專利名稱：疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有至少一種抗原和一種免疫刺激物質(zhì)的疫苗。
背景技術(shù)：
宿主免受病原體侵染的防護(hù)作用涉及細(xì)胞效應(yīng)器和體液效應(yīng)器而且該防護(hù)作用是非適應(yīng)性(天然)免疫和適應(yīng)性(獲得性)免疫協(xié)同作用的結(jié)果。后者建立在由受體介導(dǎo)的特異性免疫識別的基礎(chǔ)上，是一種最新認(rèn)識到的免疫系統(tǒng)，而且僅存在于脊椎動物體內(nèi)。前者在適應(yīng)性免疫產(chǎn)生之前就形成了，由遍布機(jī)體的各種細(xì)胞和分子組成，負(fù)責(zé)使?jié)撛诓≡w處于控制之下(Boman，H.(2000))，(Zanetti，M.(1997))。
B和T淋巴細(xì)胞是獲得性抗原特異性適應(yīng)性免疫的介質(zhì)，所述獲得性抗原-特異性適應(yīng)性免疫包括免疫“記憶”的產(chǎn)生，免疫“記憶”的產(chǎn)生是創(chuàng)建有效疫苗的主要目標(biāo)(Schijns，V.(2000))?？乖蔬f細(xì)胞(APC)是高度特異性細(xì)胞，其能夠加工抗原并將抗原的加工片段與淋巴細(xì)胞激活所需的分子一起陳列在細(xì)胞表面。這意味著APC對于引發(fā)特異性免疫反應(yīng)非常重要。用于T細(xì)胞激活的主要APC是樹突細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞，而用于B細(xì)胞的主要APC是小結(jié)樹突細(xì)胞。一般來說，DC是引發(fā)免疫應(yīng)答的最強(qiáng)有力的APC，所述APC刺激休眠原初和記憶B和T淋巴細(xì)胞。
外周中的APC(例如DC或朗格漢斯細(xì)胞)的固有作用是捕捉并加工抗原，因而使其得到激活而開始表達(dá)淋巴細(xì)胞共刺激分子，遷移到淋巴器官，分泌細(xì)胞因子并將抗原呈遞給不同種群的淋巴細(xì)胞，從而引發(fā)抗原特異性免疫應(yīng)答。它們不僅在某些情況下激活淋巴細(xì)胞，而且還使T細(xì)胞對抗原耐受(Banchereau，J.(1998))。
通過T淋巴細(xì)胞進(jìn)行的抗原識別是主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-限制性的。只有當(dāng)肽被結(jié)合到一種特定MHC分子上時(shí)，給定的T淋巴細(xì)胞才能識別抗原。一般來說，只有當(dāng)自身MHC分子存在時(shí)，T淋巴細(xì)胞才能夠得到刺激，而且只有當(dāng)肽與自身MHC分子結(jié)合時(shí)，抗原才能得到識別。MHC限制確定了T淋巴細(xì)胞對被識別抗原的特異性以及對與其肽片段結(jié)合的MHC分子的特異性。
不但在識別方面而且在產(chǎn)生適當(dāng)應(yīng)答方面，胞內(nèi)抗原和胞外抗原對免疫系統(tǒng)具有完全不同的攻擊方式?？乖騎細(xì)胞的呈遞是由兩種截然不同類型的分子-I型MHC(MHC-I)和II型MHC(MHC-II)介導(dǎo)的，這兩種分子采用了截然不同的抗原加工途徑。人們大體上能夠分清已經(jīng)形成的兩種主要抗原加工途徑。由胞內(nèi)抗原產(chǎn)生的肽通過I型MHC分子被呈遞給CD8+T細(xì)胞，然后在實(shí)際上所有細(xì)胞上進(jìn)行表達(dá)，而由胞外抗原產(chǎn)生的肽通過II型MHC分子被呈遞給CD4+T細(xì)胞(Monaco，J.(1992)；Harding，C.(1995))。然而，這兩種途徑也有某些例外。一些研究已經(jīng)表明由胞吞的顆粒性或可溶性蛋白產(chǎn)生的肽被呈遞到巨噬細(xì)胞以及樹突細(xì)胞中的MHC-I分子上(Harding，C.(1996)；Brossart，P.(1997))。因此APC如樹突細(xì)胞是在體外和體內(nèi)利用抗原對其進(jìn)行胞外刺激過程中的目標(biāo)靶子，所述APC位于外周，具有很高的捕捉和加工胞外抗原的效能并將MHC-I上的抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞。
包括對不同類型白細(xì)胞產(chǎn)生刺激作用在內(nèi)的APC的重要和唯一作用是將其中心部位作為研制有效疫苗的合適策略的目標(biāo)。從理論上講，這樣做的一種方式是增強(qiáng)或刺激它們的固有作用，即攝取抗原。一旦被所述疫苗定向抵抗的適當(dāng)抗原刺激后，APC就應(yīng)該開始對所攝取的抗原進(jìn)行加工，由此而被激活，開始表達(dá)淋巴細(xì)胞共刺激分子，遷移到淋巴器官，分泌細(xì)胞因子并將抗原呈遞給不同種群的淋巴細(xì)胞從而啟動免疫應(yīng)答。
被激活的T細(xì)胞通常以一種高度可調(diào)方式分泌多種效應(yīng)細(xì)胞因子，例如白介素2(IL-2)，IL-4，IL-5，IL-10和γ干擾素(IFN-γ)。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對特異性抗原(例如腫瘤抗原、一般是指被施用于疫苗當(dāng)中的抗原)產(chǎn)生應(yīng)答的功能性檢測通常由ELISpot測定法(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測定法)，即一種在單細(xì)胞水平上分析細(xì)胞因子產(chǎn)生的技術(shù)來監(jiān)控。在本發(fā)明中，促進(jìn)細(xì)胞因子IFN-γ的細(xì)胞免疫的ELISpot測定法被用來監(jiān)控肽-特異性T細(xì)胞的有效激活。
以前已經(jīng)證明了聚陽離子能夠有效增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對與I型MHC匹配的肽的攝入，即一種被稱作″轉(zhuǎn)運(yùn)″的肽或蛋白的刺激過程(Buschle，M.(1997))。而且，我們已經(jīng)證明聚陽離子能夠在體內(nèi)和體外將肽或蛋白“轉(zhuǎn)運(yùn)”到抗原呈遞細(xì)胞中(Buschle，M.(1998))。另外，在小鼠模型中共同注射聚-L-精氨酸或聚-L-賴氨酸與作為疫苗的適當(dāng)肽的混合物能夠避免動物體內(nèi)腫瘤的生長(Schmidt，W.(1997))。這種化學(xué)成分確定的疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的抗原/肽特異性T細(xì)胞。這一點(diǎn)已被證明至少部分歸因于由聚陽離子介導(dǎo)的肽向APC中的攝入被增強(qiáng)(Buschle，M.(1998))，表明一旦APC在體內(nèi)被抗原刺激就能夠誘導(dǎo)由T細(xì)胞介導(dǎo)的針對被施用抗原的免疫。
與其特征為高度特異性但應(yīng)答較慢的適應(yīng)性免疫相反，天然免疫是建立在效應(yīng)物機(jī)制的基礎(chǔ)上，所述效應(yīng)物機(jī)制是由相對宿主微生物成分結(jié)構(gòu)的不同而引發(fā)的。這些機(jī)制能啟動非常快的初期應(yīng)答，結(jié)果主要產(chǎn)生對有害物的中和作用。天然免疫反應(yīng)只是低等動植物類的唯一防御方式并且已被保留在脊椎動物體內(nèi)作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)被調(diào)動起來之前的第一道宿主防線。
在高等脊椎動物體內(nèi)，天然免疫的效應(yīng)細(xì)胞是噬中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞并且也可能是樹突細(xì)胞(Mizukawa，N.(1999))，而該途徑中的體液成分是補(bǔ)體級聯(lián)和多種不同的結(jié)合蛋白(Boman，H.(2000))。
天然免疫的快速和有效成分是產(chǎn)生的多種長度通常在約12至約100個(gè)氨基酸殘基之間的殺微生物肽。在從多孔動物、昆蟲到動物和人的多種生物的體內(nèi)已經(jīng)分離出了幾百種不同的抗微生物肽，表明這些分子分布的廣泛性。抗微生物肽也可以由作為一種抵抗競爭生物體的拮抗物的細(xì)菌產(chǎn)生。
在EP0905141Al中公開了具有抗病毒活性的鱟抗-LPS因子(LALF)的肽片段。該ALF肽不特異性增強(qiáng)免疫應(yīng)答但卻增強(qiáng)單核細(xì)胞的非特異性防御并且還能以預(yù)防的方式進(jìn)行使用或者所述肽還可以被局部涂敷在傷口上以便促使傷口的愈合和修復(fù)加快。
抗微生物肽的主要來源是嗜中性白細(xì)胞的顆粒體和排列在呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道上的上皮細(xì)胞。通常發(fā)現(xiàn)它們存在于最易受到微生物侵襲的解剖學(xué)部位，并且被分泌到內(nèi)部體液中或被貯存在消化性吞噬細(xì)胞(嗜中性白細(xì)胞)的胞質(zhì)顆粒體中(Ganz，T.(1997)；Ganz，T.(1998)；Ganz，T.(1999)；Boman，H.(2000)；Gudmundsson，GH.(1999))。
在先已經(jīng)證明(澳大利亞專利申請A1416/2000)天然存在的、由cathelicidin-衍生的抗微生物肽或其衍生物具有免疫應(yīng)答刺激活性因而成為高效佐劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠顯著增強(qiáng)針對被共施用的特異性抗原的免疫應(yīng)答因而成為高效佐劑的佐劑/“載體肽”。
該目的通過含有至少一種抗原和一種具有R1-XZXZNXZX-R2序列的肽的疫苗來達(dá)到，其中-N是一個(gè)3至7的整數(shù)，優(yōu)選地是5，-X是一種帶正電荷的天然和/或非天然氨基酸殘基，-Z是一種選自L，V，I，F(xiàn)和/或W的氨基酸殘基，和-R1和R2分別獨(dú)立地選自-H，-NH2，-COCH3，-COH，具有至多20個(gè)氨基酸殘基的肽或肽反應(yīng)基團(tuán)或者含有或不含肽的肽接頭；X-R2還可以是C-端氨基酸殘基的酰胺、酯或硫酯。
除了天然存在的抗微生物肽外，還對合成的抗微生物肽進(jìn)行了生產(chǎn)和研究。合成抗微生物肽KLKLLLLLKLK-NH2已被證明對被金黃色葡萄球菌感染的小鼠具有明顯的化學(xué)治療活性；人嗜中性白細(xì)胞通過細(xì)胞表面鈣網(wǎng)蛋白激活后產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)K和L的準(zhǔn)確數(shù)目和位置對于合成肽的抗微生物活性是關(guān)鍵的(Nakajima，Y.(1997)；Cho，J-H.(1999))。
目前已經(jīng)驚奇地證明在本發(fā)明的過程中，本發(fā)明的含有R1-XZXZNXZX-R2序列的肽(在下文中被稱作“A肽”)能夠比包括天然抗微生物肽在內(nèi)的已知佐劑更加有效地將抗原肽或蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到APC中，其中，-N是3至7的整數(shù)，優(yōu)選地是5，-X是帶正電荷的天然和/或非天然氨基酸殘基，-Z是一種選自L，V，I，F(xiàn)和/或W的氨基酸殘基，和-R1和R2分別獨(dú)立地選自-H，-NH2，-COCH3，-COH，具有至多20個(gè)氨基酸殘基的肽或肽反應(yīng)基團(tuán)或者含有或不含肽的肽接頭；X-R2還可以是C-端氨基酸殘基的酰胺、酯(或甚至硫酯)。本發(fā)明的肽還具有很強(qiáng)的免疫應(yīng)答刺激活性因而成為高效佐劑。
優(yōu)選地，所述C-端不被修飾(COOH或COO-)，因?yàn)檫@種形式的肽比酰胺化形式的肽甚至更有效。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述序列的羧基端可以被酰胺化或攜帶另一個(gè)氨基酸序列，然而優(yōu)選地，所述羧基端是游離的。
而且，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，含在A肽中的所有X可以代表相同的氨基酸殘基。然而優(yōu)選地，在一種A肽中，X只代表一種特定的氨基酸殘基，例如K或R等。同樣的情況也適用于Z所述A肽中的所有Z可以是單獨(dú)一個(gè)種類的氨基酸或不同種類的氨基酸例如L或V等。對于所述序列式中間的ZN部分來說尤其是這樣，其中ZN可以是例如L5或L3和LVIFW，LILFLLIW，WIF，W3L2，以及這個(gè)基元的所有其它組合方式，長度為3至7個(gè)氨基酸，優(yōu)選地為4至6個(gè)氨基酸殘基，特別優(yōu)選地為5個(gè)氨基酸殘基。這些殘基對于R1和R2部分也是優(yōu)選的(例如，如果R1和/或R2是肽的話，則多于50％，優(yōu)選地多于80％，特別優(yōu)選地多于90％的R1和/或R2是L，I，F(xiàn)，V和/或W)。優(yōu)選地R1和R2是相同的，有利地是它們都是H(即游離的氨基-或羧基端)。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“非天然的”分別包括不是天然存在的和不存在于天然蛋白質(zhì)中的任何氨基酸殘基。
肽R1-KLKL5KLK-R2是特別優(yōu)選的，然而R1-KIKL5KIK-R2，R1-KVKL5KVK-R2，R1-KFKL5KVK-R2，R1-KLKL6KLK-R2，R1-KWKW5KLK-R2，R1-KWKWL3WKWK-R2，R1-KLKL4KLK-R2或I，F(xiàn)，V，W和L位置的變換也是有利的。
當(dāng)然，根據(jù)所需要的免疫應(yīng)答，疫苗可以含有兩種或多種抗原。所述抗原也可以是被修飾的以便進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
優(yōu)選地，由病毒或細(xì)菌病原體，由真菌或寄生蟲產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或肽，以及腫瘤抗原(癌癥疫苗)或被推測在自身免疫疾病中起作用的抗原被用作抗原(包括衍生化的抗原如糖基化的、脂化的、糖脂化的或羥基化的抗原)。而且，碳水化合物、脂類或糖脂本身可以被用作抗原。衍生化方法可包括特異性蛋白質(zhì)或肽從病原體中的純化，病原體的滅活以及這種蛋白質(zhì)或肽的蛋白水解或化學(xué)衍生化或穩(wěn)定化?；蛘撸霾≡w本身也可以被用作抗原。所述抗原優(yōu)選地是肽或蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類、糖脂或其混合物。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，T細(xì)胞表位被用作抗原。另外，T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位的組合也可以是優(yōu)選地。
被用于本發(fā)明組合物中的抗原不是關(guān)鍵的。不同抗原的混合物當(dāng)然也可以被用于本發(fā)明。優(yōu)選地，由病毒或細(xì)菌病原體或由真菌或寄生蟲產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或肽被用作這類抗原(包括衍生化抗原或糖基化或脂化抗原或多糖或脂類)。另一種優(yōu)選的抗原來源是腫瘤抗原。優(yōu)選的病原體選自人免疫缺陷病毒(HIV)，甲型和乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒(HCV)，勞斯肉瘤病毒(RSV)，EB病毒(EBV)，流感病毒，輪狀病毒，金黃色葡萄球菌，肺炎衣原體，沙眼衣原體，結(jié)核分枝桿菌，肺炎鏈球菌，炭疽芽孢桿菌，霍亂弧菌，瘧原蟲屬(惡性瘧原蟲，間日瘧原蟲等)，曲霉屬菌種或白色念珠菌。抗原也可以是由癌細(xì)胞表達(dá)的分子(腫瘤抗原)。所述衍生化方法可以包括特異性蛋白質(zhì)從病原體/癌細(xì)胞中的純化，病原體的滅活以及這種蛋白質(zhì)的蛋白水解或化學(xué)衍生化或穩(wěn)定化。腫瘤抗原(癌癥疫苗)或自身免疫抗原也可以同樣的方式被用于本發(fā)明的藥物組合物中。利用這類組合物可以進(jìn)行腫瘤疫苗接種或自身免疫疾病的治療。
對于肽類抗原而言，肽類模擬表位(mimotopes)/激動劑/超激動劑/拮抗劑或某些位點(diǎn)被改變而免疫學(xué)特性未受影響的肽類或非肽類模擬表位/激動劑/超激動劑/拮抗劑的用途被包括在本發(fā)明中。肽類抗原還可以在肽類抗原的羧基端或氨基端含有延長序列從而有利于與聚陽離子化合物或免疫刺激化合物發(fā)生相互作用。肽拮抗劑可以被用于自身免疫疾病的治療。
抗原還可以被衍生化以便包括能夠增強(qiáng)抗原呈遞和抗原向抗原呈遞細(xì)胞定向的分子。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物適用于提供對自身免疫疾病中所涉及的蛋白質(zhì)或蛋白片段和肽的耐受性。在該實(shí)施方案中使用的抗原足以耐受免疫系統(tǒng)或降調(diào)節(jié)針對自身免疫過程中所涉及到的表位的免疫應(yīng)答。
優(yōu)選地，所述抗原是一種由5至60個(gè)，優(yōu)選地6至30個(gè)，特別優(yōu)選地8至11個(gè)氨基酸殘基組成的肽。該長度的抗原已被證明特別適于T細(xì)胞的激活。所述抗原可進(jìn)一步與一個(gè)尾部進(jìn)行偶聯(lián)，例如參見A657/2000，US5,726,292或WO98/01558。
所述抗原可與本發(fā)明的肽進(jìn)行混合或者具體被配制成例如脂質(zhì)體、延緩制劑等。所述抗原還可以與本發(fā)明的肽進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)連接。優(yōu)選地，所述抗原與肽如R1或R2殘基或與肽的氨基酸殘基側(cè)鏈進(jìn)行共價(jià)連接，特別優(yōu)選地是與K和R側(cè)鏈進(jìn)行共價(jià)連接。
本發(fā)明組合物的組分的相對含量主要取決于每個(gè)組合物的需要。優(yōu)選地，使用10ng至1g的抗原和A肽。每一次疫苗接種的抗原/A肽的優(yōu)選含量介于0.1至1000μg的抗原以及0.1至1000μg的A肽。本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步含有輔助物質(zhì)，如緩沖劑、鹽、穩(wěn)定劑、免疫刺激劑、抗氧化劑等，或其它有效物質(zhì)，如抗炎癥藥物或抗損傷藥物。
可以例如以每星期、兩個(gè)星期或每月的間隔給患者，例如疫苗接種受試者，施用有效量的本發(fā)明組合物。準(zhǔn)備采用本發(fā)明組合物進(jìn)行治療的患者還可以反復(fù)進(jìn)行疫苗接種或只接種一次。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選用途是主動免疫，尤其是不能抵抗特異性抗原的人或動物的主動免疫。
本發(fā)明的組合物可以以皮下、肌內(nèi)、直腸、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、耳廓內(nèi)、經(jīng)皮以及口服的形式進(jìn)行施用。
當(dāng)然，本發(fā)明的疫苗可含有任何其它物質(zhì)，例如任何其它藥用載體等。本發(fā)明的疫苗可按照已知的方法被配制成，例如靜脈內(nèi)疫苗，DNA疫苗，經(jīng)皮疫苗，局部疫苗，鼻內(nèi)疫苗和組合疫苗?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法來選擇已知疫苗的改進(jìn)疫苗的劑量，然而，比已知疫苗劑量低的劑量可能達(dá)到相同的保護(hù)作用因而是優(yōu)選的。
優(yōu)選地，所述疫苗是以一種貯存穩(wěn)定的形式來提供的，例如以凍干形式來提供，任選地以與一種合適的重構(gòu)溶液結(jié)合的方式來提供。
本發(fā)明的氨基酸殘基可以是D-或L-氨基酸。優(yōu)選地，全部或至少80％以上的殘基只屬于一個(gè)種類(D或L)。最優(yōu)選地，本發(fā)明肽中的全部氨基酸屬于相同的種類(D或L)。本發(fā)明的某些形式的肽還可以含有被插到A肽序列中的附加氨基酸殘基，然而，在所述肽的疏水部分(Z，ZN)中不應(yīng)當(dāng)含有A，G和T殘基。
優(yōu)選地，在肽序列中，X是一個(gè)選自由K，R，鳥氨酸和/或高精氨酸組成的一組的氨基酸殘基。而且，一個(gè)A肽中的X可以是選自該組的不同氨基酸殘基，然而優(yōu)選地是在一個(gè)A肽中X是K或R或鳥氨酸或高精氨酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，在肽序列中，X是K。含有該氨基酸如X的A肽已被證明在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的過程中具有特別強(qiáng)的作用。
優(yōu)選地，在肽序列中，Z選自L，V，I，F(xiàn)和/或W。就象X一樣，在一個(gè)A肽中，Z也可代表不同的氨基酸殘基。然而，優(yōu)選地是一個(gè)A肽的Z只是一種氨基酸殘基，例如是L或V或I或F或W，其中L和I殘基是最優(yōu)選的，接著依次為F，V和W(L＞I＞F＞V＞W(wǎng))。
更優(yōu)選地是，在A肽序列中，Z是L(或I，特別是L)。因此，A肽能夠誘導(dǎo)特別強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
最優(yōu)選地是，A肽是H-KLKLLLLLKLK-H。當(dāng)然，該肽的生理形式(例如具有質(zhì)子化的N-端(NH3+)和去質(zhì)子化的C-端(COO-))也應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是被包含在該序列式中(就本發(fā)明的所有肽而言)。
根據(jù)另一個(gè)有利的實(shí)施方案，在肽序列中，R1和/或R2是10至20個(gè)氨基酸殘基。因而提供了其長度足以誘導(dǎo)或增強(qiáng)特別強(qiáng)的免疫應(yīng)答的A肽。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)有利的實(shí)施方案，R1和/或R2的氨基酸殘基是不帶負(fù)電荷的氨基酸殘基。
而且，所述氨基酸殘基可以是天然的和/或非天然的氨基酸殘基。通過在A肽的一端或兩端添加不帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，該肽顯示出很強(qiáng)的增強(qiáng)或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。
優(yōu)選地，R1和/或R2形成了A肽的疏水性尾部。因此，R1和/或R2的氨基酸殘基優(yōu)選地選自L，V，I，F(xiàn)和/或W。更優(yōu)選地是，R1和/或R2的氨基酸殘基選自L，I和/或F。最優(yōu)選地是，所述附加氨基酸殘基是L。這些A肽具有特別強(qiáng)的誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答的能力。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，R1和/或R2的氨基酸殘基是帶正電荷的天然的和/或非天然的氨基酸殘基。優(yōu)選地，所述附加氨基酸殘基選自K，R，鳥氨酸和/或高精氨酸。更優(yōu)選地，R1和/或R2的氨基酸殘基是K。這些A肽還具有特別好的增強(qiáng)免疫應(yīng)答的能力。
優(yōu)選地是，R1和/或R2的氨基酸殘基選自第一組(由L，V，I，F(xiàn)和/或W組成)或第二組(由帶正電荷的氨基酸殘基組成)。然而，對于單獨(dú)一個(gè)A肽來說，R1和/或R2的氨基酸殘基還可以同時(shí)選自兩組。
通過正常的肽鍵或通過肽反應(yīng)基團(tuán)或肽接頭可以將肽連接到本發(fā)明A肽的核心部分。肽反應(yīng)基團(tuán)是適于連接肽或蛋白質(zhì)的化學(xué)基團(tuán)。因此，本發(fā)明A肽的N-或C-端可以分別被化學(xué)修飾成含有一個(gè)能夠共價(jià)連接肽或抗原的化學(xué)修飾基團(tuán)(例如亞氨基硫烷，3-巰基丙酰，...)。另外，A肽可含有一個(gè)合適的肽接頭，即一個(gè)能夠在核心A肽(例如不含R1和/或R2的肽)和例如一種被連接在或可連接在其上的抗原之間形成鍵的接頭分子。本發(fā)明的肽可以含有或不含肽/待連接到該肽反應(yīng)基團(tuán)上的抗原和/或肽接頭。這類化學(xué)修飾基團(tuán)或合適的肽接頭對于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是容易得到的。
優(yōu)選地，所述疫苗含有至少一種另外的免疫應(yīng)答刺激物質(zhì)?？梢允褂萌魏我阎鹱魟┳饔玫奈镔|(zhì)或分子作為免疫應(yīng)答刺激物質(zhì)。這類物質(zhì)被公開在WO93/19768中。其它物質(zhì)可以例如是聚陽離子，例如聚賴氨酸或聚精氨酸。其它佐劑可以是顆粒狀的組分，例如硅膠或葡聚糖珠粒，所述顆粒足夠小以便能夠進(jìn)入到細(xì)胞中。加入這種另外的免疫應(yīng)答刺激物質(zhì)將使疫苗更加有效。
優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物，特別是疫苗形式的藥物組物進(jìn)一步含有聚陽離子聚合物，優(yōu)選地含有聚陽離子肽，尤其是聚精氨酸、聚賴氨酸或一種抗微生物肽。
本發(fā)明使用的聚陽離子化合物可以是任何具有WO97/30721中所述特有效果的聚陽離子化合物。優(yōu)選的聚陽離子化合物選自堿性多肽、有機(jī)聚陽離子、堿性聚氨基酸或其混合物。這些聚氨基酸應(yīng)當(dāng)具有一條長度至少為4個(gè)氨基酸殘基的鏈。特別優(yōu)選地是含有肽鍵的物質(zhì)，如聚賴氨酸、聚精氨酸和多肽，該多肽含有20％以上，特別是50％以上的長度為8個(gè)以上，特別是20個(gè)以上氨基酸殘基的堿性氨基酸或其混合物。其它優(yōu)選的聚陽離子及其藥物組合物被記載在WO97/30721(聚乙烯亞胺)和WO99/38528中。這些多肽優(yōu)選地含有20至500個(gè)氨基酸殘基，特別優(yōu)選地含有30至200個(gè)殘基。
這些聚陽離子化合物可以通過化學(xué)或重組的方法來生產(chǎn)或可以得自天然來源。
陽離子(多)肽還可以是聚陽離子的抗菌的微生物肽。這些(多)肽可以是原核生物來源的或真核生物來源的或者可以通過化學(xué)或重組的方法來生產(chǎn)。肽還可以屬于天然存在的抗微生物肽類。這類宿主防衛(wèi)肽或防御肽也是本發(fā)明的一種優(yōu)選形式的聚陽離子聚合物。通常，將能夠使適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的終產(chǎn)物活化(或降調(diào)節(jié))的化合物被用作聚陽離子聚合物，優(yōu)選地所述活化是通過APC(包括樹突細(xì)胞)介導(dǎo)的。
被用作本發(fā)明的特別優(yōu)選的聚陽離子物質(zhì)是由cathelicidin衍生的抗微生物肽或其衍生物(A1416/2000，被引入本文作參考)，特別是由哺乳動物cathelicidins衍生的抗微生物肽，優(yōu)選地是由人、?；蚴骳athelicidins衍生的抗微生物肽。
而且，神經(jīng)活性化合物如(人)生長激素(例如WO01/24822中所記載的)也可以被用作免疫刺激劑。
得自天然來源的聚陽離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的陽離子肽、觸角足肽、脫乙酰殼多糖或殼多糖的其它衍生物)或通過生物化學(xué)或重組生產(chǎn)由這些肽或蛋白質(zhì)得到的其它肽。其它優(yōu)選的聚陽離子化合物是cathelin或相關(guān)的或衍生的cathelicidin物質(zhì)，特別是鼠、?；蛱貏e是人cathelicidins和/或cathelicidins。相關(guān)的或衍生的cathelicidin物質(zhì)含有具有至少15-20個(gè)氨基酸殘基的cathelicidin序列的全部或部分序列。衍生化可以包括由20個(gè)常規(guī)氨基酸以外的氨基酸對天然氨基酸進(jìn)行的取代或修飾。而且，還可以將其它陽離子殘基引入到這類cathelicidin分子中。這些cathelicidin分子優(yōu)選地是與本發(fā)明的抗原/疫苗組合物結(jié)合。然而，令人驚奇地是，這些cathelin分子已被證明也能有效作為抗原的佐劑而不需要添加其它佐劑。因此有可能將這類cathelicidin分子作為疫苗制劑中的有效佐劑，所述疫苗制劑含有或不含其它免疫激活物質(zhì)。
優(yōu)選地，所述免疫應(yīng)答刺激物質(zhì)是一種細(xì)胞因子。細(xì)胞因子在對B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和各種其它參與誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的細(xì)胞進(jìn)行激活或刺激的過程中起著重要的作用。任何可以額外地增強(qiáng)針對抗原的免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子都可以被使用。
優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗進(jìn)一步含有免疫刺激/免疫原性核酸，優(yōu)選地含有一種含有脫氧肌苷的寡脫氧核苷酸、一種含有脫氧尿苷的寡脫氧核苷酸、一種含有甲基化的或非甲基化的CG基元的寡脫氧核苷酸或一種含有肌苷和胞苷的核酸分子。
可被用于本發(fā)明的免疫原性核酸可以是合成的、原核生物和真核生物來源的。當(dāng)為真核生物來源時(shí)，DNA應(yīng)當(dāng)?shù)米曰谙到y(tǒng)樹發(fā)育較差的物種(例如昆蟲，但也可以是其它的物種)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述免疫原性寡脫氧核苷酸(ODN)是一種合成生產(chǎn)的DNA分子或這類分子的混合物。還包括ODN的衍生物或修飾物如例如被記載在US5,723,335和US5,663,153中的被硫代磷酸酯取代的類似物(硫代磷酸酯殘基取代磷酸酯)和其它衍生物或修飾物，所述衍生物或修飾物優(yōu)選地穩(wěn)定免疫刺激組合物而不改變其免疫學(xué)特性。一種優(yōu)選的序列基元是含有(非甲基化的)CpG二核苷酸的六堿基DNA基元，所述CpG二核苷酸的側(cè)面連接著兩個(gè)5′嘌呤和兩個(gè)3′嘧啶(5′-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3′)。含在本發(fā)明ODN中的CpG基元在微生物的DNA中比在高等脊椎動物的DNA中更常見并且甲基化的模式不同。令人驚奇地是，刺激小鼠APC的序列對于人細(xì)胞不十分有效。被用于本發(fā)明的優(yōu)選回文或非回文ODN被公開在例如澳大利亞專利申請A1973/2000，A805/2001，EP0468520A2，WO96/02555，WO98/16247，WO98/18810，WO98/37919，WO98/40100，WO98/52581，WO98/52962，WO99/51259和WO99/56755中，所有這些文獻(xiàn)被引入本文作為參考。除了刺激免疫系統(tǒng)之外，某些ODN還中和一些免疫應(yīng)答。這些序列也被包括在本發(fā)明中，例如被用于自身免疫疾病的治療。ODN/DNA可以通過化學(xué)或重組的方法來生產(chǎn)或者可以得自于天然來源。優(yōu)選的天然來源是昆蟲。
或者，基于肌苷和胞苷的核酸(例如PCT/EP01/06437中所記載的)或含有脫氧肌苷和/或脫氧尿苷殘基的脫氧核苷酸(被記載在澳大利亞專利申請A1973/2000和A805/2001中，引入本文作為參考)也可以被優(yōu)選地用作本發(fā)明的免疫刺激核酸。
當(dāng)然，不同免疫原性核酸的混合物也可以被用于本發(fā)明。
本發(fā)明的另一方面涉及含有如上文定義的序列R1-XZXZNXZX-R2的肽(A肽)用于制備能夠增強(qiáng)針對至少一種抗原的免疫應(yīng)答的佐劑的用途。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述佐劑被添加到疫苗中。當(dāng)然可以直接給哺乳動物施用所述佐劑，例如優(yōu)選地在接種疫苗之前進(jìn)行施用。然而，將所述佐劑添加到疫苗中然后同時(shí)給哺乳動物施用使施用更加容易。
本發(fā)明的另一方面涉及一種對包括人在內(nèi)的哺乳動物進(jìn)行疫苗接種從而抵抗一種特異性抗原或一組特異性抗原的方法，所述方法包括給待接種疫苗的包括人在內(nèi)的哺乳動物施用有效量的本發(fā)明的疫苗?；蛘?，所述方法包括施用有效量的含有上述A肽的佐劑，然后再施用疫苗。
本發(fā)明將通過下列實(shí)施例和附圖得到更加詳細(xì)的描述，但是本發(fā)明顯然不局限于此。
圖2顯示了與其它肽相比本發(fā)明的肽變異體的有效性。
圖3顯示了通過采用抗原肽并結(jié)合采用(合成的抗微生物)肽KLKLLLLLKLK進(jìn)行了疫苗接種的小鼠體內(nèi)存在的IFN-γ-產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)量。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1以合成抗微生物肽作為“載體肽”轉(zhuǎn)運(yùn)小鼠的巨噬細(xì)胞為了測試(合成抗微生物)肽KLKLLLLLKLK是否能夠作為抗原的“載體-肽”在體外轉(zhuǎn)運(yùn)APC，也就是說增強(qiáng)抗原向APC中的攝入，將被熒光標(biāo)記的肽用作抗原肽。將抗原肽與不同濃度的KLKLLLLLKLK和其它上述“載體-肽”按照所示方法進(jìn)行混合。
為了比較這些不同“載體-肽”的肽遞送效率，通過在37℃下將P388D1細(xì)胞(小鼠單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞抗原呈遞細(xì)胞系；購自ATCC(TIB-63))與恒量的熒光素標(biāo)記的肽單獨(dú)或與所示濃度的不同“載體-肽”一起培養(yǎng)1小時(shí)來監(jiān)測攝入到APC中的肽量。在利用流式細(xì)胞光度法進(jìn)行分析之前，對細(xì)胞充分進(jìn)行沖洗從而去掉游離肽。利用流式細(xì)胞光度法測定被細(xì)胞攝取的被熒光素標(biāo)記的肽的量。
所使用的抗原肽是一種流感-血細(xì)胞凝集素衍生的I型MHC(Kd)結(jié)合肽(Buschle，M.(1997))。將2μg的這種抗原肽(FL-LFEAIEGFI)與3種不同量的每種載體肽進(jìn)行混合，在代表101.7，50.9和5.09nmol正電荷的濃度下對所述載體肽進(jìn)行了測試。(

圖1顯示了與只有肽的情況相比肽攝入增強(qiáng)的成倍增加)與下列成分混合的肽FL-LFEAIEGFI(1)+聚-L-精氨酸(pR60；60聚體)(2)+小鼠cathelicidin衍生的抗微生物肽(mCRAMP)；SEQ ID.No.2(3)+LL-37；SEQ ID.No.3(4)+L-indolicidin；SEQ ID.No.4(5)+KLKLLLLLKLK(游離C-端)；SEQ ID.No.1(6)+線性牛十二肽；SEQ ID.No.5(7)+環(huán)化牛十二肽盡管已知在只用肽處理的細(xì)胞中熒光稀疏(如前面所說明的)，在被作為“載體肽”的(合成的抗微生物)肽KLKLLLLLKLK轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞中卻特別發(fā)現(xiàn)了“被轉(zhuǎn)運(yùn)的”細(xì)胞的強(qiáng)烈熒光，表明該載體肽能夠與抗原肽一起對APC進(jìn)行非常有效的刺激。
實(shí)施例2采用作為“載體肽”的不同合成抗微生物肽轉(zhuǎn)運(yùn)小鼠巨噬細(xì)胞對R1-XZXZNXZX-R2序列的不同合成抗微生物肽作為抗原的“載體肽”在體外轉(zhuǎn)運(yùn)APC的功能，即增強(qiáng)抗原向APC中的攝入功能進(jìn)行了測試。為了該目的，將熒光標(biāo)記的肽用作抗原肽。將抗原肽與不同濃度的含有R1-XZXZNXZX-R2序列的肽和其它上述“載體肽”按照所示方法進(jìn)行混合。
為了比較這些不同“載體-肽”的肽遞送效率，通過在37℃下將P388D1細(xì)胞(小鼠單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞抗原呈遞細(xì)胞系；購自ATCC(TIB-63))與恒量的熒光素標(biāo)記的肽單獨(dú)或與所示濃度的不同“載體-肽”一起培養(yǎng)1小時(shí)來監(jiān)測攝入到APC中的肽量。在利用流式細(xì)胞光度法進(jìn)行分析之前，對細(xì)胞充分進(jìn)行沖洗從而去掉游離肽。利用流式細(xì)胞光度法測定被細(xì)胞攝取的熒光素標(biāo)記的肽的量。
所使用的抗原肽是一種流感-血細(xì)胞凝集素衍生的-I型MHC(Kd)結(jié)合肽(Buschle，M.(1997))。將3μg的這種抗原肽(FL-LFEAIEGFI)與3種不同量的每種載體肽進(jìn)行混合，在代表101.7，50.9和5.09nmol正電荷的濃度下對所述載體肽進(jìn)行了測試。(圖1顯示了與只有肽的情況相比肽攝入增強(qiáng)的成倍增加)與下列成分混合的肽FL-LFEAIEGFI(1)+聚-L-精氨酸(60聚體)(2)Hp(2-20)，一種得自幽門螺桿菌中的核糖體蛋白L1的殺菌肽樣抗菌肽；SEQ ID.No6(3)LALF-肽SEQ ID No7(4)小鼠cathelicidin衍生的抗微生物肽；SEQ ID No2(5)KAKAAAAAKAK-NH2；SEQ ID.No8(6)KGKGGGGGKGK-NH2；SEQ ID.No9(7)KTKTTTTTKTK-NH2；SEQ ID.No10(8)KLKLVIFWKLK-NH2；SEQ ID.No11(9)KVKVVVVVKVK-NH2；SEQ ID.No12(10)KWKWWWWWKWK-NH2；SEQ ID.No13(11)KFKFFFFFKFK-NH2；SEQ ID.No14
(12)RLKLLLLLKLR-NH2；SEQ ID.No15(13)RLRLLLLLRLR-NH2；SEQ ID.No16(14)KLKLLLLLKLK-NH2；SEQ ID.No17(15)KLKLLLLLKLK-COOH(游離C-端)；SEQ ID.No.1。
盡管已知在只用肽處理的細(xì)胞中熒光稀疏(如前面所說明的)，在被作為“載體肽”的含有R1-XZXZNXZX-R2序列的肽(包括上述優(yōu)選的實(shí)施方案)轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞中卻特別發(fā)現(xiàn)了“被轉(zhuǎn)運(yùn)的”細(xì)胞的強(qiáng)烈熒光，表明本發(fā)明的肽能夠與抗原肽一起對APC進(jìn)行非常有效的刺激。
實(shí)施例3測試增強(qiáng)體內(nèi)誘導(dǎo)肽特異性T細(xì)胞應(yīng)答的能力為了測試(合成抗微生物)肽KLKLLLLLKLK增強(qiáng)體內(nèi)誘導(dǎo)肽特異性T細(xì)胞應(yīng)答的能力，給幾組的小鼠，每組包括4只小鼠(C57BL/6，雌性，8周齡，H-2b)，單獨(dú)側(cè)腹皮下注射得自TRP-2(小鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2)的抗原黑色素瘤肽(100μg)，或者與作為“載體肽”的聚-L-精氨酸或(合成抗微生物)肽KLKLLLLLKLK一起側(cè)腹皮下注射得自TRP-2(小鼠酪氨酸酶蛋白-2)的抗原黑色素瘤肽(100μg)，共注射3次(第0，28和56天)。(合成抗微生物)肽KLKLLLLLKLK的用量為在以下濃度下的四種不同的量，所述濃度代表以μg表示的等量(100μg)的聚-L-精氨酸、以正電荷表示的等量(168μg)、二倍量(336μg)和三倍量(504μg)的聚-L-精氨酸。按照以下方式給幾組小鼠進(jìn)行注射(所示量/每只小鼠)。
(1)100μg肽(2)100μg肽+100μg聚-L-精氨酸(pR60)(3)100μg肽+100μg KLKLLLLLKLK(4)100μg肽+168μg KLKLLLLLKLK(5)100μg肽+336μg KLKLLLLLKLK(6)100μg肽+504μg KLKLLLLLKLK12
第3次接種疫苗后的第12天，取出引流(腹股溝的)淋巴結(jié)并利用TRP-2衍生的(小鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2)肽離體激活淋巴結(jié)細(xì)胞(圖3)以便用ELISpot測定法確定產(chǎn)生IFN-γ的特異性細(xì)胞(每一百萬個(gè)淋巴結(jié)細(xì)胞的IFN-γ-ELISpots的數(shù)目)。
圖3顯示了采用肽與遞增量的KLKLLLLLKLK對小鼠進(jìn)行注射所產(chǎn)生的特異性IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞比單獨(dú)采用肽或采用肽與聚-L-精氨酸進(jìn)行注射所產(chǎn)生的特異性IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞多。也已經(jīng)證實(shí)了肽KLKLLLLLKLK沒有引發(fā)產(chǎn)生IFN-γ的肽特異性T細(xì)胞(通過ELISpot測定被證實(shí))，即在本實(shí)驗(yàn)中只獲得了非KLKLLLLLKLK特異性T細(xì)胞。
該實(shí)施例清楚地表明(合成抗微生物)肽KLKLLLLLKLK可增強(qiáng)肽特異性T細(xì)胞應(yīng)答的體內(nèi)誘導(dǎo)。
總之，(合成抗微生物)肽KLKLLLLLKLK具有很高的“轉(zhuǎn)運(yùn)”和免疫刺激效率，表明A肽與抗原性肽能夠在體外和體內(nèi)非常有效地刺激APC并且在誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的過程中是抗原性肽的優(yōu)良佐劑/“載體肽”。
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序列表<110>Cistem Biotechnologies GmbH<120>疫苗組合物<130>R38239<140><141><160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<400>1Lys Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Lys1 5 10<210>2<211>31<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<400>2Arg Leu Ala Gly Leu Leu Arg Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Glu Lys1 5 10 15Leu Lys Lys Ile Gly Gln Lys Ile Lys Asn Phe Phe Gln Lys Leu20 25 30<210>3<211>37<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<400>3Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30Pro Arg Thr Glu Ser35<210>4<211>13<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<220><221>MOD_RES<222>(13)<223>酰胺化<400>4Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg1 5 10<210>5<211>12<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<400>5Arg Leu Cys Arg Ile Val Val Ile Arg Val Cys Arg1 5 10<210>6<211>19<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<400>6Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Gln1 5 10 15Asn Asp Lys<210>7<211>10<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<400>7Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys1 5 10<210>8<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>8Lys Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Lys1 5 10<210>9<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>9Lys Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Gly Lys1 5 10<210>10<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>10Lys Thr Lys Thr Thr Thr Thr Thr Lys Thr Lys1 5 10<210>11<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>11Lys Leu Lys Leu Val Ile Phe Trp Lys Leu Lys1 5 10<210>12<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>12Lys Val Lys Val Val Val Val Val Lys Val Lys1 5 10<210>13<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>13Lys Trp Lys Trp Trp Trp Trp Trp Lys Trp Lys1 5 10<210>14<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>14Lys Phe Lys Phe Phe Phe Phe Phe Lys Phe Lys1 5 10<210>15<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>15Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Arg1 5 10<210>16<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>16Arg Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu Arg1 5 10<210>17<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的種類肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>17Lys Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Lys1 5 10
權(quán)利要求
1.疫苗，其特征在于該疫苗含有至少一種抗原和一種具有R1-XZXZNXZX-R2序列的肽，其中-N是一個(gè)3至7的整數(shù)，優(yōu)選地是5，-X是一種帶正電荷的天然和/或非天然氨基酸殘基，-Z是一種選自L，V，I，F(xiàn)和/或W的氨基酸殘基，和-R1和R2分別獨(dú)立地選自-H，-NH2，-COCH3，-COH，具有至多20個(gè)氨基酸殘基的肽或肽反應(yīng)基團(tuán)或者含有或不含肽的肽接頭；X-R2還可以是C-端氨基酸殘基的酰胺、酯或硫酯。
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述肽序列中的X是一種選自K、R、鳥氨酸和/或高精氨酸的氨基酸殘基。
3.如權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于所述肽序列中的X是K。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于所述肽序列中的Z選自L、I和/或F。
5.如權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于所述肽序列中的Z是L。
6.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述肽序列是H-KLKLLLLLKLK-H。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于所述肽序列中的R1和/或R2是10至20個(gè)氨基酸殘基。
8.如權(quán)利要求7所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸殘基是不帶負(fù)電荷的氨基酸殘基。
9.如權(quán)利要求8所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸殘基選自L、V、I、F和/或W。
10.如權(quán)利要求9所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸殘基選自L、I和/或F。
11.如權(quán)利要求10所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸殘基是L。
12.如權(quán)利要求7至11中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸殘基是帶正電荷的天然和/或非天然氨基酸殘基。
13.如權(quán)利要求12所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸殘基選自K、R、鳥氨酸和/或高精氨酸。
14.如權(quán)利要求13所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸殘基是K。
15.如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于該疫苗含有至少一種其它的免疫應(yīng)答刺激物質(zhì)。
16.如權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于該疫苗進(jìn)一步含有一種免疫刺激核酸，優(yōu)選地含有一種含有脫氧肌苷的寡脫氧核苷酸、一種含有脫氧尿苷的寡脫氧核苷酸、一種含有CG基元的寡脫氧核苷酸或一種含有肌苷和胞苷的核酸分子。
17.如權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于其進(jìn)一步含有一種作為免疫應(yīng)答刺激物質(zhì)的細(xì)胞因子。
18.如權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于其進(jìn)一步含有一種聚陽離子肽、神經(jīng)活性化合物或具有生長因子活性的激素。
19.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)中所定義的具有R1-XZXZNXZX-R2序列的肽用于制備用來增強(qiáng)針對至少一種抗原的免疫應(yīng)答的佐劑或載體蛋白的用途。
20.如權(quán)利要求19所述的用途，其特征在于所述佐劑或載體蛋白增強(qiáng)了至少一種抗原在抗原呈遞細(xì)胞(APC)中的攝入。
21.如權(quán)利要求19或20所述的用途，其特征在于所述佐劑或載體蛋白被加入到疫苗中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種疫苗，該疫苗含有至少一種抗原和一種具有R
文檔編號A61P37/04GK1468109SQ01817116
公開日2004年1月14日 申請日期2001年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月18日
發(fā)明者J·福里茨, J 福里茨, F·馬特納, 嗇, W·佐納, 怖, E·納吉, M·布什勒 申請人:英特塞爾生物醫(yī)藥研究發(fā)展股份公司