專利名稱：疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及奈瑟氏球菌(Neisserial)免疫原性組合物和疫苗，它們的制備方法以及這種組合物在藥物中的用途。更具體而言，它涉及包括抗原組合的疫苗組合物，正如在保護(hù)測(cè)定法或血清殺菌測(cè)定法中所測(cè)量的那樣，其具有可使本發(fā)明的疫苗引發(fā)令人驚訝的良好免疫反應(yīng)的性質(zhì)。
背景細(xì)菌中的奈瑟氏球菌菌株是很多人類病變的病原體，因此需要研制出可抗這些病原體的有效疫苗。特別是，淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)所引起的病變可通過(guò)接種疫苗而治療。
淋病奈瑟氏球菌是淋病的病原體，淋病是全世界所報(bào)道的最常見(jiàn)的性傳播疾病之一，據(jù)估計(jì)每年有六千兩百萬(wàn)個(gè)病例發(fā)病(Gerbase等人，1998 Lancet 351；(Suppl 3)2-4)。淋病的臨床表現(xiàn)包括泌尿生殖道、咽喉或直腸粘膜炎癥以及新生兒眼睛感染。婦女淋球菌(gonococcal)感染上升可導(dǎo)致不孕、子宮外妊娠、慢性盆腔炎和輸卵管-卵巢膿腫形成。敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎和腦膜炎均與并發(fā)性淋病有關(guān)。
大量淋球菌菌株對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致發(fā)病率以及與淋病有關(guān)的并發(fā)癥增加。用抗生素治療淋病的吸引人的替代方案是利用接種疫苗而預(yù)防淋病。目前還沒(méi)有抗淋病奈瑟氏球菌感染的疫苗。
腦膜炎奈瑟氏球菌是一種重要的病原體，特別是在兒童和年輕人中。敗血癥和腦膜炎是侵入性腦膜炎球菌病(IMD)的最嚴(yán)重威脅生命的形式。這種疾病由于其較高的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)成為全世界的健康問(wèn)題。
根據(jù)莢膜多糖的抗原差異，已經(jīng)鑒定出了13種腦膜炎奈瑟氏球菌血清組，最普遍的是A、B和C，它們導(dǎo)致全世界90％的該疾病。血清組B是歐洲、美國(guó)和拉丁美洲幾個(gè)國(guó)家中腦膜炎球菌病的最普遍原因。
已經(jīng)研制出了基于血清組A、C、W和Y的莢膜多糖的疫苗，它們表現(xiàn)出可控制腦膜炎球菌病的暴發(fā)(Peltola等人，1985 Pediatrics76；91-96)。然而，血清組B的免疫原性較差，且僅主要誘導(dǎo)IgM同種型的短暫抗體反應(yīng)(Ala’Aldeen D和Cartwright K1996，J.Infect.33；153-157)。因此，目前還沒(méi)有能夠抗導(dǎo)致絕大多數(shù)溫帶國(guó)家中大多數(shù)該疾病的血清組B腦膜炎球菌的廣泛有效的疫苗。尤為嚴(yán)重的是血清型B疾病在歐洲、澳洲和美洲的發(fā)生率日益增加，主要是在5歲以下的兒童中?？寡褰MB腦膜炎球菌的疫苗的研制提出了一個(gè)特有的困難，即由于多糖莢膜與人神經(jīng)細(xì)胞粘著分子的免疫學(xué)相似性導(dǎo)致其免疫原性較差。將疫苗生產(chǎn)的方案集中于腦膜炎球菌外膜的表面外露結(jié)構(gòu)，但卻被菌株之間這些抗原的顯著變異所阻礙。
進(jìn)一步的研究采用由外膜小泡構(gòu)成的疫苗，其包括很多構(gòu)成細(xì)菌膜正常內(nèi)含物的蛋白。這些的其中之一是抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B和C的VA-MENGOC-BCCuban疫苗(Rodriguez等人，1999Mem Inst.Oswaldo Cruz，Rio de Janeiro 94；433-440)。設(shè)計(jì)這種疫苗用來(lái)抗古巴的侵入性腦膜炎球菌病，這種病不能通過(guò)使用莢膜多糖AC疫苗進(jìn)行的接種程序而被消除。流行的血清組是B和C，且VA-MENGOC-BC疫苗已經(jīng)可以成功控制暴發(fā)，據(jù)估計(jì)該疫苗抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株的效能為83％(Sierra等人，1990 In Neisseria，WalterGruyter，Berlin，m.Atchman等人(eds)p 129-134，Sierra等人，1991，NIPH Ann 14；195-210)。該疫苗可有效抗特異性暴發(fā)，然而所引發(fā)的免疫反應(yīng)不能抗腦膜炎奈瑟氏球菌的其它菌株。
隨后在拉丁美洲，在由同源和異源血清組B腦膜炎球菌菌株引起的流行病過(guò)程中進(jìn)行的功效研究已在年齡稍大的兒童和成人中表現(xiàn)出一些功效，但它的有效性在感染危險(xiǎn)最大的、年齡較小的兒童中明顯偏低(Milagres等人，1994，Infect.Immun.62；4419-4424)。這種疫苗在具有多菌株地方病的國(guó)家，如UK效果怎樣還不肯定。對(duì)抗異源菌株的免疫原性的研究?jī)H證實(shí)了有限的交叉反應(yīng)性血清殺菌活性，特別是在嬰兒中(Tappero等人，1999，JAMA 281；1520-1527)。
第二種外膜小泡疫苗是在挪威，使用在斯堪的納維亞流行的那些普遍血清型B分離物研制的(Fredriksen等人，1991，NIPH Ann，14；67-80)。該疫苗已在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試，并發(fā)現(xiàn)29個(gè)月后，它具有57％的保護(hù)功效(Bjune等人，1991，Lancet，338；1093-1096)。
然而，外膜小泡在疫苗中的使用與某些問(wèn)題有關(guān)。例如，OMV包括有毒的脂多糖且它們可包括免疫顯性抗原，這些抗原或者是菌株特異性的，或者是可變表達(dá)的。已經(jīng)描述過(guò)的幾個(gè)方法都可用于克服外膜小泡制品疫苗的一些問(wèn)題。WO01/09350描述了例如通過(guò)降低毒性并修飾外膜小泡上存在的抗原而解決某些問(wèn)題的方法。
WO01/52885描述了把外膜小泡與其它抗原組合在一起的可能性且包括了超過(guò)2,000種潛在的奈瑟氏球菌蛋白列表，從該列表可推測(cè)研制出對(duì)更寬血清型范圍都具有功效的疫苗。
目前所用的抗-腦膜炎球菌疫苗存在著多種問(wèn)題?；诘鞍椎耐饽ひ呙鐑A向于特異性且僅對(duì)少數(shù)菌株有效。多糖疫苗也是次最優(yōu)的，這是因?yàn)樗鼈儍A向于引發(fā)較差且短暫的免疫反應(yīng)，特別是對(duì)血清組B(Lepow等人1986；Peltola 1998，Pediatrics 76；91-96)。
奈瑟氏球菌感染提出了一個(gè)重要的保健問(wèn)題，即對(duì)淋病奈瑟氏球菌而言，還沒(méi)有可用的疫苗，或?qū)δX膜炎奈瑟氏球菌而言，僅有有限的抗異源菌株的功效和能力的疫苗。顯然需要研制抗奈瑟氏球菌感染更好的疫苗，它們能夠改善目前所用疫苗的功效并抗更大范圍的菌株。
附圖描述

圖1.-對(duì)由tbpA和hsf表達(dá)被上調(diào)的重組腦膜炎奈瑟氏球菌菌株制備的OMV中的TbpA和Hsf的檢測(cè)。通過(guò)用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE分析(4-20％梯度凝膠)分離OMV制品(10μg)。
圖2.-在大腸桿菌(E.coli)中產(chǎn)生的重組Hsf過(guò)客(passenger)結(jié)構(gòu)域的檢測(cè)，10μg純化的Hsf過(guò)客蛋白(第2和3道)通過(guò)12％SDS-PAGE凝膠上分離，并與分子量標(biāo)記(第1道)相比較。
圖3.-Hap過(guò)客純度的分析，這是通過(guò)(A)考馬斯染色，(B)銀染，(C)抗-His5蛋白質(zhì)印跡和(D)抗-大腸桿菌檢測(cè)的。10μg純化抗原是在4-20％丙烯酰胺梯度凝膠上通過(guò)SDS-PAGE分離的。
圖4.-從腦膜炎奈瑟氏球菌菌株FAM20分離的FrpA和FrpC蛋白共有的序列相似性區(qū)。(A)腦膜炎奈瑟氏球菌菌株FAM20RTX蛋白FrpA和FrpC的結(jié)構(gòu)域組成。(B)從腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76獲得的FrpA/C擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖5.-重組Frp23(具有23個(gè)重復(fù)單位的FrpA/C保守區(qū))抗原在大腸桿菌中的表達(dá)。用對(duì)照載體(pET24d)或重組構(gòu)建體(分別為Frp3、Frp13和Frp23)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21DE3的非誘導(dǎo)(NI)和誘導(dǎo)(I)的總細(xì)胞提取物的SDS-PAGE分析。用考馬斯藍(lán)(A)將凝膠染色或?qū)⒛z轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上并用抗-His6小鼠血清進(jìn)行免疫檢測(cè)。
圖6.-在大腸桿菌中表達(dá)的FHAB2/3rd片段的優(yōu)選DNA序列。
圖7.-來(lái)源于誘導(dǎo)大腸桿菌B121DE3提取物的重組FHAB2/3rd的純化。(A)純化過(guò)程中的主要步驟。(B)對(duì)在純化過(guò)程不同步驟采樣的蛋白級(jí)分進(jìn)行的SDS-PAGE分析。
圖8.-針對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌的FHAB2/3rd、Hap、Hap過(guò)客結(jié)構(gòu)域、Hsf和Hsf過(guò)客結(jié)構(gòu)域抗原的抗-血清的粘附阻斷活性。
圖9.-表示Hsf、TbpA和NspA在來(lái)源于不同腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的外膜小泡制品中的表達(dá)水平的考馬斯藍(lán)染色凝膠。第1道-分子量標(biāo)記；第2道-從莢膜多糖被下調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡；第3道-從莢膜多糖和PorA被下調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡；第4道-從莢膜多糖和PorA被下調(diào)且NspA被上調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡；第5道-從莢膜多糖和PorA被下調(diào)且Hsf被上調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡；第6道-從莢膜多糖和PorA被下調(diào)且TbpA被上調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡；第7道-從莢膜多糖和PorA被下調(diào)且TbpA和Hsf被上調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡；第8道-從莢膜多糖和PorA被下調(diào)且TbpA和NspA被上調(diào)的菌株H44/76制備的外膜小泡。
詳述本發(fā)明公開(kāi)了奈瑟氏球菌抗原的特定組合，當(dāng)它們組合在一起時(shí)，可使疫苗抗奈瑟氏球菌感染的功效令人驚訝地提高。
奈瑟氏球菌感染要經(jīng)歷若干不同的階段。例如，腦膜炎球菌的生活周期包括鼻咽定居、粘膜附著、進(jìn)入血流、在血液中增殖、誘導(dǎo)中毒性休克、穿過(guò)血/腦屏障并在腦脊液和/或腦脊膜中增殖。細(xì)菌表面上的不同分子參與感染周期的不同階段。通過(guò)使用有效量參與奈瑟氏球菌感染的不同過(guò)程特定抗原的組合產(chǎn)生免疫反應(yīng)，可獲得具有令人吃驚的較高功效的奈瑟氏球菌疫苗。
具體而言，來(lái)源于不同種類的特定抗原的組合可引發(fā)針對(duì)感染多個(gè)階段的免疫反應(yīng)，在這些不同種類的特定抗原中，有些參與附著到宿主細(xì)胞，有些參與鐵的獲得，有些是自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而有些是毒素?？乖倪@種組合可令人吃驚地提高(優(yōu)選協(xié)同提高)疫苗抗奈瑟氏球菌感染的功效，其中以最佳方式通過(guò)免疫反應(yīng)針對(duì)細(xì)菌的不止一個(gè)功能。
疫苗的功效可通過(guò)多種測(cè)定法評(píng)價(jià)。在動(dòng)物模型中進(jìn)行的保護(hù)測(cè)定法是本領(lǐng)域熟知的。此外，血清殺菌測(cè)定法(SBA)是最普遍認(rèn)可的免疫學(xué)標(biāo)記，以評(píng)價(jià)腦膜炎球菌疫苗的功效(Perkins等人，J Infect Dis.1998，177683-691)。
抗原的某些組合(例如，某些自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和某些鐵獲得蛋白的組合)可導(dǎo)致動(dòng)物模型測(cè)定法中的保護(hù)提高和/或協(xié)同產(chǎn)生更高的SBA效價(jià)。不希望受到理論的束縛，抗原的這種協(xié)同組合可通過(guò)抗原組合所產(chǎn)生免疫反應(yīng)的許多特性實(shí)現(xiàn)?？乖旧碓谀紊锨蚓?xì)胞上通常是表面外露的，傾向于保守且未以最佳殺菌反應(yīng)所需的充足量存在于表面細(xì)胞上，該最佳殺菌反應(yīng)由單獨(dú)抗該抗原引起的抗體產(chǎn)生。將本發(fā)明抗原組合起來(lái)生產(chǎn)的制劑可導(dǎo)致殺菌抗體的有利組合，這些殺菌抗體與奈瑟氏球菌細(xì)胞的相互作用超出了臨界閾值。在這種臨界水平下，足量性質(zhì)良好的抗體與細(xì)菌表面結(jié)合，從而通過(guò)補(bǔ)體有效殺死細(xì)菌并因此見(jiàn)到更高水平的殺菌作用。
因?yàn)檠鍤⒕鷾y(cè)定法(SBA)可密切反映疫苗候選物的功效，因此通過(guò)抗原組合獲得的良好SBA效價(jià)可很好地表征包括該抗原組合的疫苗的保護(hù)功效。本發(fā)明涉及分離的或與另一抗原共同富含于混合物中的兩種抗原組合的用途。當(dāng)組合在一起時(shí)，這種抗原組合有利地相互作用，且優(yōu)選協(xié)同引發(fā)殺菌活性更高的免疫反應(yīng)(正如在血清殺菌測(cè)定法或SBA中所測(cè)量的那樣)，且優(yōu)選高于由抗原單獨(dú)引發(fā)的加成反應(yīng)，更優(yōu)選高于由至少1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9個(gè)因子，最優(yōu)選由至少10個(gè)因子引發(fā)的加成反應(yīng)。
本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)在于免疫原性組合物中來(lái)源于不同蛋白家族的本發(fā)明抗原組合可抗更大范圍的菌株。
本發(fā)明涉及包括很多(兩種或多種)蛋白的免疫原性組合物，所述蛋白選自至少兩個(gè)不同種類的蛋白，它們?cè)谀紊锨蚓芯哂胁煌墓δ堋＿@種蛋白種類的例子是粘附素、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、毒素、整合外膜蛋白和Fe獲得蛋白。本發(fā)明的疫苗組合在抗同源奈瑟氏球菌菌株(衍生抗原的菌株)且還優(yōu)選在抗異源奈瑟氏球菌菌株的疫苗功效方面顯示出令人吃驚的提高。
本發(fā)明提供免疫原性組合物，它包括至少或恰好兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種不同的抗原，這些抗原選自下列至少或恰好兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或全部五個(gè)選自下述種類的抗原·至少一種奈瑟氏球菌粘附素；·至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；·至少一種奈瑟氏球菌毒素；·至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白；·至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選外膜蛋白，特別是整合外膜蛋白)。
優(yōu)選，本發(fā)明提供包括至少或恰好兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種不同奈瑟氏球菌抗原的免疫原性組合物。最優(yōu)選這些抗原選自下列的至少或恰好兩組、三組、四組或五組選自下述蛋白·選自FhaB、NspA、PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB 0995、NMB 1119和NadA的至少一種奈瑟氏球菌粘附素；·選自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；·選自FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種奈瑟氏球菌毒素；·選自TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、Lipo28(GNA2132)、Sibp、NMB0964、NMB0293、FbpA、Bcp、BfrA、BfrB和P2086(XthA)的至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白；或·選自PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MltA、HpuB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA(GNA1946)、NMB1124、NMB1162、NMB1220、NMB1313、NMB1953、HtrA和PldA的至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白，優(yōu)選外膜蛋白，優(yōu)選整合外膜蛋白。
本發(fā)明的抗原都是分離的，即它們被人工改變。優(yōu)選，它們被純化至某種程度，最優(yōu)選超過(guò)40、50、60、70、80、90、95或99％純度(與本發(fā)明免疫原性組合物的其它組分組合前)。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌粘附素和至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白且任選包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌粘附素和至少一種奈瑟氏球菌毒素且任選包括奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌粘附素和至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白且任選包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌粘附素和至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)且任選包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和至少一種奈瑟氏球菌毒素且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌毒素或奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌毒素。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌毒素和至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌毒素和至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或奈瑟氏球菌毒素。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白和至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或奈瑟氏球菌毒素。優(yōu)選所述抗原選自上述抗原。
優(yōu)選在本發(fā)明的免疫原性組合物中提供全部5組抗原。
當(dāng)具體提到蛋白時(shí)，優(yōu)選是天然、全長(zhǎng)的蛋白及其天然變體(即，從奈瑟氏球菌，優(yōu)選腦膜炎球菌菌株獲得的天然蛋白)，它還可包括其抗原性片段(特別是在亞單位疫苗中)。這些是含有或包括從蛋白氨基酸序列上連續(xù)獲取的至少10個(gè)氨基酸，優(yōu)選20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選40個(gè)氨基酸或最優(yōu)選50個(gè)氨基酸的片段(此處常常具體描述的)。此外，抗原性片段是指與抗奈瑟氏球菌全長(zhǎng)蛋白產(chǎn)生的抗體或通過(guò)用奈瑟氏球菌感染哺乳動(dòng)物宿主產(chǎn)生的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)的片段?？乖云芜€包括當(dāng)以有效劑量施用時(shí)，可針對(duì)奈瑟氏球菌感染引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的片段，更優(yōu)選它可防止腦膜炎奈瑟氏球菌和/或淋病奈瑟氏球菌感染，最優(yōu)選它可防止腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B感染。
本發(fā)明還包括本發(fā)明奈瑟氏球菌蛋白的重組融合蛋白，或其片段。這些可將不同的奈瑟氏球菌蛋白或其片段組合在同一多肽中?？蛇x擇性地，本發(fā)明還包括奈瑟氏球菌蛋白或其片段的個(gè)體融合蛋白，即具有異源序列，如T-細(xì)胞表位或純化標(biāo)記的供給者，例如β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白(GFP)、附加表位如FLAG、myc標(biāo)記、聚組氨酸、或病毒表面蛋白如流感病毒血細(xì)胞凝集素、破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM197的融合蛋白。
本發(fā)明的抗原NMB參照符號(hào)是指可從www.neisseria.org訪問(wèn)的序列參照符號(hào)。
1.粘附素粘附素包括FhaB(WO98/02547)、NadA(J.Exp.Med(2002)1951445；NMB1994)、也可稱作NhhA的Hsf(NMB0992)(WO99/31132)、Hap(NMB1985)(WO99/55873)、NspA(WO96/29412)、MafA(NMB0652)和MafB(NMB0643)(Annu Rev Cell Dev Biol.16；423-457(2000)；Nature Biotech20；914-921(2002))、Omp26(NMB0181)、NMB0315、NMB0995、NMB1119和PilC(Mol.Microbiol.1997，23；879-892)。這些是參與奈瑟氏球菌與宿主細(xì)胞表面結(jié)合的蛋白。Hsf是粘附素的其中一個(gè)例子，同時(shí)也是自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此本發(fā)明的免疫原性組合物可包括Hsf與其它自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的組合，其中Hsf發(fā)揮其粘附素的作用。這些粘附素可來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本發(fā)明還包括來(lái)源于奈瑟氏球菌的其它粘附素。
FhaB此抗原已在WO98/02547SEQ ID NO38(核苷酸3083-9025)中描述-還可參見(jiàn)NMB0497。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FhaB在誘導(dǎo)單獨(dú)的抗-粘附抗體方面特別有效，且特別是與本發(fā)明其它抗原組合時(shí)。雖然可使用全長(zhǎng)FhaB，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)特定的C-末端截短物至少令人驚訝地有效且優(yōu)選甚至在對(duì)交叉-菌株的作用方面更有效。已經(jīng)有利地顯示出這種截短物更易克隆。本發(fā)明的FhaB截短物通常與FhaB分子的N-末端三分之二，優(yōu)選位于1200-1600位置、更優(yōu)選1300-1500位置、最優(yōu)選1430-1440位置的新的C-末端相對(duì)應(yīng)。具體的實(shí)施方案在1433或1436處具有C-末端。因此，本發(fā)明的這種FhaB截短物和包括這種截短物的疫苗是本發(fā)明的獨(dú)立方面而且是本發(fā)明組合免疫原性組合物的組分。N-末端還可被截短達(dá)10、20、30、40或50個(gè)氨基酸。
2.自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常由信號(hào)序列、過(guò)客結(jié)構(gòu)域和用于附著外膜的錨定結(jié)構(gòu)域組成。自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的例子包括Hsf(WO99/31132)(NMB0992)、HMW、Hia(van Ulsen等人，Immunol.Med.Microbiol.200132；53-64)、Hap(NMB1985)(WO99/55873；van Ulsen等人，Immunol.Med.Microbiol.200132；53-64)、UspA、UspA2、NadA(NMB1994)(Comanducci等人，J.Exp.Med.2002195；1445-1454)、AspA(Infection and Immunity2002，70(8)；4447-4461；NMB1029)、Aida-1樣蛋白、SSh-2和Tsh。NadA(J.Exp.Med(2002)1951445)是自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的另一個(gè)例子，同時(shí)也是粘附素。本發(fā)明的免疫原性組合物因此包括NadA與粘附素的組合，其中NadA作為自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮作用。這些蛋白可來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本發(fā)明還包括來(lái)源于奈瑟氏球菌的其它自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
HsfHsf具有與自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共用的結(jié)構(gòu)。例如，來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的Hsf由氨基酸1-51組成的單一序列、表面外露且包括可變區(qū)(氨基酸52-106、121-124、191-210和230-234)的成熟蛋白(氨基酸52-479)氨基末端的頭區(qū)、頸區(qū)(氨基酸480-509)、疏水的α-螺旋區(qū)(氨基酸518-529)和其中4個(gè)跨膜鏈跨越外膜的錨定結(jié)構(gòu)域(氨基酸539-591)。
雖然全長(zhǎng)Hsf可用于本發(fā)明的免疫原性組合物中，但是各種Hsf截短物和缺失物也可有利地使用，這取決于疫苗的類型。
當(dāng)Hsf用于亞單位疫苗中時(shí)，優(yōu)選使用可溶性過(guò)客結(jié)構(gòu)域的一部分；例如氨基酸52-479的完全結(jié)構(gòu)域，最優(yōu)選其保守部分，例如氨基酸134-479的特別有利的序列。Hsf的優(yōu)選形式可被截短，以缺失在WO01/55182中公開(kāi)的蛋白可變區(qū)。優(yōu)選的變體可包括在WO01/55182中限定的1、2、3、4、或5個(gè)可變區(qū)的缺失。在N或C末端的任何一端或兩端，上述序列和下面描述的那些可被伸展或截短達(dá)1、3、5、7、10或15個(gè)氨基酸。
Hsf的優(yōu)選片段因此包括Hsf的整個(gè)頭區(qū)，優(yōu)選包含氨基酸52-473。Hsf的其它優(yōu)選片段包括表面外露的頭區(qū)，它包括一個(gè)或多個(gè)下列氨基酸序列52-62、76-93、116-134、147-157、157-175、199-211、230-252、252-270、284-306、328-338、362-391、408-418、430-440和469-479。
當(dāng)Hsf存在于外膜小泡制品中時(shí)，它可被表達(dá)為全長(zhǎng)蛋白或優(yōu)選被表達(dá)為由氨基酸1-51和134-591的融合體組成的有利變體(產(chǎn)生氨基酸序列134-C末端的成熟外膜蛋白)。Hsf的優(yōu)選形式可被截短，從而缺失WO01/55182中公開(kāi)的蛋白可變區(qū)。優(yōu)選的變體可包括在WO01/55182中限定的1、2、3、4、或5個(gè)可變區(qū)的缺失。優(yōu)選第一和第二個(gè)可變區(qū)缺失。優(yōu)選的變體是使氨基酸序列52-237或54-237之間的殘基缺失，更優(yōu)選使氨基酸52-133或55-133之間的殘基缺失。所述成熟蛋白可缺少信號(hào)肽。
Hap對(duì)來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌的Hap-樣蛋白進(jìn)行的計(jì)算機(jī)分析顯示出至少3個(gè)結(jié)構(gòu)域。以來(lái)源于菌株H44/76的Hap-樣序列為例，包含氨基酸1-42的結(jié)構(gòu)域1編碼自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特征性的sec依賴性信號(hào)肽，包含氨基酸43-950的結(jié)構(gòu)域2編碼很可能表面外露且易進(jìn)入免疫系統(tǒng)的過(guò)客結(jié)構(gòu)域，包含殘基951-C末端(1457)的結(jié)構(gòu)域3被預(yù)測(cè)編碼可能裝配成桶-樣結(jié)構(gòu)且被錨定在外膜中的β-鏈。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)域2可能是表面外露、良好保守的(在所有試驗(yàn)菌株中超過(guò)80％)且可作為亞單位抗原在大腸桿菌中產(chǎn)生，因此它代表了目標(biāo)疫苗候選物。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)域2和3很可能是表面外露且良好保守的(Pizza等人，(2000)，Science 2871816-1820)，因此它們代表了目標(biāo)疫苗候選物。結(jié)構(gòu)域2被稱作過(guò)客結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的免疫原性組合物可包括全長(zhǎng)Hap蛋白，優(yōu)選被摻入到OMV制品中。本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括Hap的過(guò)客結(jié)構(gòu)域，在菌株H44/76中，其由氨基酸殘基43-950組成。Hap的這一片段可特別有利地用于本發(fā)明的亞單位組合物中。在N或C末端的任何一端或兩端，Hap過(guò)客結(jié)構(gòu)域的上述序列可被伸展或截短達(dá)1、3、5、7、10、15、20、25、或30個(gè)氨基酸。
3.鐵獲得蛋白鐵獲得蛋白包括TbpA(NMB0461)(WO92/03467，US5912336，WO93/06861和EP586266)、TbpB(NMB0460)(WO93/06861和EP586266)、LbpA(NMB1540)(Med Microbiol(1999) 321117)、LbpB(NMB1541)(WO/99/09176)、HpuA(U73112.2)(Mol Microbiol.1997，23；737-749)、HpuB(NC.003116.1)(Mol Microbiol.1997，23；737-749)、也被稱作XthA的P2086(NMB 0399)(13thInternational Pathogenic Neisseria Conference 2002)、FbpA(NMB0634)、FbpB、BfrA(NMB1207)、BfrB(NMB1206)、也被稱作GNA2132的Lipo28(NMB2132)、Sibp(NMB1882)、HmbR、HemH、Bcp(NMB0750)、Iron(III)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-通透酶蛋白(Tettelin等人，Science 287；1809-1815 2000)、Iron(III)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-周質(zhì)(Tettelin等人，Science 287；1809-1815 2000)、TonB依賴性受體(NMB0964和NMB0293)(Tettelin等人，Science 287；1809-1815 2000)和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白(Tettelin等人，Science 287；1809-1815 2000)。這些蛋白可來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本發(fā)明還包括來(lái)源于奈瑟氏球菌的其它鐵獲得蛋白。
TbpATbpA與TbpB相互作用在奈瑟氏球菌外膜上形成蛋白復(fù)合體，其結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白。在結(jié)構(gòu)上，TbpA包括具有TonB箱的胞內(nèi)N-末端結(jié)構(gòu)域和活塞結(jié)構(gòu)域，該活塞結(jié)構(gòu)域?yàn)槎鄠€(gè)由短胞內(nèi)環(huán)和較長(zhǎng)的胞外環(huán)連接的跨膜β鏈。
已經(jīng)區(qū)別了TbpB的兩個(gè)家族，它們分別具有較高的分子量和較低的分子量。TbpB的高和低分子量形式與TbpA的不同家族結(jié)合，可以同源性為基礎(chǔ)區(qū)別該不同家族。盡管它們的分子量相似，但還是將它們稱作高分子量和低分子量家族，這是因?yàn)樗鼈兣cTbpB的高或低分子量形式結(jié)合(Rokbi等人，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.100；51，1993)。術(shù)語(yǔ)TbpA(高)和TbpA(低)用于表示TbpA的這兩種形式，且與TbpB相似。本發(fā)明的免疫原性組合物可包括來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、B、C、Y和W-135的TbpA和TbpB以及來(lái)源于包括淋病奈瑟氏球菌在內(nèi)的其它細(xì)菌的鐵獲得蛋白。轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白TbpA和TbpB已經(jīng)被分別稱作Tbp1和Tbp2(Cornelissen等人，Infection andImmunity 65；822，1997)。
TbpA包括若干不同的區(qū)。例如，就來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的TbpA而言，氨基末端的186個(gè)氨基酸形成內(nèi)部球狀結(jié)構(gòu)域，22個(gè)β鏈跨越膜，形成β桶結(jié)構(gòu)。這些是由短胞內(nèi)環(huán)和較大的胞外環(huán)連接的。胞外環(huán)2、3和5具有最高程度的序列變異性且環(huán)5是表面外露的。環(huán)5和4參與配體結(jié)合。
TbpA的優(yōu)選片段包括TbpA的胞外環(huán)。使用來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的TbpA序列，這些環(huán)與環(huán)1的氨基酸200-202、環(huán)2的氨基酸226-303、環(huán)3的氨基酸348-395、環(huán)4的氨基酸438-471、環(huán)5的氨基酸512-576、環(huán)6的氨基酸609-625、環(huán)7的氨基酸661-671、環(huán)8的氨基酸707-723、環(huán)9的氨基酸769-790、環(huán)10的氨基酸814-844和環(huán)11的氨基酸872-903相對(duì)應(yīng)。在序列對(duì)比后，在其它Tbp蛋白中的相應(yīng)序列也可構(gòu)成優(yōu)選片段。最優(yōu)選的片段可包括構(gòu)成Tbp的環(huán)2、環(huán)3、環(huán)4或環(huán)5的氨基酸序列。
當(dāng)本發(fā)明的免疫原性組合物包括TbpA時(shí)，它優(yōu)選同時(shí)包括TbpA(高)和TbpA(低)。
雖然優(yōu)選TbpA存在于OMV疫苗中，但它也可以是亞單位疫苗的一部分。例如，可被引入到本發(fā)明免疫原性組合物中的分離的鐵獲得蛋白也是本領(lǐng)域熟知的(WO00/25811)。它們可在細(xì)菌宿主中表達(dá)，使用洗滌劑提取(例如2％Elugent)并通過(guò)親和層析或使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)柱層析技術(shù)純化(Oakhill等人，Biochem J.2002 364；613-6)。
當(dāng)TbpA存在于OMV疫苗中時(shí)，它的表達(dá)可通過(guò)此處討論的基因技術(shù)上調(diào)，或可優(yōu)選通過(guò)親代菌株在下述鐵有限條件下生長(zhǎng)而被上調(diào)。該方法還可導(dǎo)致可變鐵-調(diào)節(jié)蛋白，特別是FrpB的上調(diào)，其可變?yōu)槊庖唢@性的且它因此可按下面所述有利地下調(diào)這種蛋白(特別是FrpB)的表達(dá)(且優(yōu)選使編碼這種蛋白的基因缺失)，以確保本發(fā)明的免疫原性組合物引發(fā)抗存在于大范圍奈瑟氏球菌菌株中的抗原的免疫反應(yīng)。它優(yōu)選具有存在于免疫原性組合物中的TbpA(高)和TbpA(低)，且優(yōu)選這是通過(guò)將來(lái)源于表達(dá)TbpA可選擇形式的兩種菌株的OMV混合獲得的。
4.毒素毒素包括FrpA(NMB0585；NMB1405)、FrpA/C(見(jiàn)下面的定義)、FrpC(NMB1415；NMB1405)(WO92/01460)、NM-ADPRT(NMB1343)(13thInternational Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani等人，p135)、VapD(NMB1753)、脂多糖(LPS；也被稱作脂低聚糖或LOS)免疫型L2和LPS免疫型L3。FrpA和FrpC所含的區(qū)在這兩個(gè)蛋白之間是保守的且所述蛋白的優(yōu)選片段是含有該保守片段的多肽，優(yōu)選含有FrpA/C序列的氨基酸227-1004。這些抗原可來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本發(fā)明還包括來(lái)源于奈瑟氏球菌的其它毒素。
在可選擇性的實(shí)施方案中，毒素可包括參與毒性調(diào)節(jié)的抗原，例如在脂多糖合成中起作用的OstA。
FrpA和FrpC
腦膜炎奈瑟氏球菌編碼兩種RTX蛋白，它們被稱作FrpA和FrpC，是在鐵有限條件下分泌的(Thompson等人，(1993)J.Bacteriol.175811-818；Thompson等人，(1993)Infect.Immun.612906-2911)。RTX(重復(fù)毒素)蛋白家族在靠近它們的C-末端處共有下列一致序列的一系列9個(gè)氨基酸重復(fù)單位Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly(Asn/Asp)Asp Xaa(LXGGXGN/DDX)。大腸桿菌HlyA中的重復(fù)單位被認(rèn)為是Ca2+結(jié)合的位點(diǎn)。正如在圖4中所描繪的，腦膜炎球菌FrpA和FrpC蛋白，正如在菌株FAM20中所表征的，在它們的中心和C-末端區(qū)共有廣泛的氨基酸相似性但在N-末端的相似性(如果有的話)非常有限。此外，由于9個(gè)氨基酸基序的重復(fù)(在FrpA中重復(fù)13次、在FrpC中重復(fù)43次)，在FrpA和FrpC之間保守的區(qū)顯示出某些多態(tài)性。
本發(fā)明的免疫原性組合物可包括全長(zhǎng)FrpA和/或FrpC或優(yōu)選，含有在FrpA和FrpC之間保守的序列的片段。所述保守序列是由9個(gè)氨基酸的重復(fù)單位構(gòu)成的。本發(fā)明的免疫原性組合物優(yōu)選包括多于3個(gè)重復(fù)單位、多于10個(gè)重復(fù)單位、多于13個(gè)重復(fù)單位、多于20個(gè)重復(fù)單位或多于23個(gè)重復(fù)單位。
這種截短物具有較之全長(zhǎng)分子更有利的性質(zhì)且包含這種抗原并被摻入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的疫苗形成本發(fā)明的獨(dú)立方面。
在FrpA和FrpC之間保守的序列被命名為FrpA/C，且當(dāng)FrpA或FrpC形成本發(fā)明免疫原性組合物的組分時(shí)，可有利地使用FrpA/C。FrpA序列的氨基酸277-1004是優(yōu)選的保守區(qū)。在N或C末端的任何一端或兩端，上述序列可被伸展或截短達(dá)1、3、5、7、10、15、20、25、或30個(gè)氨基酸。
LPSLPS(脂多糖，也被稱作LOS-脂低聚糖)是奈瑟氏球菌外膜上的內(nèi)毒素。已知LPS的多糖部分可誘導(dǎo)殺菌抗體。
LPS低聚糖部分內(nèi)的異質(zhì)性在不同的奈瑟氏球菌菌株之間產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和抗原多樣性(Griffiss等人，Inf.Immun.1987；551792-1800)。這已被用于將腦膜炎球菌菌株細(xì)分成12個(gè)免疫型(Scholtan等人，J Med Microbiol 1994，41236-243)。免疫型L3、L7和L9在免疫學(xué)方面是相同的且在結(jié)構(gòu)上是相似的(或甚至是相同的)并因此已被命名為L(zhǎng)3、7、9(或，為了本說(shuō)明書(shū)的目的，統(tǒng)稱為“L3”)。腦膜炎球菌LPS L3、7、9(L3)、L2和L5可通過(guò)唾液酸化，或通過(guò)加入胞苷5′-一磷酸-N-乙?；窠?jīng)氨酸而被修飾。雖然L2、L4和L6 LPS在免疫學(xué)方面是可區(qū)別的，但它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上相似，且在此處提到L2時(shí)，L4或L6在本發(fā)明的范圍內(nèi)可被任選替代。見(jiàn)M.P.Jennings等人，Microbiology 1999，145，3013-3021和Mol Microbiol 2002，43931-43，其中進(jìn)一步舉例說(shuō)明了LPS的結(jié)構(gòu)和異質(zhì)性。
當(dāng)LPS，優(yōu)選腦膜炎球菌LPS包括在本發(fā)明的疫苗中時(shí)，優(yōu)選且有利地存在免疫型L2和L3之一或兩者。LPS優(yōu)選存在于外膜小泡中(優(yōu)選用低百分比的洗滌劑，更優(yōu)選0-0.5％、0.02-0.4％、0.04-0.3％、0.06-0.2％、0.08-0.15％或0.1％，最優(yōu)選脫氧膽酸鹽[DOC]提取小泡時(shí))，還可以是亞單位疫苗的一部分。LPS可使用熟知的過(guò)程，包括熱水-苯酚過(guò)程分離(Wesphal和Jann Meth.Carbo.Chem.5；83-911965)。還可見(jiàn)Galanos等人，Eur J Biochem 9245-249，和Wu等人，1987，Anal Bio Chem 160281-289。LPS可簡(jiǎn)單使用或與T-細(xì)胞表位的來(lái)源，如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM-197或OMV外膜蛋白綴合使用。使分離的LOS綴合的技術(shù)也是已知的(見(jiàn)，例如，EP941738，其引入此處作為參考)。
當(dāng)LOS(特別是本發(fā)明的LOS)存在于泡制劑中時(shí)，優(yōu)選通過(guò)使LOS與也存在于泡制劑上的一種或多種外膜蛋白(例如，腦膜炎球菌中的PorA或PorB)綴合的方法使LOS原位綴合。
該方法可有利地提高泡制劑內(nèi)LOS抗原的穩(wěn)定性和/或免疫原性(提供T-細(xì)胞幫助)和/或抗原性-因此以其保護(hù)性最強(qiáng)的構(gòu)象為非T-依賴性低聚糖免疫原提供T-細(xì)胞幫助-如在其天然環(huán)境中的、腦膜炎球菌外膜表面上的LOS。此外，LOS在泡內(nèi)的綴合可導(dǎo)致LOS解毒(脂類A部分被穩(wěn)定埋藏在外膜中，因此很少引起毒性)。因此，這里提到的從htrB-或msbB-突變體中分離泡，或通過(guò)向組合物中加入多粘菌素B的無(wú)毒肽功能性等價(jià)物的解毒方法(見(jiàn)WO93/14115、WO95/03327、Velucchi等人，(1997)J Endotoxin Res 41-12，和EP976402，多粘菌素B的無(wú)毒肽功能性等價(jià)物的進(jìn)一步描述-特別是(序列KTKCKFLKKC，其中2個(gè)半胱氨酸形成二硫鍵)肽SAEP2的使用)可能并不是必需的(但其可被加入到組合中用于增加安全性)。因此，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括泡的組合物可形成用于治療或預(yù)防由衍生泡的生物所引起疾病的疫苗基礎(chǔ)，其中存在于泡中的LOS已以泡內(nèi)模式與同時(shí)存在于泡中的外膜蛋白綴合，其中這種疫苗基本上是無(wú)毒的且能夠誘導(dǎo)抗其天然環(huán)境中的LOS的T-依賴性殺菌反應(yīng)。
本發(fā)明因此進(jìn)一步提供這種泡內(nèi)LOS綴合的腦膜炎球菌泡制品。
這種泡制品是否可從正極討論的細(xì)菌(見(jiàn)WO01/09350)中被分離出來(lái)，然后經(jīng)過(guò)已知的綴合化學(xué)過(guò)程使LOS低聚糖部分上的基團(tuán)(例如，NH2或COOH)與泡外膜蛋白上的基團(tuán)(例如，NH2或COOH)綴合還在討論?？墒褂美梦於?、甲醛、或戊二醛/甲醛混合物的交聯(lián)技術(shù)，但優(yōu)選使用選擇性更強(qiáng)的化學(xué)過(guò)程如EDAC或EDAC/NHS(J.V.Staros，R.W.Wright和D.M.Swingle.Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediatedcoupling reactions.Analytical chemistry 156220-222(1986)；和Bioconjugates Techniques.Greg T.Hermanson(1996)pp173-176)?？墒褂玫?、能夠在LOS與蛋白分子之間生成共價(jià)鍵的其它綴合化學(xué)過(guò)程或處理在EP941738中描述。
優(yōu)選泡制品在沒(méi)有莢膜多糖存在的條件下綴合。所述泡可從不(按照下面所述天然地或經(jīng)由突變)產(chǎn)生莢膜多糖的菌株中分離，或可從絕大多數(shù)且優(yōu)選全部污染莢膜多糖中純化。以這種方式，泡內(nèi)LOS綴合反應(yīng)更加有效。
優(yōu)選存在于泡中的超過(guò)10、20、30、40、50、60、70、80、90、或95％的LOS是交聯(lián)的/綴合的。
泡內(nèi)綴合應(yīng)優(yōu)選整合下列方法的1、2或全部3個(gè)步驟綴合pH應(yīng)大于pH7.0，優(yōu)選大于或等于pH7.5(最優(yōu)選在pH9下)；在反應(yīng)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)維持1-5％、優(yōu)選2-4％、最優(yōu)選約3％蔗糖的條件；在綴合反應(yīng)中應(yīng)當(dāng)將NaCl降到最低，優(yōu)選0.1M、0.05M、0.01M、0.005M、0.001M、且最優(yōu)選根本不存在。所有這些方法特征可確保在整個(gè)綴合過(guò)程中泡均保持穩(wěn)定且保持在溶液中。
EDAC/NHS綴合方法是泡內(nèi)綴合的優(yōu)選方法。EDAC/NHS優(yōu)于甲醛，甲醛可交聯(lián)至非常高的程度，由此不利地影響濾過(guò)率。EDAC與羧酸(如LOS中的KDO)反應(yīng)，產(chǎn)生活性酯中間體。在有胺親核試劑(如外膜蛋白，如PorB中的賴氨酸)存在的條件下，酰胺鍵是用異脲副產(chǎn)物的釋放形成的。然而，EDAC-介導(dǎo)的反應(yīng)的效能可通過(guò)Sulfo-NHS酯中間體的形成而增加。Sulfo-NHS酯在水溶液中存在的時(shí)間比EDAC單獨(dú)與羧酸鹽反應(yīng)形成的活性酯要長(zhǎng)。因此，更高產(chǎn)率酰胺鍵的形成可使用這種兩階段方法實(shí)現(xiàn)。EDAC/NHS綴合在J.V.Staros，R.W.Wright和D.M.Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide ofwater-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions.Analytical chemistry 156220-222(1986)；和BioconjugatesTechniques.Greg T.Hermanson(1996)pp 173-176中討論。優(yōu)選在反應(yīng)中使用0.01-5mg EDAC/mg泡、更優(yōu)選0.05-1mg EDAC/mg泡。所用EDAC的量取決于存在于樣品中的LOS量，而其又依次取決于用于提取泡的脫氧膽酸鹽(DOC)％。在低％DOC(例如，0.1％)下，使用較大用量的EDAC(1mg/mg及以上)，然而在高％DOC(例如0.5％)下，使用較小用量的EDAC(0.025-0.1mg/mg)以避免太多泡間交聯(lián)。
因此本發(fā)明的方法優(yōu)選是用于產(chǎn)生泡內(nèi)綴合LOS(優(yōu)選腦膜炎球菌)的方法，該方法包括在有EDAC/NHS存在、pH7.0-pH9.0(優(yōu)選約pH7.5)、1-5％(優(yōu)選約3％)蔗糖、且任選在基本上沒(méi)有NaCl(如上所述)的條件下使泡綴合，并分離反應(yīng)混合物中綴合泡的步驟。
所述反應(yīng)隨后使用抗-LOS(例如，抗-L2或抗-L3)mAb在反應(yīng)混合物的蛋白質(zhì)分離凝膠上進(jìn)行，其顯示隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，泡中LOS的比例增大，LOS的分子量增加。
使用這種技術(shù)可回收的泡產(chǎn)率99％。
人們發(fā)現(xiàn)EDAC是一種極好的泡內(nèi)交聯(lián)劑，這是因?yàn)樗墒筁OS與OMP充分交聯(lián)，用于提高LOS T-依賴性免疫原性，但不會(huì)使它交聯(lián)至非常高的程度而導(dǎo)致如濾過(guò)率較差、聚集和泡間交聯(lián)的問(wèn)題發(fā)生。所產(chǎn)生的泡的形態(tài)學(xué)與未綴合的泡相似(利用電子顯微鏡)。此外，上述方案可避免發(fā)生過(guò)度交聯(lián)(其可降低天然存在于泡表面上的保護(hù)性O(shè)MP，例如TbpA或Hsf的免疫原性)。
優(yōu)選衍生泡的腦膜炎球菌是不能產(chǎn)生莢膜多糖的突變株(例如，下述突變株的其中一種，特別是siaD-)。還優(yōu)選可有效抗腦膜炎球菌病的免疫原性組合物同時(shí)包含L2和L3泡，其中L2和L3 LOS均與泡外膜蛋白綴合。此外，優(yōu)選泡內(nèi)綴合泡中的LOS結(jié)構(gòu)與從lgtB-腦膜炎球菌菌株衍生的一致(如下所述)。最優(yōu)選免疫原性組合物包括泡內(nèi)綴合的泡來(lái)源于不能產(chǎn)生莢膜多糖且是lgtB-的突變腦膜炎球菌菌株；包含來(lái)源于不能產(chǎn)生莢膜多糖的突變腦膜炎球菌菌株的L2和L3泡；包含來(lái)源于lgtB-突變腦膜炎球菌菌株的L2和L3泡；或最優(yōu)選包含來(lái)源于不能產(chǎn)生莢膜多糖且是lgtB-的突變腦膜炎球菌菌株的L2和L3泡。
可用于本發(fā)明的一般L3腦膜炎球菌菌株是H44/76menB菌株。一般的L2菌株是B16B6 menB菌株或39E腦膜炎球菌C型菌株。
如上所述，本發(fā)明的泡已通過(guò)綴合作用被解毒至一定程度，且無(wú)需進(jìn)一步解毒，然而進(jìn)一步的解毒方法可用于增加安全性，例如，使用來(lái)源于htrB-或msbB-腦膜炎球菌菌株的泡或向泡組合物中加入多粘菌素B的無(wú)毒肽功能性等價(jià)物[與脂類A具有較高親和性的分子](優(yōu)選SEAP2)(如上所述)。
在上述方法中，提供腦膜炎球菌泡及含有泡的免疫原性組合物，其具有重要的抗原LOS，該抗原基本上無(wú)毒，沒(méi)有自身免疫性問(wèn)題，具有T-依賴性特征，存在于其天然環(huán)境中，且能夠誘導(dǎo)抗超過(guò)90％腦膜炎球菌菌株的殺菌抗體反應(yīng)(在L2+L3組合物的情況下)。
優(yōu)選泡內(nèi)LOS綴合應(yīng)整合下列方法的1、2、或全部3個(gè)步驟綴合pH應(yīng)大于pH7.0，優(yōu)選大于或等于pH7.5(最優(yōu)選在pH9下)；在反應(yīng)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)維持1-5％、優(yōu)選2-4％、最優(yōu)選約3％蔗糖的條件；在綴合反應(yīng)中應(yīng)當(dāng)將NaCl降到最低，優(yōu)選0.1M、0.05M、0.01M、0.005M、0.001M、且最優(yōu)選根本不存在。所有這些方法特征可確保在整個(gè)綴合過(guò)程中泡保持穩(wěn)定且保持于溶液中。
雖然可通過(guò)各種技術(shù)和化學(xué)過(guò)程使LOS與外膜蛋白在泡內(nèi)綴合，但EDAC/NHS綴合方法是泡內(nèi)綴合的優(yōu)選方法。EDAC/NHS優(yōu)于甲醛，甲醛可交聯(lián)至非常高的程度，由此對(duì)濾過(guò)率有不利的影響。EDAC與羧酸反應(yīng)，產(chǎn)生活性酯中間體。在有胺親核試劑存在的條件下，酰胺鍵是用異脲副產(chǎn)物的釋放形成的。然而，EDAC-介導(dǎo)的反應(yīng)的效能可通過(guò)Sulfo-NHS酯中間體的形成而增加。Sulfo-NHS酯在水溶液中存在的時(shí)間比EDAC單獨(dú)與羧酸鹽反應(yīng)形成的活性酯要長(zhǎng)。因此，更高產(chǎn)率酰胺鍵的形成可使用這種兩階段方法實(shí)現(xiàn)。EDAC/NHS綴合在J.V.Staros，R.W.Wright和D.M.Swingle.Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediatedcoupling reactions.Analytical chemistry 156220-222(1986)；和Bioconjugates Techniques.Greg T.Hermanson(1996)pp173-176中討論。
因此本發(fā)明的方法優(yōu)選是用于產(chǎn)生泡內(nèi)綴合LOS(優(yōu)選腦膜炎球菌)的方法，該方法包括在有EDAC/NHS存在、pH7.0-pH9.0(優(yōu)選約pH7.5)的pH、1-5％(優(yōu)選約3％)蔗糖、且任選基本上沒(méi)有NaCl(如上所述)的條件下使泡綴合，以及從反應(yīng)混合物中分離綴合泡的步驟。
所述反應(yīng)隨后使用抗-LOS(例如，抗-L2或抗-L3)mAb在反應(yīng)混合物的分離凝膠上進(jìn)行，其顯示隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，泡中LOS的比例增大，LOS的分子量增加。
使用這種技術(shù)可回收的泡產(chǎn)率99％。
人們發(fā)現(xiàn)EDAC是一種極好的泡內(nèi)交聯(lián)劑，這是因?yàn)樗墒筁OS與OMP充分交聯(lián)，用于提高LOS T-依賴性免疫原性，但不會(huì)使它交聯(lián)至非常高的程度而導(dǎo)致如濾過(guò)率較差和泡間交聯(lián)的問(wèn)題發(fā)生。此外，應(yīng)當(dāng)避免過(guò)度交聯(lián)，從而避免天然存在于泡表面上的保護(hù)性O(shè)MP，例如Tbp免疫原性的任何降低。
5.整合外膜蛋白奈瑟氏球菌蛋白的其它種類也可以是包括在本發(fā)明奈瑟氏球菌疫苗中的候選物，且能夠以令人吃驚的有效方式與其它抗原組合。膜相關(guān)蛋白、特別是整合膜蛋白且最有利地是外膜蛋白，特別是整合外膜蛋白可用于本發(fā)明的組合物中。這種蛋白的例子是也被稱作OmplA的PldA(NMB 0464)(WO00/15801)，其是奈瑟氏球菌磷脂酶外膜蛋白。其它例子是TspA(NMB0341)(Infect.Immun.1999，67；3533-3541)和TspB(T-細(xì)胞刺激蛋白)(WO00/03003；NMB1548、NMB1628或NMB1747)。其它例子包括PilQ(NMB1812)(WO99/61620)、也被稱作D15-的OMP85(NMB0182)(WO00/23593)、NspA(U52066)(WO96/29412)、FhaC(NMB0496或NMB1780)、PorB(NMB2039)(Mol.Biol.Evol.12363-370，1995)、HpuB(NC.003116.1)、TdfH(NMB1497)(Microbiology 2001，147；1277-1290)、OstA(NMB0280)、也被稱作GNA33和Lipo30的MltA(NMB0033)、HtrA(NMB0532；WO99/55872)、HimD(NMB1302)、HisD(NMB1581)、GNA1870(NMB1870)、HlpA(NMB1946)、NMB1124、NMB1162、NMB1220、NMB1313、NMB1953、HtrA、TbpA(NMB0461)(WO92/03467)(還可見(jiàn)上面的鐵獲得蛋白)和LbpA(NMB1541)。
OMP85本發(fā)明的免疫原性組合物可包括全長(zhǎng)OMP85，優(yōu)選作為OMV制品的一部分。OMP85的片段也可用于本發(fā)明的免疫原性組合物中，特別是，優(yōu)選將由氨基酸殘基1-475或50-475組成的OMP85表面外露結(jié)構(gòu)域摻入到本發(fā)明免疫原性組合物的亞單位組分中。在N或C末端的任何一端或兩端，OMP85的表面外露結(jié)構(gòu)域的上述序列可被伸展或截短達(dá)1、3、5、7、10、15、20、25、或30個(gè)氨基酸。優(yōu)選刪除OMP85片段的信號(hào)序列。
OstAOstA可在脂多糖的合成中發(fā)揮作用且可被認(rèn)為是毒性調(diào)節(jié)劑。OstA可選擇性地包括在毒素類中，其中毒素種類被擴(kuò)大至包括毒性調(diào)節(jié)劑以及毒素。
免疫原性組合物免疫原性組合物是包括至少一種抗原的組合物，當(dāng)給予宿主時(shí)，所述抗原能夠產(chǎn)生免疫反應(yīng)。優(yōu)選，這種免疫原性制品能夠產(chǎn)生抗奈瑟氏球菌，優(yōu)選抗腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
本發(fā)明涉及包括至少兩種抗原的免疫原性組合物，其優(yōu)選可引發(fā)協(xié)同殺菌、保護(hù)性或粘附阻斷反應(yīng)的一種或多種。
本發(fā)明的SBA殺菌測(cè)定法這種協(xié)同反應(yīng)可通過(guò)由抗原組合引發(fā)的SBA來(lái)表征，抗原組合引發(fā)的SBA較之由每個(gè)抗原單獨(dú)引發(fā)的SBA要高至少50％、2倍、3倍、優(yōu)選4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍且最優(yōu)選10倍。優(yōu)選SBA是相對(duì)于衍生抗原的同源性菌株測(cè)量的，且優(yōu)選是相對(duì)于一組異源性菌株測(cè)量的。(見(jiàn)下面代表性小組，例如屬于A-4聚簇的BZ10(B:2b:P1.2)；屬于ET-37復(fù)合體的B16B6(B:2a:P1.2)；和H44/76(B:15:P1.7，16))。SBA是最普遍認(rèn)可的免疫學(xué)標(biāo)記，可評(píng)價(jià)腦膜炎球菌疫苗的功效(Perkins等人，J Infect Dis.1998，177683-691)。令人滿意的SBA可通過(guò)任何已知方法測(cè)定。SBA可利用從動(dòng)物模型或人類受試者獲得的血清進(jìn)行(見(jiàn)實(shí)施例17-20)。
用人血清進(jìn)行SBA的優(yōu)選方法如下。在第一次接種前、第二次接種后2個(gè)月和第三次接種后1個(gè)月(1年中進(jìn)行3次接種是一般的人類初次接種程序，例如在第0、2和4個(gè)月或第0、1、或6個(gè)月時(shí)給予)采集血液樣品。這種人類初次接種程序可對(duì)1歲以下的嬰兒進(jìn)行(例如，與Hib接種同時(shí)進(jìn)行)，或也可給2-4歲的兒童或青少年接種以測(cè)試這種初次接種程序的SBA。如果適合，可在初次接種后6-12個(gè)月以及激發(fā)劑量后1個(gè)月再次采集血液樣品。
如果在(初次接種程序的)第三支疫苗給藥后一個(gè)月(在2-4歲兒童或青少年中，但優(yōu)選在生命第一年的嬰兒中)，抗衍生本發(fā)明抗原的腦膜炎球菌菌株的SBA(抗體稀釋度)效價(jià)(與接種前效價(jià)相比)增加4倍的受試者百分比超過(guò)30％、優(yōu)選超過(guò)40％、更優(yōu)選超過(guò)50％、最優(yōu)選超過(guò)60％受試者，那么對(duì)于具有同源殺菌活性的抗原或泡制品而言，SBA是令人滿意的。
當(dāng)然，如果它也可相對(duì)于衍生它的腦膜炎球菌菌株引發(fā)令人滿意的SBA的話，則具有異源殺菌活性的抗原或泡制品也可構(gòu)成具有同源殺菌活性的泡制品。
如果在(初次接種程序的)第三支疫苗給藥后一個(gè)月(在2-4歲兒童或青少年中，但優(yōu)選在生命第一年的嬰兒中)，抗腦膜炎球菌3種異源菌株的SBA(抗體稀釋度)效價(jià)(與接種前效價(jià)相比)增加4倍的受試者百分比超過(guò)20％、優(yōu)選超過(guò)30％、更優(yōu)選超過(guò)35％、最優(yōu)選超過(guò)40％受試者，那么對(duì)于具有異源殺菌活性的抗原或泡制品而言，SBA是令人滿意的。這種試驗(yàn)是具有異源殺菌活性的抗原或泡制品是否可誘導(dǎo)抗各種腦膜炎球菌菌株的交叉殺菌抗體的良好表征。所述三種異源菌株應(yīng)當(dāng)優(yōu)選具有彼此不同且優(yōu)選與制備或衍生具有異源殺菌活性的抗原或泡制品的菌株不同的電泳型(ET)-復(fù)合體或多基因座序列分型(MLST)模式(見(jiàn)Maiden等人，PNAS USA 1998，953140-5)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠很容易地測(cè)定具有不同ET-復(fù)合體的三種菌株，其可反映在腦膜炎球菌之間，特別是腦膜炎球菌B型菌株之間觀察到的基因多樣性，這些菌株被認(rèn)為是重要疾病負(fù)擔(dān)的原因和/或代表認(rèn)可的MenB劇毒譜系(見(jiàn)Maiden等人，見(jiàn)上)。例如，可使用的三種菌株是下列屬于A-4聚簇的BZ10(B:2b:P1.2)；屬于ET-37復(fù)合體的B16B6(B:2a:P1.2)；和屬于ET-5復(fù)合體的H44/76(B:15:P1.7，16)，或?qū)儆谕籈T/聚簇的任何其它菌株。這種菌株可用于測(cè)試從例如屬于ET-S復(fù)合體的腦膜炎球菌菌株CU385(B:4:P1.15)制備或衍生的、具有異源殺菌活性的抗原或泡制品?？墒褂玫钠渌鼧悠肪陙?lái)源于譜系3流行性克隆(例如，NZ124[B:4:P1.7，4])。另一ET-37菌株是NGP165(B:2a:P1.2)。
測(cè)量SBA活性的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可使用的方法在WO99/09176的實(shí)施例10C中描述。在一般情況中，所試驗(yàn)的菌株培養(yǎng)物是在生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期(優(yōu)選在鐵缺失的條件中-通過(guò)向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入鐵螯合劑如EDDA)生長(zhǎng)的。可將其懸浮在具有BSA的培養(yǎng)基(如具有0.3％BSA的Hanks培養(yǎng)基)中，以便獲得調(diào)至約20000CFU/ml的試驗(yàn)細(xì)胞懸浮液。一系列反應(yīng)混合物可通過(guò)將一系列2倍稀釋的試驗(yàn)血清(優(yōu)選在56℃熱滅活30分鐘)[例如，50μl/孔體積]和20000CFU/ml試驗(yàn)的腦膜炎球菌菌株懸浮液(例如，25μl/孔體積)混合而制備。應(yīng)培養(yǎng)(例如，37℃15分鐘)并振搖(例如，210rpm)反應(yīng)小瓶。此外，終反應(yīng)混合物[例如，100μl體積]還可包含補(bǔ)體源[如，25％終體積的預(yù)試幼兔血清]，并按照上面所述培養(yǎng)[例如，37℃60分]。無(wú)菌的聚苯乙烯U-底96-孔微量滴定平板可用于該測(cè)定法?？墒褂枚嗟酪埔浩鲝拿總€(gè)孔中采集等分試樣[例如，10μl]，滴在Mueller-Hinton瓊脂平板(優(yōu)選含有1％Isovitalex和1％熱滅活的馬血清)上并培養(yǎng)(例如，在37℃、5％CO2中培養(yǎng)18小時(shí))。優(yōu)選，單獨(dú)的菌落高達(dá)80CFU/等分試樣。將下列三種試驗(yàn)樣品用作對(duì)照緩沖液+細(xì)菌+補(bǔ)體；緩沖液+細(xì)菌+滅活補(bǔ)體；血清+細(xì)菌+滅活補(bǔ)體。SBA效價(jià)可使用程序直接計(jì)算，該程序可對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行加工從而得到稀釋度的測(cè)量值，該測(cè)量值與通過(guò)回歸計(jì)算得到的50％細(xì)胞死亡相對(duì)應(yīng)。
動(dòng)物保護(hù)測(cè)定法可選擇性地，協(xié)同反應(yīng)可通過(guò)抗原組合在動(dòng)物保護(hù)測(cè)定法中的功效而表征。例如，可使用實(shí)施例12或13中描述的測(cè)定法。優(yōu)選，與單獨(dú)使用抗原，特別是抗原的次優(yōu)劑量相比，通過(guò)抗原組合而得到保護(hù)的動(dòng)物數(shù)量明顯增加。
用于防止淋病奈瑟氏球菌感染的成功疫苗可能需要不止一個(gè)下列要素血清和/或粘膜抗體的產(chǎn)生以促進(jìn)補(bǔ)體介導(dǎo)的淋球菌死亡，和/或通過(guò)白細(xì)胞如多形核白細(xì)胞提高吞噬作用并殺死微生物，和/或防止淋球菌附著于宿主組織；誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，它們也可參與保護(hù)。
本發(fā)明泡淋病疫苗制品功效的提高可通過(guò)分析誘導(dǎo)的血清和/或粘膜抗體免疫反應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)，它們具有抗粘附和/或調(diào)理性和/或殺菌活性，如其他人所述(McChesney D等人，Infect.Immun.361006，1982；Boslego J等人Efficacy trial of a purified gonococclpilus vaccine，in Program and Abstracts of the 24thInterscience Conference on Antimicrobial Agents andChemotherapy，Washington，American Society for Microbiology，1984；Siegel M等人，J.Infect.Dis145300，1982；de la Pas，Microbiology，141(Pt4)913-20，1995)。
近來(lái)描述了由淋病奈瑟氏球菌所致的生殖器感染小鼠模型(Plante M，J.Infect.Dis.，182848-55，2000)。本發(fā)明泡淋病疫苗功效的提高還可通過(guò)其防止或降低淋病奈瑟氏球菌在這種小鼠感染模型中定居的能力而評(píng)價(jià)。
粘附阻斷測(cè)定法可選擇性地，協(xié)同反應(yīng)可通過(guò)抗原組合在粘附阻斷測(cè)定法中的功效而表征。例如，可使用實(shí)施例11中描述的測(cè)定法。優(yōu)選與使用抗單獨(dú)抗原產(chǎn)生的抗血清，特別是次優(yōu)劑量的抗體相比，由抗抗原組合產(chǎn)生的抗血清誘導(dǎo)的阻斷程度顯著提高。
亞單位組合物本發(fā)明的免疫原性組合物可以是一種亞單位組合物。亞單位組合物是在將組分混合形成抗原性組合物之前，其中組分已經(jīng)被分離并純化到至少50％、優(yōu)選至少60％、70％、80％、90％純度的組合物。
本發(fā)明的免疫原性亞單位組合物優(yōu)選包括選自下列的至少2種抗原FhaB、PilC、Hsf、Hap、NadA、OMP85、IgA蛋白酶、AspA、AspA的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、Hsf的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、Hap的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、FrpA、FrpC、TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、TspA、TspB、PldA、PilQ、FhaC、NspA、和LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
亞單位組合物可以是水溶性蛋白的水溶液。它們可包含洗滌劑、優(yōu)選非-離子、兩性離子或離子洗滌劑，以便使抗原的疏水部分溶解。它們可包含脂類，這樣就可形成脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，使抗原以跨越脂膜的結(jié)構(gòu)呈遞。
外膜泡制品腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B(menB)分泌足量的外膜泡從而使得能夠以工業(yè)規(guī)模制造它們。外膜泡還可經(jīng)由用洗滌劑提取細(xì)菌細(xì)胞的方法制備(見(jiàn)例如，EP11243)。
本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括具有至少兩種抗原的外膜小泡制品，所述抗原已被上調(diào)，或者被重組上調(diào)或通過(guò)其它方式被上調(diào)，包括在鐵-缺失條件下生長(zhǎng)。在這種外膜小泡制品中被上調(diào)的抗原的例子包括NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、AspA、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、MafA、MafB和PldA。這種制品還可任選包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
來(lái)源于奈瑟氏球菌菌株的泡制品的制備可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法獲得。優(yōu)選使用在EP301992、US5,597,572、EP11243或US4,271,147、Frederikson等人(NIPH Annals ，1467-80)、Zollinger等人，(J.Clin.Invest. ，63836-848)、Saunders等人，(Infect.Immun. ，67113-119)、Drabick等人(Vaccine ，18160-172)或WO01/09350(實(shí)施例8)中公開(kāi)的方法。通常，使用洗滌劑，優(yōu)選脫氧膽酸鹽提取OMV，且核酸被任選酶促除去。純化是通過(guò)超速離心后，任選接著進(jìn)行大小排阻層析實(shí)現(xiàn)的。如果包括本發(fā)明2種或多種不同的泡，則它們可在單一容器中組合形成本發(fā)明的多價(jià)制品(雖然制品也被認(rèn)為是多價(jià)的，如果本發(fā)明的不同泡是處于單獨(dú)容器中的單獨(dú)組合物，但它們是在同一時(shí)間[由同一醫(yī)師]給予宿主的]。OMV制品通常是通過(guò)0.2μm濾器過(guò)濾而滅菌的，且優(yōu)選貯存在蔗糖溶液(例如3％)中，該蔗糖溶液已知可使泡制品溶解。
蛋白在外膜小泡制品內(nèi)的上調(diào)可通過(guò)將基因的附加拷貝插入到衍生OMV制品的奈瑟氏球菌菌株中而獲得?？蛇x擇性地，可將衍生OMV制品的奈瑟氏球菌菌株中的基因啟動(dòng)子交換成較強(qiáng)的啟動(dòng)子。這種技術(shù)在WO01/09350中描述。與從未修飾的腦膜炎奈瑟氏球菌(例如菌株H44/76)衍生的OMV中存在的蛋白水平相比，蛋白的上調(diào)將導(dǎo)致OMV中存在的蛋白水平更高。優(yōu)選所述水平要高1.5、2、3、4、5、7、10或20倍。
當(dāng)LPS是OMV中的附加抗原時(shí)，使用低濃度提取洗滌劑(例如，脫氧膽酸鹽或DOC)的方案可優(yōu)選用于OMV制備方法中，以便保持高水平的結(jié)合LPS而特別除去有毒的結(jié)合較差的LPS。所用DOC的濃度優(yōu)選0-0.5％DOC、0.02-0.4％DOC、0.04-0.3％DOC，更優(yōu)選0.06％-0.2％DOC或0.08-0.15％DOC，最優(yōu)選約或準(zhǔn)確的0.1％DOC。
“強(qiáng)的啟動(dòng)子序列”是指增加編碼目標(biāo)抗原的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)控制元件。
“上調(diào)表達(dá)”是指相對(duì)于未修飾(即天然存在的)泡而言，可提高目標(biāo)抗原表達(dá)的任何方式。應(yīng)當(dāng)了解‘上調(diào)’的量取決于特定的目標(biāo)抗原，但不會(huì)超出破壞泡的膜完整性的量?？乖纳险{(diào)是指較之未修飾的泡高至少10％的表達(dá)。優(yōu)選高至少50％。更優(yōu)選高至少100％(2倍)。最優(yōu)選高3、4、5、7、10、20倍?？蛇x擇性地或附加地，上調(diào)表達(dá)是指就代謝或營(yíng)養(yǎng)變化而言表達(dá)是非-條件性的，特別是在TbpA、TbpB、LbpA和LbpB的情況下。優(yōu)選當(dāng)從在鐵有限條件中生長(zhǎng)的細(xì)菌中衍生泡時(shí)，評(píng)價(jià)表達(dá)水平(例如在有鐵螯合劑存在的條件下)。
又為了清楚的目的，術(shù)語(yǔ)‘將細(xì)菌菌株進(jìn)行改造以產(chǎn)生較少所述抗原’或下調(diào)是指相對(duì)于未修飾的(即天然存在的泡)而言，優(yōu)選通過(guò)缺失使目標(biāo)抗原表達(dá)(或功能性基因產(chǎn)物的表達(dá))降低的任何方式，這樣表達(dá)較之未修飾的泡要低至少10％。優(yōu)選低至少50％且最優(yōu)選完全缺乏。如果下調(diào)蛋白是酶或功能性蛋白，則下調(diào)可通過(guò)引入一次或多次突變而獲得，導(dǎo)致酶或功能活性降低10％、20％、50％、80％或優(yōu)選100％。
調(diào)節(jié)奈瑟氏球菌蛋白表達(dá)所需的改造步驟可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方式進(jìn)行。例如，可插入序列(例如，啟動(dòng)子或開(kāi)放閱讀框)，并通過(guò)轉(zhuǎn)座子插入技術(shù)破壞啟動(dòng)子/基因。例如，上調(diào)基因的表達(dá)時(shí)，可經(jīng)由轉(zhuǎn)座子將強(qiáng)啟動(dòng)子插入到基因起始密碼子的直到2kb上游(更優(yōu)選200-600bp上游，最優(yōu)選約400bp上游)。還可利用點(diǎn)突變或缺失(特別是對(duì)基因的下調(diào)表達(dá)而言)。
然而，這種方法可能相當(dāng)不穩(wěn)定或不確定，且因此優(yōu)選改造步驟是經(jīng)由同源重組事件進(jìn)行。優(yōu)選，該事件發(fā)生在細(xì)菌染色體上至少30個(gè)核苷酸的序列(誘重組區(qū))和在菌株內(nèi)轉(zhuǎn)化的載體上至少30個(gè)核苷酸的序列(第二誘重組區(qū))之間。優(yōu)選該區(qū)是40-1000個(gè)核苷酸，更優(yōu)選100-800個(gè)核苷酸，最優(yōu)選500個(gè)核苷酸。這些誘重組區(qū)應(yīng)當(dāng)足夠相似，這樣它們就能夠在十分嚴(yán)格的條件下彼此雜交。
用于進(jìn)行此處所述基因修飾事件的方法(如通過(guò)重組事件將基因上調(diào)或下調(diào)并將其它基因序列引入到奈瑟氏球菌基因組中)在WO01/09350中描述?？稍谀紊锨蚓斜徽系囊话銖?qiáng)啟動(dòng)子是porA、porB、lgtF、Opa、p110、lst、和hpuAB。PorA和PorB是優(yōu)選的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子。已經(jīng)確定了PorB啟動(dòng)子活性包含在與PorB起始密碼子上游的核苷酸1-250相對(duì)應(yīng)的片段中。
通過(guò)在鐵有限培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而上調(diào)抗原的表達(dá)本發(fā)明外膜小泡制品中某些抗原的上調(diào)優(yōu)選通過(guò)分離在鐵有限條件下生長(zhǎng)的奈瑟氏球菌親代菌株中的外膜小泡而實(shí)現(xiàn)。培養(yǎng)基中低濃度的鐵將導(dǎo)致參與鐵獲得的蛋白表達(dá)增加，包括TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB和P2086。這些蛋白的表達(dá)由此被上調(diào)而無(wú)需重組修飾所涉及的基因，例如通過(guò)插入較強(qiáng)的啟動(dòng)子或插入基因的附加拷貝。本發(fā)明還包括通過(guò)在鐵有限培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而上調(diào)鐵獲得蛋白，其中所述基因也已被重組修飾。
鐵有限是通過(guò)向培養(yǎng)基中加入鐵螯合劑而實(shí)現(xiàn)的。適宜的鐵螯合劑包括2，2-雙吡啶，EDDHA(乙二胺-二(o-羥基苯乙酸)和Desferal(甲磺酸去鐵胺，Sigma)。Desferal是優(yōu)選的鐵螯合劑且以10-100μM、優(yōu)選25-75μM、更優(yōu)選50-70μM、最優(yōu)選60μM的濃度加入到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基的鐵內(nèi)含物主要來(lái)源于酵母提取物和大豆胨組分，且存在的用量可根據(jù)批次而變化。因此，在不同批的培養(yǎng)基中，不同濃度的Desferal對(duì)于獲得鐵獲得蛋白的上調(diào)是最佳的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠很容易地測(cè)定最佳濃度。在基礎(chǔ)條件下，應(yīng)向培養(yǎng)基中加入充足的鐵螯合劑，從而上調(diào)所需鐵-調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，但也不能過(guò)量而不利地影響細(xì)菌的生長(zhǎng)。
優(yōu)選將通過(guò)在鐵有限條件下生長(zhǎng)的鐵獲得蛋白的上調(diào)與其它抗原的重組上調(diào)組合，從而獲得本發(fā)明的外膜小泡。
可變和非-保護(hù)性免疫顯性抗原的下調(diào)/除去在細(xì)菌菌株中，很多表面抗原都是可變的且因此只能抗一組有限的緊密相關(guān)的菌株。本發(fā)明一方面涉及本發(fā)明的外膜小泡，其中其它蛋白的表達(dá)減少，或優(yōu)選編碼可變表面蛋白的基因缺失。這種缺失導(dǎo)致產(chǎn)生泡的細(xì)菌菌株當(dāng)以疫苗形式給藥時(shí)，抗各種菌株交叉反應(yīng)性的潛能更強(qiáng)，這是由于保守蛋白(留存在外膜上)對(duì)接種者的免疫系統(tǒng)施加了更強(qiáng)的影響?？稍诒景l(fā)明泡免疫原性組合物中被下調(diào)的奈瑟氏球菌中這種可變抗原的例子包括PorA、PorB、Opa。
可被下調(diào)或切斷的其它類型基因是在體內(nèi)可被細(xì)菌很容易地接通(表達(dá))或切斷的基因。因?yàn)橛蛇@種基因編碼的外膜蛋白并不總是存在于細(xì)菌上，因此這種蛋白在泡制品中的存在還可由于上述原因而對(duì)疫苗有效性有害。下調(diào)或缺失的優(yōu)選例子是奈瑟氏球菌Opc蛋白。由含Opc的泡疫苗誘導(dǎo)的抗-Opc免疫性僅具有有限的保護(hù)能力，這是因?yàn)楦腥旧锖苋菀鬃優(yōu)镺pc-。
例如，這些可變或非-保護(hù)基因的表達(dá)可被下調(diào)，或最終被切斷。如此則具有將免疫系統(tǒng)集中于更好抗原上的優(yōu)點(diǎn)，所述抗原僅少量存在于泡外表面上。下調(diào)還指表面外露的，上述外膜蛋白的可變免疫顯性環(huán)可被改變或缺失，從而產(chǎn)生免疫顯性較低的外膜蛋白。
下調(diào)表達(dá)的方法在WO01/09350中公開(kāi)。在本發(fā)明的泡免疫原性組合物中被下調(diào)的優(yōu)選蛋白組合包括PorA與OpA、PorA與OpC、OpA與OpC、PorA與OpA與OpC。
已知有4種不同的Opa基因存在于腦膜炎球菌基因組(Aho等人，1991 Mol.Microbiol.51429-37)中，因此當(dāng)提到Opa的表達(dá)被下調(diào)時(shí)，它是指優(yōu)選存在于腦膜炎球菌中的1、2、3或(優(yōu)選)全部4種基因都被下調(diào)。這種下調(diào)通?？砂凑誛O01/09350所述基因工程進(jìn)行或通過(guò)查找很容易發(fā)現(xiàn)的、天然的、穩(wěn)定的腦膜炎球菌菌株而進(jìn)行，它們自O(shè)pa基因座的表達(dá)較低或沒(méi)有。這種菌株可使用Poolman等人(1985J.Med.Micro.19203-209)描述的技術(shù)發(fā)現(xiàn)，其中Opa-細(xì)胞具有與表達(dá)Opa的細(xì)胞不同的表型，這可通過(guò)在平板上或顯微鏡下觀察細(xì)胞外觀而見(jiàn)到。一旦找到，在進(jìn)行發(fā)酵以使Opa缺失后，通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)含物上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡而顯示出該菌株是穩(wěn)定的Opa-。
當(dāng)外膜小泡中某些抗原的上調(diào)是通過(guò)在鐵有限條件下生長(zhǎng)而實(shí)現(xiàn)的時(shí)，可變蛋白FrpB(Microbiology 142；3269-3274，(1996)；J.Bacteriol.181；2895-2901(1999))也可被上調(diào)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，按照WO01/09350所述通過(guò)下調(diào)全部蛋白的表達(dá)或通過(guò)使FrpB可變區(qū)缺失而在這些環(huán)境下下調(diào)FrpB表達(dá)是有利的。如此可確保由免疫原性組合物引發(fā)的免疫反應(yīng)針對(duì)存在于大范圍菌株中的抗原。在本發(fā)明的泡免疫原性組合物中，F(xiàn)rpB的下調(diào)優(yōu)選與PorA和OpA、PorA和OpC、OpA和OpC、PorA和OpA和OpC的下調(diào)組合。
在本發(fā)明可選擇性的實(shí)施方案中，外膜小泡中的FrpB被下調(diào)，所述外膜小泡是從不是在鐵有限條件下生長(zhǎng)的奈瑟氏球菌菌株制備的。
LPS解毒本發(fā)明免疫原性組合物中的泡可經(jīng)由WO01/09350公開(kāi)的LPS解毒方法解毒。本發(fā)明LPS解毒的具體方法包括使WO01/09350中公開(kāi)的htrB和/或msbB酶被下調(diào)/缺失。奈瑟氏球菌的msbB和htrB基因還分別被稱作1pxL1和lpxL2(WO00/26384)且這些基因的缺失突變是通過(guò)失去一個(gè)仲?；湹膍sbB-突變LOS和失去兩個(gè)仲酰基鏈的htrB-突變LOS而從表型方面表征的。WO93/14155和WO95/03327描述了可用于本發(fā)明組合物中的多粘菌素B的無(wú)毒肽功能性等價(jià)物。
這種方法優(yōu)選與泡提取方法組合，泡提取方法包括使用低水平的DOC、優(yōu)選0-0.3％DOC、更優(yōu)選0.05％-0.2％DOC、最優(yōu)選約或準(zhǔn)確的0.1％DOC。
LPS解毒的其它方法包括如上所述向泡制品中加入多粘菌素B的無(wú)毒肽功能性等價(jià)物(優(yōu)選SAEP2)。
交叉反應(yīng)性多糖將細(xì)菌外膜泡從有莢膜的革蘭氏陰性菌中分離出來(lái)常常導(dǎo)致莢膜多糖的共-純化。在某些情況下，這種“污染”材料可顯示有用，這是因?yàn)槎嗵强商岣哂善渌萁M分產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。然而在其它情況下，污染性多糖材料在細(xì)菌泡制品中的存在可證明對(duì)泡在疫苗中的應(yīng)用有害。例如，已經(jīng)顯示出至少在腦膜炎奈瑟氏球菌的情況下，血清組B莢膜多糖不會(huì)帶來(lái)保護(hù)免疫性且很容易在人類中誘導(dǎo)不利的自身免疫反應(yīng)。因此，可將本發(fā)明的外膜小泡從細(xì)菌菌株中分離出來(lái)用于泡的生產(chǎn)，其已被改造成沒(méi)有莢膜多糖。這樣一來(lái)泡即適用于人類。這種泡制品的特別優(yōu)選的例子是來(lái)源于沒(méi)有莢膜多糖的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B的泡制品。
這可通過(guò)使用修飾的泡產(chǎn)生菌株實(shí)現(xiàn)，其中莢膜生物合成和/或輸出所需的基因已損壞。編碼莢膜多糖生物合成或輸出的基因的滅活可通過(guò)(優(yōu)選使用上述同源重組技術(shù))使控制區(qū)、編碼區(qū)或兩者突變(點(diǎn)突變、缺失或插入)，或通過(guò)降低這種基因酶功能的任何其它方式而實(shí)現(xiàn)。此外，莢膜生物合成基因的滅活還可通過(guò)反義過(guò)量表達(dá)或轉(zhuǎn)座子誘變而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選方法是使多糖生物合成及輸出所需的腦膜炎奈瑟氏球菌Lps基因的一部分或全部缺失。就該目的而言，置換質(zhì)粒pMF121(在Frosh等人，1990，Mol.Microbiol.41215-1218中所述)可用于傳遞使cpsCAD(+galE)基因聚簇缺失的突變。
已經(jīng)對(duì)抗L3或L2 LPS所產(chǎn)生抗體的安全性產(chǎn)生了疑問(wèn)，這是由于與存在于人鞘糖脂中的乳-N-neotetraose低聚糖基團(tuán)(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-)相似的結(jié)構(gòu)的存在。盡管已經(jīng)有很多人安全接種了脫氧膽酸鹽提取的含有殘余量L3LPS的小泡疫苗(G.Bjune等人，Lancet(1991)，338，1093-1096；GVG.Sierra等人，NIPH ann(1991)，14，195-210)，LOS糖末端部分的缺失可有利地防止與存在于人組織表面的結(jié)構(gòu)的任何交叉反應(yīng)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，lgtB基因的滅活產(chǎn)生中間體LPS結(jié)構(gòu)，其中缺少末端半乳糖殘基和唾液酸(突變留下L2和L3LOS中的4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-結(jié)構(gòu))。這種中間體可在L3和L2LPS菌株中獲得。LPS的可選擇性且不太優(yōu)選的(短的)版本可通過(guò)關(guān)閉lgtE基因獲得。LPS的其它選擇性且不太優(yōu)選的版本可通過(guò)關(guān)閉lgtA基因獲得。如果選擇這種lgtA-突變，優(yōu)選還可關(guān)閉lgtC表達(dá)從而防止形成非免疫原性L1免疫型。
LgtB-突變體是最優(yōu)選的，這是因?yàn)楸景l(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這是用于解決安全性問(wèn)題同時(shí)仍然保留可誘導(dǎo)殺菌抗體反應(yīng)的LPS保護(hù)性低聚糖表位的最佳截短。
因此，還包含L2或L3制品(純化的或在分離的泡中)的本發(fā)明免疫原性組合物或腦膜炎球菌泡制品通常有利地來(lái)源于奈瑟氏球菌菌株(優(yōu)選腦膜炎球菌)，它們已被基因工程改造成永久性下調(diào)來(lái)源于lgtB、lgtA或lgtE基因的功能性基因產(chǎn)物的表達(dá)，優(yōu)選通過(guò)切斷基因，最優(yōu)選通過(guò)使基因啟動(dòng)子和/或開(kāi)放閱讀框的全部或一部分缺失。
當(dāng)本發(fā)明上述免疫原性組合物來(lái)源于腦膜炎球菌B菌株時(shí)，還優(yōu)選除去莢膜多糖(其還包含人—樣糖結(jié)構(gòu))。雖然可將很多基因切斷以實(shí)現(xiàn)此目的，但本發(fā)明人有利地顯示優(yōu)選已將泡產(chǎn)生菌株進(jìn)行基因工程改造以永久下調(diào)siaD基因的功能性基因產(chǎn)物的表達(dá)(即，下調(diào)α-2-8聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶的活性)，優(yōu)選通過(guò)切斷基因，最優(yōu)選通過(guò)使基因啟動(dòng)子和/或開(kāi)放閱讀框的全部或一部分缺失。這種滅活在WO01/09350中描述。siaD(也被稱作synD)突變是多種突變中最有利的，可除去莢膜多糖的人-相似表位，這是因?yàn)橥蛔冎袃H有一種對(duì)LOS保護(hù)性表位的生物合成沒(méi)有作用，因此在最終使用LOS作為保護(hù)性抗原的方法中是有利的，且對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的作用最小。因此本發(fā)明的優(yōu)選方面是上述泡免疫原性制品，其來(lái)源于lgtE-siaD-、lgtA-siaD-或優(yōu)選lgtB-siaD-腦膜炎球菌B突變株。所述菌株本身是本發(fā)明的另一方面。
雖然由于上述原因siaD-突變是優(yōu)選的，但也可使用切斷腦膜炎球菌B莢膜多糖合成的其它突變。因此，可將泡產(chǎn)生菌株進(jìn)行基因工程改造以永久下調(diào)來(lái)源于下列一種或多種基因的功能性基因產(chǎn)物的表達(dá)ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA(相當(dāng)于synX和siaA)、synB(相當(dāng)于siaB)或synC(相當(dāng)于siaC)基因，優(yōu)選通過(guò)切斷基因，最優(yōu)選通過(guò)使基因啟動(dòng)子和/或開(kāi)放閱讀框的全部或一部分缺失。lgtE-突變可與這些突變的一種或多種組合。優(yōu)選lgtB-突變與這些突變的一種或多種組合。因此本發(fā)明另一方面是上述泡免疫原性制品，其來(lái)源于腦膜炎球菌B的這種組合突變株。所述菌株本身是本發(fā)明的另一方面。
含有各種lgt基因，包括lgtB和lgtE的奈瑟氏球菌基因座及其序列是本領(lǐng)域已知的(見(jiàn)M.P.Jennings等人，Microbiology 1999，145，3013-3021和其中引證的參考文獻(xiàn)，以及J.Exp.Med.1802181-2190 )。
當(dāng)把全長(zhǎng)(未-截短的)LOS用于終產(chǎn)品中時(shí)，希望LOS沒(méi)有被唾液酸化(因?yàn)檫@種LOS可產(chǎn)生抗絕大多數(shù)危險(xiǎn)的、侵入性腦膜炎球菌B菌株的免疫反應(yīng)，所述菌株也未被唾液酸化)。在這種情況下，使用具有缺失synA(相當(dāng)于synX和siaA)、synB(相當(dāng)于siaB)或synC(相當(dāng)于siaC)基因的莢膜陰性菌株是有利的，這是因?yàn)檫@種突變也可導(dǎo)致menB LOS不能被唾液酸化。
在泡制品中，特別是在用低濃度DOC提取的制品中，可使用LPS作為本發(fā)明免疫原性組合物中的抗原。然而，可有利地將lgtE、lgtA(特別是與lgtC組合)、或優(yōu)選lgtB基因/基因產(chǎn)物的酶功能下調(diào)/缺失/滅活，以便除去人樣乳-N-neotetraose結(jié)構(gòu)。包含用于生物合成LPS低聚糖結(jié)構(gòu)的lgt基因的奈瑟氏球菌基因座(及其序列)是本領(lǐng)域已知的(Jennings等人，Microbiology 1999 1453013-3021和其中引證的參考文獻(xiàn)，以及J.Exp.Med.1802181-2190 )。優(yōu)選lgtB(或功能性基因產(chǎn)物)被下調(diào)/缺失，這是因?yàn)樗闪粝峦暾腖PS保護(hù)性表位。
在本發(fā)明的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B泡制品中，siaD和lgtB的下調(diào)/缺失是優(yōu)選的，(雖然，在腦膜炎球菌B泡產(chǎn)生菌株中也可使用lgtB-與ctrA-、ctrB-、ctrC-、ctrD-、synA-(相當(dāng)于synX-和siaA-)、synB-(相當(dāng)于siaB-)或synC-(相當(dāng)于siaC-)中任何一個(gè)的組合)，得到具有最佳安全性和LPS保護(hù)性表位保留的泡制品。
本發(fā)明的另一方面是上述泡免疫原性制品，其來(lái)源于腦膜炎球菌B的這種組合突變株。所述菌株本身是本發(fā)明的另一方面。
本發(fā)明的免疫原性組合物可包括至少1、2、3、4或5種不同的外膜小泡制品。當(dāng)包括兩種或多種OMV制品時(shí)，本發(fā)明至少一個(gè)抗原在各OMV中被上調(diào)。這種OMV制品可來(lái)源于相同種類和血清組的奈瑟氏球菌菌株或優(yōu)選來(lái)源于不同種類、血清組、血清型、亞血清型或免疫型的奈瑟氏球菌菌株。例如，免疫原性組合物可包括一種或多種外膜小泡制品，其含有免疫型L2的LPS和含有免疫型L3的LPS的一種或多種外膜小泡制品。L2或L3OMV制品優(yōu)選來(lái)源于穩(wěn)定的菌株，其在LPS低聚糖合成基因座具有最小的相變異性。
與亞單位組合物組合的外膜小泡本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括亞單位組合物和外膜小泡。有若干抗原由于它們的溶解性而特別適于包括在亞單位組合物中。這種蛋白的例子包括FhaB、NspA、Hsf的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、Hap的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、AspA的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、AspA、OMP85、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PilQ。外膜小泡制品具有選自下列的至少一種不同抗原，其在外膜小泡中已被重組上調(diào)NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、TbpB、LbpB、NadA、TspA、TspB、PilC、PilQ、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、MafA、MafB和PldA；且任選包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
本發(fā)明具體的免疫原性組合物在下列具體組合中，當(dāng)抗原組合存在于泡中時(shí)，這種抗原組合應(yīng)如上所述被上調(diào)。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案包括自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鐵獲得蛋白，更優(yōu)選Hsf和TbpA(高)和/或TbpA(低)。這種免疫原性組合物可優(yōu)選進(jìn)一步包括OMP85、FrpA、FrpC、LbpA、LbpB、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、TspA、NadA、TspB、PilQ、FhaC、NspA、PldA、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、FhaB、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、VapD和Hap中的至少一種。所有上述免疫原性組合物還可包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案包括Hsf和選自下列的至少一種其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、Hap、AspA、IgA蛋白酶、OMP85、NspA、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、FhaC、NadA、PldA、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB。所有上述免疫原性組合物還可包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括Hsf和OMP85(任選與Hap、FrpA或LbpB的一個(gè)或多個(gè))；Hsf和Hap(任選與FrpA、LbpB或OMP85的一個(gè)或多個(gè))；Hsf和FrpA(任選與Hap、LbpB或OMP85的一個(gè)或多個(gè))；Hsf和LbpB(任選與Hap、OMP85或FrpA的一個(gè)或多個(gè))。由于Hsf既是粘附素又是自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此特別優(yōu)選的組合包括Hsf、OMP85、TbpA、LPS免疫型L2和/或L3，優(yōu)選在多價(jià)泡制品中，其具有所提供的所有5組抗原的成員。優(yōu)選TbpA(低)和TbpA(高)均存在。
本發(fā)明的另一免疫原性組合物包括FhaB和選自下列的至少一種其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、TdfH、PorB、PldA、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、NadA、PldA、TbpA、Hsf、TspA和TspB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括FhaB和Hsf(任選與OMP85、LbpB、Hap或FrpA的一個(gè)或多個(gè))；FhaB和OMP85(任選與LbpB、Hap或FrpA的一個(gè)或多個(gè))；FhaB和LbpB(任選與Hap或FrpA的一個(gè)或多個(gè))；FhaB和Hap(任選與FrpA)。優(yōu)選組合包括FhaB、LbpB、Hsf(作為OMP)和FrpA，其具有所提供的全部5組抗原的成員。
本發(fā)明的另一免疫原性組合物包括NspA和選自下列的至少一種其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、SIBp、NMB0964、NMB0293、Hap、OMP85、PilQ、AspA、IgA蛋白酶、NadA、PldA、Hsf、Hap、TspA、TspB、TdfH、PorB、和LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括NspA和Hsf(任選與OMP85、Hap、LbpA或TbpA的一個(gè)或多個(gè))；NspA和OMP85(任選與Hap、LbpA或TbpA的一個(gè)或多個(gè))；NspA和Hap(任選與LbpA或TbpA的一個(gè)或多個(gè))；NspA和LbpA(任選與TbpA)。特別優(yōu)選的組合包括NspA、Hsf、TbpA、LPS免疫型L2和/或L3，優(yōu)選在多價(jià)泡制品中，其具有所提供的全部5組抗原的成員。優(yōu)選TbpA(低)和TbpA(高)均存在。
本發(fā)明沒(méi)有要求保護(hù)具有WO00/25811中所公開(kāi)的抗原的個(gè)別組合的免疫原性組合物。優(yōu)選，如果它們的抗原內(nèi)含物僅由轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白和NspA組成(或在泡疫苗中，上調(diào)的或富聚的抗原內(nèi)含物僅由轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白和NspA組成)，則這類免疫原性組合物或疫苗不包括在本發(fā)明內(nèi)，然而可包括由NspA以及TbpA(高)和TbpA(低)組成或包括NspA以及TbpA(高)和TbpA(低)的特定抗原(或上調(diào)的抗原)組合。任選地，沒(méi)有要求保護(hù)包括轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白和NspA的組合(亞單位)或上調(diào)(泡)的組合物或疫苗。
本發(fā)明另一免疫原性組合物包括NadA和選自下列的至少一種其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、OMP85、NspA、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、HpuA、HpuB、AspA、IgA蛋白酶、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
本發(fā)明另一免疫原性組合物包括TbpA(低)和選自下列的至少一種抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、IgA蛋白酶、NspA、HpuA、HpuB、Hap、OMP85、NspA(當(dāng)與TbpA(高)組合時(shí))、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、AspA、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和haB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括TbpA(低)和Hsf和LbpA；TbpA(低)和OMP85(任選與LbpA和Hap之一或兩者)；TbpA(低)和LbpA和Hap。
本發(fā)明另一免疫原性組合物包括TbpA(高)和選自下列的至少一種其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、Hap、OMP85、NspA(當(dāng)與TbpA(低)組合)、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB 1119、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、MafA、MafB、AspA、IgA蛋白酶、PldA、FhaB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括TbpA(高)和Hsf和LbpA；TbpA(高)和OMP85(任選與LbpA和Hap之一或兩者)；TbpA(高)和LbpA和Hap。
本發(fā)明另一免疫原性組合物包括LbpA和選自下列的至少一個(gè)其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、TbpB、Hap、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、NadA、PldA、TbpA、Hsf、TspA、TspB、MafA、MafB、IgA蛋白酶、AspA、FhaB、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TdfH、PorB和FhaB以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括LbpA和Hsf(任選與Hap)。
本發(fā)明另一免疫原性組合物包括LbpB和選自下列的至少一個(gè)其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpA、TbpB、Hap、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、NadA、PldA、TbpA、Hsf、TspA、TspB、MafA、MafB、IgA蛋白酶、AspA、FhaB、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括LbpB和Hsf(任選與OMP85、Hap或FrpA的一個(gè)或多個(gè))；LbpB和OMP85(任選與Hap或FrpA的一個(gè)或多個(gè))；LbpB和Hap(任選與FrpA)。
本發(fā)明另一免疫原性組合物包括OMP85和選自下列的至少一個(gè)其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、IgA蛋白酶、AspA、Hsf、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、PilQ、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優(yōu)選組合包括OMP85和Hsf(任選與LbpA或NspA的一個(gè)或多個(gè))；OMP85和LbpA(任選與Hap和NspA的一個(gè)或多個(gè))；OMP85和Hap(任選與NspA)。
本發(fā)明另一免疫原性組合物包括Hap和選自下列的至少一個(gè)其它抗原FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、NspA、IgA蛋白酶、AspA、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
本發(fā)明另一免疫原性組合物包括FrpA和選自下列的至少一個(gè)其它抗原LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、NadA、FhaB、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
本發(fā)明另一免疫原性組合物包括FrpC和選自下列的至少一個(gè)其它抗原LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、NadA、FhaB、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
本發(fā)明另一免疫原性組合物包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者以及選自下列的至少一個(gè)其它抗原LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、NadA、FhaB、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB。
本發(fā)明免疫原性組合物中的優(yōu)選抗原組合包括如下組合，該組合包含鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和FhaB；鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和PilC；鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和NadA；鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和FrpA；鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和PilQ；鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和TspA；鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和TspB；鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和NspA；鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和FrpC；更優(yōu)選包含鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和Hap；鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和FrpA/C；鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和LbpB；鐵獲得蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和OMP85(D15)。最優(yōu)選，摻入OMP85(D15)作為外膜小泡制品的一部分。
包含LPS的本發(fā)明免疫原性組合物優(yōu)選具有與T-輔助細(xì)胞表位來(lái)源，優(yōu)選蛋白綴合的LPS，且就OMV中的LPS而言，優(yōu)選外膜蛋白。特別優(yōu)選的實(shí)施方案包括已經(jīng)與OMP在外膜小泡制品中(如上所述)原位(優(yōu)選泡內(nèi))綴合的LPS。
本發(fā)明的免疫原性組合物可包括來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、B、C、Y、W-135或淋病奈瑟氏球菌的抗原(蛋白、LPS和多糖)。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗不由WO00/71725第3頁(yè)第18行-第52頁(yè)第2行表中所列的SEQ ID的特定組合和/或WO00/71725中實(shí)施例1-11描述的任何單個(gè)組合組成和/或含有這些組合。
優(yōu)選，本發(fā)明不要求保護(hù)WO01/52885中公開(kāi)的個(gè)別組合。
其它組合本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括細(xì)菌莢膜多糖或低聚糖。莢膜多糖或低聚糖可來(lái)源于下列一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、C、Y、和/或W-135、流感嗜血桿菌b(Haemophilus influenzae b)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、A組鏈球菌、B組鏈球菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcas aureus)和表皮葡萄球菌(Stapylocoaus epidermidis)。
本發(fā)明另一方面是含有本發(fā)明抗原性組合物和其它抗原的疫苗組合物，其可有利地用于抗某些疾病狀況，包括與病毒或革蘭氏陽(yáng)性菌有關(guān)的那些。
在其中一個(gè)優(yōu)選組合中，本發(fā)明的抗原性組合物是用下列腦膜炎球菌莢膜多糖或低聚糖的1、2、3或優(yōu)選全部4種配制的，其可以是簡(jiǎn)單的或與蛋白載體A、C、Y或W-135綴合的。優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物是用A和C；或C；或C和Y配制的。這種含有源自腦膜炎奈瑟氏球菌，優(yōu)選血清組B的蛋白的疫苗可被有利地用作通用的腦膜炎球菌疫苗。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原性組合物，優(yōu)選用簡(jiǎn)單或綴合的腦膜炎球菌莢膜多糖或低聚糖A、C、Y或W-135的1、2、3或全部4種配制(如上所述)的，是用綴合的流感嗜血桿菌b莢膜多糖或低聚糖，和/或一種或多種簡(jiǎn)單或綴合的肺炎球菌莢膜多糖或低聚糖配制的。任選地，所述疫苗還可包括一種或多種蛋白抗原，它們可保護(hù)宿主免受肺炎鏈球菌感染。這種疫苗可被有利地用作通用腦膜炎疫苗。
在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物是用來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血桿菌b、肺炎鏈球菌、A組鏈球菌、B組鏈球菌、金黃色膿葡萄球菌或表皮葡萄球菌中一種或多種的莢膜多糖或低聚糖配制的。肺炎球菌的莢膜多糖抗原優(yōu)選選自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最優(yōu)選選自1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案包括流感嗜血桿菌的PRP莢膜多糖。進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案包括金黃色葡萄球菌的5型、8型或336莢膜多糖。進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案包括表皮葡萄球菌的I型、II型或III型莢膜多糖。進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案包括B組鏈球菌的Ia型、Ic型、II型或III型莢膜多糖。進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案包括A組鏈球菌的莢膜多糖，優(yōu)選還包括至少一種M蛋白且更優(yōu)選多種類型的M蛋白。
本發(fā)明這種莢膜多糖可與載體蛋白如破傷風(fēng)類毒素、破傷風(fēng)類毒素片段C、白喉類毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D(US6342224)非-綴合或綴合。所述多糖綴合物可通過(guò)任何已知的偶聯(lián)技術(shù)制備。例如，可經(jīng)由硫醚鍵使多糖偶聯(lián)。這種綴合方法依靠用1-氰基-4-二甲氨基四氟硼酸吡啶鎓(CDAP)活化多糖而形成氰酸酯。活化多糖可因此與載體蛋白上的氨基直接偶聯(lián)或經(jīng)由間隔基團(tuán)偶聯(lián)。優(yōu)選，使用包括形成硫醚鍵的雜絡(luò)合化學(xué)過(guò)程使氰酸酯與己二胺偶聯(lián)，使氨基-衍生的多糖與載體蛋白偶聯(lián)。這種綴合物在PCT公開(kāi)申請(qǐng)WO93/15760Uniformed Services University中描述。
綴合物還可通過(guò)如US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)中描述的直接還原胺化方法制備。其它方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。其它方法包括通過(guò)碳二亞胺縮合使己二酸酰肼(ADH)衍生的溴化氰活化的多糖與蛋白載體偶聯(lián)(Chu C.等人，Infect.Immunity，1983 245 256)。當(dāng)包括低聚糖時(shí)，優(yōu)選使它們綴合在一起。
優(yōu)選的肺炎球菌蛋白抗原是在肺炎球菌外表面上暴露的那些肺炎球菌蛋白(在肺炎球菌至少部分生活周期內(nèi)能夠由宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別)，或是由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白。最優(yōu)選，所述蛋白是毒素、粘附素、2-組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、或肺炎鏈球菌的脂蛋白，或其片段。特別優(yōu)選的蛋白包括，但不限于肺炎球菌溶血素(優(yōu)選通過(guò)化學(xué)處理或突變解毒)[Mitchell等人，Nucleic Acids Res.1990年7月11日18(13)4010“Comparison of pneumolysin genes and proteinsfrom Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.”，Mitchell等人，Biochim Biophys Acta 1989年1月23日；1007(1)67-72，“Expression of the pneumolysin gene in Escherichiacolirapid purification and biological properties.”，WO96/05859(A.Cyanamid)、WO90/06951(Paton等人)、WO99/03884(NAVA)]；PspA及其跨膜缺失變體(US5804193-Briles等人)；PspC及其跨膜缺失變體(WO97/09994-Briles等人)；PsaA及其跨膜缺失變體(Berry和Paton，Infect Immun 1996年12月；64(12)5255-62，“Sequence heterogeneity of PsaA，a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence ofStreptococcuspneumoniae”)；肺炎球菌膽堿結(jié)合蛋白及其跨膜缺失變體；CbpA及其跨膜缺失變體(WO97/41151、WO99/51266)；甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(Infect.Immun.1996 643544)；HSP70(WO96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato等人，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 1998，164207-14)；M樣蛋白(EP0837130)和粘附素18627(EP0834568)。進(jìn)一步優(yōu)選的肺炎球菌蛋白抗原是WO98/18931中公開(kāi)的那些，特別是WO98/18930和PCT/US99/30390中選擇的那些。
本發(fā)明的免疫原性組合物/疫苗還可任選包括由其它革蘭氏陰性菌，例如粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)或流感嗜血桿菌制備的外膜小泡制品。
粘膜炎莫拉氏菌泡制品本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括來(lái)源于粘膜炎莫拉氏菌的OMV制品。如WO01/09350所述，基因工程改造的OMV制品可來(lái)源于粘膜炎莫拉氏菌。優(yōu)選將下列基因(編碼保護(hù)性抗原)的一種或多種上調(diào)OMP106(WO97/41731和WO96/34960)、HasR(PCT/EP99/03824)、PilQ(PCT/EP99/03823)、OMP85(PCT/EP00/01468)、lipo06(GB9917977.2)、lipo10(GB9918208.1)、lipo11(GB9918302.2)、lipo18(GB9918038.2)、P6(PCT/EP99/03038)、ompCD、CopB(Helminen ME等人，(1993)Infect.Immun.612003-2010)、D15(PCT/EP99/03822)、Omp1A1(PCT/EP99/06781)、Hly3(PCT/EP99/03257)、LbpA和LbpB(WO98/55606)、TbpA和TbpB(WO97/13785和WO97/32980)、OmpE、UspA1和UspA2(WO93/03761)、和Omp21。作為可被異源引入到其他革蘭氏陰性菌中的基因，它們也是優(yōu)選的。
優(yōu)選將下列基因的一個(gè)或多個(gè)下調(diào)CopB、OMP106、OmpBl、TbpA、TbpB、LbpA、和LbpB。
優(yōu)選將下列基因的一個(gè)或多個(gè)下調(diào)htrB、msbB和lpxK。
優(yōu)選將下列基因的一個(gè)或多個(gè)上調(diào)pmrA、pmrB、pmrE、和pmrF。
流感嗜血桿菌泡制品本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括來(lái)源于流感嗜血桿菌的OMV制品。如WO01/09350所述，基因工程改造的OMV制品可來(lái)源于流感嗜血桿菌。優(yōu)選將下列基因(編碼保護(hù)性抗原)的一個(gè)或多個(gè)上調(diào)D15(WO94/12641)、P6(EP281673)、TbpA(WO96/40929、WO95/13370)、TbpB(WO96/40929；WO95/13370)、P2、P5(WO94/26304)、OMP26(WO97/01638)、HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hsf、Hap、Hin47、和Hif(該操縱子中的所有基因均應(yīng)被上調(diào)以將菌毛蛋白上調(diào))。作為可被異源引入到其他革蘭氏陰性菌中的基因，它們也是優(yōu)選的。
優(yōu)選將下列基因的一個(gè)或多個(gè)下調(diào)P2、P5、Hif、IgAl-蛋白酶、HgpA、HgpB、HMW1、HMW2、Hxu、htrB、msbB和1pxK。
優(yōu)選將下列基因的一個(gè)或多個(gè)上調(diào)pmrA、pmrB、pmrE、和pmrF。
本發(fā)明的免疫原性組合物/疫苗還可任選包括抗白喉、破傷風(fēng)和百日咳鮑特氏菌(Bordetella pertussis)感染中一種或多種的抗原。百日咳鮑特氏菌組分可被殺死，無(wú)論是全細(xì)胞百日咳鮑特氏菌(Pw)還是無(wú)細(xì)胞的百日咳鮑特氏菌(Pa)，其包含來(lái)源于PT、FHA和69kDapertactin的至少一種抗原(優(yōu)選2或所有3種)。通常，提供抗白喉和破傷風(fēng)保護(hù)的抗原是白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素。類毒素是化學(xué)滅活的毒素或通過(guò)引入點(diǎn)突變而滅活的毒素。
免疫原性組合物/疫苗還可任選地包括一種或多種保護(hù)宿主免受非-分型(non-typeable)流感嗜血桿菌、RSV感染的抗原和/或一種或多種可保護(hù)宿主免受流感病毒感染的抗原。這種疫苗可有利地用作通用中耳炎疫苗。
優(yōu)選的非分型流感嗜血桿菌蛋白抗原包括絲束蛋白(US5766608)和含有來(lái)自絲束蛋白的肽的融合蛋白(例如，LB1融合蛋白)(US5843464-Ohio State Research Foundation)、OMP26、P6、蛋白D、TbpA、TbpB、Hia、Hmw1、Hmw2、Hap、和D15。
優(yōu)選的流感病毒抗原包括完整的、活的或滅活的病毒、脫落流感病毒，其在卵或MDCK細(xì)胞中生長(zhǎng)，或非洲綠猴腎細(xì)胞株系細(xì)胞或完整的流感病毒體(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所述)或其純化或重組蛋白，如HA、NP、NA、或M蛋白、或其組合。
優(yōu)選的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。
本發(fā)明的免疫原性組合物可包括粘膜炎莫拉氏菌蛋白，包括TbpA(WO97/13785；WO99/52947)、TbpB(WO97/13785；WO99/52947；Mathers等人，F(xiàn)EMS Immunol Med Microbiol 1997 19；231-236；Myers等人Infect Immun 1998 66；4183-4192)、LbpA、LbpB(Du等人，Infect Immun 1998 66；3656-3665)、UspA1、UspA2(Aebi等人，Infect Immun.1997 65；4367-4377)、OMP106(US6214981)、Ton-B依賴性受體(WO00/78968)、CopB(Sethi等人，Infect.Immun.199765；3666-3671)、和HasR受體(WO00/78968)；流感嗜血桿菌的蛋白包括HMW(St Geme等人，Infect Immun 1998 66；364-368)、Hia(St Geme等人，J.Bacteriol.2000 182；6005-6013)、Tbp1(WO96/40929；WO95/13370)、Tbp2(WO96/40929；WO95/13370；Gray-Owen等人，Infect Immun 1995 63；1201-1210)、LbpA、LbpB(Schryvers等人，1989，29121-130)、HasR、Ton B-依賴性受體(Fleishmann等人，Science 1995 269；496-512)、血紅蛋白-結(jié)合蛋白、HhuA(Cope等人，Infect Immun 2000 68；4092-4101)、HgpA(Maciver等人，Infect Immun 1996 64；3703-3712)、HgbA、HgbB和HgbC(Jin等人，Infect Immun 1996 64；3134-3141)、HxuA(Cope等人，Mol Microbiol 1994 13；863-873)、HxuC(Cope等人，InfectImmun 2001 69；2353-2363)；來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌的蛋白，包括Tbp1、Tbp2、FbpA、FbpB、BfrA、BfrB(Tettelin等人，Science 2000287；1809-1815)、LbpA、LbpB和HmbR。
疫苗制劑本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是還可含有藥學(xué)上可接受賦形劑或載體的本發(fā)明免疫原性組合物的疫苗制劑。
來(lái)源于上述任何一種修飾菌株的外膜小泡制品的制備可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何一種方法實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選使用EP 301992、US5,597,572、EP 11243或US 4,271,147中公開(kāi)的方法。更優(yōu)選使用WO01/09350中描述的方法。
疫苗制品通常在疫苗設(shè)計(jì)中描述(“The subunit and adjuvantapproach”(eds Powell M.F.& Newman M.J.)(1995)Plenum PressNew York)。
本發(fā)明的疫苗制劑中可向本發(fā)明的抗原性組合物施加佐劑。適宜的佐劑包括鋁鹽如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁，但還可以是鈣鹽(特別是碳酸鈣)、鐵鹽或鋅鹽，或可以是?；野彼峄蝓；?，陽(yáng)離子或陰離子衍生的多糖或聚磷腈的不溶性懸浮液。
可使用的適宜Thl佐劑系統(tǒng)包括單磷?；怉，特別是3-脫-O-?；瘑瘟柞；怉和單磷?；怉、優(yōu)選3-脫-O-?；瘑瘟柞；怉(3D-MPL)與鋁鹽(優(yōu)選磷酸鋁)的組合。增強(qiáng)的系統(tǒng)包括單磷?；怉和皂苷衍生物的組合，特別是WO94/00153中公開(kāi)的QS21與3D-MPL的組合，或如WO96/33739中公開(kāi)的反應(yīng)原性較低的組合物，其中用膽固醇猝滅QS21。WO95/17210中描述了特別有效的、包含QS213D-MPL和生育酚的水包油乳液的佐劑，且其是優(yōu)選的制劑。
所述疫苗可包括皂苷，更優(yōu)選QS21。它還可包括水包油乳液和生育酚。含有寡核苷酸的未甲基化的CpG(WO96/02555)是TH1反應(yīng)的優(yōu)選誘導(dǎo)劑，且適用于本發(fā)明。
本發(fā)明的疫苗制品可用于保護(hù)或治療易感染的哺乳動(dòng)物，其中經(jīng)由全身或粘膜途徑給予所述疫苗。這些給藥可包括經(jīng)由肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑注射；或經(jīng)由粘膜給予口腔/消化、呼吸、泌尿生殖道。因此本發(fā)明其中一個(gè)方面是使人類宿主免疫而抗革蘭氏陰性菌感染所引起的疾病的方法，該方法包括給予所述宿主免疫保護(hù)劑量的本發(fā)明OMV制品。
選擇每個(gè)疫苗劑型中的抗原量，其可誘導(dǎo)免疫保護(hù)反應(yīng)且沒(méi)有一般疫苗的明顯的副作用。這種量可根據(jù)所用的特定免疫原以及如何提供而變化。通常預(yù)期每個(gè)劑型包含1-100μg蛋白抗原或OMV制品，優(yōu)選5-50μg，且最一般5-25μg。
特定疫苗的最佳用量可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)研究確定，該標(biāo)準(zhǔn)研究包括觀察受試者中的適宜免疫反應(yīng)。初次接種后，受試者可接受一次或若干次適當(dāng)間隔的加強(qiáng)免疫。
本發(fā)明的疫苗優(yōu)選是免疫保護(hù)性且無(wú)毒的，并適于兒童和青少年使用。
給兒科使用時(shí)，它是指小于4歲的兒童。
免疫保護(hù)性是指令人滿意地滿足上述SBA和/或動(dòng)物保護(hù)模型和/或粘附阻斷測(cè)定法。
無(wú)毒是指通過(guò)熟知的LAL和熱原性測(cè)定法測(cè)量，疫苗中的內(nèi)毒素活性水平不大于令人滿意的水平。
本發(fā)明的多核苷酸“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA?！岸嗪塑账帷卑ǖ幌抻趩捂満碗p鏈的DNA，單鏈和雙鏈區(qū)混合的DNA，單鏈和雙鏈的RNA，單鏈和雙鏈區(qū)混合的RNA，包含單鏈或，更通常雙鏈或單鏈與雙鏈區(qū)混合的DNA和RNA的雜交分子。此外“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或同時(shí)包含RNA與DNA的三鏈區(qū)。術(shù)語(yǔ)多核苷酸還包括含有一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的DNA或RNA，和具有由于穩(wěn)定性或其它原因而被修飾的主鏈的DNA或RNA?！靶揎棥眽A基包括，例如，三苯甲基化的堿基和特殊堿基如肌苷。已經(jīng)對(duì)DNA和RNA進(jìn)行了各種修飾；因此，“多核苷酸”包括一般天然存在的多核苷酸的化學(xué)、酶或代謝修飾形式，以及病毒和細(xì)胞特征性的DNA和RNA的化學(xué)形式?！岸嗪塑账帷边€包括相對(duì)較短的多核苷酸，通常被稱作寡核苷酸。
本發(fā)明另一方面涉及免疫/疫苗制劑，其包含一種或多種多核苷酸。這種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，見(jiàn)，例如Wolff等人，Science(1990)2471465-8。
這種疫苗包含編碼與上述本發(fā)明蛋白組合相對(duì)應(yīng)的多種蛋白的一種或多種多核苷酸。
來(lái)源于這種多核苷酸的蛋白的表達(dá)將受到真核啟動(dòng)子的控制，該啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。此外所述多核苷酸可包含編碼其它抗原的序列?？沈?qū)動(dòng)表達(dá)的真核啟動(dòng)子的例子包括來(lái)源于病毒的病毒啟動(dòng)子，包括腺病毒啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子?？蛇x擇性地，哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子可用于驅(qū)動(dòng)表達(dá)。
本發(fā)明其它方面本發(fā)明另一方面包括用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌病的方法，包括在宿主需要時(shí)，給予其保護(hù)劑量(或有效量)的本發(fā)明疫苗。腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、B、C、Y或W135和/或淋病奈瑟氏球菌感染可被有利地預(yù)防或治療。
本發(fā)明還包括本發(fā)明疫苗在制備用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌感染的藥物中的用途。此外奈瑟氏球菌感染包括由腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、B、C、Y、W-135和/或淋病奈瑟氏球菌引起的感染。
本發(fā)明另一方面是可衍生本發(fā)明外膜小泡(如上所述，具有本發(fā)明重組上調(diào)的至少兩種蛋白)的基因工程改造的奈瑟氏球菌菌株。這種奈瑟氏球菌菌株可以是腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌。
所述菌株還可被改造(如上所述)以下調(diào)其它奈瑟氏球菌蛋白的表達(dá)，包括LgtB、LgtE、SiaD、OpC、OpA、PorA、FrpB、msbB和HtrB中1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)的表達(dá)。用于下調(diào)的優(yōu)選組合包括至少LgtB和SiaD的下調(diào)(優(yōu)選缺失)、至少PorA和OpC的下調(diào)、至少PorA和OpA的下調(diào)以及至少PorA、OpA和OpC的下調(diào)。
本發(fā)明另一方面是制備本發(fā)明免疫原性組合物或疫苗的方法。這些方法包括將至少兩種來(lái)源于奈瑟氏球菌的分離抗原或蛋白混合在一起的步驟，其可以以來(lái)源于本發(fā)明奈瑟氏球菌菌株的泡形式存在，從而制備本發(fā)明的免疫原性組合物，另一制備本發(fā)明疫苗的方法包括將本發(fā)明的免疫原性組合物與藥學(xué)上可接受的載體組合的步驟。
也包括在本發(fā)明中的制備本發(fā)明免疫原性組合物的方法包括分離奈瑟氏球菌培養(yǎng)物中的外膜小泡的步驟。這種方法可包括將至少兩種外膜小泡制品混合的又一步驟，優(yōu)選其中至少一種外膜小泡制品包含免疫型L2的LPS且至少一種外膜小泡制品包含免疫型L3的LPS。本發(fā)明還包括這種方法，其中所述外膜小泡制品是通過(guò)用0-0.5％濃度的DOC提取而分離的。0.3％-0.5％濃度的DOC用于將LPS含量減到最小。在OMV制品中，其中LPS作為抗原是保守的，0-0.3％、優(yōu)選0.05％-0.2％、最優(yōu)選約0.1％濃度的DOC用于提取。
血影細(xì)胞或被殺死的全細(xì)胞疫苗本發(fā)明人預(yù)期對(duì)泡制品和疫苗的上述改進(jìn)可很容易地?cái)U(kuò)展至血影細(xì)胞或被殺死的全細(xì)胞制品和疫苗(具有相同的優(yōu)點(diǎn))。可從其制備泡制品的本發(fā)明修飾的革蘭氏陰性菌菌株還可用于制備血影細(xì)胞和被殺死的全細(xì)胞制品。從革蘭氏陰性菌菌株制備血影制品(具有完整外膜的空細(xì)胞)是本領(lǐng)域熟知的(見(jiàn)例如WO92/01791)。殺死全細(xì)胞以制備用于疫苗中的滅活細(xì)胞制品的方法也是熟知的。術(shù)語(yǔ)‘泡[或OMV]制品’和‘泡[或OMV]疫苗’以及本文獻(xiàn)所描述的方法因此，因本發(fā)明目的起見(jiàn)，可分別應(yīng)用于本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)‘血影制品’和‘血影疫苗’和‘被殺死的全細(xì)胞制品’和‘被殺死的全細(xì)胞疫苗’。
抗體和被動(dòng)免疫本發(fā)明另一方面是制備用于預(yù)防或治療奈瑟氏球菌感染的免疫球蛋白的方法，包括用本發(fā)明疫苗使受體免疫并分離受體中免疫球蛋白的步驟。通過(guò)該方法制備的免疫球蛋白是本方面的另一方面。包含本發(fā)明免疫球蛋白以及藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物是本發(fā)明的另一方面，其可制備用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌病的藥物。用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌感染的方法是本發(fā)明的另一方面，該方法包括給予患者有效量的本發(fā)明的藥物制品。
用于多克隆抗體產(chǎn)生的接種物通常是通過(guò)將抗原性組合物分散在適于人類使用的生理學(xué)耐受的稀釋劑，如生理鹽水或其它佐劑中，從而形成含水組合物而制備的。將免疫刺激量的接種物給予哺乳動(dòng)物，然后使接種的哺乳動(dòng)物維持一段時(shí)，這段時(shí)間足以使抗原性組合物誘導(dǎo)保護(hù)性抗體。
可通過(guò)熟知的技術(shù)，如親和層析分離抗體至所需的程度(Harlow和Lane Antibodies；a laboratory manual 1988)。
抗體可包括來(lái)源于通常使用的各種動(dòng)物，例如，山羊、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、驢、豬、馬、豚鼠、大鼠或人的抗血清制品。給所述動(dòng)物抽血并回收血清。
按照本發(fā)明生產(chǎn)的免疫球蛋白可包括完整的抗體、抗體片段或亞片段?？贵w可以是任何種類，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的完整免疫球蛋白，嵌合抗體或?qū)Ρ景l(fā)明兩種或多種抗原具有雙重特異性的雜交抗體。它們還可以是片段，例如F(ab′)2、Fab’、Fab、Fv等，包括雜交片段。免疫球蛋白還包括天然的、合成的或基因工程改造的蛋白，它們可通過(guò)與特異性抗原結(jié)合形成復(fù)合體而像抗體一樣發(fā)揮作用。
可將本發(fā)明的疫苗給予受體，然后受體作為免疫球蛋白的來(lái)源發(fā)揮作用，該免疫球蛋白是在應(yīng)答特異性疫苗的攻擊時(shí)產(chǎn)生的。然后經(jīng)由常規(guī)的血漿分離方法從如此治療過(guò)的受試者所捐獻(xiàn)的血漿中獲得超免疫球蛋白。將所述超免疫球蛋白給予另一受試者，從而產(chǎn)生抗或治療奈瑟氏球菌感染的抗性。本發(fā)明的超免疫球蛋白特別用于治療或預(yù)防兒童、無(wú)免疫應(yīng)答個(gè)體或在需要治療對(duì)而個(gè)體在應(yīng)答接種免疫時(shí)沒(méi)時(shí)間產(chǎn)生抗體的奈瑟氏球菌病。本發(fā)明另一方面是一種藥物組合物，它包含對(duì)本發(fā)明免疫原性組合物至少兩種組分具有反應(yīng)性的兩種或多種單克隆抗體(或其片段；優(yōu)選人或人源化的)，該藥物組合物可用于治療或預(yù)防革蘭氏陰性菌，優(yōu)選奈瑟氏球菌，更優(yōu)選腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌，最優(yōu)選腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B所引起的感染。
這種藥物組合物包括單克隆抗體，它們可以是任何種類，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的完整免疫球蛋白，嵌合抗體或?qū)Ρ景l(fā)明兩種或多種抗原具有特異性的雜交抗體。它們還可以是片段，例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等，包括雜交片段。
制備單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的，且包括脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合體(Kohler和Milstein 1975 Nature 256；495；Antibodies-a laboratory manual Harlow and Lane 1988)?？蛇x擇性地，單克隆Fv片段可通過(guò)篩選適宜的噬菌體展示庫(kù)而獲得(Vaughan TJ等人，1998 Nature Biotechnology 16；535)。利用已知方法，單克隆抗體可以是人源化的或部分人源化的。
本專利說(shuō)明書(shū)中引證的所有參考文獻(xiàn)或?qū)＠暾?qǐng)均引入此處作為參考。
本發(fā)明人指出此處每個(gè)例子中的術(shù)語(yǔ)“包括(comprising)”、“包括(comprise)”和“包括(comprises)”可分別任選用“由的組成(consisting of)”、“由的組成(consist of)”和“由的組成(consists of)”替代。
本發(fā)明的工業(yè)應(yīng)用方法除非另有詳細(xì)描述，下面的實(shí)施例是使用本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知且常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行的。實(shí)施例僅是舉例說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1構(gòu)建用于外膜小泡制品中的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B的方法WO01/09350提供用于制備外膜小泡并處理衍生外膜小泡的細(xì)菌菌株的詳細(xì)方法。當(dāng)外膜小泡保留有脂蛋白如TbpB或脂多糖時(shí)，優(yōu)選使用低水平或不使用脫氧膽酸鹽的分離方法。
實(shí)施例2Hsf蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表達(dá)PorA的重組腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株中的上調(diào)如WO01/09350實(shí)施例中所述，在某些國(guó)家，PorA在外膜小泡中的存在可能是有利的，且可增強(qiáng)重組改良泡的疫苗功效。在下列實(shí)施例中，我們使用修飾的pCMK(+)載體上調(diào)Hsf蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表達(dá)PorA的菌株中的表達(dá)。原始的pCMK(+)載體包括在表達(dá)lac1q的大腸桿菌宿主中被抑制，但在腦膜炎奈瑟氏球菌中是轉(zhuǎn)錄活性的嵌合porA/lacO啟動(dòng)子。在修飾的pCMK(+)中，天然的porA啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)hsf基因的轉(zhuǎn)錄。編碼Hsf的基因是使用下表中提供的HSF01-NdeI和HSF 02-NheI寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的。由于HSF01-NdeI引物的序列，所表達(dá)Hsf蛋白的5’末端包括兩個(gè)甲硫氨酸殘基。PCR擴(kuò)增所用的條件是由供應(yīng)商描述的那些(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。熱循環(huán)如下25次(94℃1分鐘，48℃1分鐘，72℃3分鐘)和1次(72℃10分鐘，4℃直到回收)。隨后在pCMK(+)送遞載體相應(yīng)限制位點(diǎn)中克隆相應(yīng)的擴(kuò)增子。在該重組質(zhì)粒中，即所設(shè)計(jì)的pCMK(+)-Hsf中，我們通過(guò)重組PCR策略使存在于嵌合porA/lacO啟動(dòng)子中的lacO缺失。pCMK(+)-Hsf質(zhì)粒被用作模板以使下列2個(gè)單獨(dú)的DNA片段PCR擴(kuò)增-片段1包括porA5’誘重組區(qū)，卡那霉素抗性基因和porA啟動(dòng)子。所用的寡核苷酸引物RP1(SacII)和RP2在下表中提供。RP1引物與緊在lac操縱子上游的序列同源。
-片段2包括來(lái)源于porA基因的Shine-Dalgarno序列、hsf基因和porA3’重組區(qū)。所用的寡核苷酸引物RP3和RP4(ApaI)在下表中提供。RP3引物與緊在lac操縱子下游的序列同源。片段1的3’末端和片段2的5’末端具有48個(gè)堿基重疊。將各500ng PCR(1和2)用于使用引物RP1和RP4進(jìn)行的終PCR反應(yīng)。將所得的終擴(kuò)增子亞克隆到用SacII和ApaI限制酶切的pSL1180載體中。使用QIAGEN maxiprep試劑盒大規(guī)模純化修飾質(zhì)粒pCMK(+)-Hsf，并將2μg該材料用于轉(zhuǎn)化缺少功能性cps基因的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株。為了維持porA的表達(dá)，通過(guò)PCR和蛋白質(zhì)印跡篩選方法的組合來(lái)選擇單一交換產(chǎn)生的整合。將通過(guò)porA-特異性PCR和蛋白質(zhì)印跡被證實(shí)為陽(yáng)性的卡那霉素抗性克隆在-70℃以甘油原液貯存用于進(jìn)一步的研究。將細(xì)菌(相當(dāng)于約5.108個(gè)細(xì)菌)重懸浮于50μl PAGE-SDS緩沖液中，冷凍(-20℃)/沸騰(100℃)3次，然后通過(guò)PAGE-SDS電泳在12.5％凝膠上分離。Hsf的表達(dá)是在來(lái)源于NmB[Cps-，PorA+]或NmB[Cps-，PorA+，Hsf+]的全細(xì)胞細(xì)菌溶菌產(chǎn)物(WCBL)中檢測(cè)的?？捡R斯染色可檢測(cè)出Hsf表達(dá)的顯著增加(相當(dāng)于內(nèi)源性Hsf水平)。該結(jié)果證實(shí)修飾pCMK(+)-Hsf載體是功能性的且可成功用于上調(diào)外膜蛋白的表達(dá)，不會(huì)消除主要PorA外膜蛋白抗原的產(chǎn)生。
這項(xiàng)工作中使用的寡核苷酸

實(shí)施例3利用啟動(dòng)子置換上調(diào)腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B的tbpA基因?qū)嶒?yàn)的目的是用較強(qiáng)的porA啟動(dòng)子置換tbpA基因的內(nèi)源性啟動(dòng)子區(qū)，以上調(diào)TbpA抗原的產(chǎn)生。就該目的而言，啟動(dòng)子置換質(zhì)粒是用大腸桿菌克隆方法構(gòu)建的。位于tbpA編碼區(qū)列上游的DNA區(qū)(731bp)是在腦膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC 13090的私立Incyte PathoSeq數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的。該DNA包含編碼TbpB抗原的序列。所述基因是在操縱子中組織的。TbpB基因?qū)⑷笔Р⒈籆mR/porA啟動(dòng)子彈夾置換。就該目的而言，與tbpB基因的509bp5’側(cè)翼區(qū)、2139bp的tbpB編碼序列、87bp的基因間序列以及tbpA編碼序列的前483個(gè)核苷酸相對(duì)應(yīng)的3218bp的DNA片段是用含有吸收序列和NheI及HindIII限制位點(diǎn)(下劃線)的寡核苷酸BAD16(5’-GGC CTAGCT AGCCGT CTG AAG CGA TTAGAG TTT CAA AAT TTA TTC-3’)和BAD17(5’-GGC CAAGCTTCA GAC GGCGTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3′’)從腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B基因組DNA擴(kuò)增的。用High Pure Kit(Boerhinger Mannheim，德國(guó))純化該P(yáng)CR片段并將其直接克隆到pGemT載體(Promega，美國(guó))中。使該質(zhì)粒進(jìn)行循環(huán)PCR誘變(Jones和Winistofer(1992))以便(i)插入適宜的限制位點(diǎn)，使CmR/PorA啟動(dòng)子盒克隆和(ii)使209bp的tbpB 5’側(cè)翼序列和tbpB編碼序列缺失。循環(huán)PCR是用含有適宜限制位點(diǎn)XmaI、BglII和XhoI(下劃線)的BAD18(5’-TCCCCC GGGAAG ATCTGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3’)和BAD19(5’-GGAAGA TCTCCGCTC GAGCAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATTTGT TCC G-3’)寡核苷酸進(jìn)行的。CmR/PorA啟動(dòng)子彈夾是使用含有適宜限制位點(diǎn)XmaI、SpeI、BglII和XhoI(下劃線)的引物BAD21(5’-GGAAGA TCTCCGCTC GAGACA TCG GGC AAA CAC CCG-3’)和BAD20(5’-TCCCCC GGGAGA TCTCAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3’)，按照先前所述從pUC D15/Omp85質(zhì)粒擴(kuò)增的。將該P(yáng)CR片段克隆到循環(huán)PCR質(zhì)粒中。該質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B[cps-]和[cps-porA-]菌株。通過(guò)在tbpA上游區(qū)中進(jìn)行雙重交換進(jìn)行整合可將porA啟動(dòng)子直接插入到tbpA ATG的上游。
實(shí)施例4兩種抗原TbpA和Hsf的表達(dá)被上調(diào)的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭瑫r(shí)上調(diào)TbpA和Hsf在同一腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株中的表達(dá)。TbpA的產(chǎn)生是通過(guò)用較強(qiáng)的porA啟動(dòng)子置換其內(nèi)源性啟動(dòng)子區(qū)而被上調(diào)的(啟動(dòng)子置換)。在本文中，位于tbpA上游的tbpB基因缺失，且TbpB蛋白不再存在于外膜中。Hsf的表達(dá)是通過(guò)在porA基因座插入相應(yīng)基因的第二個(gè)拷貝(同源重組)而被上調(diào)的(基因送遞)。兩種菌株已經(jīng)在WO01/09350獨(dú)立專利中描述。兩種策略中所用的選擇標(biāo)記(CmR或KanR)可使兩種整合到同一染色體中。
通過(guò)Qiagen Genomic尖端500-G方案從重組Nm.B cps-/TbpA+/PorA+菌株提取總基因組DNA。用DraIII限制酶限制酶切10μgDNA，并用于通過(guò)經(jīng)典轉(zhuǎn)化方案轉(zhuǎn)化腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B。用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是重組NmB cps-/Hsf+/PorA+(通過(guò)1次交換到porA基因座中而進(jìn)行的同源重組)或重組NmB cps-/Hsf+/PorA-(通過(guò)2次交換到porA基因座中而進(jìn)行的等位基因交換/同源重組)。將它們平板接種在含200μg/ml卡那霉素的GC瓊脂上過(guò)夜，在GC液體培養(yǎng)基10mMMgCl2中被稀釋到DO650＝0.1，并在用力攪拌的條件下與10μg DraIII限制酶切的基因組DNA于37℃溫育6小時(shí)。在含有200μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的GC培養(yǎng)基上選擇由于雙重交換事件(PCR篩選)產(chǎn)生的重組腦膜炎奈瑟氏球菌，并分析TbpA和Hsf在OMV制品中的表達(dá)。如圖1所示，與從對(duì)照NmB cps-菌株制備的OMV相比，從TbpA/Hsf重組NmB菌株制備的OMV中的TbpA和Hsf產(chǎn)生顯著增加。各蛋白在雙重重組體中的過(guò)量表達(dá)水平可與在相應(yīng)的單一重組體中獲得的表達(dá)水平相比較。TbpA和Hsf的過(guò)量表達(dá)水平是在PorA+和PorA-菌株中比較的(沒(méi)有給出數(shù)據(jù))。這些數(shù)據(jù)共同證實(shí)了(i)TbpA和Hsf在腦膜炎奈瑟氏球菌中的表達(dá)可共同且相伴地被上調(diào)，且(ii)可獲得富含TbpA和Hsf的重組泡并用于免疫。
實(shí)施例5兩種抗原TbpA和NspA的表達(dá)被上調(diào)的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭瑫r(shí)上調(diào)TbpA和NspA在同一腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株中的表達(dá)。TbpA的產(chǎn)生是通過(guò)用較強(qiáng)的porA啟動(dòng)子置換其內(nèi)源性啟動(dòng)子區(qū)而被上調(diào)的(啟動(dòng)子置換)。NspA的表達(dá)是通過(guò)在porA基因座插入相應(yīng)基因的第二個(gè)拷貝(同源重組)而被上調(diào)的(基因送遞)。兩種菌株已經(jīng)在獨(dú)立專利WO01/09350描述。兩種策略中所用的選擇標(biāo)記(CmR或KanR)可使兩種整合到同一染色體中。
通過(guò)Qiagen Genomic尖端500-G方案從重組NmB cps-/TbpA+/PorA+菌株提取總基因組DNA。用AatII限制酶限制酶切10μgDNA，并用于通過(guò)經(jīng)典轉(zhuǎn)化方案轉(zhuǎn)化腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B。用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是重組NmB cps-/NspA+/PorA+。將它們平板接種在含200μg/ml卡那霉素的GC瓊脂上過(guò)夜，在GC液體培養(yǎng)基10mM MgCl2中被稀釋到DO650＝0.1，并在用力攪拌的條件下與10μg AatII限制酶切的基因組DNA于37℃溫育6小時(shí)。在含有200μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的GC培養(yǎng)基上選擇由于雙重交換事件(PCR篩選)產(chǎn)生的重組腦膜炎奈瑟氏球菌，并分析TbpA和NspA在OMV制品中的表達(dá)。與從對(duì)照NmB cps-菌株制備的OMV相比，從TbpA/NspA重組NmB菌株制備的OMV中的TbpA和NspA產(chǎn)生顯著增加。各蛋白在雙重重組體中的過(guò)量表達(dá)水平可與在相應(yīng)的單一重組體中獲得的表達(dá)水平相比較。這些數(shù)據(jù)共同證實(shí)了(i)TbpA和NspA在腦膜炎奈瑟氏球菌中的表達(dá)可共同且相伴地被上調(diào)，且(ii)可獲得富含TbpA和NspA的重組泡并用于免疫。
實(shí)施例6兩種抗原NspA和D15/Omp85的表達(dá)被上調(diào)的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)的是同時(shí)上調(diào)NspA和D15/Omp85在同一腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株中的表達(dá)。D15/Omp85的產(chǎn)生是通過(guò)用較強(qiáng)的porA啟動(dòng)子置換其內(nèi)源性啟動(dòng)子區(qū)而被上調(diào)的(啟動(dòng)子置換)。NspA的表達(dá)是通過(guò)在porA基因座插入相應(yīng)基因的第二個(gè)拷貝(同源重組)而被上調(diào)的(基因送遞)。兩種菌株已經(jīng)在獨(dú)立專利WO01/09350中描述。兩種策略中所用的選擇標(biāo)記(CmR或KanR)可使兩種整合組合到同一染色體中。
通過(guò)Qiagen Genomic尖端500-G方案從重組NmB cps-/D15-Omp85/PorA+菌株提取總基因組DNA。用AatII限制酶限制酶切10μgDNA，并用于通過(guò)經(jīng)典轉(zhuǎn)化方案轉(zhuǎn)化腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B。用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是重組NmB cps-/NspA+/PorA-。將它們平板接種在含200μg/ml卡那霉素的GC瓊脂上過(guò)夜，在GC液體培養(yǎng)基，10mM MgCl2中被稀釋到DO650＝0.1，并在用力攪拌的條件下與10μg AatII限制酶切的基因組DNA于37℃溫育6小時(shí)。在含有200μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的GC培養(yǎng)基上選擇由于雙重交換事件(PCR篩選)產(chǎn)生的重組腦膜炎奈瑟氏球菌，并分析NspA和D15/Omp85在OMV制品中的表達(dá)。與從對(duì)照NmB cps-菌株制備的OMV相比，從NspA/D15-Omp85重組NmB菌株制備的OMV中的NspA和D15/Omp85產(chǎn)生顯著增加。各蛋白在雙重重組體中的過(guò)量表達(dá)水平可與在相應(yīng)的單一重組體中獲得的表達(dá)水平相比較。這些數(shù)據(jù)共同證實(shí)了(i)NspA和Omp85在腦膜炎奈瑟氏球菌中的表達(dá)可共同且相伴地被上調(diào)，且(ii)可獲得富含NspA和Omp85的重組泡并用于免疫。
實(shí)施例7重組Hsf形式在大腸桿菌中的產(chǎn)生和純化對(duì)來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌的Hsf-樣蛋白進(jìn)行的計(jì)算機(jī)分析揭示了至少4個(gè)結(jié)構(gòu)域。將來(lái)源于菌株H44/76的Hsf序列作為參考，包含氨基酸1-51的結(jié)構(gòu)域1編碼自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特征性的sec-依賴性信號(hào)肽，包含氨基酸52-473的結(jié)構(gòu)域2編碼很可能是表面外露的且易進(jìn)入免疫系統(tǒng)的過(guò)客結(jié)構(gòu)域，包含氨基酸474-534的結(jié)構(gòu)域3編碼蛋白低聚所需的推定卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域及絞鏈(頸部)區(qū)，包含殘基535-C末端的結(jié)構(gòu)域4被預(yù)測(cè)編碼可能裝配成桶-樣結(jié)構(gòu)且被錨定在外膜中的β-鏈(Henderson等人，(1998)，Trends Microbiol.6370-378；Hoiczyk等人，(2000)，EMBO 225989-5999)。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)域2和3很可能是表面外露的，且很好保守的(在所測(cè)試的所有菌株中超過(guò)80％；如Pizza等人，(2000)，Science 2871816-1820所述)，它們代表了目標(biāo)疫苗候選物。就該目的而言，結(jié)構(gòu)域2(被稱作Hsf過(guò)客結(jié)構(gòu)域)和結(jié)構(gòu)域2+3(被稱作Hsf頸部區(qū)+卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域)在大腸桿菌中表達(dá)并被純化。編碼氨基酸52-473(Hsf過(guò)客)和52-534(Hsfn+cc)的DNA片段是用加入末端RcaI(正向引物)和XhoI(反向引物)限制位點(diǎn)的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增的。純化的擴(kuò)增子是用RcaI/XhoI在供應(yīng)商建議的條件下消化的；且隨后被克隆到pET24d(Novagen Inc.，MadisonWI)大腸桿菌表達(dá)載體的NcoI(與rcaI相容)/XhoI位點(diǎn)中。選擇重組質(zhì)粒并用于制備純化重組質(zhì)粒。進(jìn)行表達(dá)研究時(shí)，將這些載體(pET-Hsfpas和pET-Hsf ncc)引入到大腸桿菌菌株B121DE3(Novagen)中，其中，T7聚合酶的基因受到異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)-可調(diào)節(jié)的lac啟動(dòng)子的控制。Novablue(DE3)[pET-24b/BASB029]大腸桿菌重組菌株的液體培養(yǎng)物(700ml)是在37℃攪拌下生長(zhǎng)的，直到600nm的光密度(OD600)達(dá)到0.6。在該時(shí)間點(diǎn)，加入IPTG至1mM終濃度，使培養(yǎng)物再生長(zhǎng)4小時(shí)。然后10,000rpm離心該培養(yǎng)物，將沉淀在-20℃冷凍至少10小時(shí)。融化后，在細(xì)胞溶解之前，22℃下，利用Rannie破裂器通過(guò)兩種途徑將沉淀(680ml培養(yǎng)物)重懸浮于pH7.0的20mM磷酸鹽緩沖液中30分鐘。4℃下，15,000rpm(Beckman J2-HS離心機(jī)，JA-20轉(zhuǎn)子)離心溶解的細(xì)胞30分鐘使其成為沉淀。將上清液上樣到在pH8.0的20mM Tris-HCl緩沖液中平衡的Q-瓊脂糖快速流動(dòng)柱(Pharmacia)上。流過(guò)后，用5倍柱體積的pH8.0的20mM Tris-HCl緩沖液洗滌柱子。利用溶于pH8.0的20mM Tris-HCl緩沖液中的250mMNaCl溶液洗脫柱上的重組蛋白。收集抗原陽(yáng)性級(jí)分，并相對(duì)于pH7.0的20mM磷酸鹽緩沖液透析過(guò)夜。然后將0.5M NaCl和20mM咪唑加入到透析樣品中。然后將樣品應(yīng)用在Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen)上，該柱是在含500mM NaCl和pH7.0的20mM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液中平衡的。流過(guò)后，用5倍柱體積含500mM NaCl和20mM咪唑的pH7.0的20mM磷酸鹽緩沖液洗滌柱子。用溶于pH7.0的20mM磷酸鹽緩沖液中的100mM咪唑溶液洗脫污染物。用溶于pH7.0的20mM磷酸鹽緩沖液中的250mM咪唑溶液洗脫重組蛋白。收集抗原陽(yáng)性級(jí)別并相對(duì)于含150mMNaCl的pH6.8的10mM磷酸鹽緩沖液透析。如圖2所示，從柱上洗脫富聚的(據(jù)估計(jì)在CBB染色的SDS-PAGE中的純度高于90％)Hsf-樣過(guò)客蛋白，它們遷移到約47kDa(估計(jì)的相對(duì)分子量)處。該多肽對(duì)5-組氨酸基序產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體是反應(yīng)性的。這些數(shù)據(jù)共同表明Hsf過(guò)客及Hsf ncc基因可以以重組形式在大腸桿菌中表達(dá)并純化。
實(shí)施例8重組Hap過(guò)客在大腸桿菌中的產(chǎn)生和純化對(duì)來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌的Hap-樣蛋白進(jìn)行的計(jì)算機(jī)分析揭示了至少3個(gè)結(jié)構(gòu)域。將來(lái)源于菌株H44/76的Hap-樣序列作為參考，包含氨基酸1-42的結(jié)構(gòu)域1編碼自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特征性的sec-依賴性信號(hào)肽，包含氨基酸43-950的結(jié)構(gòu)域2編碼很可能是表面外露的且易進(jìn)入免疫系統(tǒng)的過(guò)客結(jié)構(gòu)域，包含氨基酸951-C末端(1457)的結(jié)構(gòu)域3被預(yù)測(cè)編碼可能裝配成桶-樣結(jié)構(gòu)且被錨定在外膜中的β-鏈。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)域2很可能是表面外露的，且很好保守的(在所測(cè)試的所有菌株中超過(guò)80％)并可能作為亞單位抗原在大腸桿菌中產(chǎn)生，所以它代表了目標(biāo)疫苗候選物。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)域2和3很可能是表面外露的，且很好保守的(在所測(cè)試的所有菌株中超過(guò)80％；如Pizza等人，(2000)，Science 2871816-1820所述)，所以它們代表了目標(biāo)疫苗候選物。就該目的而言，結(jié)構(gòu)域2(被稱作Hap過(guò)客結(jié)構(gòu)域)在大腸桿菌中表達(dá)并被純化。編碼氨基酸43-950(Hap過(guò)客)的DNA片段是用加入末端NcoI(正向引物)和XhoI(反向引物)限制位點(diǎn)的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增的。純化的擴(kuò)增子是用NcoI/XhoI在供應(yīng)商建議的條件下消化的；且隨后被克隆到pET24d(Novagen Inc.，Madison WI)大腸桿菌表達(dá)載體的NcoI/XhoI位點(diǎn)中。選擇重組質(zhì)粒并大規(guī)模純化。進(jìn)行表達(dá)研究時(shí)，將這些載體(pET-Hap pass)引入到大腸桿菌菌株B121DE3(Novagen)中，其中，T7聚合酶的基因受到異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)-可調(diào)節(jié)的lac啟動(dòng)子的控制。
在發(fā)酵罐中培養(yǎng)大腸桿菌BL21[pET-Hap pass]將主接種物的等分試樣級(jí)分(100μl)在FEC013AA平板(大豆胨A3 20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L、瓊脂18g/L、蒸餾水加到1L)上擴(kuò)散，并在37℃下生長(zhǎng)20小時(shí)。收獲菌苔并重懸浮于含0.9％NaCl的無(wú)菌水中。該溶液用于以批量模式在20L發(fā)酵罐中的FEC011AC培養(yǎng)基(大豆胨24g/L、酵母提取物48g/L、MgSO4/7H2O 0.5g/L、K2HPO42g/L、NaH2PO4/2H2O 0.45g/L、甘油(87％)40g和蒸餾水加到1L)上接種。維持溫度(30℃)、pH(6.8，NaOH 25％/H3PO425％)、壓力(500mbar)恒定，以20L/分換氣。在這些條件中，通過(guò)調(diào)整攪拌速度(100-1000rpm)將溶解的氧壓維持在20％。生長(zhǎng)8小時(shí)后加入誘導(dǎo)物(IPTG、1mM)(OD＝27.8)。6小時(shí)(OD＝49.2)和16H30(OD＝48.6)后收集樣品(6L)，離心收獲生物量，并在-20℃貯存相應(yīng)的顆粒狀物。
Hap過(guò)客的純化HAP過(guò)客是以批量模式自發(fā)酵罐純化的。開(kāi)發(fā)了純化流程(見(jiàn)下面)。
細(xì)胞破裂后，在離心沉淀中回收到大量Hap過(guò)客。用8M尿素進(jìn)行溶解。盡管有N-末端His-尾部，IMAC作為第一步是無(wú)效的，但第一步后仍在SP-XL陽(yáng)離子交換器上進(jìn)行。在該SP-瓊脂糖-XL上，在線性NaCl(0-250mM)梯度的中點(diǎn)定量洗脫蛋白。IMAC是用Cu++-上樣的螯合瓊脂糖FF進(jìn)行的，如同F(xiàn)HAb。該時(shí)間，與FHAb相反，IMAC顯示重要的純化因子。在SDS-PAGE上，IMAC之后HAP2/3似乎是純的。然而在0-200mM咪唑梯度下，HAP2/3的峰非常寬，因此我們?cè)噲D通過(guò)咪唑步驟(10mM-100mM)洗脫；然而就純度而言，梯度模式似乎更有效。作為最后一步，我們?cè)囼?yàn)了通過(guò)凝膠滲透作用進(jìn)行尿素-精氨酸緩沖液交換，然而在這種情況下，蛋白有兩個(gè)洗脫峰。這兩個(gè)峰在SDS-PAGE上顯示出可比較的分布；因此假設(shè)是由于HAP過(guò)客的部分重折疊。然后我們進(jìn)行最后一步的經(jīng)典透析用于緩沖液交換。SDS-PAGE分析顯示終材料的良好純度(見(jiàn)圖3)。HAP過(guò)客純度是通過(guò)WB抗-his進(jìn)一步證實(shí)的。它由抗-大腸桿菌識(shí)別。分子量為96.1KD。
實(shí)施例9重組FrpA/C形式在大腸桿菌中的產(chǎn)生和純化腦膜炎奈瑟氏球菌編碼兩種RTX蛋白，它們被稱作FrpA和FrpC，是在鐵有限條件下分泌的(Thompson等人，(1993)J.Bacteriol.175811-818；Thompson等人，(1993)Infect.Immun..612906-2911)。RTX(重復(fù)毒素)蛋白家族在靠近它們的C-末端處共有具有如下一致序列的一系列9個(gè)氨基酸的重復(fù)Leu Xaa Gly Gly XaaGly(Asn/Asp)AspXaa.(LXGGXGN/DDX)。大腸桿菌HlyA中的重復(fù)單位被認(rèn)為是Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。如圖4所示，在菌株FAM20中表征的腦膜炎球菌FrpA和FrpC蛋白在它們的中心和C-末端區(qū)共有廣泛的氨基酸相似性，但N-末端的氨基酸相似性非常有限(如果有的話)。此外，在FrpA和FrpC之間保守的區(qū)顯示出某些多態(tài)性，這是由于9氨基酸基序的重復(fù)(在FrpA中13次，在FrpC中43次)。為了評(píng)價(jià)FrpA和FrpC的疫苗潛能，我們?cè)诖竽c桿菌中重組生產(chǎn)了在FrpA和FrpC之間保守的蛋白區(qū)。就該目的而言，包括氨基酸277-1007的DNA片段(關(guān)于腦膜炎奈瑟氏球菌FAM20肽序列)是用正向引物FrpA-19(5’-CTCGAGACCATGGGCAAA TATCATGTCTACGACCCCCTCGC-3’)和反向引物FrpA-18(3’-GTG CATAGTGTCAGAGTTTTTGTCGACGTCGTAATTATAGACC-3’)從腦膜炎奈瑟氏球菌血清組BH44/76基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增的。獲得分別為約1530bp(3個(gè)重復(fù)單位)、約2130bp(13個(gè)重復(fù)單位)和2732bp(23個(gè)重復(fù)單位)的3個(gè)擴(kuò)增子并用NcoI和SalI限制性內(nèi)切酶消化。然后將這些片段插入到pET24d的NcoI/XhoI(與SalI相容)位點(diǎn)中，并選擇重組質(zhì)粒(分別為pET-Frp3、pET-Frp13和pET-Frp23)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3細(xì)胞。如圖5所示，所有這3個(gè)構(gòu)建體均可在誘導(dǎo)后產(chǎn)生重組FrpA/C保守結(jié)構(gòu)域。此外，增加重復(fù)單位的數(shù)量可增加重組蛋白的溶解性，這是通過(guò)細(xì)胞分級(jí)分離分析測(cè)定的(沒(méi)有給出數(shù)據(jù))。
包含23個(gè)九肽LXGGXGN/DDX重復(fù)的FrpA/C保守結(jié)構(gòu)域(總計(jì)911aa)的純化培養(yǎng)3.5升大腸桿菌B121DE3[pET-FRP23]并在OD達(dá)到0.6時(shí)，通過(guò)加入2mM IPTG而誘導(dǎo)4小時(shí)。離心收獲細(xì)胞并將相應(yīng)的沉淀壓碎，離心澄清，并將相應(yīng)的上清液上樣在Ni2+-離子金屬親和柱上(Ni-NTA-瓊脂糖，Qiagen GmBh)。咪唑用于洗脫，且最終通過(guò)相對(duì)于pH6.8的10mM磷酸鈉、150mM NaCl進(jìn)行廣泛透析而被除去。
實(shí)施例10重組FHA形式在大腸桿菌中的產(chǎn)生和純化截短的FhaB自腦膜炎奈瑟氏球菌克隆基因組DNA是用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒(Qiagen Gmbh)從腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株H44/76的1010個(gè)細(xì)胞中提取的。然后使該材料(1μg)經(jīng)過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)DNA擴(kuò)增，其中使用下列FhaB基因的特異性引物JKP5’AAT GGA ATA CAT ATG AAT AAA GGT TTA CATCGC ATT ATC3’和57JKP 5’CCA ACT AGT GTT TTT CGC TAC TTG GAG CTGT3’。得到編碼所述蛋白前1433個(gè)N-末端氨基酸的約4200bp的DNA片段，用NdeI/SpeI限制性內(nèi)切酶消化并使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Second Edition，EdsSambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Cold Spring Harbor press 1989)插入到pMG MCS的相應(yīng)位點(diǎn)中(pMG衍生物，Proc Natl Acad Sci USA1985年1月；82(1)88-92)?？寺haB片段的DNA序列是用Big DyeCycle測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer)和ABI 373A/PRISM DNA測(cè)序儀測(cè)定的(見(jiàn)圖1)。然后使重組pMG-FhaB質(zhì)粒(1μg)經(jīng)歷聚合酶鏈反應(yīng)DNA擴(kuò)增，其中使用FhaB特異性引物(XJKP035’AATGGAATACATATGAATAAAGGTTTACATCGCATTATCTTTAG3’和XJKP57025’GGGGCCACTCGAGGTTTTTCGCTACTTGGAGCTGTTTCAG ATAGG3’)。獲得4214bp的DNA片段，利用NdeI/XhoI限制性內(nèi)切酶消化并使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(Molecular Cloning，a Laboratory Manual，SecondEdition，EdsSambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Cold Spring Harborpress 1989)插入到pET-24b克隆/表達(dá)載體(Novagen)的相應(yīng)位點(diǎn)中。含有截短FhaB(pET24b/FhaB2/3)的重組pET-24b的證實(shí)性測(cè)序是使用Big Dyes試劑盒(Applied biosystems)進(jìn)行的并在由供應(yīng)商描述的條件下，在ABI 373/A DNA測(cè)序儀上進(jìn)行分析。所得核苷酸序列在圖6中給出。
重組截短的FhaB蛋白在大腸杠桿菌中的表達(dá)和純化pET24b/FhaB2/3克隆/表達(dá)載體的構(gòu)建在上面描述。該載體攜帶從與6個(gè)組氨酸殘基片段融合的菌株H44/76中分離出來(lái)的截短FhaB基因(在重組產(chǎn)品的C-末端)，其受到強(qiáng)噬菌體T7基因10啟動(dòng)子的控制。進(jìn)行表達(dá)研究時(shí)，該載體被引入到大腸桿菌菌株Novablue(DE3)(Novagen)中，其中，T7聚合酶的基因受到異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)-可調(diào)節(jié)的lac啟動(dòng)子的控制。Novablue(DE3)[pET24b/FhaB2/3]大腸桿菌重組菌株的液體培養(yǎng)物(100ml)在37℃攪拌下生長(zhǎng)，直到600nm(OD600)的光密度達(dá)到0.6。在該時(shí)間點(diǎn)，加入IPTG到1mM終濃度，并使培養(yǎng)物再生長(zhǎng)4小時(shí)。然后10,000rpm離心培養(yǎng)物并將沉淀在-20℃冷凍至少10小時(shí)。融化后，25℃下將沉淀重懸浮于緩沖液A(6M鹽酸胍、0.1M NaH2PO4、0.01MTris，pH8.0)中30分鐘，3次通過(guò)針，并離心澄清(20000rpm，15分鐘)。然后以1ml/分鐘的流速將樣品上樣到Ni2+-上樣的Hitrap柱(Pharmacia Biotech)上。流過(guò)之后，用40ml緩沖液B(8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01M Trts，pH8.0)、40ml緩沖液C(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris，pH6.3)連續(xù)洗滌柱子。然后用30ml含有500mM咪唑的緩沖液D(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris，pH6.3)將柱上的重組蛋白FhaB2/3/His6洗脫下來(lái)，并收集3ml-大小的級(jí)分。如圖7所示，從柱上洗脫下遷移到大約154kDa(估計(jì)的相對(duì)分子量)處的高度富聚的FhaB-2/3/His6蛋白。該多肽對(duì)5-組氨酸基序的小鼠單克隆抗體是反應(yīng)性的。這些數(shù)據(jù)共同表明FhaB2/3可以以重組形式在大腸桿菌中表達(dá)并純化。
用重組FhaB2/3/His給小鼠免疫將在大腸桿菌中表達(dá)的部分純化的重組FhaB2/3/His6蛋白在第0、14和29天三次注射到Balb/C小鼠中(10只動(dòng)物/組)。用大約5μg抗原以兩種不同制劑通過(guò)皮下途徑給動(dòng)物注射或者吸附在100μgAlPO4上或在SBAS2乳液中配制(每個(gè)劑量的SB62乳液含5μg MPL和5μg QS21)。此外，還在實(shí)驗(yàn)中加入由僅用SBAS2乳液免疫的小鼠組成的陰性對(duì)照組。在第29天(II后15天)和第35(III后6天)給小鼠采血以檢測(cè)特異性抗-FhaB抗體。通過(guò)對(duì)純化重組FhaB2/3/His進(jìn)行ELISA而測(cè)量混合血清(10只小鼠/組)的特異性抗-FhaB抗體。
實(shí)施例11抗FHA、Hap和Hsf抗原產(chǎn)生的小鼠和兔血清的粘附阻斷活性與腦膜炎球菌FHAB-樣、Hsf-樣和Hap-樣同源的蛋白先前已被描述為重要的毒性決定因素并介導(dǎo)百日咳鮑特氏菌(FHA)和流感嗜血桿菌(Hap和Hsf)的細(xì)菌粘附。已知與上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附對(duì)于腦膜炎球菌的鼻咽定居和穿透血腦屏障而言至關(guān)重要。因此，阻礙腦膜炎球菌粘附提供了一種很有價(jià)值的方法，以控制腦膜炎球菌定居和感染。在這里我們測(cè)試了針對(duì)腦膜炎球菌FHAB2/3rd、Hap-樣和Hsf-樣抗原的抗-血清是否能夠阻礙腦膜炎奈瑟氏球菌與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。使用下列實(shí)驗(yàn)過(guò)程HUVEC粘附的抑制本研究中所用的腦膜炎球菌試驗(yàn)菌株是菌株NmA8013的無(wú)莢膜、無(wú)菌毛的Opa-和Opc-衍生物。37℃下，將腦膜炎球菌細(xì)胞(NmA8013衍生物的2.10E5集落形成單位(CFU))在由40μlRPMI、50μl胎牛血清和50μl血清組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30分鐘以測(cè)試粘附阻斷性。然后將該混合物放在含人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)匯合單層的孔中，其中的培養(yǎng)基之前已被除去。在37℃、5％CO2下培養(yǎng)細(xì)菌和HUVEC細(xì)胞4小時(shí)。然后用新鮮的RPMI血清洗滌細(xì)胞單層3次，隨后刮平板。然后連續(xù)稀釋并將細(xì)胞溶解產(chǎn)物接種在GC平板上，測(cè)定與HUVEC相關(guān)的CFU。37℃培養(yǎng)平板48小時(shí)，以回收并使細(xì)胞相關(guān)腦膜炎球菌生長(zhǎng)。
小鼠和兔血清的抗重組FHAB2/3rd、Hap和hsf抗原的粘附-阻斷活性抗-FHA 2/3、抗-Hsf全長(zhǎng)(WO99/58683中所述)和抗-Hap全長(zhǎng)(WO99/55873)抗體，以及針對(duì)相應(yīng)的Hsf和Hap過(guò)客結(jié)構(gòu)域的抗-血清可阻礙腦膜炎球菌與內(nèi)皮HUVEC細(xì)胞粘附。圖8舉例說(shuō)明與單獨(dú)的佐劑相比，由在AlPO4中配制的FHA2/3誘導(dǎo)的特異性抗體能夠抑制腦膜炎奈瑟氏球菌B與HUVEC細(xì)胞粘附。與單獨(dú)的SBAS2佐劑相比(沒(méi)有抗原，4組)，抗-FHA2/3abs(SBAS2制劑)仍然是有效的，但效力低于AlPO4。單獨(dú)的SBAS2佐劑(沒(méi)有抗原)不能誘導(dǎo)可阻礙粘附的抗體。與4組相比，抗-Hap抗體(1組)可能具有輕微的抑制作用。在5組中，當(dāng)試驗(yàn)抗-FHA2/3、抗-Hsf和抗-Hap抗體的混合物時(shí)，粘附的抑制強(qiáng)于單獨(dú)的抗-FHA2/3，表明抗-Hap和抗-Hsf抗體產(chǎn)生了協(xié)同作用。在第二組抑制實(shí)驗(yàn)(圖2)中，與陰性對(duì)照相比(3和4組)，針對(duì)抗OMV過(guò)量表達(dá)Hsf(作為候選蛋白)的特異性兔抗血清能夠部分抑制腦膜炎奈瑟氏球菌B固定在內(nèi)皮細(xì)胞上。該兔抗血清已被證實(shí)包含非常高的特異性抗-Hsf抗體效價(jià)。針對(duì)rec Hsf(Hsf過(guò)客和Hsf全長(zhǎng))的抗體也能夠抑制細(xì)菌在HUVEC細(xì)胞上的粘附。用小鼠血清(5-6組)和用兔血清(激光擴(kuò)展(laserextend))(7-8組)都是這樣的。在該第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)了已經(jīng)在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的特異性抗-rec FHA2/3抗體(1組)具有非常高的抑制作用。這些結(jié)果表明這些特異性抗原(Hap、FHA2/3和Hsf)，無(wú)論分離的還是組合的，都是目標(biāo)疫苗抗原。
實(shí)施例12在小鼠攻擊模型中重組OMV的保護(hù)作用在Balb/C小鼠中評(píng)價(jià)在致命攻擊后若干重組OMV的保護(hù)作用。這種活性免疫模型包括在通過(guò)皮下途徑進(jìn)行一系列免疫后，將來(lái)源于若干菌株的腦膜炎球菌(懸浮于缺鐵TSB培養(yǎng)基中)腹膜內(nèi)注射到成年Balb/C或OF1小鼠(6-8周大)中。用作外部鐵來(lái)源的鐵葡聚糖似乎是維持菌血癥所必需的且導(dǎo)致感染動(dòng)物死亡。雖然該小鼠IP模型已經(jīng)顯示出可有效評(píng)價(jià)毒力、免疫保護(hù)和鐵在感染中的作用，但它們不會(huì)進(jìn)入在人類菌血癥和腦膜炎之前發(fā)生的咽運(yùn)階段。該模型已經(jīng)用于篩選過(guò)量表達(dá)NspA、TbpA、或Hsf的若干OMV候選物。在下列實(shí)驗(yàn)中，在第0、14和28天，通過(guò)皮下途徑用3(PV00N049)-5μg(PV00N035和PV00N043實(shí)驗(yàn))過(guò)量表達(dá)Hsf、NspA或TbpA的rec OMV給Balb/C(近交)或OF1(遠(yuǎn)交)小鼠免疫接種3次OMV是在Al(OH)3(100μgAl(OH)3/動(dòng)物)(PV00N035和PV00N043)或在AlPO4(100μg AlPO4/動(dòng)物)上配制的。然后在第28天(II后14天)和第35天(III后7天)給所述動(dòng)物采血，用于特異性Ab評(píng)價(jià)。第35天，在攻擊前1小時(shí)，腹膜內(nèi)注射10mg鐵葡聚糖。用H44/76(B:15:P1.7，16)或CU-385(B:4:P1.19，15)菌株攻擊，約1.10e7 CFU/動(dòng)物(見(jiàn)準(zhǔn)確攻擊劑量結(jié)果的表)。使用CU-385菌株進(jìn)行的異源菌株較之使用同源菌株更為嚴(yán)格。記錄第1-5天的死亡率。之后的表1舉例說(shuō)明與較小擴(kuò)展(lesser extend)中OMV porA(-)以及OMV porA(+)相比，使用OMV TbpA(+)(1/10和3/5的porA(-)與9/10和3/5的porA(+))、OMV NspA(+)(4/10和4/5)和OMVHsf(+)(3/10、2/10和3/5)觀察到了更好的保護(hù)。這是我們?cè)谶@三個(gè)實(shí)驗(yàn)中共同得到的觀察結(jié)果。這些數(shù)據(jù)支持了在泡表面表達(dá)的TbpA、Hsf和NspA抗原對(duì)未來(lái)menB疫苗是重要的。
表1重組外膜小泡小鼠模型中的保護(hù)活性。該表概括了在3個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中獲得的結(jié)果(PV00N35、PV00N043和PV00N049)OMVs(泡)OMVs(泡)

NT沒(méi)有測(cè)試實(shí)施例13在小鼠攻擊模型中重組亞單位抗原的保護(hù)作用進(jìn)行致死攻擊后，在Balb/C小鼠中評(píng)價(jià)若干重組純化蛋白的保護(hù)作用。這種活性免疫模型包括在通過(guò)皮下途徑進(jìn)行一系列免疫后，將來(lái)源于若干菌株的腦膜炎球菌(懸浮于缺鐵的TSB培養(yǎng)基中)腹膜內(nèi)注射到成年Balb/C或OF1小鼠(6-8周大)中。
用作外部鐵來(lái)源的鐵葡聚糖似乎是維持菌血癥所必需的且導(dǎo)致感染動(dòng)物死亡。雖然該小鼠IP模型已經(jīng)顯示出可有效評(píng)價(jià)毒力、免疫保護(hù)和鐵在感染中的作用，但它們不會(huì)進(jìn)入在人類菌血癥和腦膜炎前發(fā)生的咽運(yùn)階段。該模型已經(jīng)用于篩選若干menB亞單位疫苗候選物，如重組FrpC、TbpA、FHA2/3和Hap分子。
在該實(shí)驗(yàn)中，在第0、14和28天，通過(guò)皮下途徑，在有10μg MPL(每只動(dòng)物)存在時(shí)，用在AlPO4(100μg)上配制的5μg(PV00N050實(shí)驗(yàn))這些蛋白給OF1(遠(yuǎn)交)小鼠免疫接種3次。
然后在第28天(II后14天)和第35天(III后7天)給所述動(dòng)物采血，用于特異性Ab評(píng)價(jià)，同時(shí)在第35天攻擊它們。攻擊那天，在攻擊前1小時(shí)，腹膜內(nèi)注射10mg鐵葡聚糖。用CU-385(B:4:P1.19，15)菌株進(jìn)行攻擊，在這種情況下其是異源的，事實(shí)上，除了TbpA序列來(lái)自B16B6菌株(B:2a:P1.2)之外，所述抗原序列均來(lái)自H44/76(B:15:P1.7，16)。
表2所列結(jié)果表明在該模型中，F(xiàn)rpC、TbpA、FHAB2/3rd、Hap誘導(dǎo)顯著保護(hù)攻擊之后，5只小鼠中有2-4只存活，而只使用佐劑僅僅1/5存活。除了一組之外，在所有組中，特異性抗體的效價(jià)均較高(特異性抗-TbpA效價(jià)適中)。所有這些數(shù)據(jù)支持了以亞單位抗原、分離或組合形式提供的FrpC、FrpA、FrpA/C保守結(jié)構(gòu)域、TbpA、FHAB2/3rd、Hap可用于研制menB疫苗。
表2重組外膜小泡的小鼠模型中的保護(hù)活性。該表概括了在其中一個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中獲得的結(jié)果(PV00N050)。
亞單位抗原

實(shí)施例14表示疫苗抗原組合的協(xié)同作用的方法在檢測(cè)疫苗候選物這種組合的協(xié)同作用方面，可單獨(dú)或組合測(cè)試所得到的不同重組OMV(OMVs porA(+)rmp-LbpB、OMVsporA(-)TbpA(+)Hsf(+)、OMVs porA(-)TbpA(+)、OMysporA(-)NspA(+)、OMVs porA(-)Hsf(+)、OMVsporA(-)TbpA(+)NspA(+))以從統(tǒng)計(jì)學(xué)上確定最佳組合。這項(xiàng)工作還可用亞單位抗原的組合、以及亞單位抗原+重組OMV的組合進(jìn)行。給32組5只OF1小鼠/組注射并測(cè)試小鼠模型中的血清殺菌和調(diào)理活性，主動(dòng)和被動(dòng)保護(hù)(如果需要使用次優(yōu)量的各抗原)。如果組合免疫后所產(chǎn)生的保護(hù)水平高于各抗原的總和，則表示抗原組合的協(xié)同作用。
實(shí)施例15外膜小泡考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE的Hsf和TbpA含量分析將15μg溶于外膜小泡制品中的蛋白在含有β-巰基乙醇的樣品緩沖液中稀釋，其中Hsf或TbpA或Hsf與TbpA兩個(gè)被上調(diào)，并在95℃下加熱10分鐘。然后使樣品通過(guò)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠(Novex4-20％Tris-甘氨酸1.5mm 2Dwell SDS Page)，并在考馬斯藍(lán)中染色1小時(shí)，并通過(guò)若干次脫色洗滌而脫色。結(jié)果在圖9中表示，其表明在來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜小泡制品中，Hsf和TbpA水平明顯更高，其中它們的表達(dá)水平已得到提高。
實(shí)施例16Hsf和/或TbpA被上調(diào)的OMV的免疫原性在第0、21和28天，通過(guò)肌內(nèi)途徑用OMV給20只小鼠的組免疫3次。每次接種包括5μg(蛋白含量)在含MPL的AlPO4上配制的OMV。所述OMV來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76，其被改造成莢膜多糖和PorA被下調(diào)。比較其中的Hsf、TbpA、Hsf和TbpA兩個(gè)被上調(diào)或均未被上調(diào)的OMV。在第41天，采集血液樣品，通過(guò)ELISA或血清殺菌測(cè)定法進(jìn)行分析。
檢測(cè)抗Hsf抗體的ELISA4℃下，用100μl 1μg/ml溶于PBS中的特異性抗原覆蓋96孔微量平板(Nunc，Maxisorb)過(guò)夜。用150mM NaCl 0.05％Tween 20洗滌后，在室溫振搖下，用100μl 1％的PBS-BSA使平板飽和30分鐘。在每個(gè)步驟之間(室溫下振搖進(jìn)行30分鐘，并使用0.2％PBS-BSA作為稀釋緩沖液)，通過(guò)用NaCl-Tween 20洗滌除去過(guò)量試劑。向每個(gè)微量孔中加入100μl稀釋的血清樣品。結(jié)合抗體是由生物素化的抗-小鼠Ig(Prosan)(1/2000)識(shí)別的?？乖?抗體復(fù)合體是通過(guò)與鏈霉抗生物素-生物素化的過(guò)氧化物酶綴合物(Amersham)(1/4000)溫育而顯示的。鄰苯二胺/H2O2(4mg/10ml檸檬酸鹽緩沖液0.1M pH4.5+5μl H2O2)用于顯示測(cè)定。通過(guò)加入50μl 1N HCl而終止反應(yīng)前，在黑暗中室溫溫育平板15分鐘。閱讀490nm處的吸光度。

上表所示結(jié)果表明抗Hsf的較高和相等的抗體效價(jià)是通過(guò)用其中Hsf或Hsf和TbpA兩個(gè)均被上調(diào)的OMV免疫而提高的。事實(shí)上，在用單獨(dú)的佐劑或其中Hsf或TbpA均未被上調(diào)或只有TbpA被上調(diào)的OMV接種后產(chǎn)生的血清中沒(méi)有檢測(cè)到抗Hsf的抗體。
實(shí)施例17抗Hsf和/或TbpA被上調(diào)的OMV產(chǎn)生的抗血清的血清殺菌活性在使用同源菌株H44/76或異源菌株Cu385的測(cè)定法中比較用OMV接種的小鼠抗血清的血清殺菌活性，其中OMV中的Hsf、TbpA、Hsf和TbpA兩個(gè)被上調(diào)或未被上調(diào)。血清殺菌測(cè)定法已經(jīng)顯示出與保護(hù)作用的良好關(guān)聯(lián)且因此是候選組合物在引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)方面有效程度的良好指征。
在37℃+5％CO2下，在MH+1％Polyvitex+1％馬血清培養(yǎng)皿上過(guò)夜培養(yǎng)腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B野生型菌株(H44/76菌株＝B:15 P1.7，16L3，7，9和CU385菌株＝B:4 P1.19，15 L3，7，9)。37℃振搖下，在補(bǔ)充了50μM Desferal(鐵螯合劑)的液體TSB培養(yǎng)基中將它們傳代培養(yǎng)3小時(shí)，以在470nm處達(dá)到約0.5的光密度。
56℃下，將混合或單獨(dú)的血清滅活40分鐘。在0.3％HBSS-BSA中1/100稀釋血清樣品，然后在50μl體積的圓底微量平板中連續(xù)稀釋2倍(稀釋8次)。
將適宜OD的細(xì)菌在0.3％HBSS-BSA中稀釋，得到1.3 10e4CFU/ml。將37.5μl該稀釋液加入到血清稀釋液中，并在37℃振搖下培養(yǎng)微量平板15分鐘。然后，將12.5μl兔補(bǔ)體加入到各孔中。37℃振搖培養(yǎng)1小時(shí)后，將微量平板放在冰上停止殺死。
使用傾斜方法，將每孔20μl涂在MH+1％Polyvitex+1％馬血清培養(yǎng)皿中，37℃+CO2培養(yǎng)過(guò)夜。計(jì)算CFU和殺死的百分比。血清殺菌效價(jià)是達(dá)到≥50％殺死的最后稀釋度。

與上表所示那些相似的結(jié)果是在兩個(gè)其它相似的實(shí)驗(yàn)中獲得的。
對(duì)同源菌株和異源的殺菌效價(jià)(GMT)顯著增加是在用其中Hsf和TbpA被上調(diào)的OMV接種后見(jiàn)到的。通過(guò)比較，在用Hsf或TbpA上調(diào)的OMV接種的小鼠上測(cè)量的殺菌GMT與使用對(duì)照OMV接種小鼠獲得的那些相似。
雙重上調(diào)的益處還可很清楚地在產(chǎn)生顯著水平殺菌抗體的小鼠百分比方面觀察到(效價(jià)大于1/100)，特別是使用異源菌株的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例18混合抗-Hsf和抗-TbpA血清對(duì)殺菌活性的作用在第0、21和28天，通過(guò)肌內(nèi)途徑用OMV給20只小鼠的組免疫3次。每次接種包括5μg(蛋白含量)在含MPL的AlPO4上配制的OMV。所述OMV來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76，其被改造成莢膜多糖和PorA被下調(diào)。用其中沒(méi)有蛋白上調(diào)的對(duì)照OMV給其中一組小鼠免疫。在第二組中，Hsf表達(dá)被上調(diào)，在第三組中，TbpA表達(dá)被上調(diào)，在第四組中，Hsf和TbpA的表達(dá)均被上調(diào)。
混合血清，即或者使用同組小鼠的血清或混合從其中Hsf單獨(dú)或TbpA單獨(dú)被上調(diào)的組中分離的血清。測(cè)量各組混合血清的血清殺菌活性，結(jié)果在下表提供。

上表中的結(jié)果表明將抗-Hsf和抗-TbpA抗血清混合在一起可導(dǎo)致較之任何一種抗血清單獨(dú)獲得的更高的血清殺菌活性。協(xié)同作用似乎是由于抗Hsf和TbpA抗體的同時(shí)存在而獲得的。
實(shí)施例19截短的Hsf蛋白可與TbpA協(xié)同組合一系列截短的Hsf構(gòu)建體是用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法制備的。這些包括編碼包含Hsf信號(hào)序列的氨基酸1-54和Hsf氨基酸134-592的構(gòu)建體(Tr1Hsf)。第二個(gè)截短的Hsf包括Hsf信號(hào)序列的氨基酸1-53，接著是Hsf的氨基酸238-592(Tr2Hsf)。將這兩個(gè)截短的Hsf構(gòu)建體和全長(zhǎng)Hsf引入到腦膜炎奈瑟氏球菌B菌株MC58siaD-、Opc-、PorA中-這樣它們的表達(dá)將被上調(diào)，且外膜小泡是用上述方法生產(chǎn)的。
外膜小泡制品吸附在Al(OH)3上，并在第0、21和28天注射到小鼠中。在第42天，給小鼠采血并制備血清。將所述血清與從用上調(diào)的TbpA OMV免疫的小鼠的血清混合，并按照上面所述進(jìn)行血清殺菌測(cè)定。
結(jié)果

上表所示結(jié)果表明第一次截短(Tr1Hsf)可引發(fā)免疫反應(yīng)，其能夠與抗TbpA的抗血清組合產(chǎn)生較之使用全長(zhǎng)Hsf更高的血清殺菌活性。然而，截短的程度十分重要，且在Tr2中產(chǎn)生的截短物與全長(zhǎng)Hsf相比，具有有害作用。相對(duì)于所用的兩種菌株，均可見(jiàn)到Tr1Hsf的殺菌活性提高。
實(shí)施例20抗TbpA、Hsf和第三種腦膜炎球菌蛋白抗體的血清殺菌活性將上述其中PorA和莢膜多糖被下調(diào)的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H66/76用作使用上述方漢上調(diào)TbpA和Hsf、LbpB、D15、PilQ或NspA的背景菌株。外膜小泡是從上述各菌株制備的。重組FHAb、FrpC、FrpA/C和Hap是用此前所述技術(shù)和本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備的(如PCT/EP99/02766、WO92/01460和WO98/02547中所述)。
外膜小泡制品和重組蛋白吸附到Al(OH)3上，并在第0、21和28天注射到小鼠中。第42天，給小鼠采血并制備血清。將抗TbpA和Hsf上調(diào)的OMV的血清和來(lái)源于用含上調(diào)的LbpB、D15、PIlQ或NspA或重組FHAb、FrpC、FrpA/C或Hap的OMV接種的小鼠血清混合，并按照上面所述進(jìn)行血清殺菌測(cè)定。
結(jié)果結(jié)果在下表中給出。在使用同源H44/76菌株的測(cè)定法中，除了FrpC之外，加入抗第三腦膜炎球菌抗原的抗體不會(huì)產(chǎn)生較之使用單獨(dú)的抗TbpA和Hsf抗體所產(chǎn)生的更高的血清殺菌效價(jià)。
然而，抗第三種抗原抗體的加入在使用異源菌株的血清殺菌測(cè)定法中是有利的?？笵15(OMP85)、Hap、FrpA/C和LbpB的抗體可特別有效地增加抗CU385菌株的血清殺菌效價(jià)。

實(shí)施例21外膜小泡中的FrpB KO對(duì)它們?cè)谕春彤愒淳曛幸l(fā)殺菌免疫反應(yīng)的能力的作用按照WO01/09350所述，使用0.1％DOC提取，將H44/76腦膜炎奈瑟氏球菌的兩種菌株用于制備外膜小泡制品，這樣LOS含量大約為20％。菌株B1733是siaD(-)、PorA(-)，具有Tr1 Hsf(實(shí)施例19)的上調(diào)且lgtB被敲除。菌株B1820 B1733是siaD(-)、PorA(-)，具有Tr1 Hsf的上調(diào)，且lgtB被敲除，F(xiàn)rpB也被敲除。兩種菌株都是在補(bǔ)充了60μM Desferal的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，這樣就可使鐵調(diào)節(jié)的蛋白如LbpA/B和TbpA/B被上調(diào)。
泡制品吸附在Al(OH)3上，并在第0和21天，將5μg肌內(nèi)注射到30只小鼠的組中。在第28天采集血液樣品。
按照實(shí)施例17所述，在3種L3菌株(同源野生型菌株H44/76和兩種異源L3菌株；NZ124和M97250687)上進(jìn)行血清殺菌測(cè)定法。
結(jié)果

GMT表示SBA中的血清幾何平均效價(jià)。
SC表示小鼠血清轉(zhuǎn)變數(shù)(SBA效價(jià)＞1/100)。
所述結(jié)果清楚地表明FrpB KO(B 1820)泡較之FrpB(+)泡(B1733)可誘導(dǎo)更好的異源交叉-殺菌反應(yīng)。在菌株M97250687和NZ124中，SBA效價(jià)更高且血清轉(zhuǎn)變小鼠的比例更高。當(dāng)FrpB缺失時(shí)，同源性菌株的結(jié)果不是很好。這些數(shù)據(jù)表明FrpB驅(qū)動(dòng)免疫反應(yīng)，但因?yàn)樵撏饽さ鞍资歉叨瓤勺兊模虼丝乖摰鞍椎目贵w僅能誘導(dǎo)殺死同源菌株。
權(quán)利要求
1.一種包括兩種或多種不同抗原的免疫原性組合物，其中所述抗原選自下列種類中的至少兩個(gè)a)至少一種奈瑟氏球菌粘附素；b)至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；c)至少一種奈瑟氏球菌毒素；d)至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白；或e)至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白，優(yōu)選整合外膜蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述抗原選自下列種類中的至少兩個(gè)a)選自FhaB、NspA、PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB 0995、NMB 1119和NadA的至少一種奈瑟氏球菌粘附素；b)選自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；c)選自FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種奈瑟氏球菌毒素；d)選自TbpA高、TbpA低、TbpB高、TbpB低、LbpA、LbpB、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、FbpA、BfrA、BfrB、Bcp、NMB 0964和NMB 0293的至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白；或e)選自PilQ、OMP 85、FhaC、NspA、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、HpuB、TspA、TspB、TdfH、PorB、HimD、HisD、GNA 1870、OstA、HlpA、MltA、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA和PldA的至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白，優(yōu)選整合外膜蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其是亞單位組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫原性組合物，它包括選自FhaB、NspA、Hsf的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、Hap的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、OMP 85的表面外露結(jié)構(gòu)域、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PldA、PilC、Lipo28以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少2種抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，它包括外膜小泡制品，其中所述抗原在外膜小泡中已被(優(yōu)選重組)上調(diào)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫原性組合物，它包括在外膜小泡中已被上調(diào)的選自下列的至少兩種抗原NspA、Hsf、Hap、OMP 85、AspA、HpuA、HpuB、TspA、TspB、FhaC、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、NM-ADPRT、P2086、TdfH、PorB、MafA、MafB、HimD、HisD、GNA 1870、OstA、HlpA、MltA和PldA；且任選包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，它包括具有一種或多種抗原的亞單位組合物，和具有在外膜小泡中已被上調(diào)的至少一種抗原的外膜小泡制品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫原性組合物，它包括亞單位組合物和外膜小泡制品，其中所述亞單位組合物包括選自下列的至少一種抗原FhaB、NspA、Hsf的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、Hap的過(guò)客結(jié)構(gòu)域、OMP 85的表面外露結(jié)構(gòu)域、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PilC、Lipo28，且所述外膜小泡制品具有在外膜小泡中已被重組上調(diào)的選自下列的至少一種不同抗原NspA、Hsf、Hap、OMP 85、AspA、HpuA、HpuB、TspA、TspB、FhaC、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、NM-ADPRT、P2086、TdfH、PorB、MafA、MafB、HimD、HisD、GNA 1870、OstA、HlpA、MltA和PLdA；且任選包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者，優(yōu)選在外膜小泡制品內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8所述的免疫原性組合物，它包括權(quán)利要求5或6的至少兩種不同的外膜小泡制品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其中一種外膜小泡制品是免疫型L2且另一種外膜小泡制品是免疫型L3。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、2、5、6、7、8、9或10所述的免疫原性組合物，其中選擇Hsf和TbpA(高)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-2或5-11所述的免疫原性組合物，其中選擇Hsf和TbpA(低)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的免疫原性組合物，其中還選擇選自Hap、LbpB、OMP 85和FrpA的一種或多種的附加抗原。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13所述的免疫原性組合物，其中還選擇LPS免疫型L2。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14所述的免疫原性組合物，其中還選擇LPS免疫型L3。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15所述的免疫原性組合物，其中選擇FhaB，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、NadA、OMP85、PldA、LbpA、TbpA(低)、TbpA(高)、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、NspA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16所述的免疫原性組合物，其中選擇NspA，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、NadA、OMP85、PldA、LbpA、TbpA(低)、TbpA(高)、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17所述的免疫原性組合物，其中選擇NadA，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、OMP85、PldA、LbpA、TbpA(低)、TbpA(高)、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18所述的免疫原性組合物，其中選擇TbpA(低)，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、OMP85、PldA、LbpA、TbpA(高)、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19所述的免疫原性組合物，其中選擇TbpA(高)，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、LbpB、FrpA、FrpC、FrpA/C、OMP85、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20所述的免疫原性組合物，其中選擇LbpB，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、FrpA、FrpC、FfpA/C、OMP85、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21所述的免疫原性組合物，其中選擇OMP85，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、FrpA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22所述的免疫原性組合物，其中選擇Hap，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、Hsf、FrpA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23所述的免疫原性組合物，其中選擇Hsf，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、FrpA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-24所述的免疫原性組合物，其中選擇FrpA，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、FrpC、FrpA/C、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25所述的免疫原性組合物，其中選擇FrpC，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種其它抗原。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-26所述的免疫原性組合物，其中選擇LPS免疫型L2，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB 0964、NMB 0293、NMB 0315、NMB 1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT、VapD以及LPS免疫型L3的至少一種其它抗原。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-27所述的免疫原性組合物，其中選擇LPS免疫型L3，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB 0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT以及VapD的至少一種其它抗原。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-28所述的免疫原性組合物，其中選擇PilQ，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT以及VapD的至少一種其它抗原。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-29所述的免疫原性組合物，其中選擇HlpA，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、MltA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT以及VapD的至少一種其它抗原。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-30所述的免疫原性組合物，其中選擇MltA，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、GNA1870、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT以及VapD的至少一種其它抗原。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-31所述的免疫原性組合物，其中選擇GNA1870，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB、NM-ADPRT以及VapD的至少一種其它抗原。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-32所述的免疫原性組合物，其中選擇NM-ADPRT，以及選自PilC、MafA、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
34.根據(jù)權(quán)利要求1-33所述的免疫原性組合物，其中選擇MafA，以及選自PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-34所述的免疫原性組合物，其中選擇MafB，以及選自PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB0315、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
36.根據(jù)權(quán)利要求1-35所述的免疫原性組合物，其中選擇NMB0315，以及選自PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-36所述的免疫原性組合物，其中選擇NMB1119，以及選自PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、HisD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
38.根據(jù)權(quán)利要求1-37所述的免疫原性組合物，其中選擇HisD，以及選自PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、LbpA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
39.根據(jù)權(quán)利要求1-38所述的免疫原性組合物，其中選擇LbpA，以及選自PilC、MafB、Omp26、NMB0995、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
40.根據(jù)權(quán)利要求1-39所述的免疫原性組合物，其中選擇NMB0995，以及選自PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
41.根據(jù)權(quán)利要求1-40所述的免疫原性組合物，其中選擇Lipo28，以及選自PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、HimD、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
42.根據(jù)權(quán)利要求1-41所述的免疫原性組合物，其中選擇HimD，以及選自PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
43.根據(jù)權(quán)利要求1-42所述的免疫原性組合物，其中選擇NMB1313，以及選自PilC、MafB、Omp26、FhaC、PbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1953、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
44.根據(jù)權(quán)利要求1-43所述的免疫原性組合物，其中選擇NMB1953，以及選自PilC、MafB、Omp26、FhaC、FbpA、Bcp、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、HtrA、PldA、TbpB(低)、TbpB(高)、HpuA、HpuB、IgA蛋白酶、AspA、OstA、TspA、TspB、P2086、Sibp、NMB0964、NMB0293、NMB1119、TdfH、PorB以及VapD的至少一種其它抗原。
45.根據(jù)權(quán)利要求5-44所述的免疫原性組合物，其中衍生外膜小泡制品的宿主細(xì)胞已被工程改造以下調(diào)一種或多種1gtB或1gtE，優(yōu)選前者的表達(dá)。
46.根據(jù)權(quán)利要求5-45所述的免疫原性組合物，其中衍生外膜小泡制品的宿主細(xì)胞不能合成莢膜多糖且優(yōu)選已被工程改造以下調(diào)一種或多種siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA(相當(dāng)于synX和siaA)或synB(相當(dāng)于siaB)和synC(相當(dāng)于siaC)，優(yōu)選siaD的表達(dá)。
47.根據(jù)權(quán)利要求5-46所述的免疫原性組合物，其中衍生外膜小泡制品的宿主細(xì)胞已被工程改造以下調(diào)一種或多種OpC、OpA或PorA，優(yōu)選PorA的表達(dá)。
48.根據(jù)權(quán)利要求5-47所述的免疫原性組合物，其中衍生外膜小泡制品的宿主細(xì)胞已被工程改造以下調(diào)FrpB的表達(dá)。
49.根據(jù)權(quán)利要求5-48所述的免疫原性組合物，其中衍生外膜小泡制品的宿主細(xì)胞已被工程改造以下調(diào)msbB和/或htrB，優(yōu)選msbB的表達(dá)。
50.根據(jù)權(quán)利要求5-49所述的免疫原性組合物，其中所述外膜小泡制品包括與外膜蛋白(OMP)綴合的LPS。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的免疫原性組合物，其中LPS與OMP在外膜小泡制品中原位(優(yōu)選泡內(nèi))綴合。
52.根據(jù)權(quán)利要求1-51所述的免疫原性組合物，它包括從腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)衍生的抗原，優(yōu)選血清組B。
53.根據(jù)權(quán)利要求1-52所述的免疫原性組合物，它包括從淋病奈瑟氏球菌衍生的抗原。
54.根據(jù)權(quán)利要求1-52所述的免疫原性組合物，其中所有奈瑟氏球菌抗原均來(lái)源于腦膜炎奈瑟氏球菌，優(yōu)選血清組B。
55.根據(jù)權(quán)利要求1-54所述的免疫原性組合物，它還包括一種或多種細(xì)菌莢膜多糖或低聚糖。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的免疫原性組合物，其中所述莢膜多糖或低聚糖來(lái)源于選自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、C、Y和W-135，流感嗜血桿菌b(Haemophilus influenzae b)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，A組鏈球菌，B組鏈球菌，金黃色葡萄球菌(Staphylococcas aureus)和表皮葡萄球菌(Stapylocoausepidermidis)的細(xì)菌。
57.根據(jù)權(quán)利要求55-56所述的免疫原性組合物，其中所述莢膜多糖或低聚糖與蛋白綴合。
58.根據(jù)權(quán)利要求1-57所述的免疫原性組合物，它包括佐劑。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的免疫原性組合物，它包括鋁鹽，優(yōu)選磷酸鋁。
60.根據(jù)權(quán)利要求58或59所述的免疫原性組合物，它包括3D-MPL。
61.一種包括權(quán)利要求1-60的免疫原性組合物以及藥學(xué)上可接受載體的疫苗。
62.一種包括一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的疫苗，所述多核苷酸編碼兩種或多種不同的蛋白，它的表達(dá)由真核啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，其中所述蛋白選自下列種類中的至少兩個(gè)a)選自FhaB、NspA、PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB 1119和NadA的至少一種奈瑟氏球菌粘附素；b)選自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的至少一種奈瑟氏球菌自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；c)選自FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD和NM-ADPRT的至少一種奈瑟氏球菌毒素；d)選自TbpA高、TbpA低、TbpB高、TbpB低、LbpA、LbpB、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、FbpA、BfrA、BfrB、Bcp、NMB0964和NMB0293的至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白；或e)選自PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、HpuB、TspA、TspB、TdfH、PorB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA、MltA、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA和PldA的至少一種奈瑟氏球菌膜相關(guān)蛋白，優(yōu)選整合外膜蛋白。
63.一種用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌病的方法，包括在宿主需要時(shí)給予其保護(hù)劑量的權(quán)利要求61-62的疫苗。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中腦膜炎奈瑟氏球菌感染被預(yù)防或治療。
65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中淋病奈瑟氏球菌感染被預(yù)防或治療。
66.權(quán)利要求61-62的疫苗制備用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌感染的藥物的用途。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的用途，其中腦膜炎奈瑟氏球菌感染被預(yù)防或治療。
68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的用途，其中淋病奈瑟氏球菌感染被預(yù)防或治療。
69.一種衍生權(quán)利要求5-60的外膜小泡制品的基因工程改造的奈瑟氏球菌菌株。
70.一種制備權(quán)利要求1-60的免疫原性組合物的方法，包括將至少兩種來(lái)源于奈瑟氏球菌的抗原混合在一起的步驟。
71.一種制備權(quán)利要求5-60的免疫原性組合物的方法，包括分離奈瑟氏球菌培養(yǎng)物中的外膜小泡的步驟。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，還包括將至少兩種外膜小泡制品混合的步驟。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中至少一種外膜小泡制品包括免疫型L2的LPS，以及至少一種外膜小泡制品包括免疫型L3的LPS。
74.根據(jù)權(quán)利要求71-73所述的方法，其中所述外膜小泡是通過(guò)用0-0.5％濃度的DOC提取而分離的。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述外膜小泡是通過(guò)用0.02％-0.4％、0.04％-0.3％、0.06％-0.2％、0.08％-0.15％或優(yōu)選大約或準(zhǔn)確的0.1％濃度的DOC提取而分離的。
76.一種制備權(quán)利要求61的疫苗的方法，包括將權(quán)利要求1-60的免疫原性組合物與藥學(xué)上可接受的載體混合的步驟。
77.一種制備用于預(yù)防或治療奈瑟氏球菌感染的免疫球蛋白的方法，包括用權(quán)利要求61的疫苗使受體免疫，以及從受體中分離免疫球蛋白的步驟。
78.一種通過(guò)權(quán)利要求77的方法制備的免疫球蛋白。
79.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求78的免疫球蛋白和藥學(xué)上可接受載體。
80.一種用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌感染的方法，包括給予患者有效量的權(quán)利要求79的藥物制品的步驟。
81.權(quán)利要求79的藥物制品在制備用于治療或預(yù)防奈瑟氏球菌病的藥物的用途。
82.根據(jù)權(quán)利要求5-60所述的免疫原性組合物，它包括免疫型L2的腦膜炎球菌泡和免疫型L3的腦膜炎球菌泡。
83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的免疫原性組合物，其中TbpA(高)在其中一個(gè)泡中被上調(diào)。
84.根據(jù)權(quán)利要求82或83所述的免疫原性組合物，其中TbpA(低)在其中一個(gè)泡中被上調(diào)。
85.根據(jù)權(quán)利要求82-84所述的免疫原性組合物，其中Hsf在其中一個(gè)泡中被上調(diào)。
86.根據(jù)權(quán)利要求82-85所述的免疫原性組合物，其中OMP85在其中一個(gè)泡中被上調(diào)。
87.根據(jù)權(quán)利要求82-86所述的免疫原性組合物，其中所述泡是從不能產(chǎn)生莢膜多糖，優(yōu)選siaD-的腦膜炎球菌菌株中分離的。
88.根據(jù)權(quán)利要求82-87所述的免疫原性組合物，其中L2和/或L3LPS低聚糖結(jié)構(gòu)被截短成與已經(jīng)從1gtB-腦膜炎球菌菌株中分離出來(lái)的泡一致。
89.根據(jù)權(quán)利要求82-88所述的免疫原性組合物，其中所述泡是從下調(diào)msbB表達(dá)的腦膜炎球菌菌株中分離出來(lái)的。
90.根據(jù)權(quán)利要求82-89所述的免疫原性組合物，其中L2和/或L3LPS低聚糖部分與泡整合外膜蛋白泡內(nèi)綴合。
91.根據(jù)權(quán)利要求82-89所述的免疫原性組合物，其中所述泡來(lái)源于下調(diào)一種或多種FrpB、PorA、Opa或Opc表達(dá)的腦膜炎球菌菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防奈瑟氏球菌病的免疫原性組合物和疫苗。本發(fā)明的免疫原性組合物含有選自包括粘附素、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、毒素、鐵獲得蛋白和膜相關(guān)蛋白(優(yōu)選整合外膜蛋白)在內(nèi)的至少兩個(gè)不同種類抗原的抗原組合。這種抗原組合能以抗奈瑟氏球菌生活周期不同方面的免疫反應(yīng)為目標(biāo)，產(chǎn)生更有效的免疫反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K39/102GK1674933SQ03818648
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月2日
發(fā)明者F·-X·J·貝爾泰, R·比曼斯, P·德諾埃, C·費(fèi)龍, C·戈拉, J·普爾曼, V·魏南茨 申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司