATTGTGATGTTATACAGGCAGATGGCGGTACACGCACAGCCAGTATCAGTGGTGCTGCGGTGGCACTTATTGATGCTTTAGAACACTTGCAGCGTCGTAAAAAGCTTACCCAAGATCCGCTTTTGGGCTTGGTGGCAGCGGTTTCTGTGGGTGTTAATCAAGGCCGTGTATTGCTTGATTTGGATTATGCTGAAGATTCAACTTGTGATACCGATTTAAATGTGGTCATGACGCAGGCAGGTGGGTTTATTGAGATTCAAGGCACAGCAGAAGAAAAGCCATTTACTCGTGCTGAAGCTAATGCGATGCTTGATTTGGCAGAGCTGGGAATTGGGCAGATTATCGAAGCCCAAAAGCAAGTATTAGGCTGGTGATATGCTAATCGTTGAAGATAATGGCGTGATCATCACATTAAATGGACAAGTAAAAGACCCATTATTTTGGTGGTCGATGATATTGCTGCTGCTGGGTGTCTTGGTGGCAATCATTTGTTTGATTGCACCCGTTTTTTATGCAATCGGTGCGTTGGCTTTATTTGCAGTTGTGGTATTTGTGTTTAATATTCAAAGGCAAAAAGCCAAAACTTGTCATATGTTTTCACAAGGTCGCTTGAAGATTACGTCCAAACGCTTTGAGATTCATAACAAATCACTAACCTTATCAGCATCGGCAACAATATCTGCTAAAGATAACAAAATGACAATTGTTGATCGGGGCATTGAATATCATTTTACAGGTTTTGCTGATGACCGTGAAATTAATATAGCCAAACAGGTACTTTTGGGAAAGTCAATCAAAACCAATGCGGTGGCGGTAACATTGGCTAAGTAGTTGTTGTGATACAGACAGGTTGGATGGTCTTTAACTCCACCCACCTAACTTTTTCTTTGTTTGGATTTAAGAGTATGTTATGATGGGCAGGATTTTATTTTAAGTCATCATTTAATGCAATCAGTTGTCCAGAGTAGCCGTTCSEQ.ID NO43粘膜炎莫拉氏菌hly3基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GTGATCGGCAACACCCCACCATTCAGGAGCAACCAAAATTGCCCGTGCCTTGCCTGTCTTGGTGGTATCATTTGGCAGGGCAATGTGGCTAAGTAGTGGTGTGCCATCAGGTGCGGTGGTGGTGAGTGTACGATTCGTTATTGTCATAAAATTATCCTTTTGGGTTGGATGATATCAATGAAATACCCTACGGTTGTATGGAATTTTATCCATTGTACCACGGTATTGGTCTTTTTAAATTAACAAGCAGCTTCTAGCAAGTCAAAGTTTTTATGCCTATTTTTTCAGATTTTAAGGTACAATAAAGCCAATTGTTAATAATATGGTATTGTCATGATTTATGATGAATTGCGACCAAAATTTTGGGAAAATTATCCCTTAGATGCGTTAACAGATGCTGAATGGGAAGCATTATGTGACGGATGTGGCGCGTGTTGTTTGGTGAAATTTCTTGATGATGACAATGTTAAATTGACCGAATATACCGATGTTGCCTGCCAGCTATTGGATTGCTCAACAGGATTTTGCCAAAACTATGCCAAGCGTCAAACGATTGTGCCAGATTGTATTCGCTTAACACCTGATATGCTGCCTGATATGCTGTGGTTGCCACGCCATTGTGCTTATAAGCGGTTGTATCTTGGGCAAAATCTGCCAGCATGGCACAGGCTCATTAAACATAGCCAAAACCATGGTGCAGGATTTGCGAAAGTTTCAACTGCTGGGCGATGTGTGAGTGAGCTTGGTATGAGTGATGAAGACATAGAAAGGCGAGTGGTGAAATGGGTTAAACCTTGACATGATTGTTGACATGATTGACAGACAATAAAAATTGGCAAATTTGATAAAATTGGTGTATGTGTGTGATTTTATCAAAAGCACTTGAATAAAACCGAGTGATACGCTAAATTGTAGCAAACCAATCAATTCATCATAATTTTAATGAACACGAGGTTAAATTATACTGTCTATGTCTGATGACAATTCAAGCACTTGGTCGSEQ.ID NO44粘膜炎莫拉氏菌lbpA基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TAACAAAGGCAACCCAACACGCAGTTATTTTGTGCAAGGCGGTCAAGCGGATGTCAGTACTCAGCTGCCCAGTGCAGGTAAATTCACCTATAATGGTCTTTGGGCAGGCTACCTGACCCAGAAAAAAGACAAAGGTTATAGCAAAGATGAGGATACCATCAAGCAAAAAGGTCTTAAAGATTATATATTGACCAAAGACTTTATCCCACAAGATGACGATGACGATGACGATGACGATAGTTTGACCGCATCTGATGATTCACAAGATGATAATACACATGGCGATGATGATTTGATTGCATCTGATGATTCACAAGATGATGACGCAGATGGCGATGACGATTCAGATGATTTGGGTGATGGTGCAGATGATGACGCCGCAGGCAAAGTGTATCATGCAGGTAATATTCGCCCTGAATTTGAAAACAAATACTTGCCCATTAATGAGCCTACTCATGAAAAAACCTTTGCCCTAGATGGTAAAAATAAGGCTAAGTTTGATGTAAACTTTGACACCAACAGCCTAACTGGTAAATTAAACGATGAGAGAGGTGATATCGTCTTTGATATCAAAAATGGCAAAATTGATGGCACAGGATTTACCGCCAAAGCCGATGTGCCAAACTATCGTGAAGAAGTGGGTAACAACCAAGGTGGCGGTTTCTTATACAACATCAAAGATATTGATGTTAAGGGGCAATTTTTTGGCACAAATGGCGAAGAGTTGGCAGGACGGTTACATCATGACAAAGGCGATGGCATCACTGACACCGCCGAAAAAGCAGGGGCTGTCTTTGGGGCTGTTAAAGATAAATAAAGCCCCCCTCATCATCGTTTAGTCGCTTGACCGACAGTTGATGACGCCCTTGGCAATGTCTTAAAACAGCACTTTGAAACAGTGCCTTGGGCGAATTCTTGGATAAATGCACCAGATTTGCCTCGGGCTAATATCTTGATAAAACATCGCCATAAAATAGAAAATAAAGTTTAGGATTTTTTTSEQ.ID NO45粘膜炎莫拉氏菌lbpB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列CAGCTTGTACCATTTGGTGAATATATACCATTTGGTGGTTTGTTGGATATTTTACCAGGGCTTGAGGGTGTCGCTAGCCTAAGCCGTGGCGATGATAAGCAACCACCGCTCAAATTGGGCGGCGGCGTGGGCGATACGATTGGTGCGGCAATTTGTTATGAGGTGGCATATCCTGAGACGACGCGTAAAAATGCACTTGGCAGTAATTTTTTATTAACCGTCTCAAACGATGCTTGGTTTGGTACAACAGCAGGTCCTTTGCAGCATTTACAAATGGTGCAAATGCGAAGCTTGGAGACGGGGCGATGGTTTGTGCGTGCAACAAACAACGGAGTGACTGCATTAATTGACCATCAAGGACGGATTATCAAGCAGATACCGCAGTTTCAGCGAGATATTTTGCGAGGTGATGTACCCAGTTATGTTGGACACACGCCTTATATGGTTTGGGGGCATTATCCCATGTTGGGGTTTTCTTTGGTGCTGATTTTTCTTAGTATCATGGCAAAGAAAATGAAAAATACCACCGCCAAACGAGAAAAATTTTATACCGCTGATGGTGTGGTAGACCGCTGAATTGTGCCACTTTGGGCGTTAGAGCATGAGCAAGATTAGGCGTTGGGTGAGCTTTGGTTGTATTACTCATCAGCCTACCCGAAACCTGCCAAACATCACCGCCCAAAACCTAAACATACAATGGCTAAAAATATCAGAAAATAACTTGCTGTATTGTAAATTCTTATGTTATCATGTGATAATAATTATCATTAGTACCAAGATATCCATTACTAAACTTCATCCCCCATCTTAACAGTTACCAAGCGGTGAGCGGATTATCCGATTGACAGCAAGCTTAGCATGATGGCATCGGCTGATTGTCTTTTTGCCTTGTTGTGTGTTTGTGGGAGTTGATTGTACTTACCTTAGTGGTGGATGCTTGGGCTGATTTAATTAAATTTGATCAAAGCGGTCTTCACAACACACCAAACGAGATATCACCSEQ.ID NO46粘膜炎莫拉氏菌tbpB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列AGTTTGCCCTGATTTTGAGAGCCACTGCCATCATGAATTTGTTGGCGTAAACACCACTCGTATTCTTCTTCGGTTTCCCCTTTCCATGCAAACACAGGGATACCAGCGGCCGCCATGGCAGCGGCGGCGTGGTCTTGGGTGCTAAAAATATTGCATGATGTCCAGCGAACTTCTGCACCCAAGGCAACCAAAGTCTCAATCAGCACCGCTGTTTGAATGGTCATGTGGATACAGCCTAGGATTTTAGCACCCTTAAGTGGTTGCTGGTCTTGATAGCGTTTTCTTAACCCCATCAGGGCTGGCATCTCAGCTTCTGCCAAGGCAATCTCACGGCGACCATAATCGGCTAAACGGATATCAGCGACTTTATAATCGGTGAAGTTTTGGGTGGTACTTGGATTGATTGAGGTAGGCATATCTTTATTCCTAAGCTATTTTAAAGTATTTTTAACAATAATTTTGATGAATTTGAGATAATTGATGCTAAAAGGTTGAATGACCAAACCATCGCTAACAATCAAGAAAAGACATTTTAAGCATAAAAAGCAAATGTGTCTTGATGGCTTATTATAACAGTTATTATGATAAATTTGGGTAGAAAGTTAAATGGATCGTTGGGTAAGTTTGTTGGCTATCCTTAATTAATTATAATTTTTTAATAATGCTTTTACTTTATTTTAAAAATAGAGTAAAAAATGGTTGGCTTTGGGTTTTTATCTCACTATGGTAGATAAAATTGATACAAAATGGTTTGTATTATCACTTGTATTTGTATTATAATTTTACTTATTTTTACAAACTATACACTAAAATCAAAAATTAATCACTTTGGTTGGGTGGTTTTAGCAAGCAAATGGTTATTTTGGTAAACAATTAAGTTCTTAAAAACGATACACGCTCATAAACAGATGGTTTTTGGCATCTGCAATTTGATGCCTGCCTTGTGATTGGTTGGGGTGTATCGGTGTATCAAAGTGCAAAAGCCAACAGGTGGTCATTGSEQ.ID NO47粘膜炎莫拉氏菌tbpA基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列from thefromTTGGGGGCGGATAAAAAGTGGTCTTTGCCCAAAGGGGCATATGTGGGAGCGAACACCCAAATCTATGGCAAACATCATCAAAATCACAAAAAATACAACGACCATTGGGGCAGACTGGGGGCAAATTTGGGCTTTGCTGATGCCAAAAAAGACCTTAGCATTGAGACCTATGGTGAAAAAAGATTTTATGGGCATGAGCGTTATACCGACACCATCGGCATACGCATGTCGGTTGATTATAGAATCAACCCAAAATTTCAAAGCCTAAACGCCATAGACATATCACGCCTAACCAACCATCGGACGCCCAGGGCTGACAGTAATAACACTTTATACAGCACATCATTGATTTATTACCCAAATGCCACACGCTATTATCTTTTGGGGGCAGACTTTTATGATGAAAAAGTGCCACAAGACCCATCTGACAGCTATGAGCGTCGTGGCATACGCACAGCGTGGGGGCAAGAATGGGCGGGTGGTCTTTCAAGCCGTGCCCAAATCAGCATCAACAAACGCCATTACCAAGGGGCAAACCTAACCAGTGGCGGACAAATTCGCCATGATAAACAGATGCAAGCGTCTTTATCGCTTTGGCACAGAGACATTCACAAATGGGGCATCACGCCACGGCTGACCATCAGTACAAACATCAATAAAAGCAATGACATCAAGGCAAATTATCACAAAAATCAAATGTTTGTTGAGTTTAGTCGCATTTTTTGATGGGATAAGCACGCCCTACTTTTGTTTTTGTAAAAAAATGTGCCATCATAGACAATATCAAGAAAAAATCAAGAAAAAAAGATTACAAATTTAATGATAATTGTTATTGTTTATGTTATTATTTATCAATGTAAATTTGCCGTATTTTGTCCATCACAAACGCATTTATCATCAATGCCCAGACAAATACGCCAAATGCACATTGTCAACATGCCAAAATAGGCATTAACAGACTTTTTTAGATAATACCATCAACCCATCAGAGGATTATTTTSEQ.ID NO48粘膜炎莫拉氏菌ompE基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列AAAGACATTACACATCATCATTCAAACGCCCAACCATGTACCTCTGCCCCGTGGTCGCACGCCAACGCTTTTTGATGCGGTGCGTTGGGTTCAGATGGCTTGTCAATCATTTGGTTTTATTAAAATTCATACCTTTGGTAGTTTGGCTTTACCTGATATGTCATTTGATTATCGAAACAATACGCAGTTGACCAAACATCAATTTTTAGCCATTTGCCAAGCACTCAATATTACCGCTCATACGACCATGCTTGGTATTAAATCATCACATAAAGATACTTTACATCCATTTGAATTGACATTACCCAAATACGGCCATGCCTCAAATTATGATGATGAATTGGTGCAAAACAATCCATTGGCTTATTTTCATCAACTGTCTGCCGTCTGCCGATATTTTTATACCCAAACGGTTTGTATTGTTGGCGGTGAAAGCTCAGGGAAAACTACCTTGGTGCAAAAACTTGCCAATTATTATGGTGCCAGCATCGCACCTGAAATGGGTCGATTATACACACACTCCCATCTCGGCGGTAGCGAACTTGCCCTTCAATACAGCGACTACGCATCCATTGCCATCAATCACGCCAACGCTATCGAAACCGCTCGTACCACTGCCAGCTCTGCTGTTACACTGATTGATACTGATTTTGCGACAACGCAAGCATTTTGTGAAATTTATGAAGGGCGAACGCATCCGCTTGTCGCAGAATTTGCTAAACAAATGCGATTGGATTTTACGATTTATTTAGATAATAATGTTGCTTGGGTCGCTGATGGCATGCGTAGGCTTGGTGATGATCATCAACGCAGTTTGTTCGCCAATAAATTGCTTGAGATTTTGGCACGATATGATATTAGTTATCATATCATTAATGACACCGACTACCACAAACGCTATCTACAAGCATTAAGCTTGATAGACAATCATATTTTTAATCATTTTACAAAAATTCATGACAATTAATTAGGGAAAATCTGATGAAAATTGATATTTTAGSEQ.ID NO49粘膜炎莫拉氏菌uspa1基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GGATGTGGCATATCTGCCCATCGACCCAATACACATCGGTCGAGGCTATCAAGATGTGGTACGAATTAATAGCCAGTCAGGTAAGGGCGGTGCTGCGTATATCTTGCAGCGGCATTTTGGTTTTAATTTACCACGCTGGACACAGATTGATTTTGCTCGTGTGGTACAGGCTTATGCAGAAAGTATGGCGCGTGAACTAAAAACTGATGAGCTGCTTGAAATTTTTACCCAAGCGTATCTTAAGCAAGATAAATTCCGCCTAAGTGACTATACCATCAGCAATAAAGGCGATGCTGTCAGCTTCCAAGGCCAAGTAGCGACACCCAAAGCGGTGTTTGAGGTGATTGGTCAAGGCAATGGTGCGTTATCTGCGTTCATTGATGGCTTGGTGAAATCCACAGGCAGACAGATTCATGTCACCAATTACGCCGAACACGCCATCGATAACAAAACCCATCAAAAAACCGATACGGATAACCAAACCGATGCCGCCGTGCCGCTTATATCCAGCTGTCGGTAGAGGGGCAGATTTATTCAGGCATCGCCACTTGCCATAGCACCGTATCCGCCATGCTAAAAGGTGCATTATCCGCTTTGGCACAGGCGTGGTAATCTGACCCAATCAAAATCCTGCATGATGGCAGGATTTTATTATTTAGTGGGCTGCCCAACAATGATGATCATCAGCATGTGAGCAAATGACTGGCGTAAATGACTGATGAGTGTCTATTTAATGAAAGATATCAATATATAAAAGTTGACTATAGCGATGCAATACAGTAAAATTTGTTACGGCTAAACATAACGACGGTCCAAGATGGCGGATATCGCCATTTACCAACCTGATAATCAGTTTGATAGCCATTAGCGATGGCATCAAGTTGTGTTGTTGTATTGTCATATAAACGGTAAATTTGGTTTGGTGGATGCCCCATCTGATTTACCGTCCCCCTAATAAGTGAGGGGGGGGGAGACCCCAGTCATTTATTAGGAGACTAAGSEQ.ID NO50粘膜炎莫拉氏菌uspa2基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列CCCCAAGCTTTCCGTTTGTGTGCCTGCTGGTGTCGGGCGGTCATACCATGCTGGTGCGTGCCGATGGTGTGGGCGTGTATCAGATATTGGGCGAGTCTATCGATGATGCGGTGGGTGAATGCTTTGATAAAACGGCAAAAATGCTCAAACTGCCCTATCCTGGTGGCCCAAATATCGAAAAATTAGCCAAAAACGGCAACCCACACGCCTATGAGCTGCCAAGACCCATGCAGCATAAAGGGCTGGATTTTTCGTTCAGTGGCATGAAAACCGCCATTCATAATCTCATCAAAGACACACCAAACGCCCAAAGCGACCCCGCCACACGAGCAGACATCGCCGCAAGCTTTGAGTATGCGGTGGTGGATACTTTGGTCAAAAAATGCACCAAAGCACTACAGATGACAGGCATTCGCCAGCTGGTGGTCGCAGGGGGCGTCTCTGCCAATCAGATGCTACGCCGCACCCTGACCGAGACGCTCCGCCAAATCGATGCGTCGGTGTACTATGCCCCGACCGAGCTATGCACGGATAATGGTGCGATGATCGCCTATGCTGGCTTTTGTCGGCTCAGCTGTGGACAGTCGGATGACTTGGCGGTTCGCTGTATTCCCCGATGGGATATGACGACGCTTGGCGTATCGGCTCATAGATAGCCACATCAATCATACCAACCAAATCGTACAAACGGTTGATACATGCCAAAAATACCATATTGAAAGTAGGGTTTGGGTATTATTTATGTAACTTATATCTAATTTGGTGTTGATACTTTGATAAAGCCTTGCTATACTGTAACCTAAATGGATATGATAGAGATTTTTCCATTTATGCCAGCAAAAGAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGAACTCTGTCTTTTATCTGTCCGCTGATGCTTTCTGCCTGCCACCGATGATATCATTTATCTGCTTTTTAGGCATCAGTTATTTCACCGTGATGACTGATGTGATGACTTAACCACCAAAAGAGAGTGCTAASEQ.ID NO51粘膜炎莫拉氏菌omp21基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GAGTGAACTTTATTGTAAAATATGATTCATTAAAGTATCAAAATCATCAAACGCAGCATCAGGGTTTGCTAAATCAATTTTTTCACCATAATTATAGCCATAACGCACAGCAAGCGTAGTTATGCCAGCGGCTTGCCCTGATAAAATATCATTTTTGGAATCACCAACCATAATGGCATCAGTCGGTGCGATGCCCAGTGATTGACACAGGTATAATAAAGGCGTTGGGTCGGGCTTTTTGACGCTGAGCGTATCACCGCCAATCACTTGGTCAAACAGTGTCAGCCATCCAAAATGTGATAAAATTTTAGGCAAATAACGCTCAGGCTTATTGGTACAAATTGCCAAATAAAACCCCGCTGCTTTTAATCGTTCAAGCCCTTGTATAACCCCTGCATAGCTTTGCGTATTTTCAATTGTTTTATGGGCATATTCTGCCAAAAATAACTCATGGGCATGGTGAATCATAGTCGTATCATAGATATGATGTGCTTGCATTGCTCGCTCAACCAATTTTAGCGAACCATTGCCCACCCAGCTTTTGATGATATCAATTGGCATAGGCGGTAAGTTAAGCTTGGCATACATGCCATTGACCGCCGCCGCCAAATCAGGGGCACTATCGATAAGCGTACCATCCAAATCAAATATAATCAGTTTTTTGCCAGTCATTGACAGTGTTTGCATGCTTTTTCCTTATTCTTAAAATTGGCGGCTGTTTGGTATTTTTTAAATCAGTCAATTTTTACCATTTGTCATATAATGACAAAGTACAAATTTAGCAATATTTTAGTGCATTTTTTGGCGAAGTTTTATGAAAACTGGTCATTGGTTGCAAAACTTTACACAGTACCTATAAAACTTGCACAGTTAATAAGAAATATTTTGTTACTATAGGGGCGTCATTTGGAACAAGACAGTTATTTGTAAATAGTTATTTGCAAAAGACGGCTAAAAGACAGAACAGCGTTTGTTTCAGTGATTAACTAGGAGAAAAACASEQ.ID NO52粘膜炎莫拉氏菌omp106基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TTGATCGGTTTTGCCCCACTGTTTCATGATTTACTCAAAACAGGCGGCTTGATCGTGCTGGCAGGTCTGACCCAAAACCAAACCCAAGCGGTCATCGATGCCTACTCGCCTTATGTTACGCTTGATACGCCATTTTGTTATGCAGATGCCCAAGACTGCCATTGGCAACGCCTAAGCGGCATCAAACCTACCAACCCATAAGCGATATGCCATGAGCCACAAACCTAAGCCAACACCGCTATATCAACAAGTTGAGCAGACCGCCAAGCGTTATTTTGAGACATTGGGCGATGCTCATACTCATGATGTCTATGCCACTTTTTTGGCCGAATTTGAAAAACCGCTGCTCATCGCCGCACTCAATCACACGCACGGCAATCAGTCAAAAACCGCCCAAATCCTTGGTATCAATCGTGGCACATTACGCACCAAAATGAAAACCCATCACTTACTTTAGACCGCCAGTTATCGCCATGGATATGGGCAGGTGTGCTCGCCTGCCGTATGATGGCGATGACACCCCATTTGCCCCATATCTGCACGATTTGACATGATTTAACATGTGATATGATTTAACATGTGACATGATTTAACATTGTTTAATACTGTTGCCATCATTACCATAATTTAGTAACGCATTTGTAAAAATCATTGCCCCCTTTTTTTATGTGTATCATATGAATAGAATATTATGATTGTATCTGATTATTGTATCAGAATGGTGATGCCTACGAGTTGATTTGGGTTAATCACTCTATTATTTGATATGTTTTGAAACTAATCTATTGACTTAAATCACCATATGGTTATAATTTAGCATAATGGTAGGCTTTTTGTAAAAATCACATCGCAATATTGTTCTACTGTTACCACCATGCTTGAATGACGATCCAAATCACCAGATTCATTCAAGTGATGTGTTTGTATACGCACCATTTACCCTAATTATTTCAATCAAATGCCTATGTCAGCATGTATCATTTTTTTAAGGTAAACCACCSEQ.ID NO53粘膜炎莫拉氏菌HtrB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列ACTATTCTGCTTTTTGTTTTTCACGAATGCGAATGCCCAACTCACGCAACTGGCGATTATCAACTTCAGCAGGTGCTTCGGTCAATGGGCAATCTGCCGTCTTGGTTTTTGGGAAGGCGATCACATCACGGATTGAGCTGGCACCAACCATCAGCATAATCAGGCGATCTAGACCAAATGCCAAACCACCGTGCGGCGGTGCACCAAAACGCAATGCATCCATCAAAAACTTAAACTTAAGCTCTGCTTCTTCTTTAGAAATACCCAAGGCATCAAATACCGCCTCTTGCATGTCAACCGTATTAATACGCAGCGAACCGCCACCAATTTCTGTGCCATTTAGTACCATGTCATAGGCAATGGATAGGGCGGTTTCGGGACTTTGTTTGAGTTCCTCAACCGAGCCTTTTGGGCGTGTAAAAGGATGATGAACTGATGTCCACTTACCATCATCAGTTTCCTCAAACATTGGAAAATCAACGACCCAAAGCGGTGCCCATTCACAGGTAAATAAATTTAAATCAGTACCGATTTTAACACGCAATGCACCCATAGCATCATTGACGATTTTGGCTTTATCGGCACCAAAGAAAATGATATCGCCAGTTTGGGCATCGGTACGCTCAATCAGCTCAATCAAAACCTCATCGGTCATATTTTTAATGATGGGTGATTGTAATCCTGATTCTTTTTCAACGCCATTATTGATATTGCTTGCGTCATTGACCTTAATATATGCCAATCCACGAGCGCCATAAATACCAACAAATTTGGTGTACTCATCAATCTGCTTGCGACTCATGTTACCGCCATTTGGAATGCGTAAGGCAACAACACGGCCTTTAGGATCTTGGGCGGGCCCTGAAAATACTTTAAATTCAACATGTTGCATGATGTCAGCAACATCAATAAGTTTTAAGGGAATGCGTAAATCAGGCTTATCTGAGGCATAATCACGCATGGCATCTGCGTAAGTCATGCGGGGGAAGGTATCAAACTCASEQ.ID NO54粘膜炎莫拉氏菌MsbB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TGGATCATATTCTTTATTAATGGTACTGTTTAAACCTGTATTTTAAAGTTTATTGGGTCATATTTTCAAGCTCATCCCATCGCTCAAGCTTCATCATCAAAAGCTCATCAATCTCTACCAATCGCTCACCAGCCTTCGTTGCTGCCGCCAAATCGGTATTAAACCATGAACCATCTTCAATCTTTTTGGCAAGCTGTGCCTGCTCTTGTTCAAGTGCAGCAATTTCATTAGGCAAATCTTCAAGTTCACGCTGCTCTTTATAGCTGAGTTTGCGTTTTTGGGCAACGCCTGATTGAGGTGGTTTGATTTGGATGGGTTCAGCGGGTTTTGTCGCCTTAGGTTTATTGTCTGTGGCGTGATGAGCAAGCCATCTTTCATGCTGTTGTACATAGTCTTCATAACCGCCAACATATTCCAAAACGATACCGTCGCCGTACTTATCAGTATCAAATACCCAAGTTTGGGTAACAACATTATCCATAAAAGCACGGTCATGGCTGATGAGTAATACCGTGCCTTTAAAATTGACCACAAAATCTTCTAAAAGCTCAAGTGTTGCCATATCCAAATCATTGGTAGGCTCATCAAGCACCAAAACATTGGCAGGTTTTAGCAATAATTTGGCCAATAAAACGCGTGCTTTTTCACCGCCTGATAGTGCTTTAACAGGTGTGCGAGCACGATTTGGCGTGAATAAAAAATCTTGCAAATAGCTTAAAATGTGCGTAGTTTTTCCACCAACATCGACATGGTCAGAGCCTTCTGAAACATTATCTGCGATAGATTTTTCAGGGTCTAGGTCGTCTTTGAGTTGGTCAAAAAAAGCAATATTTAGATTGGTGCCAAGCTTAACTGAACCTGACTGAATCGCTGAATCATCCAAACCCAAAATGCTTTTAATTAAGGTTGTTTTACCAACGCCATTTTTGCCAATGATACCAACTTTATCACCACGAACAAGCAGCGTTGAAAAATCCTTAACTAAGGTTTTATTGTCGTATSEQ.ID NO55粘膜炎莫拉氏菌PilQ基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列CAACTTGAAAATCAGCTCAATGCTCTGCCACGCACAGCACCGATGAGCGAGATTATCGGAATGATAAATACCAAAGCACAAGCGGTTAATGTGCAGGTGGTGAGTGCATCAGTTCAAGCAGGTCGTGAACAGGATTATTATACCGAACGCCCTATCGCAGTGAGTGCGACAGGGGATTATCATGCTTTGGGTCGATGGTTACTTGAGTTGTCAGAGGCTAACCATTTGCTGACAGTGCATGATTTTGATCTGAAGGCTGGTTTGAACCATCAGCTGATGATGATTGTTCAGATGAAAACTTATCAAGCGAACAAACGCCCAAAACCAGTTGCTCAGCAGGTGCCTGATGTTCAATGAATATTATCGGTGGGGCATTTTGGGTGCTTGGATTTGGGTTGGGATTGGATGTGCTGATAGCACCAGTCAAGTTGTTGATGATAAGCTTGCACATATTACCCATGAAGAGCGTATGGCGATCAGTGAGCCTGTGCCGATACCCTTATCTGTGCCGATGATATATCAGCAAGGCAAAGATCCTTTTATCAATCCTTATAGAAATGTTGAGGTTCTTGATACCAATCATGCCGCTGATCAGCAAGATGAGCCAAAAACCGAATCTACCAAAGCTTGGCCTATGGCAGACACTATGCCATCTCAGCCATCTGATACTCATCAGTCTGCCAAGGCTCAGGCACAAGTCTTCAAAGGCGATCCGATAGTCATTGATACCAACCGTGTTCGAGAGCCTTTAGAAAGCTATGAGTTATCAAGCCTACGCTATCATGGTCGTATTTTTGATGATGTTAGACTTGTGGCACTCATTATGAGTCCTGATGGCATCGTTCATCGTGTGAGTACTGGACAATATCTTGGTAAAAATCACGGAAAAATTACCCATATTGACAGTCGTACGATACATCTGATTGAAGCGGTCGCTGATACACAAGGTGGCTATTATCGCCGTGATGTAAACATTCATTTTATTCATAAGCAATGACACSEQ.ID NO56粘膜炎莫拉氏菌lipo18基因DNA區(qū)核苷酸序列(1000bp)上游TTCATGCAACAAGCGACCATCTTGGCCGATGATACCATCCTGCTCACCTAAGAAAATCAGTTTATCAGCTTGCAGGGCAATGGCTGTGGTCAGTGCTACATCTTCTGCCAATAGATTAAAAATTTCGCCCGTAACCGAAAAACCTGTCGGTCCTAGTAGGACAATATGGTCATTATCCAAATTATGGCGAATGGCATCGACATCAATTGAGCGTACCTCACCTGTCATCTGATAATCCATACCATCTCTGATGCCGTAAGGGCGAGCGGTGACAAAATTACCCGAAATGGCATCAATACGAGATCCGTACATTGGGGAGTTAGCAAGCCCCATCGACAGCCGAGCTTCGATTTGTAGACGAATTGAGCCGACTGCCTCCAAGATGGCAGGCATAGATTCATACGGTGTTACACGCACATTCTCATGTAGGTTTGATATCAGCTTGCGATTTTGTAAATTTTTTTCCACTTGTGGGCGTACACCATGCACAAGCACCAATTTGATGCCCAAGCTGTGTAGCAGTGCAAAATCATGAATCAGCGTACTAAAATTGTCACGAGCGACCGCCTCATCACCAAACATAACCACAAAGGTTTTGCCACGATGGGTGTTAATGTACGGGGCAGAATTACGAAACCAATGCACAGGTGTGAGTGCAGGAGTGTTCTGATAGGTGCTGACAGAATTCATGAATGCTCCAAAGAGTCAATGGCTGGTAAAATAAGAATGGCGAACAATATATGGCGAGAGCGTCTGATGTTGGTCAAATGTCCCATTAATAACTATCAAGATACCATCATACCATAGCAAAGTTTTGGGCAGATGCCAAGCGAATTTATCAGCTTGATAAGGTTGGCATATGATAAAATCTACCATCATCGTCGCCAGTTTTGAGCATGTGTAAGTAGTTACCATAATTAAACAGTCAAGAAATTCACACCGTCAATCAGCTGTGCTATGCTTATGGGCACATAAAACTTGACCAACACAGGATAAATTTASEQ.ID NO57粘膜炎莫拉氏菌lipo11基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GGCATACTTTTGCCATGCTTTATTTTGGCATAACTGCTATAAGCCCATTGCTACTTTTTATCATTTATCCATATGTCCAATAATGTGCTTTATGTAATTTAGGCACACTATTAACTCGTGCCACTGTTAACATTCAGCATAAAAATCTTAACAATGAATCAAAGCATCGTATTGGCTGTTAAATGATAAGCTTATATTTATTTAAATTCAGACTAAATGATTGTAATATGGACATATCAAGGTTGAAATCAAAAATTTTGGAGAGTTATGTACGATAATGATAAAAAATTGACCACCATCGTAGGGGTGTTGTATACGGTGTCTTATATTGCCATATGGTTGGTCAGTGGCTATATTTTATGGGGCTGGATTGGTGTGACAGGATTTACTCGTGCGATACTTTGGCTGATCGCTTGGATGATTGTGGGTACGATTGCTGATAGAATTCTGATACCGATTATTTTGACCGTCGTGGTTGGGTTATTTTCTATCTTTTTTGAAAAAAGGCGATAATTTGGTTATTTTTTCACAAAAAATCATGATTTTTTTTGTAAACTATCTAAAATATCAATTATGTTATATTATGTGATAAAAGATGGGCATGCTTAAGTTTTGGATTGCAAAAATCCTAATATCATCACTGACCAAAGCTGTGATGATATCAAAACTTTATCAAAGTTCTTAGGGTATTATCAAGATATCATACCAAATGAATACTTACCCAACTTACTATAAAAATCAAATGATATGACTGTGATTTTATTATCATAGATACAAAAATCAAAACGCATGAGCCAAAGGTATGATGAATGAATACAAAATTTCGCACACATTATGACAATCTAAATGTCGCCAGAAACGCTGACATTGCGGTGATTTGGTGGGATAGGGGTCAAGCCAGTGCGATTAAGCTAAATTTTTATGTGGGCAATCGCTGACTTTATTTTATTTGTGCCAGTTGGAACAATTCGTGGTCTAATGTATTTATTTTAAGGAGATAASEQ.ID NO58粘膜炎莫拉氏菌lipo10基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TCTGGTCTACATCCCAAACTATTTACACAAGAAACACTAAAGACAGTGGAGCAGATGACGCTCAAAAAGGCATCTTATAGTAATTTGACAGTTAATTTTCGTCAAGTGCTTGTACAAAAATACACCATCGTGCAAGAAGTTTGTACCAATTTAAGCACAATCATTTTGGCACACACTGTCAAGCAATGCTTCAGGCAAATTAGCTGCTGGTAAAGATACTTGGGTCATCATGCAATCGCATCAACCCTTCTTGCTGCGTTGAAGCGATAAGTTTGCCATCTTGCCAAAATTGACCATGGTTTAGACCCTTGGCGTGGCTTGTGGTATCGCTCCACATGTCGTAGAGTAGATATTCGGTCATATCAAAAGGGCGATGGAAATGTATGGAATGGTCAATACTAGCCATTTGTAGACCTTGTGTCATCAGGCTTAGCCCATGACTCATTAAACCTGTGCTGACCAAATAATAATCAGACACAAACGCAAGTAGTGCTTGATGAATGGCAACTGGCTGCTCCCCAATATCAGCGATACGCACCCAATTGGCTTGGCGTGGACGCTCAGGCTTGGGTGTCACAGGGTCTCGTGGTGTGACGGGGCGGATTTCGACATGACGCTGACGCATAAATCTTGCTTTGAGTGGTTCGGGAATTTTATGTAAATAATCCGCTTTGAGTTCTTGCTCGGTTTTTAGGCTTTCAGGGGGTGGATAATCAGGCATGGTTTCTTGGTAATCAAGCCCGCCTTCCATGGGTGAAAATGAGGCAATCATCGAAAAAATGACCTGTTCATTGGTCGTATGATTACCGTTTTTGTCGGTGGTTGGCACATATTGCACCGCAATGACTTCTCGAGCTGATAAACTGCGTCCATCACGTAAGCGGCGTACTTGATAGATGACTGGTAGACGAATATCGCCACCTCGTAAAAAATAACCATGTAGGCTATGACAAGGTTTATCAATCGTTAATGTGTTAGCACCAGCAAGCAGCGCTTGGGCASEQ.ID NO59粘膜炎莫拉氏菌lipo2基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TAAAATGACCTTACAAAATAAAATTATATGTTCAAAAATCGCTTAAGTATTGAAAAAAGCTATAAAAACTTATCTATTAAAGCATAAAAGATATTAAAGCATAAAAGACGAGAAAAGAGCAAGCGTCAATGATGATATTTCATATAAAAACTTATGAAATTTTTCAATTTTTTATCGATTGATTCAGCTTGGCTATCGGTGGTCAACTTTGGCTGCCAAGACATCGCCGGCTTTTTGAAAAATCATCACAATGGCAACAATGATGATGGTTGAAATCCACTTGACATATACCATGTTGCGATGCTCACCATAGTTAATCGCAAGGCTTCCCAAGCCACCACCGCCAACCACACCTGCCATTGCAGAATAACCAATCAAAGACACCAAGGTCAATGTGACCGCATTAATCAAAATGGGCAGGCTTTCAGCAAAATAGTATTTGCTGACAACCTGCCAATGCGTTGCACCCATAGATTTGGCAGCTTCGGTCAGTCCTGTGGGTACTTCTAATAAAGCATTGGCACTCAAGCGTGCAAAAAATGGAATTGCTGCCACACTCAAAGGGACGATGGCGGCTGTTGTGCCAAGGGTTGTTCCCACCAAAAATCGTGTGACTGGCATGAGAATAATGAGCAAAATAATAAAAGGAACGGAGCGACCAATATTAATAATAACATCCAAAATTACAAATACACTGCGATTTTCAAGGATACGCCCTTTATCGGTTAAAAATGCCAAAAACCCTATCGGTAGCCCAACCAAAACAGCGATGGCAGTGGCAGCAAGCCCCATATAGATGGTTTCCCAAGTGGATTGGGCAACCATCTCCCACATTCTTGGGTGCATTTCACTGACAAATTTTGTGACGATTTCATTCCACATAGCCGATAATCTCAATATTGACCCGATGGGTGGTTAAAAATTCTATTGCTTGCATGACCGAGGTGCCTTCACCGATAAGCTCAGCAATGGTAAAGCCAAATTTTATATCACCTGCATAASEQ.ID NO60粘膜炎莫拉氏菌lipo7基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列AGTAAACAATGGTAACAAATACAGCAGTGTCGCACAGTCCTCAGTACGATGATTCTGAATTTGAATATGCAGGATTTTGGATACGATTTGTGGCATGTCTTGTCGATAATTTAATTGTTATGATTATAATTGCACCGTATTGGTTTTATAATTATCAGCAAATGATGGCCATGCCTGCTGACCAAATACCGTTTTATAGTGTTGGGGATGCCATCCTTTATAGTGCTGGGGATGCTATCCTAAACTTAGTGATGGCGGCGGCGGTTGTTTGGTTTTGGGTAAAAAAAGGTGCAACACCAGGTAAAATGCTCTTTGGGCTGCAAGTCCGTGATGCCAAAACAGGGCAATTTATCAGTGTGCCAAGGGCATTATTGCGATATTTTAGTTATCTGATTTCATCCGTGATTCTTTGTTTGGGACTTATTTGGGTTGGTTTTGATAAGAAAAAACAAGGCTGGCATGATAAAATTGCCAAAACTGTTGTGGTAAAACGCATTCGCTGATGGGTCGCCAGTTAAACAATAAAACCATCAAACGCAAGCAGGGCGATGTGTTTGAGCAGTTGGCGGTAGATAAGCTAAAACAAGCAGGCTATGAAATTATTTTAACCAACTTTACCACCCCATTTGTTGGTGAGATTGATATTATCGCCAGACAGCCTTTGGAGCAATCGCACCGTTTGGTGCAGCCAAGATTTTGTACGGTATTTGTTGAAGTGCGTAGCCGAACAAGTTCTGTGTATGGTACAGCGCTTGAGAGTGTTACCTCAAAAAAGCAGGCAAAAATCTACCGAACAGCAGAACGATTTTTAATCAATTATCCCAAATATATTGATGATGCATACCGTTTTGATGTCATGGTTTTTGATTTGGTTGATGGATTGATTGAACATGAATGGATAAAAAATGCGTTTTGATTGGCTCAATGGTCGTGAATTAAAATCAATCAAGCAATCCGTAGCTTTACTATAAGATATATCCCAGTAATATGGAAACATAGCASEQ.ID NO61粘膜炎莫拉氏菌lipo6基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列CGTTTAGCTTCATACGCAGACCTTGTGCACCTTCGGGCAACCGAAGCATCACGCCAGCATCACGCATCCGCACAAAACCCATCATGCCATCAATTTCGCTGCTGATATGATATACCCCCACCAAAGTAAACCGCTTAAATCGTGGAATAACGCCTGCTGCTGAGGGTGAGGCTTCAGGCAAAACCAAGGTAACCTTATCCCCCAACTTAAGTCCCATGTCAGAGACAATGGACTCACCTAATATAATACCAAACTCGCCGATATGTAAATCATCCAAATTGCCTGCGGTCATATGCTCATCAATGATAGAAACTTGCTTTTCGTAATCAGGCTCAATGCCAGAAACCACGATTCCAGTCACCTGACCTTCAGCGGTTAACATACCTTGTAGTTGAATATAAGGGGCAACTGCTTGCACTTCTGGATTTTGCATTTTGATTTTTTCGGCAAGTTCTTGCCAATTTGTCAAAATTTCTGTTGAGGTAACTGAAGCTTGAGGCACCATGCCAAGAATGCGTGATTTAATTTCACGGTCAAAGCCATTCATGACCGACAAAACCGTGATAAGCACTGCAACCCCAAGCGTAAGCCCAATGGTTGAGATAAAAGAAATAAAGGAAATAAAGCCATTTTTACGCTTAGCTTTGGTATATCTAAGCCCAATAAATAACGCCAAGGGACGAAACATAAGCTGTGTTCCAAACGACCCAACCGTGCTAGTTTAGCACTTTTTTGGACAAATACCAAACATCACATAACAAATGAATCATCAGGTTGGTTTTGTTGCGCTTGTGTATCTGTATGATAAGTTTCTTGCTAAAACAGCTTTTTTATGTCAGAATACAGAAAAGGTATATACTTATATTTTTAACTTTAAATAGATCTGCTTTTTTATACCGATGATTTGGCATGAAGTTTATCGGTCTGATATGCTGGATATAAGTTTATCGGCTTGATATAAATTTTAATTAATCATCAAATTTTTAAGGAATTTATCATTASEQ.ID NO62粘膜炎莫拉氏菌P6基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TAAGGATACCAGATTTTGGCTTGTCAATCGTTGTGTTAATCATTGTAACGGTTTATAGTGATTGTCAATTAATAAGGGTAAAAAAGTATTTATCAAGTAATAATCTTTCTTATATGTGAATATAATGACAAATTTATCACATTTTTACAAGGATTTTTTATCAAGATTAGGATATGTTCCAGCTTAATTATTAGTGATGAGCGTGTGATTATTTGGCATCGTTAAATTTATGAGTGCTAAAATTGCCAAATGATTAAAATTTTGCTAACATGATAGCCCCTTTGGTAGGCTTTATTTGGTATTGATGAGCAATAATAATATACCGAGTTAAATGGATTAACTTAACATACGCCAAAAACTTAACAACGAAAAGTAGATGATTATGACAGATACAGTACAAAAAGATACAGCACAGTCCCCCAAAAAAGTTTATCTAAAAGACTACACGCCGCCAGTATATGCAGTTAATAAAGTGGATTTGGATATCCGCTTGTTTGATGATCATGCTGTCGTTGGTGCCAAACTTAAAATGACACGAGCACACGCAGGCGAGCTTCGGCTTCTTGGGCGAGATTTAAAGCTTAAAAGCATTCACCTAAATGGTCAGGAATTAGAGTCGCAGGCGTATCATCTTGATAAGGAAGGCTTAACAATTTTAGATGCACCAGATGTCGCAGTGATTGAGACATTGGTTGAGATTTCACCACAAACCAACACAACACTTGAAGGGCTATATCAAGCAGGAACAGGTGATGATAAGATGTTTGTGACACAATGCGAACCTGAGGGTTTTCGCAAAATCACCTTTTTCCCTGACCGCCCTGATGTTTTGACAGAATACACCACACGCCTAGAAGCACCAAAGCATTTTAAAACCTTGCTTGCCAATGGTAATTTGGTTGAGTCAGGAGATGTGGATGAAAATCGCCATTATACCATTTGGCATGATCCTACCAAAAAACCCAGCTATCTATTCGCCGCTGTCATTGCCAATCTAGAAGSEQ.ID NO63流感嗜血桿菌(HiRd)MsbB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列AAATCAAGCGCCTGTGCCTGCTGGTGATGGTTGTGGAGACGAATTATATTCTTGGTTTGAACCGCCAAAACCAGGCACTTCAGTGAGCAAACCTAAAGTTACACCGCCTGAGCCGTTTTTGTGCCAACAGATTTTGAACTCACCGAATCGGAGAGAATGGTTAGAATAGCATTGAGGTAAATCAATATGGATATCGGCATTGATCTTTTAGCAATATTGTTTTGTGTTGGTTTTGTCGCATCATTTATCGATGCAATTGCTGGCGGTGGTGGATTAATCACCATTCCAGCGTTACTCATGACAGGTATGCCACCAGCAATGGCGTTAGGCACCAACAAATTGCAAGCTATGGGCGGTGCATTATCCGCAAGCCTTTATTTCTTGCGAAAAAGAGCGGTCAATTTACGCGATATTTGGTTTATTTTGATTTGGGTTTTCTTAGGTTCTGCCCTAGGTACATTATTAATTCAATCAATTGACGTGGCGATTTTCAAAAAAATGCTTCCTTTTTTGATTTTAGCCATTGGTCTATATTTTTTATTTACTCCTAAATTAGGTGATGAAGATCGAAAACAACGATTAAGTTATCTGTTATTTGGTCTTTTAGTTAGCCCATTTTTAGGTTTTTATGATGGCTTCTTTGGGCCAGGGACTGGCTCAATCATGAGTTTAGCCTGTGTTACTTTGCTAGGATTTAATCTCCCGAAAGCGGCAGCACATGCAAAAGTGATGAACTTCACTTCGAACCTTGCTTCTTTTGCACTTTTCTTATTGGGCGGACAAATTCTTTGGAAAGTGGGTTTCGTGATGATGGCTGGGAGCATTTTAGGTGCAAATTTAGGTGCCAAAATGGTGATGACGAAAGGTAAAACCTTGATTCGACCGATGGTTGTTATCATGTCTTTTATGATGACGGCTAAAATGGTTTACGATCAGGGTTGGTTTCATTTTTAATTCGGAAAGCGCGCAAAAGTGCGGTTAAAATTAATTACATTTTATTASEQ.ID NO64流感嗜血桿菌(HiRd)HtrB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TTGAAGTCCCCAATTTACCCACCACAATTCCTGCGGCAACATTGGCTAGGTAACAAGATTCTTCGAAAGAACGTCCATCTGCTAATGTGGTTGCTAATACACTAATGACAGTGTCACCGGCTCCCGTCACATCAAACACTTCTTTTGCAACGGTTGGCAAATGATAAGGCTCTTGATTTGGGCGTAATAATGTCATGCCTTTTTCAGAACGCGTCACCAAAAGTGCGGTTAATTCAATATCAGAAATTAATTTTAAACCTTTCTTAATAATCTCTTCTTCTGTATTACATTTACCTACAACGGCTTCAAATTCAGACATATTGGGTGTCAATAATGTAGCCCCACGATAACGTTCAAAATCAGTTCCCTTTGGATCGATCAACACAGGCACATTCGCTTTGCGTGCAATTTGAATCATTTTCTGAACATCTTTAAGCGTGCCTTTGCCGTAATCAGAAAGAATCAAAGCACCGTAATTTTTCACCGCACTTTCTAACTTCGCTAATAAATCCTTGCAATCTACATTATTGAAATCTTCTTCAAAATCAAGGCGGAGCAGCTGTTGATGACGAGATAAAATACGTAATTTAGTAATGGTTGGATGGGTTTCTAATGCAACAAAATTACAATCAATCTTTTGTTTTTCTAATAAGTGGGAAAGTGCAGAACCTGTCTCATCTTGTCCAATCAATCCCATTAACTGAACGGGTACATTGAGTGAAGCAATATTCATCGCCACATTTGCAGCACCGCCCGCGCGTTCTTCATTTTCTTGTACGCGAACTACTGGCACTGGTGCTTCTGGTGAAATACGGTTGGTTGCACCGAACCAATAACGATCAAGCATCACATCGCCTAATACAAGTACTTTTGCTTGCTTAAATTCTGCTGAATATTGAGCCATTTTAAAATCTCTCTATTTGAATAACCAAAATTGTGGCGATTTTACCACAACTCAAATTTACGATAAACTACGCCCCTAACTTACGTGGAAAGAACAASEQ.ID NO65流感嗜血桿菌(HiRd)蛋白D基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列AGCAATAATTATAGCTGGAATATTCTTTAAAGATGAAAGAGATCGTATAAGACAAAAAGAATTTTATATTGGAGAATTATTAGCAATTATTGGTTCGCTAATATTCGTAATAAATAGTTCAAATAATGATGGAAATACAGACTTTTTTCTTGGGGCAATATTTCTTTTTACAGCTATTTTTATTCAATCTGTACAGAATTTAATTGTAAAAAAAGTAGCCAAAAAGATAAATGCTGTTGTAATAAGTGCATCGACAGCAACAATTTCAGGAGTATTATTTTTATGTTTAGCTTTTAATACTAAACAAATATATTTATTACAAGATGTTGGCATTGGAATGTTGATAGGTTTAGTTTGCGCTGGCTTTTATGGGATGCTAACAGGGATGTTGATGGCTTTTTATATTGTTCAAAAACAGGGAATCACTGTTTTTAACATTTTGCAATTATTAATTCCTCTTTCAACTGCGATAATAGGTTACTTAACATTAGATGAAAGAATAAATATCTATCAGGGAATTAGCGGTATTATTGTAATTATTGGTTGTGTATTGGCATTAAAAAGAAAAAACAAGGAGTGTTGATATATAAAGTAGATGATGTTGGTGGAATAGGTATAGTTAAATATCTGGTTCAATTGGTTTTATTAAGGGCGTTAGCAATTCTCCATTTAAGTTTATGTTTGAATTAGATATTTTGGGAAAAGATGGAAGAATAAAGCTGTTAAATAATGCTGAAACATATGAACTATACCAATACTCAAATAAAAATAATTCTGCTGGAAATGATTATAAATCTCTAATTCTAACTTGTAGAGAGGATAATGACTATCAATCAGAAAGAATGATTAAAGCCATTAAAAATATTATTCATTGTATGACTAATAATCATCAACCTATTTCAAGTGCTGAAACATCTTTAGAAACTATTAAAATTATTCACGGAATAATTAATTCTGTTAAAATAGGTAATGATCCTAACAATATATAAGGAGAATAAGTSEQ.ID NO66流感嗜血桿菌(HiRd)Hin47基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TAAATACTCCAAAATAAATTTCAGATAACGTGGTCTGTAAGACAAAAAAATAAAAAAAATGTTCAATAAGAGGAGAGCAAATTATCTTGTTTAAAAGGAAATCGGAGCAGTACAAAAACGGTCTTACAAGTAGCAAATTCTATAAATTTATGTTCTAATACGCGCAATTTTCTAGTCAATAAAAAGGTCAAAAAATGAGCTGGATTAACCGAATTTTTAGTAAAAGTCCTTCTTCTTCCACTCGAAAAGCCAATGTGCCAGAAGGCGTATGGACAAAATGTACTGCTTGTGAACAAGTACTTTATAGTGAAGAACTCAAACGTAATCTGTATGTTTGCCCGAAATGTGGTCATCATATGCGTATTGATGCTCGTGAGCGTTTATTAAATTTATTGGACGAAGATTCAAGCCAAGAAATTGCGGCAGATTTAGAACCAAAAGATATTTTAAAATTCAAAGATTTAAAGAAATATAAAGATCGTATCAATGCGGCGCAAAAAGAAACGGGCGAGAAAGATGCGCTAATTACTATGACAGGTACACTTTATAATATGCCAATCGTTGTGGCTGCATCGAACTTTGCTTTTATGGGCGGTTCAATGGGTTCTGTAGTTGGTGCAAAATTTGTTAAAGCGGCTGAAAAAGCGATGGAAATGAATTGTCCATTTGTGTGTTTCTCTGCGAGTGGTGGTGCTCGTATGCAGGAAGCATTATTCTCTTTAATGCAAATGGCAAAAACTAGTGCCGTACTTGCTCAAATGCGTGAAAAGGGTGTGCCATTTATTTCAGTATTAACGGATCCGACTTTAGGCGGCGTATCAGCCAGTTTTGCGATGTTAGGGGATTTAAATATTGCCGAGCCAAAAGCCTTAATTGGTTTTGCAGGGCCACGCGTTATTGAACAAACTGTGCGTGAAAAATTGCCAGAAGGTTTCCAACGTAGTGAGTTTCTACTTGAGAAAGGGGCAATTGATATGATCGTGAAACGTTCAGAAATGCGTSEQ.ID NO67流感嗜血桿菌(HiRd)P5基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TCACTTAATTCAAGCGCATCAATGTTTTCTAAAACATCAACAGAATTGACCGCACTTGTATCTAAAATTTCGCCATTTATTAAGACTGCGCGTAATGCCAAAACATGATTAGAGGTTTTACCATATTGCAATGAGCCTTGCCCAGAGGCATCGGTGTTAATCATTCCACCTAAAGTCGCTCGATTGCTGGTGGACAGTTCTGGGGCAAAGAACAAACCATGTGGTTTTAAAAATTGATTAAGTTGATCTTTTACTACGCCTGCTTGTACTCGAACCCAACGTTCTTTTACATTGAGTTCTAAGATGGCTGTCATATGACGAGAAAGATCCACTATTATATTGTTATTGATGGATTGCCCATTTGTGCCAGTGCCTCCACCGCGAGGCGTAAAGCTGATTGATTGATATTCAGGTAAATTTGCCAATTTTGTTATCCGCACTATATCAGCAACCGTTTTCGGAAAAAGAATTGCTTGTGGAAGTTGTTGGTAAACGCTGTTATCCGTAGCCAGACTTAATCTATCTGCATAGTTTGTCGCAATATCCCCCTCAAAATGTTGGCATTGAAGATCATCAAGATAATCAAGTACATATTGTTCAACTTGAGGAATGCGATTTAGATTTGGCAACATAGTATTTGACCCATTTAAACATATCAGATGGAGGCTTTGATAATATCCTAAGGCTAGAATAATGTCGATTAGGAAAGAGAGAGGAGAAAGTAAAAAGTCTGTTTAAGAAAGTGTTATTTTGGATAAAAACTAAACAAAAAATTCAAAAGAATTTGATCTTTTCAATTTTTATAGGATAATAAGCGCACTTTTGAACGTTCCTTTGGGGTAAACATAAGCAAAGGAATTGAATTTGTCAAAAGGTAATAAAGTAGGGCAAATTCAAAACCCTAGTTAAGTGACTGTTTATAATGTAGCTTTAATTAAAAGTTCAGTATAAACAAGGACACTTTTTATTACTATTCGATCACTAAATAGAGGACATCAAAASEQ.ID NO68流感嗜血桿菌(HiRd)D15基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TCGATTGTATCCTATATAAATTATAGACGTAAAAAATCATTAAATAATGCAAACACCGTTAAGCTTAATAACAGTGCTGCGCCAATTCGATAACAGATGCTTTGCACCCGCTCAGAAACAGGTTTTCCTTTAACAGCTTCCATTGTTAAAAAAACTAAATGACCGCCATCTAATACTGGTAATGGAAATAAATTCATAATCCCTAAATTTACACTAATCAATGCCATAAAACTTAAAAAATACACCAATCCAATATTTGCTGATGCGCCAGCACCTTTTGCAATAGAAATTGGCCCACTTAAATTATTTAATGACAAATCGCCAGTAAGTAATTTCCCTAATATTTTCAAGGTTAAAAGGGAAAGCTGTCCTGTTTTTTCAATGCCTTTTTGTAAAGATTCAAGAATACCATATTTTAATTCAGTACGGTATTCATCCGCTAATTTTGTTAAGGCTGGGCTAACCCCAACAAACCATTTGCCATTTTGATTACGCACTGGAGTTAGGACTTTGTCAAATGTTTCTCCATTACGTTCAACTTTAATAGAAAAAGATTCGCCTTGTTCGACCTGTTTTATAAAATCTTGCCAAGGAAGTGCGGTTAAATTTTCTTTTAAAATTTTATCACCGATTTGTAAACCAGCTTTCTCAGCGGGAGAATTTTGAACAACTTTAGAAAGCACCATTTCAATTTTAGGACGCATAGGCATAATCCCTAATGCCTCAAAAGCACTTTCTTTTTCAGGATCGAATGTCCAATTTGTAAGATTTAAAGTCCGTTGTTGTTCAATATTAGAATTGAAAGGAGAAAGGCTAATCTCAACATTAGGCTCCCCCATTTTTGTGGCAAGTAGCATATTGATGGTTTCCCAATCTTGAGTTTCTTCGCCATCAATTGTAAGAATTTGCGTATTGGGTTCAATGTGGGCTTGTGCTGCGATTGAGTTTGGTGTTATTGATTCAATCACTGGTTTAACCGTTGGCATTCCATAAAGGTAAATSEQ.ID NO69流感嗜血桿菌(HiRd)Omp26基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TTTGATAAATATCCTTAATTAAATGATGGGTTTAATATTTTCTCTGCCCAATTAAATTAGGCAGAGAACGTTGTTTTTGAGTTCTGATGAAGAAAAAAGTTCAATTTATTAGAAAGAACCTCCAATACTAAATTGGAACTGTTCGACATCATCATTTTCATATTTTTTAATTGGTTTGGCATAAGAGAATACCAATGGCCCAATAGGAGATTGCCATTGGAATCCGACACCTGTAGAGGCGCGAATACGGCTTGATTTGCCATAATCGGGTAAGCTTTTTAATACATTGTTATCTAACCCACTCTTATCCGATTTCCACTTAGTATTCCAAACACTTGCCGCATCAACAAATAGGGAGGTTCGGACTGTATTTTGGCTTTTATCACTCACAAACGGTGTTGGTACAATAAGTTCTGCACTCGCAGTTGTGATTGCATTACCACCAATCACATCAGAACTTATCTTCTTAAAAGTACCATTACCATTACCATGTTCTGCATAAATTGCGTTAGGTCCAATACTACCATAAGCAAAACCACGTAATGAACCGATGCCACCCGCTGTATAAGTTTGATAGAACGGTAAACGCTTGTTTCCAAAACCATTTGCATATCCTGCAGATGCTTTTGCAGATACAACCCAGAGGTGATCTCTGTCTAATGGGTAGAAACCCTGTACGTCTGCACTTAGTTTGTAGTATTTGTTATCAGAACCTGGAATAGTAACTCGTCCACCAAGACTTGCTTTAACCCCTTTAGTTGGGAAATAGCCTCTATTAAGGCTGTTATAGTTCCAACCAAAAGAAAAATCAAAGTCATTTGTTTTAATGCCATTACCTTTAAATTTCATTGATTGAATATATAAATTACGGTTATATTCTAGAGCAAAGTTACTAATTTTATTATAGGTATGGCCTAATCCTACATAATAGGAGTTATTTTCATTTACAGGGAAACCTAAAGTAACATTACTTCCATAAGTCGTACGCTTATAGTTAGAGGSEQ.ID NO70流感嗜血桿菌(HiRd)P6基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TTAGATTTCTCCTAAATGAGTTTTTTATTTAGTTAAGTATGGAGACCAAGCTGGAAATTTAACTTGACCATCACTTCCTGGAAGGCTCGCCTTAAAGCGACCATCTGCGGAAACCAATTGTAGCACCTTTCCTAAGCCCTGTGTAGAACTATAAATAATCATAATTCCATTTGGAGAGAGGCTTGGGCTTTCGCCTAGAAAAGATGTACTAAGTACCTCTGAAACGCCCGTTGTGAGATCTTGTTTAACTACATTATTGTTACCATTAATCATCACAAGTGTTTTTCCATCTGCACTAATTTGTGCGCTACCGCGACCACCCACTGCTGTTGCACTACCACCGCTTGCATCCATTCGATAAACTTGTGGCGAACCACTTCTATCGGATGTAAATAAAATTGAATTTCCGTCTGGCGACCACGCTGGTTCAGTATTATTACCCGCACCACTCGTCAATTGAGTAGGTGTACCGCCATTTGCTCCCATAACGTAAATATTCAGAACACCATCACGAGAAGAAGCAAAAGCTAAACGAGAACCATCTGGCGAAAAGGCTGGTGCGCCATTATGCCCTTGAAAAGATGCCACTACTTTACGTGCGCCAGAATTTAAATCCTGTACAACAAGTTGTGATTTTTTATTTTCAAACGATACATAAGCCAAACGCTGGCCGTCTGGAGACCAAGCTGGAGACATAATTGGTTGGGCACTACGATTGACGATAAATTGATTATAGCCATCATAATCTGCTACACGAACTTCATAAGGTTGCGAACCGCCATTTTTTTGCACAACATAAGCGATACGAGTTCTAAAGGCACCACGGATCGCAGTTAATTTTTCAAAAACTTCATCGCTCACAGTATGCGCGCCATAGCGTAACCATTTATTTGTTACTGTATAGCTATTTTGCATTAATACAGTCCCTGGCGTACCTGATGCACCAACCGTATCAATTAATTGATAAGTAATACTATAACCATTACCCGATGGAACCACTTSEQ.ID NO71流感嗜血桿菌(非典型性)TbpA基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列GGCGATAACCGAGTTTTTGGGGTATTTAGTGCCAAAGAAGACCCACAAAACCCAAAATTATCCAGAGAAACCTTAATTGATGGCAAGCTAACTACTTTTAAAAGAACTGATGCAAAAACCAATACAACAGCCGATACAACAACCAATAAAACAACCAATGCAATAACCGATGAAAAAAACTTTAAGACGGAAGATATACTAAGTTTTGGTGAAGCTGATTATCTTTTAATTGACAATCAGCCTGTTCCGCTTTTACCTGAAAAAAATACTGATGATTTCATAAGTAGTAGGCATCATACTGTAGGAAATAAACGCTATAAAGTGGAAGCATGTTGCAAGAATCTAAGCTATGTAAAATTTGGTATGTATTATGAAGACCCACTTAAAGAAGAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGACCAAGAAAAAAAAGAAAAAGAAAAACAAACGACGACAACATCTATCGAGACTTATTATCAATTCTTATTAGGTCACCGTACTGCCAAGGCCGACATACCTGCAACGGGAAACGTGAAATATCGCGGTAATTGGTTTGGTTATATTGGTGATGACACGACATCTTACTCCACTACTGGAGATAAAAATGCTCTCGCCGAGTTTGATGTAAATTTTGCCGATAAAAAGCTAACAGGCGAATTAAAACGACACGATAATGGAAATACCGTATTTAAAATTACTGCAGACCTTCAAAGTGGTAAGAATGACTTCACTGGTACAGCAACCGCAACAAATTTTGTAATAGATGGTAACAATAGTCAAACTGGAAATACCCAAATTAATATTAAAACTGAAGTAAATGGGGCATTTTATGGACCTAAGGCTACAGAATTAGGCGGTTATTTCACCTATAACGGAAATTCTACAGCTAAAAATTCCTCAACCGTACCTTCACCACCCAATTCACCAAATGCAAGAGCTGCAGTTGTGTTTGGAGCTAAAAAACAACAAGTAGAAACAACCAAGTAATGGAATACTAAAAASEQ.ID NO72流感嗜血桿菌(HiRd)TbpB基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TAGAATTATATTCTTATACAAAATTGATAATTGTTCGCATTATCATTTTTTTTTTGTAATAATGTCAACTTATAATTTTTTAAGTTCATGGATAAAATATGAAAAATGGCGTAAAACAACTTTTTCTCTTATCATTAATAGGCTTATCATTAACGAATGTAGCTTGGGCAGAAGTTGCACGTCCTAAAAATGATACATTGACAAATACGATTCAAAGTGCGGAATTAAAAACCTCCTCTTTTTCCTCTATGCCTAAGAAAGAAATACCAAATAGGCATATTATTTCTCTTTCCAAAAGCCAATTAGCGCACCATCCAAGGCTTGTTTTGCGTGGGTTAATTCCTGCTTTATATCAAAATAACACTCAGGCAGTTCAACTGTTATTACCACTATATAAACAATTTCCTCAACAAGATAATTTCTTACTAACTTGGGCAAAGGCTATTGAAGCTCGTGAACAAGGTGATTTAACTCAATCTATTGCTTATTATCGTGAATTATTCGCTCGAGACGCATCTTTACTACCTTTACGTTATTAATTAGCTCAAGCTCTATTTTTTAACTATGAAAATGAAGCTGCCAAAATTCAATTTGAAAAATTACGTACAGAGGTAGATGATGAAAAATTTTTAGGTGTTATTGATCAGTATCTTTTAACACTAAATCAGCGGAATCAATGGATATGGCAAGTAGGATTAAATTTTTTAAATGATGATAATTTGAATAACGCTCCAAAAAGTGGCACAAAAATTGGTAGTTGGACCGCTTGGGAAAAAGAAAGTGGGCAGGGGGTAGGGTATTCTTTATCAGTAGAAAAAAAATGGCCATGGGCAGATCATTTTTTTAGTAAAACTATGTTTAATGGGAATGGAAAATATTATTGGGATAATAAAAAATACAATGAGGCTACTGTGCGTATAGGTGGTGGTTTAGGCTATCAAACTGCCTCAGTTGAAGTCTCGTTGTTTCCTTTTCAAGAAAAACGCTGGTATGCAGGCGGTSEQ.ID NO73流感嗜血桿菌(LKP血清型1基因組)HifA(pilin)基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TAATAAATTGCTCCATAAAGAGGTTTGTGCCTTATAAATAAGGCAATAAAGATTAATATAAACCGTTTATTAAAATGCCAAAGGCTTAATAAACAGCAAACTTTGTTTTCCCAAAAAAAGTAAAAAACTCTTCCATTATATATATATATATATATAATTAAAGCCCTTTTTGAAAAATTTCATATTTTTTTGAATTAATTCGCTGTAGGTTGGGTTTTTGCCCACATGGAGACATATAAAAAAGATTTGTAGGGTGGGCGTAAGCCCACGCGGAACATCATCAAACAACTGTAATGTTGTATTAGGCACGGTGGGCTTATGCCTCGCCTACGGGGAAATGAATAAGGATAAATATGGGCTTAGCCCAGTTTATGGATTTAATTATGTTGAAATGGGGAAAACAATGTTTAAAAAAACACTTTTATTTTTTACCGCACTATTTTTTGCCGCACTTTGTGCATTTTCAGCCAATGCAGATGTGATTATCACTGGCACCAGAGTGATTTATCCCGCTGGGCAAAAAAATGTTATCGTGAAGTTAGAAAACAATGATGATTCGGCAGCATTGGTGCAAGCCTGGATTGATAATGGCAATCCAAATGCCGATCCAAAATACACCAAAACCCCTTTTGTGATTACCCCGCCTGTTGCTCGAGTGGAAGCGAAATCAGGGCAAAGTTTGCGGATTACGTTCACAGGCAGCGAGCCTTTACCTGATGATCGCGAAAGCCTCTTTTATTTTAATTTGTTAGATATTCCGCCGAAACCTGATGCGGCATTTCTGGCAAAACACGGCAGCTTTATGCAAATTGCCATTCGCTCACGTTTGAAGTTGTTTTATCGCCCTGCGAAACTCTCGATGGATTCTCGTGATGCAATGAAAAAAGTAGTGTTTAAAGCCACACCTGAAGGGGTGTTGGTGGATAATCAAACCCCTTATTATATGAACTACATTGGTTTGTTACATCAAAATAAACCTGCGAAAAATGTCAAAATGGTTGSEQ.ID NO73流感嗜血桿菌(LKP血清型1基因組)HifE(tip pilin)基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列TAGTAGATTTCCGCACGGGCAAAAATACAATGGTGTTATTTAACCTCACTTTGCCAAATGGCGAGCCAGTGCCAATGGCATCCACCGCACAAGATAGCGAAGGGGCATTTGTGGGCGATGTGGTGCAAGGTGGTGTGCTTTTCGCTAATAAACTTACCCAGCCAAAAGGCGAGTTAATCGTCAAATGGGGTGAGCGAGAAAGCGAACAATGCCGTTTCCAATATCAAGTTGATTTGGATAACGCACAAATACAAAGTCACGATATTCAATGCAAAACCGCAAAATAAATAATTGAAGAGGATTTATGCAAAAAACACCCAAAAAATTAACCGCGCTTTTCCATCAAAAATCCACTGCTACTTGTAGTGGAGCAAATTATAGTGGAGCAAATTATAGTGGCTCAAAATGCTTTAGGTTTCATCGTCTGGCTCTGCTTGCTTGCGTGGCTCTGCTTGATTGCATTGTGGCACTGCCTGCTTATGCTTACGATGGCAGAGTGACCTTTCAAGGGGAGATTTTAAGTGATGGCACTTGTAAAATTGAAACAGACAGCCAAAATCGCACGGTTACCCTGCCAACAGTGGGAAAAGCTAATTTAAGCCACGCAGGGCAAACCGCCGCCCCTGTGCCTTTTTCCATCACGTTAAAAGAATGCAATGCAGATGATGCTATGAAAGCTAATCTGCTATTTAAAGGGGGAGACAACACAACAGGGCAATCTTATCTTTCCAATAAGGCAGGCAACGGCAAAGCCACCAACGTGGGCATTCAAATTGTCAAAGCCGATGGCATAGGCACGCCTATCAAGGTGGACGGCACCGAAGCCAACAGCGAAAAAGCCCCCGACACAGGTAAAGCGCAAAACGGCACAGTTATTCAACCCCGTTTTGGCTACTTTGGCTCGTTATTACGCCACAGGTGAAGCCACCGCAGGCGACGTTGAAGCCACTGCAACTTTTGAAGTGCAGTATAACTAAAATATTTATTATCCAGTGAAAAAASEQ.ID NO75流感嗜血桿菌(HiRd)P2基因上游(1000bp)DNA區(qū)核苷酸序列1 TTATCCGCTA ACATTTCATC AGTAATTCCA TGAACTTTAA TCGCATCAGG51 ATCANCGGGG CGATCTGGCT TAATATAAAT ATGAYAATTA TTACCTGTGT101 AACGACGATT TATTAATTCA ACTGCACCAA TTTCAATAAT GCAGTGTCCT151 TCATAATGCG CGCCAAGCTG ATTCATACCT GTAGTTTCAG TATCTAATAC201 AATTTGGCGA TTGGGATTAA TCATTTGTTC AACCTATCTC TTTCCATTAA251 AATACTTGCC ATTCTACACA ACAACCTTTT TGTTATGCCK AAACAGATTG301 AAATTTTTAC TGATGGATCT TGCTTAGGTA ATCCAGGGGC GGGCGGAATT351 GGTGCCGTAT TGCGTTATAA ACAACATGAA AAAACACTCT CCAAAGGCTA401 TTTCCAAACC ACCAATAATC GAATGGAATT ACGCGCTGTC ATTGAAGCAT451 TAAATACATT AAAAGAACCT TGCTTGATCA CGCTTTATAG TGATAGCCAA501 TATATGAAAA ATGGCATAAC CAAATGGATC TTTAACTGGA AAAAAAATAA551 TTGGAAAGCA AGTTCTGGAA AGCCTGTAAA AAACCAAGAT TTATGGATAG601 CCTTAGATGA ATCCATCCAA CGTCATAAAA TTAATTGGCA ATGGGTAAAA651 GGCCATGCTG GACACAGAGA AAATGAAATT TGCGATGAAT TAGCAAAAAA701 AGGGGCAGAA AATCCGACAT TGGAAGATAT GGGGTACATA GAAGAATAAT751 ACAACTGATA TAACGTCATA TTTTTCGATA CCTAAAAATA TTTAATACTT801 AAACCTAAAA CAGAATAAAA AATAATCAAA TTCATTTAAA AAATGTGATC851 TCGATCAGAT TTCAAGAAAA TTAAAATTTT GGAGTATTGA CATCAAAAAT901 TTTTTTTGTA AAGATGCAGC TCGTCCGTTT TGGCGATTGG ACAATTCTAT951 TGGAGAAAAG TTCAATCATA GATAGTAAAC AACCATAAGG AATACAAATT1001 ASEQ.ID NO76粘膜炎莫拉氏菌HtrB基因DNA編碼區(qū)(部分)核苷酸序列1 TCAGTGCTTG GTTTTTTAAG ATATGTACCG CTGTCAGTCC TGCATGGATT51 GGCGGCGTGT GCGTCTTATA TTTCCTATCA TTGCAGGCTT AGTATTTATC101 GCAGCATCCA AGCCAATTTA ATCTTGGTTC ACCCCAAGAT GCCAGACGCA151 CAGCGGCAAA AACTCGCCAA ACAAATCCTA AAAAATCAGC TCATCAGTGC201 AGTCGACAGT CTTAAAACTT GGGCAATGCC ACCAAAATGG TCTATCGCAC251 AAATTAAAAC GGTTCATCAT GAAGATATCC TAATCAAAGC ACTTGCCAAT301 CCAAGTGGTA TGCTTGCCAT TGTGCCTCAT ATCGGCACTT GGGAGATGAT351 GAATGCTTGG CTCAATACCT TTGGCTCCCC TACTATCATG TATAAGCCCA401 TCAAAAATGC GGCGGTAGAT CGCTTTGTTT TACAGGGGCG TGAAAGACTA451 AATGCCAGCC TTGTACCCAC AGATGCTAGT GGTGTTAAGG CAATTTTTAA501 AACACTCAAA GCAGGTGGAT TTAGTATCAT ACTGCCCGAC CATGTACCTG551 ATCCATCAGG TGGTGAGATT GCTCCTTTTT TTGGTATTAA AACCCTAACC601 AGTACGCTGG CGTCAAAGCT TGCTGCAAAA ACTGGTTGTG CTCTTGTTGG651 CTTAAGCTGT ATTCGGCGTG AAGATGGCGA TGGTTTTGAA ATTTTTTGTT701 ATGAATTAAA TGATGAACAA CTTTATTCAA AAAATACCAA AATTGCAACC751 ACTGCTTTAA ATGGTGCGAT GGAACAAATG ATTTATCCAC ATTTTTTGCA801 TTATATGTGG AGCTATCGTC GGTTCAAGCA TACACCACTA TTAAATAATC851 CTTATTTACT TAATGAAAAT GAGCTAAAAA AAATAGCCAT AAAGCTTCAA901 GCCATGTCAA AGGATAGTTA TGAG蛋白序列與大腸桿菌HtrB的同一性為25％相似性為35％1 SVLGFLRYVP LSVLHGLAAC ASYISYHCRL SIYRSIQANL ILVHPKMPDA51 QRQKLAKQIL KNQLISAVDS LKTWAMPPKW SIAQIKTVHH EDILIKALAN101 PSGMLAIVPH IGTWEMMNAW LNTFGSPTIM YKPIKNAAVD RFVLQGRERL151 MASLVPTDAS GVKAIFKTLK AGGFSIILPD HVPDPSGGEI APFFGIKTLT201 STLASKLAAK TGCALVGLSC IRREDGDGFE IFCYELNDEQ LYSKNTKIAT251 TALNGAMEQM IYPHFLHYMW SYRRFKHTPL LNNPYLLNEN ELKKIAIKLQ301 AMSKDSYESEQ.ID NO77奈瑟氏菌(腦膜炎球菌B)HtrB基因DNA編碼區(qū)核苷酸序列1 ATGTTTCGTT TACAATTCGG GCTGTTTCCC CCTTTGCGAA CCGCCATGCA51 CATCCTGTTG ACCGCCCTGC TCAAATGCCT CTCCCTGCTG CCACTTTCCT101 GTCTGCACAC GCTGGGAAAC CGGCTCGGAC ATCTGGCGTT TTACCTTTTA151 AAGGAAGACC GCGCGCGCAT CGTCGCCAAT ATGCGTCAGG CAGGCATGAA201 TCCCGACCCC AAAACAGTCA AAGCCGTTTT TGCGGAAACG GCAAAAGGCG251 GTTTGGAACT TGCCCCCGCG TTTTTCAGAA AACCGGAAGA CATAGAAACA301 ATGTTCAAAG CGGTACACGG CTGGGAACAT GTGCAGCAGG CTTTGGACAA351 ACACGAAGGG CTGCTATTCA TCACGCCGCA CATCGGCAGC TACGATTTGG401 GCGGACGCTA CATCAGCCAG CAGCTTCCGT TCCCGCTGAC CGCCATGTAC451 AAACCGCCGA AAATCAAAGC GATAGACAAA ATCATGCAGG CGGGCAGGGT501 TCGCGGCAAA GGAAAAACCG CGCCTACCAG CATACAAGGG GTCAAACAAA551 TCATCAAAGC CCTGCGTTCG GGCGAAGCAA CCATCGTCCT GCCCGACCAC601 GTCCCCTCCC CTCAAGAAGG CGGGGAAGGC GTATGGGTGG ATTTCTTCGG651 CAAACCTGCC TATACCATGA CGCTGGCGGC AAAATTGGCA CACGTCAAAG701 GCGTGAAAAC CCTGTTTTTC TGCTGCGAAC GCCTGCCTGG CGGACAAGGT751 TTCGATTTGC ACATCCGCCC CGTCCAAGGG GAATTGAACG GCGACAAAGC801 CCATGATGCC GCCGTGTTCA ACCGCAATGC CGAATATTGG ATACGCCGTT851 TTCCGACGCA GTATCTGTTT ATGTACAACC GCTACAAAAT GCCG蛋白序列-與大腸桿菌Htrb的同一性為30％相似性為38％1 MFRLQFGLFP PLRTAMHILL TALLKCLSLL PLSCLHTLGN RLGHLAFYLL51 KEDRARIVAN MRQAGMNPDP KTVKAVFAET AKGGLELAPA FFRKPEDIET101 MFKAVHGWEH VQQALDKHEG LLFITPHIGS YDLGGRYISQ QLPFPLTAMY151 KPPKIKAIDK IMQAGRVRGK GKTAPTSIQG VKQIIKALRS GEATIVLPDH201 VPSPQEGGEG VWVDFFGKPA YTMTLAAKLA HVKGVKTLFF CCERLPGGQG251 FDLHIRPVQG ELNGDKAHDA AVFNRNAEYW IRRFPTQYLF MYNRYKMPSEQ.ID NO78流感嗜血桿菌(非典型性)HtrB基因DNA編碼區(qū)核苷酸序列1 ATGAAAAACG AAAAACTCCC TCAATTTCAA CCGCACTTTT TAGCCCCAAA51 ATACTGGCTT TTTTGGCTAG GCGTGGCAAT TTGGCGAAGT ATTTTATGTC101 TTCCCTATCC TATTTTGCGC CATATTGGTC ATGGTTTCGG TTGGCTGTTT151 TCACATTTAA AAGTGGGTAA ACGTCGAGCT GCCATTGCAC GCCGTAATCT201 TGAACTTTGT TTCCCTGATA TGCCTGAAAA CGAACGTGAG ACGATTTTGC251 AAGAAAATCT TCGTTCAGTA GGCATGGCAA TTATCGAAAC TGGCATGGCT301 TGGTTTTGGT CGGATTCACG TATCAAAAAA TGGTCGAAAG TTGAAGGCTT351 ACATTATCTA AAAGAAAATC AAAAAGATGG AATTGTTCTC GTCGGTGTTC401 ATTTCTTAAC GCTAGAACTT GGCGCACGCA TCATTGGTTT ACATCATCCT451 GGCATTGGTG TTTATCGTCC AAATGATAAT CCTTTGCTTG ATTGGCTACA501 AACACAAGGC CGTTTACGCT CCAATAAAGA TATGCTTGAT CGTAAAGATT551 TACGCGGAAT GATCAAAGCT TTACGCCACG AAGAAACCAT TTGGTATGCG601 CCTGATCACG ATTACGGCAG AAAAAATGCC GTTTTTGTTC CTTTTTTTGC651 AGTACCTGAC ACTTGCACTA CTACTGGTAG TTATTATTTA TTGAAATCCT701 CGCAAAACAG CAAAGTGATT CCATTTGCGC CATTACGCAA TAAAGATGGT751 TCAGGCTATA CCGTGAGTAT TTCAGCGCCT GTTGATTTTA CGGATTTACA801 AGATGAAACG GCGATTGCTG CGCGAATGAA TCAAATCGTA GAAAAGGAAA851 TCATGAAGGG CATATCACAA TATATGTGGC TACATCGCCG TTTTAAAACA901 CGTCCAGATG AAAATACGCC TAGTTTATAC GATTAA蛋白序列-與大腸桿菌HtrB同一性為57％相似性為66％1 MKNEKLPQFQ PHFLAPKYWL FWLGVAIWRS ILCLPYPILR HIGHGFGWLF51 SHLKVGKRRA AIARRNLELC FPDMPENERE TILQENLRSV GMAIIETGMA101 WFWSDSRIKK WSKVEGLHYL KENQKDGIVL VGVHFLTLEL GARIIGLHHP151 GIGVYRPNDN PLLDWLQTQG RLRSNKDMLD RKDLRGMIKA LRHEETIWYA201 PDHDYGRKNA VFVPFFAVPD TCTTTGSYYL LKSSQNSKVI PFAPLRNKDG251 SGYTVSISAP VDFTDLQDET AIAARMNQIV EKEIMKGISQ YMWLHRRFKT301 RPDENTPSLY D*SEQ.ID NO79流感嗜血桿菌(非典型性)MsbB基因DNA編碼區(qū)核苷酸序列1 ATGTCGGATA ATCAACAAAA TTTACGTTTG ACGGCGAGAG TGGGCTATGA51 AGCGCACTTT TCATGGTCGT ATTTAAAGCC TCAATATTGG GGGATTTGGC101 TTGGTATTTT CTTTTTATTG TTGTTAGCAT TTGTGCCTTT TCGTCTGCGC151 GATAAATTGA CGGGAAAATT AGGTATTTGG ATTGGGCATA AAGCAAAGAA201 ACAGCGTACG CGTGCACAAA CTAACTTGCA ATATTGTTTC CCTCATTGGA251 CTGAACAACA ACGTGAGCAA GTGATTGATA AAATGTTTGC GGTTGTCGCT301 CAGGTTATGT TTGGTATTGG TGAGATTGCC ATCCGTTCAA AGAAACATTT351 GCAAAAACGC AGCGAATTTA TCGGTCTTGA ACATATCGAA CAGGCAAAAG401 CTGAAGGAAA GAATATTATT CTTATGGTGC CACATGGCTG GGCGATTGAT451 GCGTCTGGCA TTATTTTGCA CACTCAAGGC ATGCCAATGA CTTCTATGTA501 TAATCCACAC CGTAATCCAT TGGTGGATTG GCTTTGGACG ATTACACGCC551 AACGTTTCGG CGGAAAAATG CATGCACGCC AAAATGGTAT TAAACCTTTT601 TTAAGTCATG TTCGTAAAGG CGAAATGGGT TATTACTTAC CCGATGAAGA651 TTTTGGGGCG GAACAAAGCG TATTTGTTGA TTTCTTTGGG ACTTATAAAG701 CGACATTACC AGGGTTAAAT AAAATGGCAA AACTTTCTAA AGCCGTTGTT751 ATTCCAATGT TTCCTCGTTA TAACGCTGAA ACGGGCAAAT ATGAAATGGA801 AATTCATCCT GCAATGAATT TAAGTGATGA TCCTGAACAA TCAGCCCGAG851 CAATGAACGA AGAAATAGAA TCTTTTGTTA CGCCAGCGCC AGAGCAATAT901 GTTTGGATTT TGCAATTATT GCGTACAAGG AAAGATGGCG AAGATCTTTA951 TGATTAA蛋白序列-與大腸桿菌MsbB的同一性為45％相似性為56％1 MSDNQQNLRL TARVGYEAHF SWSYLKPQYW GIWLGIFFLL LLAFVPFRLR51 DKLTGKLGIW IGHKAKKQRT RAQTNLQYCF PHWTEQQREQ VIDKMFAVVA101 QVMFGIGEIA IRSKKHLQKR SEFIGLEHIE QAKAEGKNII LMVPHGWAID151 ASGIILHTQG MPMTSMYNPH RNPLVDWLWT ITRQRFGGKM HARQNGIKPF201 LSHVRKGEMG YYLPDEDFGA EQSVFVDFFG TYKATLPGLN KMAKLSKAVV251 IPMFPRYNAE TGKYEMEIHP AMNLSDDPEQ SARAMNEEIE SFVTPAPEQY301 VWILQLLRTR KDGEDLYD*SEQ.ID NO80粘膜炎莫拉氏菌MsbB基因DNA編碼區(qū)核苷酸序列1 ATGAGTTGCC ATCATCAGCA TAAGCAGACA CCCAAACACG CCATATCCAT51 TAAGCATATG CCAAGCTTGA CAGATACTCA TAAACAAAGT AGCCAAGCTG101 AGCCAAAATC GTTTGAATGG GCGTTTTTAC ATCCCAAATA TTGGGGAGTT151 TGGCTGGCTT TTGCGTTGAT TTTACCGCTG ATTTTTCTAC CGCTGCGTTG201 GCAGTTTTGG ATCGGCAAGC GTCTTGGCAT TTTGGTACAT TACTTAGCTA251 AAAGCCGAGT TCAAGACACT CTAACCAACC TGCAGCTTAC CTTCCCAAAT301 CAACCAAAAT CAAAACACAA GGCCACCGCA CGGCAAGTAT TTATTAATCA351 AGGTATTGGT ATTTTTGAAA GTTTATGTGC ATGGTTTCGC CCTAATGTCT401 TTAAACGCAC TTTTAGCATT TCTGGTTTAC AGCATTTGAT TGATGCCCAA451 AAACAAAATA AAGCGGTGAT TTTACTTGGT GGACATCGCA CGACGCTTGA501 TTTGGGCGGT CGGTTATGTA CACAGTTTTT TGCGGCGGAC TGCGTGTATC551 GCCCACAAAA CAACCCTTTG CTTGAATGGT TTATCTATAA TGCACGCCGC601 TGTATCTTTG ATGAGCAAAT CTCAAATCGT GATATGAAAA AACTCATCAC651 TCGGCTCAAA CAAGGTCGGA TAATTTGGTA TTCACCTGAT CAAGATTTTG701 GTCTTGAGCA TGGCGTGATG GCGACCTTTT TTGGTGTGCC TGCAGCAACG751 ATTACCGCTC AGCGTCGTCT TATTAAGCTG GGTGATAAAG CCAATCCTCC801 TGTCATCATC ATGATGGATA TGCTCAGACA AACGCCCGAT TATATCGCAA851 AAGGTCACCG TCCACATTAT CACATCAGCC TAAGCGCTGT GTTAAAAAAT901 TATCCCAGCG ATGACGAAAC CGCCGATGCT GAACGCATCA ATCGACTGAT951 TGAGCAAAAT ATTCAAAAAG ATTTAACCCA GTGGATGTGG TTTCATCGCC1001 GCTTTAAAAC TCAAGCCGAT GACACCAATT ACTATCAACA TTAATG蛋白序列-與大腸桿菌MsbB的同一性為28％相似性為37％1 MSCHHQHKQT PKHAISIKHM PSLTDTHKQS SQAEPKSFEW AFLHPKYWGV51 WLAFALILPL IFLPLRWQFW IGKRLGILVH YLAKSRVQDT LTNLQLTFPN101 QPKSKHKATA RQVFINQGIG IFESLCAWFR PNVFKRTFSI SGLQHLIDAQ151 KQNKAVILLG GHRTTLDLGG RLCTQFFAAD CVYRPQNNPL LEWFIYNARR201 CIFDEQISNR DMKKLITRLK QGRIIWYSPD QDFGLEHGVM ATFFGVPAAT251 ITAQRRLIKL GDKANPPVII MMDMLRQTPD YIAKGHRPHY HISLSAVLKN301 YPSDDETADA ERINRLIEQN IQKDLTQWMW FHRRFKTQAD DTNYYQH*SEQ.ID NO81奈瑟氏菌(腦膜炎球菌B)MsbB基因DNA編碼區(qū)核苷酸序列1 ATGAAATTTA TATTTTTTGT ACTGTATGTT TTGCAGTTTC TGCCGTTTGC51 GCTGCTGCAC AAACTTGCCG ACCTGACGGG TTTGCTCGCC TACCTTTTGG101 TCAAACCCCG CCGCCGTATC GGCGAAATCA ATTTGGCAAA ATGCTTTCCC151 GAGTGGGACG GAAAAAAGCG CGAAACCGTA TTGAAGCAGC ATTTCAAACA201 TATGGCGAAA CTGATGCTTG AATACGGCTT ATATTGGTAC GCGCCTGCCG251 GGCGTTTGAA ATCGCTGGTG CGTTACCGCA ATAAGCATTA TTTGGACGAC301 GCGCTGGCGG CGGGGGAAAA AGTCATCATT CTGTACCCGC ACTTCACCGC351 GTTCGAGATG GCGGTGTACG CGCTTAATCA GGATGTACCG CTGATCAGTA401 TGTATTCCCA CCAAAAAAAC AAGATATTGG ACGCACAGAT TTTGAAAGGC451 CGCAACCGCT ACGACAATGT CTTCCTTATC GGGCGCACCG AAGGCGTGCG501 CGCCCTCGTC AAACAGTTCC GCAAAAGCAG CGCGCCGTTT CTGTATCTGC551 CCGATCAGGA TTTCGGACGC AACGATTCGG TTTTTGTGGA TTTTTTCGGT601 ATTCAGACGG CAACGATTAC CGGCTTGAGC CGCATTGCCG CGCTTGCAAA651 TGCAAAAGTG ATACCCGCCA TCCCCGTCCG CGAGGCGGAC AATACGGTTA701 CATTGCATTT CTACCCGGCT TGGGAATCCT TTCCGAGTGA AGATGCGCAG751 GCCGACGCGC AGCGCATGAA CCGTTTTATC GAGGAACCGT GCGCGAACAT801 CCCGAGCAGT ATTTTTGGCT GCACAAGCGT TTCAAAACCC GTCCGGAAGG851 CAGCCCCGAT TTTTACTGAT ACGTAA蛋白序列-與大腸桿菌MsbB的同一性為25％相似性為36％1 MKFIFFVLYV LQFLPFALLH KLADLTGLLA YLLVKPRRRI GEINLAKCFP51 EWDGKKRETV LKQHFKHMAK LMLEYGLYWY APAGRLKSLV RYRNKHYLDD101 ALAAGEKVII LYPHFTAFEM AVYALNQDVP LISMYSHQKN KILDAQILKG151 RNRYDNVFLI GRTEGVRALV KQFRKSSAPF LYLPDQDFGR NDSVFVDFFG201 IQTATITGLS RIAALANAKV IPAIPVREAD NTVTLHFYPA WESFPSEDAQ251 ADAQRMNRFI EEPCANIPSS IFGCTSVSKP VRKAAPIFTD T*
權利要求
1.來自革蘭氏陰性細菌的基因工程改造的囊泡制劑，其特征在于所述的制劑通過利用選自一下的方法獲得a)一種減少囊泡制劑中的免疫顯性可變的或非保護性抗原的方法，包括以下步驟確定此抗原的身份，工程改造一種細菌菌株來產生較少的或不產生所述的抗原，并且從所述菌株生產囊泡；b)一種上調囊泡制劑中的保護性OMP抗原的表達的方法，包括以下步驟鑒定所述的抗原，工程改造一種細菌菌株來導入強啟動子序列到編碼所述抗原的基因的上游使得所述基因以比在非修飾的囊泡中更高的水平表達，且從所述的菌株制備囊泡；c)一種上調囊泡制劑中的條件化表達的保護性OMP抗原的表達的方法，包括以下步驟鑒定所述的抗原，工程改造一種細菌菌株來去除其表達的抑制調控機制，且從所述的菌株制備囊泡；d)一種修飾囊泡制劑中的細菌LPS的脂A部分的方法，包括以下步驟鑒定與LPS類脂A部分的毒性有關的基因，工程改造一種細菌菌株來減少或關閉所述基因的表達，并從所述的菌株制備囊泡；e)一種修飾囊泡制劑中的細菌LPS的脂A部分的方法，包括以下步驟鑒定與使得LPS的類脂A部分毒性降低有關的基因，工程改造一種細菌菌株來導入強啟動子序列到編碼所述抗原的基因的上游使得所述基因以比在非修飾的囊泡中更高的水平表達，且從所述的菌株制備囊泡；f)一種減少囊泡制劑中脂類A毒性和增加保護性抗原的水平的方法，包括以下步驟工程改造細菌菌株的染色體來結合一個編碼融合到保護性抗原上的多粘菌素A肽，或其衍生物或類似物的基因，并從所述的菌株制備囊泡；g)一種在囊泡制劑中生成保守的OMP抗原的方法，包括以下步驟鑒定所述的抗原，改造細菌菌株來缺失編碼所述抗原的基因的可變區(qū)，并從所述的菌株制備囊泡；
2.權利要求1的基因工程改造的囊泡制劑，其中所述的制劑通過采用選自以下的一種或多種進一步的方法獲得h)一種減少抗原在囊泡制劑中表達的方法，其中的抗原結構與人的結構類似且可以在人體中誘導自身免疫應答，包括以下步驟鑒定涉及抗原的生物合成的基因，改造細菌菌株來減少或關閉所述基因的表達，并從所述的菌株制備囊泡；i)一種上調囊泡制劑中保護性OMP抗原的表達的方法，包括以下步驟鑒定所述的抗原，工程改造一種細菌菌株來導入編碼所述由異源強啟動子序列調控的抗原的基因的一或多個拷貝至染色體，并從所述的菌株制備囊泡。
3.權利要求1或2中的囊泡制劑，其中方法a)，b)，c)，d)，e)，h)和i)的工程改造步驟通過在細菌染色體的至少30個核苷酸的序列和轉化菌株的載體上的至少30個核苷酸序列之間的同源重組事件來進行。
4.如權利要求3所述的囊泡制劑，其中的工程改造步驟通過細菌染色體上兩個由核苷酸序列“X”分隔的至少30個核苷酸的序列和轉化菌株的載體上兩個由核苷酸序列“Y”分隔的至少30個核苷酸的序列之間的雙重交叉互換同源重組事件來進行，其中在重組事件中，X和Y是相互交換的。
5.如權利要求4所述的囊泡制劑，其中的兩個核苷酸序列為大約相同的長度，且其中的載體是線性的DNA分子。
6.如權利要求4或5所述的囊泡制劑，其中方法a)，b)，c)，d)，e)和h)的重組事件是在目的基因的起始密碼子上游1000bp的染色體區(qū)進行。
7.如權利要求6所述的囊泡制劑，其中方法a)，d)或h)的核苷酸序列X含有基因的部分啟動子區(qū)，且核苷酸序列Y含有弱啟動子區(qū)，或無啟動子區(qū)。
8.如權利要求6所述的囊泡制劑，其中方法b)或e)中的核苷酸序列Y含有細菌的強啟動子區(qū)。
9.如權利要求8所述的囊泡制劑，其中的核苷酸序列Y插入在目的基因的起始密碼子上游大約200-600bp。
10.如權利要求9所述的囊泡制劑，其中的核苷酸序列Y插入在目的基因的起始密碼子上游大約400bp。
11.如權利要求6所述的囊泡制劑，其中方法c)中核苷酸序列X含有啟動子的部分抑制調控區(qū)，且核苷酸序列Y不含這種序列。
12.如權利要求4或5所述的囊泡制劑，其中方法a)，d)和h)的重組事件被進行使得核苷酸序列X含有目的基因的部分編碼序列。
13.如權利要求4或5所述的囊泡制劑，其中方法i)被進行使得核苷酸序列Y含有表達盒中基因的更多拷貝。
14.權利要求1-13中的囊泡制劑，分離自修飾的腦膜炎奈瑟氏菌B菌株。
15.如權利要求14所述的囊泡制劑，通過采用至少方法b)和/或i)獲得，其中以下一或多個基因被上調NspA，Hsf-樣，Hap，PorA，PorB，OMP85，PilQ，PldA，FrpB，TbpA，TbpB，FrpA，FrpC，LbpA，LbpB，FhaB，HasR，lipo02，Tbp2(lipo28)，MltA(lipo30)和ctrA。
16.如權利要求14和15所述的囊泡制劑，通過采用至少方法a)獲得，其中以下一或多個基因被下調PorA，PorB，PilC，TbpA，TbpB，LbpA，LbpB，Opa和Opc。
17.如權利要求14-16所述的囊泡制劑，通過采用至少方法d)獲得，其中以下一或多個基因被上調htrB，msbB和lpxK。
18.如權利要求14-17所述的囊泡制劑，通過采用至少方法e)獲得，其中以下一或多個基因被上調pmrA，pmrB，pmrE和pmrF。
19.如權利要求14-18所述的囊泡制劑，通過采用至少方法c)獲得，其中啟動子的抑制調控序列是TbpB或LbpB基因或二者的fur操縱基因區(qū)。
20.如權利要求14-19所述的囊泡制劑，通過采用至少方法h)獲得，其中以下一或多個基因被下調galE，siaA，siaB，siaC，siaD，ctrA，ctrB，ctrC，和ctrD。
21.權利要求1-13的囊泡制劑，分離自修飾的粘膜炎莫拉氏菌菌株。
22.如權利要求21所述的囊泡制劑，通過采用至少方法b)獲得，其中以下一或多個基因被上調OMP106，HasR，PilQ，OMP85，lipo06，lipo10，lipo11，lipo18，P6，ompCD，CopB，D15，OmplA1，Hly3，LbpA，LbpB，TbpA，TbpB，OmpE，UspA1，UspA2，和Omp21。
23.如權利要求21或22所述的囊泡制劑，通過采用至少方法a)獲得，其中以下一或多個基因被下調CopB，OMP106，OmpB1，TbpA，TbpB，LbpA和LbpB。
24.如權利要求21-23所述的囊泡制劑，通過采用至少方法d)獲得，其中以下一或多個基因被下調htrB，msbB和lpxK。
25.如權利要求21-24所述的囊泡制劑，通過采用至少方法e)獲得，其中以下一或多個基因被上調pmrA，pmrB，pmrE，和pmrF。
26.權利要求1-13的囊泡制劑，分離自修飾的流感嗜血桿菌菌株。
27.如權利要求26所述的囊泡制劑，通過采用至少方法b)和/或i)獲得，其中以下一或多個基因被上調D15，P6，TbpA，TbpB，P2，P5，OMP26，HMW1，HMW2，HMW3，HMW4，Hia，Hsf，Hap，Hin47，和Hif。
28.如權利要求26或27所述的囊泡制劑，通過采用至少方法a)獲得，其中以下一或多個基因被下調P2，P5，Hif，IgAI-protease，HgpA，HgpB，HMW1，HMW2，Hxu，TbpA，和TbpB。
29.如權利要求26-28所述的囊泡制劑，通過采用至少方法d)獲得，其中以下一或多個基因被下調htrB，msbB和lpxK。
30.如權利要求26-29所述的囊泡制劑，通過采用至少方法e)獲得，其中以下一或多個基因被上調pmrA，pmrB，pmrE，和pmrF。
31.來自革蘭氏陰性細菌的基因工程改造的囊泡制劑，其特征在于所述制劑通過包括以下步驟的方法獲得通過同源重組，導入一個外源基因到染色體中，該基因可選地被強啟動子序列調控，并從所述的菌株制備囊泡。
32.權利要求31的囊泡制劑，其中的革蘭氏陰性菌株是淋病奈瑟氏菌，且異源基因是來自砂眼衣原體的保護性OMP。
33.權利要求31的囊泡制劑，其中的革蘭氏陰性菌株是流感嗜血桿菌，且異源基因是來自粘膜炎莫拉氏菌的保護性OMP。
34.權利要求31的囊泡制劑，其中的革蘭氏陰性菌株是粘膜炎莫拉氏菌，且異源基因是來自流感嗜血桿菌的保護性OMP。
35.一種疫苗，包含權利要求1-34中的囊泡制劑和一種藥學上可接受的賦形劑。
36.一種腦膜炎球菌疫苗，包含權利要求14-20的囊泡制劑和一或多種普通的或結合的選自血清型A，C，Y或W的腦膜炎球菌莢膜多糖。
37.一種腦膜炎疫苗，含有權利要求14-20的制劑或權利要求32的囊泡制劑，結合的流感嗜血桿菌b莢膜多糖，以及一或多個普通或結合的肺炎球菌莢膜多糖。
38.一種中耳炎疫苗，含有權利要求21-25的囊泡制劑以及一或多個普通或結合的肺炎球菌莢膜多糖，和一或多個能保護宿主抵抗非典型性流感嗜血桿菌感染的抗原。
39.一種中耳炎疫苗，含有權利要求26-30的囊泡制劑或以及一或多個普通或結合的肺炎球菌莢膜多糖，和一或多個能保護宿主抵抗粘膜炎莫拉氏菌感染的抗原。
40.權利要求38或39的中耳炎疫苗，其中疫苗另外含有一或多種可保護宿主抵抗肺炎鏈球菌的蛋白抗原和/或一或多種可保護宿主抵抗RSV的抗原和/或一或多種可保護宿主抵抗流感病毒的抗原。
41.一種適于進行權利要求3-34所述的重組事件的載體。
42.一種修飾的用來制備權利要求1-34的囊泡制劑的革蘭氏陰性菌菌株。
43.一種適于兒科使用的免疫保護性和無毒的革蘭氏陰性囊泡，空胞或滅活全細胞疫苗。
44.一種分離的多核苷酸序列，其在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO2-23，25，27-81或其互補鏈的至少30個核苷酸部分雜交。
45.權利要求44的分離的多核苷酸序列，含有至少30個核苷酸。
46.權利要求45的分離的多核苷酸序列，含有SEQ ID NO2-23，25，27-81或其互補鏈的至少30個核苷酸。
47.權利要求44-46的分離的多核苷酸序列在革蘭氏陰性菌染色體基因上游1000bp內進行同源重組來增加或減少所述基因表達的同源重組事件中的應用。
48.在革蘭氏陰性菌株內遺傳上調基因表達的方法，包括以下步驟制備含有強啟動子序列的載體和能與基因上游1000bp至少30個核苷酸的序列重組的至少30個核苷酸的序列，用載體轉化細菌菌株，在染色體和載體之間進行同源重組來在基因的起始密碼子的上游1000bp內導入啟動子。
49.權利要求48的方法，其中的啟動子被導入在基因的起始密碼子上游200-600bp內。
50.權利要求49的方法，其中的啟動子被導入在基因的起始密碼子上游約400bp處。
51.如權利要求48-50所述的方法，其中的同源重組事件通過在細菌染色體上兩個由核苷酸序列“X”分隔的至少30個核苷酸的序列和轉化菌株的載體上兩個由含有強啟動子序列的核苷酸序列“Y”分隔的至少30個核苷酸的序列之間的雙重交叉互換同源重組事件來進行，其中的載體是線性的核苷酸序列，且在重組事件中X和Y是相互交換的。
52.權利要求51的方法，其中的兩個核苷酸序列具有大約相同的長度。
53.一種通過權利要求48-52的方法獲得的修飾的細菌菌株。
54.一種從革蘭氏陰性菌菌株通過采用選自下組的一或多種方法來生產遺傳工程改造的囊泡制劑的方法a)一種減少囊泡制劑中的免疫顯性可變的或非保護性抗原的方法，包括以下步驟檢測此抗原的特性，工程改造一種細菌菌株來產生較少的或不產生所述的抗原，并且從所述菌株生產囊泡；b)一種上調囊泡制劑中的保護性OMP抗原的表達的方法，包括以下步驟鑒定所述的抗原，工程改造一種細菌菌株來導入強啟動子序列到編碼所述抗原的基因的上游使得所述基因比在非修飾的囊泡中較高水平的表達，且從所述的菌株制備囊泡；c)一種上調囊泡制劑中的條件化表達的保護性OMP抗原的表達的方法，包括以下步驟鑒定所述的抗原，工程改造一種細菌菌株來去除其表達的抑制調控機制，并從所述的菌株制備囊泡；d)一種修飾囊泡制劑中的細菌LPS的脂A部分的方法，包括以下步驟鑒定與表現LPS毒物的類脂A部分有關的基因，工程改造一種細菌菌株來減少或關閉所述基因的表達，并從所述的菌株制備囊泡；e)一種修飾囊泡制劑中的細菌LPS的脂A部分的方法，包括以下步驟鑒定與表現LPS的脂A部分較少毒性有關的基因，工程改造一種細菌菌株來導入強啟動子序列到編碼所述抗原的基因的上游使得所述基因比在非修飾的囊泡中較高水平的表達，且從所述的菌株制備囊泡；f)一種減少囊泡制劑中脂類A毒性和增加保護性抗原的水平的方法，包括以下步驟工程改造細菌菌株的染色體來結合一個編碼融合到保護性抗原上的多粘菌素A肽，或其衍生物或類似物的基因，并從所述的菌株制備囊泡；或g)一種在囊泡制劑中生成保守的OMP抗原的方法包括以下步驟鑒定所述的抗原，改造細菌菌株來缺失編碼所述抗原的基因的可變區(qū)，并從所述的菌株制備囊泡；h)一種減少抗原在囊泡制劑中表達的方法，其中的抗原與人的結構具有結構相似性且可能能夠在人體中誘導自身免疫應答，包括以下步驟鑒定涉及抗原的生物合成的基因，改造細菌菌株來減少或關閉所述基因的表達，并從所述的菌株制備囊泡；或i)一種上調囊泡制劑中保護性OMP抗原的表達的方法，包括以下步驟鑒定所述的抗原，工程改造一種細菌菌株來導入編碼所述由異源強啟動子序列調控的抗原的基因的一或多個染色體拷貝，并從所述的菌株制備囊泡。
55.一種免疫人宿主抵抗下列一或多種細菌感染引起的疾病的方法腦膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血桿菌，粘膜炎莫拉氏菌，銅綠假單胞菌，砂眼衣原體，肺炎衣原體，該方法包括向宿主給藥免疫保護劑量的權利要求1-34的囊泡制劑。
56.權利要求1-34的囊泡制劑在用于免疫人宿主抵抗以下一或多種細菌感染引起的疾病的藥物生產中的應用腦膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血桿菌，粘膜炎莫拉氏菌，銅綠假單胞菌，砂眼衣原體，肺炎衣原體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適于兒科使用的免疫保護性且無毒的革蘭氏陰性囊泡疫苗。產生此囊泡的革蘭氏陰性菌的例子是腦膜炎奈瑟氏菌,粘膜炎莫拉氏菌和流感嗜血桿菌。本發(fā)明的囊泡通過一或多個細菌染色體的遺傳改變被改進,包括保護性抗原的上調,免疫顯性非保護性抗原的下調,以及LPS的類脂A部分的脫毒。
文檔編號A61P31/04GK1377415SQ00813842
公開日2002年10月30日 申請日期2000年7月31日 優(yōu)先權日1999年8月3日
發(fā)明者F·X·J·伯特特, W·L·J·達勒曼斯, P·德諾埃爾, G·德奎斯尼, C·菲倫, Y·羅貝特, J·波爾曼, G·蒂里, J·通納德, P·沃埃特 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司