專利名稱：用于改變t細(xì)胞介導(dǎo)病理的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來講涉及免疫學(xué)和免疫治療領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及用于改變T細(xì)胞介導(dǎo)病理例如T細(xì)胞惡性腫瘤和/或自身免疫病的方法和組合物。
背景技術(shù)：
本發(fā)明總的來講涉及免疫學(xué)和免疫治療領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及用于改變T細(xì)胞介導(dǎo)病理例如T細(xì)胞惡性腫瘤和/或自身免疫病的方法和組合物。
免疫系統(tǒng)既產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的應(yīng)答，也產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。每種類型的免疫應(yīng)答由淋巴細(xì)胞B細(xì)胞(對(duì)于抗體介導(dǎo)應(yīng)答而言)和T細(xì)胞(對(duì)于細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答而言)中的一種類型來調(diào)控。當(dāng)某些外源性蛋白質(zhì)(抗原)的部分與主要組織相容性復(fù)合體(“MHC”)結(jié)合(通常通過抗原呈遞細(xì)胞(“APC”))時(shí)(所述抗原在APC中被消化為片段，與自身MHC結(jié)合呈遞到所述APC表面)，T細(xì)胞與所述蛋白的部分結(jié)合。
T細(xì)胞淋巴瘤是一種由于T細(xì)胞不當(dāng)復(fù)制而引起、最終導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能受損的一種T細(xì)胞介導(dǎo)的病理。T細(xì)胞淋巴瘤用目前可利用的藥物難以有效地治療，其它的治療策略將會(huì)被受歡迎地加入到醫(yī)師的武器庫(kù)中。
其它T細(xì)胞介導(dǎo)病理包括越來越多的被分類為自身免疫病的人類疾病，在自身免疫病中宿主自身的免疫系統(tǒng)攻擊宿主自身組織。T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的初級(jí)調(diào)節(jié)物之一，直接或間接地影響這類自身免疫病理。這類自身免疫病的實(shí)例包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、重癥肌無力(MG)、多發(fā)性硬化(MS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)、Graves病、炎性腸病、自身免疫性眼色素層視網(wǎng)膜炎(uveoretinitis)、多肌炎和某些類型的糖尿病。本發(fā)明對(duì)于這些自身免疫病的治療并不治愈這些疾病，而是僅治療癥狀。
現(xiàn)在已知這些和其它自身免疫病涉及T輔助細(xì)胞通過其T細(xì)胞受體(TCR)與MHC/自身抗原(或非自身抗原)復(fù)合體結(jié)合而被刺激的作用。有人提出，對(duì)這些自身免疫病的可能的治療可以通過破壞MHC/抗原復(fù)合體和TCR之間的相互作用來完成。
在大多數(shù)成熟T淋巴細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的TCR是一種最常見包含α鏈和β鏈的異二聚體膜內(nèi)在蛋白。TCR的整體三維結(jié)構(gòu)與B細(xì)胞上的細(xì)胞表面相關(guān)免疫球蛋白(Ig)的三維結(jié)構(gòu)類似，因?yàn)槊總€(gè)α鏈和β鏈都含有一個(gè)負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的氨基末端可變(V)區(qū)和一個(gè)在將識(shí)別事件信號(hào)發(fā)送至細(xì)胞內(nèi)部中重要的的羧基末端恒定(C)區(qū)。β鏈還含有由多樣性(D)基因和連接(J)基因區(qū)段編碼的額外的氨基酸。這些V、D、J和C基因區(qū)段在染色體上位于不同且隔開的位置上。Vβ、Dβ、Jβ和Cβ基因區(qū)段重組產(chǎn)生編碼β鏈的功能性轉(zhuǎn)錄單位。功能性α鏈轉(zhuǎn)錄單位通過Vα、Dα、Jα和Cα區(qū)段重組而形成。在一個(gè)淋巴細(xì)胞克隆中Vα、Jα和Cα基因區(qū)段加上Vβ、Dβ、Jβ和Cβ基因區(qū)段的獨(dú)特重組，產(chǎn)生一種僅在該特定淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特的蛋白決定簇-獨(dú)特型(Id)。
存在區(qū)別TCR分子與免疫球蛋白分子的重大差異。免疫球蛋白一般識(shí)別溶液相中或者作為B細(xì)胞抗原受體、或者作為分泌型分子的其配體，而TCR僅識(shí)別作為與居留在其它細(xì)胞的細(xì)胞表面的MHC I類和II類分子結(jié)合的來自蛋白質(zhì)抗原的肽片段的配體。另外，與免疫球蛋白不同，不發(fā)生TCR mRNA可變剪接而產(chǎn)生分泌型TCR鏈，因此，TCR分子僅作為T細(xì)胞表面的膜內(nèi)在蛋白存在。最后，當(dāng)T細(xì)胞在識(shí)別抗原后被活化時(shí)，TCR可變區(qū)基因區(qū)段不發(fā)生超變，與B細(xì)胞中的免疫球蛋白V基因區(qū)段相反，后者經(jīng)歷體細(xì)胞突變，從而增加其對(duì)其配體的親和力。
根據(jù)對(duì)自身免疫病的廣泛研究，現(xiàn)已大量記載了T細(xì)胞及其表達(dá)的TCR鏈可以作為其它T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的靶(Vandenbark等，“HumanTCR as antigenHomologoies and potentially cross-reactive HLA-DR-2restricted epitopes with the AV and BV CDR2 loops，”Critical Reviews inImmunol.，2057-83，2000)。目前人們認(rèn)為，TCR鏈的肽片段被酶促加工，隨后與MHC I類和II類分子結(jié)合而被呈遞到活化T細(xì)胞的細(xì)胞表面。MHC II類分子僅存在于活化后的T細(xì)胞上，最近的證據(jù)提示，TCR肽呈遞通過其表達(dá)也在活化后被正調(diào)節(jié)的一個(gè)亞類的MHC I類分子而發(fā)生(Ware等，Immunity 2177-184，1995；Jiang等，Immunity 2185-94，1995)。這些MHC/TCR-肽復(fù)合體以MHC I類限制性CD8+效應(yīng)T細(xì)胞和MHC II類限制性CD4+效應(yīng)T細(xì)胞的形式誘發(fā)自身調(diào)節(jié)性免疫。所選TCR肽疫苗在T細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫病環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)特性已有報(bào)道(Gold等，Critical Reviews Immunol.，17507-10，1997)。此外，因?yàn)橥暾鸗CR鏈克隆分布在T細(xì)胞上(正如B細(xì)胞克隆上的免疫球蛋白一樣)，完整的功能性TCR是作為T細(xì)胞淋巴瘤的潛在腫瘤特異性抗原的候選物。在采用完整TCR作為抗原的潛在缺點(diǎn)中，有可能因產(chǎn)生針對(duì)α鏈和β鏈的恒定區(qū)的免疫應(yīng)答而引起的并發(fā)癥。
免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)TCR鏈特異性的應(yīng)答，看來針對(duì)所述TCR鏈可變區(qū)中種系編碼的決定簇。由于TCR鏈同Ig分子一樣往往不突變，所以動(dòng)物研究中的試驗(yàn)證據(jù)提示屬類TCR鏈有治療應(yīng)用。接種在細(xì)菌中制備的分泌型TCR β鏈(Kumar，J.Immunol.1595150-56，1997)、表達(dá)TCR β鏈的痘苗病毒構(gòu)建體(Chundru，J.Immunol.1564940-45，1996)或者編碼單一TCR β鏈的“裸”DNA構(gòu)建體(Waisman，Nat.Med.2899-905，1996)，都導(dǎo)致誘發(fā)針對(duì)所述免疫性TCR β鏈的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答。
已經(jīng)測(cè)試了基于具有已限定化學(xué)特性的單一TCR基序的肽疫苗作為治療T細(xì)胞介導(dǎo)病理的治療藥的應(yīng)用。某些研究人員已經(jīng)指明，如果用在特定疾病環(huán)境中過量表達(dá)的來源于TCR鏈的肽來治療，則TCR鏈的構(gòu)架區(qū)/CDR區(qū)衍生肽可以預(yù)防在動(dòng)物中發(fā)生的自身免疫病。這證明T細(xì)胞加工其自身內(nèi)源TCR鏈，并且將它們以一種方式重新呈遞給其它T細(xì)胞，使得確保T細(xì)胞-T細(xì)胞相互作用可以發(fā)揮作用，以調(diào)節(jié)致病細(xì)胞。然而，由于TCR肽的識(shí)別要求所述TCR鏈被加工為肽片段，所述肽片段與MHC分子結(jié)合而呈遞到靶T細(xì)胞表面，所以很難預(yù)測(cè)來自特定TCR的哪種肽在臨床環(huán)境下有效。顯示出對(duì)TCR肽的MHC II類限制性應(yīng)答的近交嚙齒動(dòng)物研究調(diào)查闡明了這一點(diǎn)(Gold等，Critical Reviews Immunol.，17507-10，1997，參見上文)。因此，與大多數(shù)蛋白質(zhì)一樣，所述Vβ序列和所述MHC一起決定哪種表位將會(huì)刺激T細(xì)胞，沒有明顯的規(guī)律可預(yù)測(cè)相關(guān)TCR肽位于所述Vβ氨基酸序列中何處。這種挑戰(zhàn)又混合有人群中存在廣泛的MHC多態(tài)性。
產(chǎn)生TCR獨(dú)特型以調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答是困難的，因?yàn)門CR是一種膜內(nèi)在蛋白，通常不作為可溶性蛋白合成和分泌。因此，從致病細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞常規(guī)純化足量的TCR以供治療應(yīng)用是不可行的。
已經(jīng)嘗試用昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)大量的分泌形式的異二聚體TCR。這些分泌型分子含有完整的VαJαCα/VβDβJβCβ胞外結(jié)構(gòu)域，并且根據(jù)用構(gòu)象特異性抗TCR Vβ抗體檢測(cè)，它們進(jìn)行正確的折疊。然而，分泌型分子的生產(chǎn)水平可能很低。其它研究人員已經(jīng)用各種方法產(chǎn)生重組TCR鏈，所有這些方法的目的都是制備能夠產(chǎn)生識(shí)別其關(guān)連配偶體MHC+肽的功能性TCR的可溶性異二聚體結(jié)構(gòu)。
用幾種不同方法產(chǎn)生用于治療的TCR可溶性部分的工作遇到了其它重大的問題。這些工作和相關(guān)工作包括(1)在大腸桿菌中生產(chǎn)可以從包涵體中純化并且隨后可以重折疊的單鏈Fv構(gòu)建體(Kurucz等，Proc.Natl.Acad.Sci.，903830-34，1994)；(2)在細(xì)菌中生產(chǎn)重組TCR分子(Kumar等，J.Immunol.1595150-56，1997；Offner等，J.Immunol.1612178-86，1998；Novotny等，Proc.Natl.Acad.Sci.，888646-50，1991)，(3)生產(chǎn)通過在TCR可變區(qū)加上所有或幾乎所有TCR恒定區(qū)和Ig恒定區(qū)之間融合制備的、可以從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌的嵌合分子(Gregoire等，Proc.Natl.Acad.Sci.888077-81，1991；Weber等，Nature356793-96，1992；Eilat，Proc.Natl.Acad.Sci.，896871-75，1992)，(4)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面表達(dá)TCR胞質(zhì)外結(jié)構(gòu)域，所述胞質(zhì)外結(jié)構(gòu)域通過磷脂酰肌醇聚糖鍵連接，該鍵隨后可以通過磷脂酰肌醇特異性的磷脂酶C的作用而被切除(Lin等，Science 249677-79，1990；Chung等，Proc.Natl.Acad.Sci.9112654-58，1994；Okada等，J.Immunol.，1595516-27，1997)，和(5)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)作為分泌型蛋白的單鏈或完整的異二聚體TCR鏈(Kappler等，Proc.Natl.Acad.Sci.，918462-66，1994)。與利用細(xì)菌的每種所述方法相關(guān)的缺點(diǎn)，包括不確定的溶解性和可能的內(nèi)毒素污染問題，這些有損于在細(xì)菌中制備的蛋白質(zhì)的容易性和高產(chǎn)潛力。對(duì)于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)，引起了關(guān)于病毒負(fù)載的擔(dān)心。這些擔(dān)心以及在純化磷脂相關(guān)蛋白方面的困難，使得這種方法對(duì)于臨床環(huán)境的吸引力更加低。
在大腸桿菌中生產(chǎn)抗體遇到了其它困難，所述抗體一般不能用于治療應(yīng)用，盡管它們可用來鑒定編碼所需結(jié)合特異性的基因。通常，僅所述抗體的抗原結(jié)合片段Fab或Fv在細(xì)菌中被分泌(參見例如Kurucz等，Proc.Natl.Acad.Sci.，903830-34，1994)。用大腸桿菌生產(chǎn)完整鏈的四聚體IgG時(shí)在非常少的情況下，所述抗體被不當(dāng)?shù)靥腔?。沒有正確的糖基化，抗體就不會(huì)觸發(fā)抗體引導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體激活的溶細(xì)胞活性，而這些活性使被動(dòng)免疫治療如此有功效。另一方面，哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生糖基化抗體。然而，最近FDA CBER部門的“Points to Consider”的修改明確地表明他們對(duì)與用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的單克隆抗體相關(guān)的病毒負(fù)載的擔(dān)心。此外，預(yù)期用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的任何工程抗體都將是相當(dāng)昂貴的(每劑$1500-$5000)。
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是用大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)抗體的一種很好的替代方法。用桿狀病毒系統(tǒng)在真核細(xì)胞中高產(chǎn)地生產(chǎn)(1-100mg/L)生物活性蛋白是可能的(Haseman等，Proc.Natl.Acad.Sci.873942-46，1990)。桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)繞過了當(dāng)重組蛋白在原核生物中過量表達(dá)時(shí)通常遇到的溶解性問題。另外，昆蟲細(xì)胞含有在真核細(xì)胞中存在的負(fù)責(zé)正確折疊、二硫鍵形成、糖基化、β-羥基化、脂肪酸?；?、異戊烯基化、磷酸化和酰胺化的翻譯后修飾機(jī)器。最近證明了用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)識(shí)別人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的功能性糖基化單克隆抗體(Nesbit，J.Immunol.Methods 151201-208，1992)。顯示出這種桿狀病毒生產(chǎn)的抗體介導(dǎo)ADCC；相反，在細(xì)菌中生產(chǎn)的抗體不被糖基化，因此沒有可檢測(cè)的ADCC活性。
在某些情況下，應(yīng)用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)生物活性蛋白由于不能在不過度蛋白酶降解的情況下有效地溶解重組蛋白而受到阻礙。為了繞開在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白所遇到的溶解性和蛋白水解的問題，開發(fā)了可供有效分泌生物活性蛋白的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體。通過將功能性分泌前導(dǎo)序列插入到多角體蛋白啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建了這些促進(jìn)重組蛋白從宿主昆蟲細(xì)胞中分泌的載體。cDNA序列符合讀框的插入，導(dǎo)致合成含有將重組蛋白引向所述分泌途徑的異源信號(hào)序列的蛋白。測(cè)試了人和昆蟲的前導(dǎo)序列，以使得異源蛋白從昆蟲細(xì)胞的分泌最大化。證明人胎盤堿性磷酸酶信號(hào)序列(MLGPCMLLLLLLLGLRLQLSLG(SEQ ID NO1)；DNA序列ATG GTG GGA CCC TGC ATG CTG CTGCTG CTG CTG CTG CTA GGC CTG AGG CTA CAG CTC TCC CTGGGC(SEQ ID NO2))和蜜蜂蜂毒肽信號(hào)序列(MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(SEQ ID NO3)；DNA序列ATGAAA TTC TTA GTC AAC GTT GCA CTA GTT TTT ATG GTC GTGTAC ATT TCT TAC ATC TAT GCG(SEQ ID NO4))對(duì)于許多細(xì)菌蛋白和人蛋白的分泌都是有效的(Mroczkowski等，J.Biol.Chem.26913522-28，1994和Tessier等，Gene 98177-83，1991)。
利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，McKeever等(J.Exp.Med 1841755-68，1996)能夠產(chǎn)生由與小鼠IgG1重鏈的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)連接的TCR鏈胞外結(jié)構(gòu)域(Vα-Cα和Vβ-Cβ)構(gòu)成的嵌合蛋白。用所得的來自胰腺β細(xì)胞抗原特異性的T細(xì)胞克隆的溶解的TCR-IgG1嵌合蛋白，來免疫非肥胖性糖尿病性(NOD)雌性小鼠。交配后，分析這些小鼠的后代，以確定母性轉(zhuǎn)移的抗TCR抗體對(duì)致糖尿病活性的效應(yīng)。這些研究證明，當(dāng)以可溶性形式給予時(shí)，所述TCRα鏈或β鏈的可變區(qū)在所來源品系小鼠中可以具有免疫原性。這些研究也表明，用可溶性TCR-IgG1免疫，可以刺激識(shí)別天然克隆型表位的抗體的產(chǎn)生。McKeever等明確地證明，使用相對(duì)簡(jiǎn)單的表達(dá)和純化策略，有可能生產(chǎn)含有全部α鏈和β鏈的可溶性TCR-IgG1蛋白，其中所述TCR部分具有免疫原性的、與在功能活性的細(xì)胞表面形式的TCR中發(fā)現(xiàn)的那些決定簇交叉反應(yīng)的克隆型決定簇。
一些其它研究人員也表達(dá)了作為以各種方式與Ig鏈融合的分子融合體的TCR分子。然而，所有這些研究都利用完整的TCR結(jié)構(gòu)(即可變區(qū)和恒定區(qū))與Ig骨架的各個(gè)部分融合，所有這些研究的目的都是再現(xiàn)TCR可變區(qū)的識(shí)別功能。也證明了，各種形式的TCR鏈在動(dòng)物研究中有可能用作預(yù)防/治療自身免疫病的疫苗。例如Okada等(J.Immunol.，1595516-27，1997)已經(jīng)指出，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備的可溶性TCR鏈有可能用來治療小鼠的T細(xì)胞腫瘤。然而，如上所述，這些TCR分子的生產(chǎn)是困難的，并且生產(chǎn)水平低。
另外，預(yù)測(cè)TCR蛋白的應(yīng)用在獸醫(yī)應(yīng)用中具有治療價(jià)值(參見1999年7月29日申請(qǐng)的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US99/17309，WO00/06733)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種改變患者的T細(xì)胞介導(dǎo)病理的方法。該方法包括給予一種含有至少一種嵌合蛋白的組合物，所述嵌合蛋白具有TCR Vβ或Vα鏈的至少一部分和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，存在的所述嵌合蛋白可以包含TCR Vβ或Vα鏈的至少一部分、加上一個(gè)接頭區(qū)、加上免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白中TCR恒定區(qū)的所述部分為約3-30個(gè)相連氨基酸殘基。接頭區(qū)可以包含TCR恒定區(qū)的一部分。在再更優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合蛋白中恒定區(qū)的所述部分包含直到并包括所述恒定區(qū)免疫球蛋白折疊的第一個(gè)半胱氨酸殘基的氨基酸殘基。在該組合物中使用的Vβ或Vα鏈與來自具有T細(xì)胞介導(dǎo)病理的患者的T細(xì)胞的特定TCR相關(guān)。在將這樣的組合物給予患者后，該患者的T細(xì)胞介導(dǎo)病理得到改變。
本發(fā)明也提供通過給予含有兩種不同嵌合蛋白的組合物來改變患者的T細(xì)胞介導(dǎo)病理的方法。每種嵌合蛋白具有與免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分連接的TCR Vβ或Vα鏈的至少一部分。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，存在的嵌合蛋白可以包含TCR Vβ或Vα鏈的至少一部分、加上一個(gè)接頭區(qū)、加上免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白中TCR恒定區(qū)的所述部分為約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30個(gè)相連氨基酸殘基。接頭區(qū)可以包含TCR恒定區(qū)的一部分。在再更優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合蛋白中恒定區(qū)的所述部分包含直到所述恒定區(qū)的免疫球蛋白折疊的第一個(gè)半胱氨酸殘基氨基末端一側(cè)的某些或所有的氨基酸殘基。作為所述嵌合蛋白部分的Vβ和/或Vα鏈與來自具有T細(xì)胞介導(dǎo)病理的患者的T細(xì)胞的特定TCR相關(guān)。
含有患者來源的特有Vα和/或Vβ鏈的特異性TCR蛋白可以被開發(fā)成為治療組合物。可以用可疑的自身抗原來選擇性地刺激和擴(kuò)充參與自身免疫性T細(xì)胞病理的T細(xì)胞，所述自身免疫病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、重癥肌無力(MG)、多發(fā)性硬化(MS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)、Graves病、炎性腸病、自身免疫性眼色素層視網(wǎng)膜炎、多肌炎和某些類型的糖尿病。或者，利用T細(xì)胞生長(zhǎng)因子即IL-2、IL-4，可以選擇性地?cái)U(kuò)充從組織中分離的、經(jīng)歷過自身免疫攻擊的T細(xì)胞。與多發(fā)性硬化相關(guān)的T細(xì)胞已經(jīng)由Wilson等以這種方式表征(J.Neuroimmunol.7615-28，1997)，該文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中，包括任何附圖和圖表。與其它T細(xì)胞介導(dǎo)病理相關(guān)的T細(xì)胞可以用Wilson等所述方法的改進(jìn)方法來表征。在純化少量致病性T細(xì)胞后，可以采用本發(fā)明中所述方法，通過PCR克隆由這些細(xì)胞表達(dá)的T細(xì)胞受體的可變區(qū)部分。一旦克隆出所述部分，則可以用具體參與所述T細(xì)胞病理的受體的Vα和/或Vβ部分，來制備可以在本文所述的桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)的嵌合蛋白。
用于上述組合物和嵌合蛋白中的免疫球蛋白恒定區(qū)可以是選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鏈、κ和λ輕鏈的蛋白質(zhì)的一部分。在某些實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白僅含有TCR的或者Vβ鏈或者Vα鏈和免疫球蛋白恒定區(qū)。嵌合蛋白的實(shí)例包括Vβ-IgGγ1、Vα-κ或Vα-λ、或者Vα-IgGγ1、Vβ-κ或Vβ-λ。在另外的實(shí)施方案中，所述組合物含有兩種嵌合蛋白，每種嵌合蛋白分別含有一個(gè)Vβ和Vα鏈與一個(gè)免疫球蛋白恒定區(qū)。實(shí)例包括Vβ-IgGγ1和Vα-κ、或者Vβ-IgGγ1和Vα-λ、或者Vα-IgGγ1和Vβ-κ、或者Vα-IgGγ1和Vβ-λ。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白可以包含TCR Vβ或Vα鏈的至少一部分、加上一個(gè)接頭鏈、加上免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白中TCR恒定區(qū)的所述部分為約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30個(gè)相連氨基酸殘基。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白中恒定區(qū)的所述部分包含直到所述免疫球蛋白折疊的第一個(gè)半胱氨酸殘基氨基末端一側(cè)的某些或所有的氨基酸殘基。實(shí)例包括Vβ-Cβ-IgGγ1和Vα-Cα-κ、或者Vβ-Cβ-IgGγ1和Vα-Cα-λ、或者Vα-Cα-IgGγ1和Vβ-Cβ-κ、或者Vα-Cα-IgGγ1和Vβ-Cβ-λ。
本發(fā)明也提供一種用重組DNA技術(shù)和一種表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)嵌合蛋白的方法。該方法包括以下步驟(a)從具有T細(xì)胞介導(dǎo)病理的患者的T細(xì)胞中分離出編碼TCR Vβ或Vα鏈的基因，(b)將編碼所述TCR Vβ或Vα鏈的基因和編碼所述免疫球蛋白恒定區(qū)的基因插入到表達(dá)載體中，以允許嵌合蛋白表達(dá)，(c)通過將所述表達(dá)載體導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞系中并讓其表達(dá)，生產(chǎn)所述嵌合蛋白，并且(d)分離所述嵌合蛋白。所述生產(chǎn)嵌合蛋白的方法還包括下述步驟將編碼所述TCR Vβ或Vα鏈的基因和編碼第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的基因插入到所述表達(dá)載體中，以允許所述第二種嵌合蛋白表達(dá)。所述分離的編碼所述TCR Vβ或Vα鏈的基因可以另外包含所述TCR恒定區(qū)中約30個(gè)或更少氨基酸的一個(gè)部分。
本發(fā)明還提供一種用于改變患者的T細(xì)胞介導(dǎo)病理的組合物。該組合物含有至少一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白具有TCR Vβ或Vα鏈的至少一部分和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白可以包含TCR Vβ或Vα鏈的至少一部分、加上所述TCR鏈恒定區(qū)中約30個(gè)或更少氨基酸殘基的一個(gè)部分和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白中TCR恒定區(qū)的所述部分為約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30個(gè)相連氨基酸殘基。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白中TCR恒定區(qū)的所述部分包含直到所述恒定區(qū)的免疫球蛋白折疊的第一個(gè)半胱氨酸殘基氨基末端一側(cè)的某些或所有的氨基酸殘基。作為所述嵌合蛋白部分的Vβ或Vα鏈與來自具有T細(xì)胞介導(dǎo)病理的患者的T細(xì)胞的特定TCR相關(guān)。所述組合物還含有第二種嵌合蛋白，所述第二種嵌合蛋白具有TCR Vβ或Vα鏈的至少一部分和第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白可以包含TCRVβ或Vα鏈的至少一部分、加上一個(gè)接頭區(qū)、加上免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述接頭區(qū)可以包含所述TCR恒定區(qū)中約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30個(gè)相連氨基酸殘基的一個(gè)部分。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白中所述恒定區(qū)的所述部分包含直到所述恒定區(qū)的免疫球蛋白折疊的第一個(gè)半胱氨酸殘基氨基末端一側(cè)的某些或所有的氨基酸殘基。作為所述第二種嵌合蛋白部分的Vβ或Vα鏈與來自具有T細(xì)胞介導(dǎo)病理的患者的T細(xì)胞的特定TCR相關(guān)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含兩種嵌合蛋白，所述第一種嵌合蛋白包含完整的Vβ區(qū)和人免疫球蛋白IgGγ1恒定區(qū)(TCRVβ-IgGγ1)，第二種嵌合蛋白包含完整的Vα和人κ或λ恒定區(qū)(TCR Vα-κ或TCR Vα-λ)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白中的任一種或兩種蛋白可以包含TCR Vβ或Vα鏈的至少一部分、加上一個(gè)接頭區(qū)、加上免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，任一種或兩種所述嵌合蛋白中的接頭區(qū)可以包含TCR恒定區(qū)中約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30個(gè)相連氨基酸殘基的一個(gè)部分。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述組合物含有兩種嵌合蛋白，第一種蛋白包含完整的Vβ區(qū)加上所述TCR β鏈恒定區(qū)(Cβ)中30個(gè)或更少的氨基酸殘基的一個(gè)部分和人免疫球蛋白IgGγ1恒定區(qū)(TCR VβCβ(1-30)-IgGγ1)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所用的Cβ的所述部分為約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30個(gè)相連氨基酸殘基。第二種嵌合蛋白包含完整的Vα加上所述TCR α鏈恒定區(qū)(Cα)中30個(gè)或更少的氨基酸殘基的一個(gè)部分和人κ恒定區(qū)(TCR VαCα(1-30)-κ)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所用的Cα的所述部分為約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30個(gè)相連氨基酸殘基。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述組合物含有一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白含有來自患者T細(xì)胞的特定TCR的Vβ或Vα鏈和免疫球蛋白恒定區(qū)。實(shí)例包括嵌合蛋白Vβ-IgGγ1、Vα-κ或Vα-λ、或者Vα-IgGγ1、Vβ-κ或Vβ-λ。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白可以包含TCR Vβ或Vα鏈的至少一部分、加上一個(gè)接頭區(qū)、加上免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，任一種或兩種所述嵌合蛋白中的接頭區(qū)可以包含TCR恒定區(qū)中約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30個(gè)相連氨基酸殘基的一個(gè)部分。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用來表達(dá)所述嵌合蛋白的表達(dá)載體是一種桿狀病毒載體。所述載體含有兩個(gè)表達(dá)盒，每個(gè)表達(dá)盒具有啟動(dòng)子、分泌信號(hào)序列和嵌合蛋白。一個(gè)表達(dá)盒含有與蜜蜂蜂毒肽信號(hào)序列連接的桿狀病毒AcNPV p10啟動(dòng)子。另一表達(dá)盒具有與人胎盤堿性磷酸酶信號(hào)序列連接的多角體蛋白啟動(dòng)子。除所列的啟動(dòng)子和信號(hào)序列之外，還可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它啟動(dòng)子和信號(hào)序列來替代。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用與來源于特定患者的免疫球蛋白基因相關(guān)的內(nèi)源分泌序列。將編碼所述TCR Vα或Vβ鏈、所述接頭區(qū)和所述免疫球蛋白恒定區(qū)的基因分別地和/或一起插入到所述桿狀病毒載體的上述表達(dá)盒中，讓一種或兩種嵌合蛋白表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)例如IgG1與或者Vβ鏈或者Vα鏈一起，由多角體蛋白啟動(dòng)子來控制。
所產(chǎn)生的嵌合蛋白用具有抗免疫球蛋白的抗體或Ig結(jié)合蛋白和/或與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的任何其它蛋白的親和柱來純化，所述Ig結(jié)合蛋白例如用于免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的A蛋白和用于免疫球蛋白κ輕鏈可變區(qū)的L蛋白。
本發(fā)明也考慮了將所述嵌合蛋白與載體蛋白例如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)共價(jià)偶聯(lián)。本發(fā)明的組合物也可以與細(xì)胞因子例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)或趨化因子例如單核細(xì)胞趨化蛋白3(MCP3)一起給予患者。因?yàn)楹星逗系鞍椎谋景l(fā)明組合物與來自具有T細(xì)胞介導(dǎo)病理的患者T細(xì)胞的特定TCR特異性相關(guān)，所以給予這種組合物誘發(fā)針對(duì)涉及特定Vα或Vβ區(qū)段的疾病特異性獨(dú)特型的免疫應(yīng)答。同樣，針對(duì)涉及使用TCR V區(qū)區(qū)段(例如Vα或Vβ區(qū)段)有限組成部分的T細(xì)胞的自身免疫病相關(guān)T細(xì)胞的應(yīng)答。因此，給予本發(fā)明組合物改變患者的T細(xì)胞介導(dǎo)病理和/或自身免疫病。本發(fā)明組合物的給藥途徑包括但不限于口服給藥、吸入給藥、注射給藥、經(jīng)皮給藥等。
本文提及的所有美國(guó)專利和申請(qǐng)；外國(guó)專利和申請(qǐng)；科學(xué)論文；書籍；和出版物，包括任何附圖和圖表，都通過引用全部結(jié)合到本文中，如同全文敘述一樣。
附圖簡(jiǎn)述

圖1用于生產(chǎn)組合物的總流程，所述組合物包含來自具有T細(xì)胞介導(dǎo)病理的患者T細(xì)胞的特定TCR Vα或Vβ鏈的嵌合蛋白。
圖2具有多克隆位點(diǎn)的桿狀病毒表達(dá)載體p2Bac的質(zhì)粒圖譜。
圖3桿狀病毒表達(dá)載體p2Bac的DNA序列(SEQ ID NO5)。該序列從5’至3’描述。p2Bac載體含有AcNPV多角體蛋白基因啟動(dòng)子(GenBank登記號(hào)X06637的核苷酸1-120(SEQ ID NO44))和AcMNPVp10啟動(dòng)子(GenBank登記號(hào)A28889的核苷酸8-237(SEQ ID NO45))。
圖4質(zhì)粒pTRABac/9F12的DNA序列。該質(zhì)粒含有由穩(wěn)定的人細(xì)胞系9F12表達(dá)的重鏈和輕鏈(κ)的基因(SEQ ID NO41)。9F12細(xì)胞系產(chǎn)生對(duì)破傷風(fēng)類毒素特異性的人IgG1/κ抗體。下劃線區(qū)分別代表編碼成熟9F12 IgG1(TTTACCC....)和κ(ATCGACA...)鏈的序列。該序列從5’至3’描述。
圖5a使用IgGγ1和κ恒定區(qū)的重組桿狀病毒表達(dá)載體pTRABacHuLCκHCγ1的質(zhì)粒圖譜。
圖5b具有IgGγ1和λ恒定區(qū)的重組桿狀病毒表達(dá)載體pTRABacHuLCλHCγ1的質(zhì)粒圖譜。
圖6ApTRABacHuLCκHCγ1的DNA序列(SEQ ID NO6)。該序列從5’至3’描述。
圖6BpTRABacHuLCλHCγ1的DNA序列(SEQ ID NO7)。該序列從5’至3’描述。
圖6C利用κstuff引物修飾后的pTRABacHuLCκHCγ1的DNA序列(SEQ ID NO42)。該序列從5’至3’描述。
圖6D利用λstuff引物修飾后的pTRABacHuLCλHCγ1的DNA序列(SEQ ID NO43)。該序列從5’至3’描述。
圖7TCR α鏈和β鏈的代表性蛋白質(zhì)序列。兩種序列的恒定區(qū)以下劃線標(biāo)注，所述免疫球蛋白折疊的第一個(gè)半胱氨酸殘基以雙下劃線標(biāo)注(SEQ ID NO24和SEQ ID NO25)。
圖8a使用IgGγ1和κ恒定區(qū)的重組桿狀病毒表達(dá)載體pTRABacHuLCκHCγ1的質(zhì)粒圖譜，顯示了Vα和Vβ區(qū)的插入位點(diǎn)。
圖8b具有IgGγ1和λ恒定區(qū)的重組桿狀病毒表達(dá)載體pTRABacHuLCλHCγ1的質(zhì)粒圖譜，顯示了Vα和Vβ區(qū)的插入位點(diǎn)。
圖9用TCR Vβ-Ig嵌合蛋白制劑治療帶有腫瘤的小鼠。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述在本發(fā)明中，改變了免疫系統(tǒng)的獨(dú)特特異性，以治療T細(xì)胞惡性腫瘤和T細(xì)胞病理。在本發(fā)明中，用來源于每個(gè)獨(dú)特TCR V基因家族5’端的引物和一種TCR恒定區(qū)引物，克隆編碼所述T細(xì)胞受體可變區(qū)的DNA序列。通常，這種方法采用幾種合適的克隆技術(shù)之一，例如PCR。用這些TCR恒定區(qū)引物、一種α鏈引物和一種β鏈引物，來克隆所述可變區(qū)，以產(chǎn)生由Vα或Vβ加上IgG1恒定區(qū)構(gòu)成的嵌合蛋白。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇若干可以同等用于該系統(tǒng)以產(chǎn)生同等結(jié)果的不同的引物，來擴(kuò)增任何一對(duì)抗體可變區(qū)，以便于亞克隆。另一方面，可以使用例如5’RACE的技術(shù)，來克隆所述TCR鏈的可變區(qū)，作為生產(chǎn)嵌合蛋白中的一個(gè)步驟。
用桿狀病毒載體，在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)這種嵌合蛋白。所產(chǎn)生的無全部完整的Cα或Cβ區(qū)的這些嵌合蛋白可區(qū)別于存在完整α或β鏈的嵌合TCR/Ig分子。例如，這些嵌合蛋白不被針對(duì)所述TCR可變區(qū)的某些構(gòu)象特異性抗體例如抗小鼠Vβ6(克隆RR4-7)和抗小鼠Vβ12(克隆MR 11-1)(PharMingen，San Diego，Ca.)所識(shí)別。預(yù)測(cè)這些獨(dú)特的嵌合蛋白是供疫苗接種用的優(yōu)良抗原，因?yàn)榭赡苁怪委煆?fù)雜的正常決定簇不被呈遞而引發(fā)免疫反應(yīng)。另外，先前在生產(chǎn)可溶性TCR嵌合蛋白方面的嘗試針對(duì)采用所述TCR天然構(gòu)象以便允許與合適的肽/MHC復(fù)合體結(jié)合的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明滿足了對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)病理和自身免疫病的有效療法的迫切要求。本發(fā)明利用參與T細(xì)胞病理的T細(xì)胞表面存在的特有細(xì)胞表面抗原(獨(dú)特型)。為此，需要以患者特異性方式制備疫苗。這類疫苗提供根據(jù)在特定患者中發(fā)現(xiàn)的致病性T細(xì)胞所特有的標(biāo)記而定制的敏銳的選擇性。
為了使本發(fā)明適合于特定的患者，首先需要鑒定和分離所述特有抗原，然后需要生產(chǎn)那些抗原的方法。可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的多種不同方式來達(dá)到生產(chǎn)這些抗原。例如，適合于本發(fā)明需要的一種新開發(fā)的方法，利用一種新型桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，并且最近開發(fā)用于有效地生產(chǎn)供免疫治療用的功能性抗體(參見美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)順序號(hào)60/244,722，題為“Expression Vectors for Production ofRecombinant Immunoglobulin”)。設(shè)計(jì)這種桿狀病毒表達(dá)載體，使得僅需要兩種定制的基因特異性引物來擴(kuò)增任何一對(duì)抗體可變區(qū)，以便容易地亞克隆并作為具有人κ輕鏈或IgG1重鏈的嵌合蛋白表達(dá)。加入將重鏈和輕鏈引向分泌途徑的異源分泌信號(hào)序列，以便從昆蟲細(xì)胞表達(dá)大量活性免疫球蛋白。這種載體應(yīng)該可用于表達(dá)與人κ恒定區(qū)符合讀框并且通過人胎盤堿性磷酸酶分泌信號(hào)序列分泌的任何κ輕鏈可變區(qū)(VL)；和與人IgG1恒定區(qū)符合讀框、前接蜜蜂蜂毒肽分泌信號(hào)序列的任何重鏈可變區(qū)(VH)。得自單克隆細(xì)胞系、或者通過噬菌體展示克隆鑒定的任何小鼠或人單克隆抗體，在兩個(gè)簡(jiǎn)單的亞克隆步驟后，可以容易地作為完整人IgG1/κ或IgG1/λ在該載體中表達(dá)。
在本發(fā)明中，設(shè)計(jì)這種桿狀病毒表達(dá)載體，使得僅需要兩種定制的基因特異性引物來擴(kuò)增任何一對(duì)TCR可變區(qū)，以便容易地亞克隆并作為融合的Vα鏈、接頭和IgG1重鏈表達(dá)。加入將Vα和Vβ鏈引向分泌途徑的異源分泌信號(hào)序列，允許從昆蟲細(xì)胞表達(dá)大量的嵌合蛋白。這種載體應(yīng)該可用于表達(dá)與Ig κ恒定區(qū)符合讀框并且通過人胎盤堿性磷酸酶分泌信號(hào)序列分泌的任何TCR α鏈可變區(qū)(Vα)；和與IgG1恒定區(qū)符合讀框并且通過蜜蜂蜂毒肽分泌信號(hào)序列分泌的任何TCR β鏈可變區(qū)(Vβ)，或者反之亦然。
使用所述桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，允許生產(chǎn)大量的生物活性蛋白，而沒有與在細(xì)菌中制備的蛋白相關(guān)的許多缺點(diǎn)，也避免了使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)雜情況。例如，使用市售的桿狀病毒單啟動(dòng)子載體(pVL1392)或雙啟動(dòng)子載體(pAcUW51)(這兩種載體在商業(yè)上都可以得自BD-Pharmingen)，用無血清培養(yǎng)基，生產(chǎn)或者作為單體β鏈，或者作為異二聚體αβ對(duì)的大鼠分泌型TCR鏈。在ELISA中，用抗Cβ恒定區(qū)捕獲抗體(R73，Pharmingen)和抗Vβ檢測(cè)抗體(R78；抗大鼠Vβ8.2或HIS42；抗大鼠Vβ16，Pharmingen)，可以檢測(cè)這些鏈的存在。生產(chǎn)水平測(cè)定為大約300ng/ml。所述TCR鏈被制備，并以天然構(gòu)象分泌，所述α鏈和β鏈形成穩(wěn)定的二硫鍵連接的異二聚體(Gold等，1997，參見上文)。
含有特定V區(qū)段的特異性表位的可溶性人TCR片段，可以通過基因工程在昆蟲宿主細(xì)胞中生產(chǎn)。含有來源于一位患者的特定Vα和/或Vβ鏈的這些可溶性重組TCR蛋白，可以作為治療組合物使用。當(dāng)將其給予所述患者時(shí)，它在體內(nèi)將特異性地誘發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，以改變所述T細(xì)胞介導(dǎo)病理。
這種技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)用于快速鑒定和克隆由B細(xì)胞淋巴瘤表達(dá)的患者特異性VH和VL基因，然后將這些基因作為重組IgG1/κ或λ分子在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)(參見美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)順序號(hào)60/224,723，題為“Method forProducing Idiotype-Vaccine”)。可以配制并且使用以這種方法生產(chǎn)的分子來以患者特異性方式誘發(fā)針對(duì)淋巴瘤的抗獨(dú)特型細(xì)胞介導(dǎo)免疫。
術(shù)語“改變”是指本發(fā)明的化合物調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)病理的能力。改變T細(xì)胞病理的化合物可以通過多種可能的機(jī)制做到這一點(diǎn)，包括產(chǎn)生針對(duì)所述化合物的抗體應(yīng)答，所述抗體應(yīng)答進(jìn)而破壞所述T細(xì)胞病理的細(xì)胞、誘導(dǎo)所述T細(xì)胞病理的細(xì)胞凋亡、抑制所述T細(xì)胞病理的細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)和分裂、誘發(fā)針對(duì)所述T細(xì)胞病理的細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)免疫或者抑制病理性T細(xì)胞的活性。引起所述改變的實(shí)際機(jī)制尚有待確定，但是在給予本發(fā)明的分子或組合物后，通過某種機(jī)制發(fā)生所述T細(xì)胞介導(dǎo)病理的改變。
術(shù)語“T細(xì)胞介導(dǎo)病理”或“T細(xì)胞病理”是指由于T細(xì)胞的不當(dāng)復(fù)制或活性而引起的那些疾病和病癥。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用本發(fā)明來治療作為由于T細(xì)胞不當(dāng)復(fù)制引起的T細(xì)胞淋巴瘤的T細(xì)胞介導(dǎo)病理。T細(xì)胞淋巴瘤用目前可利用的醫(yī)學(xué)方法難以有效地治療。涉及T細(xì)胞不當(dāng)復(fù)制的其它類型的T細(xì)胞病理包括慢性和急性T細(xì)胞白血病以及蕈樣真菌病。其它優(yōu)選實(shí)施方案包括越來越多的被分類為自身免疫病的人類疾病，在自身免疫病中宿主自身的免疫系統(tǒng)攻擊宿主自身組織，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、重癥肌無力(MG)、多發(fā)性硬化(MS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)、Graves病、炎性腸病、自身免疫性眼色素層視網(wǎng)膜炎、多肌炎和某些類型的糖尿病。本發(fā)明對(duì)于這些自身免疫病的治療并不治愈所述疾病，而是僅治療癥狀。
術(shù)語“T細(xì)胞”是指生物體免疫系統(tǒng)中參與生物體正常功能中的細(xì)胞介導(dǎo)免疫的細(xì)胞(即沒有經(jīng)歷T細(xì)胞介導(dǎo)病理的T細(xì)胞)。
術(shù)語“病理”是指被醫(yī)學(xué)會(huì)會(huì)員認(rèn)為異常的生物體(例如人類)的一種狀態(tài)。待用本發(fā)明治療的病理的特征為T細(xì)胞功能或復(fù)制異常。
術(shù)語“患者”是指需要治療病理、或更具體地講治療T細(xì)胞病理的生物體。該術(shù)語是指在臨床水平上表現(xiàn)出一種或多種特定癥狀、表明需要用治療藥治療的活的受治療者。所述治療可以或者被醫(yī)學(xué)會(huì)普遍接受，或者可能是實(shí)驗(yàn)性的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述患者是一種哺乳動(dòng)物，包括諸如狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠和小鼠的動(dòng)物。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述患者是人類?；颊叩脑\斷可能在疾病發(fā)展過程中自發(fā)改變，或者在治療方案或治療過程中改變。
“生物體”可以是單細(xì)胞生物體或者是多細(xì)胞生物體。該術(shù)語包括哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人類。優(yōu)選的生物體包括小鼠，因?yàn)橹委熁蛟\斷小鼠的能力通常預(yù)示著在其它生物體例如人類中發(fā)揮作用的能力。其它優(yōu)選生物體包括靈長(zhǎng)類，因?yàn)橹委熁蛟\斷靈長(zhǎng)類的能力通常預(yù)示著在其它生物體例如人類中發(fā)揮作用的能力。
術(shù)語“嵌合蛋白”是指包含含有來源于至少兩種不同蛋白的區(qū)段的單一多肽鏈的蛋白。嵌合蛋白的區(qū)段一定來源于異種蛋白，亦即嵌合多肽的所有區(qū)段不是來自同一種蛋白。本發(fā)明的嵌合蛋白包括包含TCRα或β鏈的部分、但不包括所述α或β鏈的完整恒定區(qū)的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互換使用。
術(shù)語“區(qū)段”或“部分”用來指來源于用作所述嵌合蛋白來源的蛋白的氨基酸序列、其長(zhǎng)度小于所來源的全長(zhǎng)多肽的一種多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述區(qū)段至少長(zhǎng)約10、15、20、21、22、30、40、70、100、150、300或450個(gè)氨基酸。人們會(huì)理解，這類區(qū)段可能保留天然多肽的一種或多種特征。這類保留的特征的實(shí)例包括與對(duì)天然多肽或其表位特異性的抗體結(jié)合。
術(shù)語“天然的”是指從自然界分離出的蛋白。因此，天然存在的蛋白可以指在自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白。天然蛋白可以指可能在自然界中存在或合成的蛋白。這些術(shù)語也適用于由生物系統(tǒng)(例如本發(fā)明的桿狀病毒系統(tǒng))或者由患者樣品的細(xì)胞培養(yǎng)物所生產(chǎn)的蛋白。天然蛋白也可以指未經(jīng)變性的分離的蛋白。術(shù)語“天然”也可以指單獨(dú)的或者與其它多肽結(jié)合的多肽或蛋白折疊、使得它類似自然界中存在的相似蛋白的方式，或者它在翻譯后經(jīng)修飾(“翻譯后修飾”)而使得它類似自然界中存在的相似蛋白的方式。存在的唯一天然存在的蛋白可能僅見于得自一位患者的病理T細(xì)胞，然而，這被認(rèn)為是天然存在的蛋白。
術(shù)語“Vα”和“Vβ”是指所述TCR多肽鏈的可變區(qū)或者編碼這類多肽鏈的核酸的可變區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這些術(shù)語的含義?？勺儏^(qū)的實(shí)際序列不可預(yù)測(cè)，必須通過分離出所述序列來測(cè)定。然而，已經(jīng)鑒定并表征了來自TCR基因可變區(qū)的多個(gè)亞家族(參見以下綜述Arden等，Immunogenetics，1995，42455-500，Arden等，Immunogenetics，1995，42501-530，和Clark等，Immunogenetics，1995，42531-540)。這些Vα和Vβ區(qū)中的任何區(qū)都可以用于本發(fā)明。α鏈的實(shí)際序列通過TCRα鏈基因座的V區(qū)、J區(qū)和恒定區(qū)的克隆重排來測(cè)定。β鏈的實(shí)際序列通過TCR β鏈基因座的V區(qū)、D區(qū)、J區(qū)和恒定區(qū)的克隆重排來測(cè)定。術(shù)語“Vα”和“Vβ”也指Vα或Vβ鏈的部分或區(qū)段。Vα或Vβ鏈的區(qū)段可以包括所述V區(qū)的至少約30個(gè)氨基酸。Vα或Vβ鏈的區(qū)段也可以包括全部或基本上全部的所述V區(qū)。術(shù)語“基本上全部”可以指完整可變區(qū)的大約90％或者完整可變區(qū)的大約80％。術(shù)語Vα”和“Vβ”也指如下所述的這類多肽鏈的功能衍生物。術(shù)語“完整的Vα鏈”是指α鏈的所有可變區(qū)。術(shù)語“完整的Vβ鏈”是指β鏈的所有可變區(qū)。
術(shù)語“接頭區(qū)”或“接頭”是指連接編碼可變區(qū)的序列和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)分子所述部分的序列的DNA區(qū)段。接頭序列可以是合成序列，以便于方便地克隆，或者它可以是TCR Cα或Cβ的一部分。在這兩種情況下，接頭區(qū)都不破壞本發(fā)明嵌合蛋白中所述可變區(qū)的部分和所述免疫球蛋白恒定區(qū)的部分之間的讀框。術(shù)語“接頭區(qū)”也包括由接頭區(qū)DNA序列編碼的氨基酸序列。術(shù)語“合成的接頭區(qū)”或“合成接頭”是指得自非T細(xì)胞受體基因或免疫球蛋白基因來源的接頭區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述合成接頭由研究人員設(shè)計(jì)并且在體外合成。合成接頭將包含不破壞嵌合蛋白中所述T細(xì)胞受體和免疫球蛋白基因部分的可讀框的序列。如果接頭區(qū)包含TCR Cα或Cβ的一部分，則它可以包含所恒定區(qū)起點(diǎn)和所述免疫球蛋白折疊的第一個(gè)半胱氨酸殘基之間的某些或全部的氨基酸。
術(shù)語“Cα”和“Cβ”是指所述TCR多肽鏈的恒定區(qū)或者編碼這類多肽鏈的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這些術(shù)語的含義。當(dāng)在本發(fā)明中涉及恒定區(qū)時(shí)，術(shù)語“區(qū)段”或“部分”不包括所述TCR的全部恒定區(qū)，而是可以包括大約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30個(gè)相連氨基酸殘基。在接頭區(qū)中可以存在任何整數(shù)的密碼子，包括1至約30之間且包括1和30的任何整數(shù)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，可以存在所述TCR恒定區(qū)的至多約80％的氨基酸。所述區(qū)段可以包括直到免疫球蛋白折疊的第一個(gè)半胱氨酸的Cα鏈的前22個(gè)氨基酸中的全部或部分氨基酸。在圖8中顯示了具有所標(biāo)注的免疫球蛋白折疊的第一個(gè)半胱氨酸的人TCR α鏈的一種代表性序列。所述區(qū)段可以包括直到免疫球蛋白折疊的第一個(gè)半胱氨酸的Cβ鏈的前30個(gè)氨基酸中的全部或部分氨基酸。在圖8中顯示了具有所標(biāo)注的免疫球蛋白折疊的第一個(gè)半胱氨酸的人TCR β鏈的一種代表性序列。術(shù)語“Cα”和“Cβ”也指如下所述的這類多肽鏈的功能衍生物。
術(shù)語“TCR”或“T細(xì)胞受體”是指一種在T細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的、包含兩個(gè)多肽鏈-α鏈和β鏈的多肽。術(shù)語“TCR”或“T細(xì)胞受體”也可以指編碼這類多肽鏈的核酸。由于免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育，由于DNA重排操作，TCR顯示出相當(dāng)大的序列多樣性，例如Bell等所述(Bell等，1995，T Cell Receptors，Oxford University Press，Oxford)。特定TCR的實(shí)際序列不可預(yù)測(cè)，必須通過對(duì)所述TCR的編碼核酸或蛋白質(zhì)測(cè)序來測(cè)定。TCR的任何可能序列都可以用于本發(fā)明中。
術(shù)語“免疫球蛋白恒定區(qū)”是指免疫球蛋白分子中不由免疫球蛋白可變區(qū)編碼的所有部分或其一部分。術(shù)語“免疫球蛋白恒定區(qū)”也可以指編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA序列。免疫球蛋白恒定區(qū)包括區(qū)段CL、CH1、CH2、CH3和鉸鏈區(qū)。免疫球蛋白的類型包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鏈以及κ或λ輕鏈或者它們的區(qū)段。在優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈和輕鏈恒定區(qū)來源于9F12細(xì)胞。任何來源的任何免疫球蛋白恒定區(qū)的區(qū)段都可以用于本發(fā)明中，條件是所述區(qū)段允許例如通過與G蛋白、A蛋白、L蛋白或合適的抗體結(jié)合，來親和純化所述嵌合分子。也可以使用如下所述的免疫球蛋白恒定區(qū)區(qū)段的功能衍生物。
術(shù)語“免疫球蛋白折疊”或“免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域”是指免疫球蛋白超家族的一種結(jié)構(gòu)元件。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是大約110個(gè)氨基酸的保守的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。對(duì)于每種結(jié)構(gòu)域，一般而言，有7個(gè)反平行β鏈，分別以4條鏈和3條鏈的兩個(gè)片層排列，并且有一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，形成一個(gè)大約60個(gè)氨基酸的環(huán)。兩個(gè)片層一般面對(duì)面，使得疏水性氨基酸面向內(nèi)，而親水性氨基酸面向外。
免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域存在于許多蛋白分子中，包括抗體、T細(xì)胞抗原受體、細(xì)胞因子受體(例如具有5個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的血小板衍生生長(zhǎng)因子受體)、細(xì)胞粘著分子(例如ICAM-1/CD54)和許多其它蛋白分子。在TCR的每條鏈中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域；一個(gè)在可變區(qū)中，一個(gè)在恒定區(qū)中。在抗體輕鏈中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，而在IgG重鏈中發(fā)現(xiàn)4個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
術(shù)語“kappa恒定區(qū)”、“l(fā)amda恒定區(qū)”、“κ恒定區(qū)”和“λ恒定區(qū)”是指在免疫系統(tǒng)發(fā)育期間保持恒定的kappa(κ)和lambda(λ)輕鏈的恒定區(qū)。所述術(shù)語可以指所述蛋白的DNA序列或氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，免疫球蛋白輕鏈可以包含在含有來自一種或多種其它蛋白的氨基酸的嵌合蛋白中。
術(shù)語“IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE”是指人免疫球蛋白的類別和亞類。所述術(shù)語可以指所述蛋白的DNA序列或者氨基酸序列。免疫球蛋白分子的類別和亞類由其重鏈決定。例如，IgG和IgD是不同類別的免疫球蛋白；IgG1和IgG2是不同亞類的免疫球蛋白分子。術(shù)語“IgA”可以指任何亞類的IgA分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，它是指IgA1分子。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，它是指IgA2分子。在某些實(shí)施方案中，所用的免疫球蛋白重鏈可以是含有來自第二種蛋白的氨基酸的嵌合蛋白。
術(shù)語“IgGγ1”是指與IgG1類免疫球蛋白相關(guān)的重鏈。IgG1代表大約66％的人IgG免疫球蛋白(Roitt等，Immunology，Mosby，St.Louis，1993，第4.2頁)。
術(shù)語“給予”涉及使化合物與生物體的細(xì)胞或組織接觸的方法。所述T細(xì)胞介導(dǎo)病理可以在所述生物體的細(xì)胞或組織存在于所述生物體內(nèi)或生物體外時(shí)得到預(yù)防或治療。存在于生物體之外的細(xì)胞可以在細(xì)胞培養(yǎng)皿中保持或生長(zhǎng)。對(duì)于在生物體體內(nèi)含有的細(xì)胞，本領(lǐng)域中有許多技術(shù)可給予化合物，包括(但不限于)口服、胃腸外給藥、皮膚應(yīng)用、注射和氣霧劑應(yīng)用。然后可以監(jiān)測(cè)給予化合物對(duì)生物體功能的效應(yīng)。所述生物體最好是小鼠、大鼠、兔、豚鼠或山羊，更優(yōu)選是猴或猿猴，最優(yōu)選是人類。
術(shù)語“組合物”是指含有感興趣蛋白的混合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物可以含有額外的組分，例如佐劑、穩(wěn)定劑、賦形劑等。
涉及可變區(qū)與T細(xì)胞克隆相關(guān)時(shí)的術(shù)語“與…相關(guān)”，是指在由特定T細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的免疫球蛋白上發(fā)現(xiàn)的可變區(qū)。
術(shù)語“T細(xì)胞克隆”是指單個(gè)T細(xì)胞的克隆后代。T細(xì)胞的克隆后代在所產(chǎn)生的TCR中表達(dá)與親代細(xì)胞相同的獨(dú)特型。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，一個(gè)T細(xì)胞的克隆后代可能經(jīng)歷了TCR基因內(nèi)的體細(xì)胞突變，但仍保留所述T細(xì)胞克隆的部分。
術(shù)語“分離”是指將天然存在的核酸序列從其正常細(xì)胞環(huán)境中取出。因此，所述序列可以在無細(xì)胞溶液中，或者被置于不同的細(xì)胞環(huán)境中。該術(shù)語不是暗示所述序列是存在的唯一核苷酸鏈，而是它基本上無(純度至少為大約90-95％)與其天然相連的非核苷酸物質(zhì)，因此不同于分離的染色體。此外，在提及核酸時(shí)利用術(shù)語“分離”是指特定的DNA或RNA序列在感興趣的溶液中存在的總DNA或RNA中所占的比率被增加至顯著高于(2-5倍)在從中取出所述序列的細(xì)胞中所占的比率。人們可以通過優(yōu)先降低所存在的其它DNA或RNA的量，或者通過優(yōu)先增加所述特定DNA或RNA序列的量，或者通過這兩種方法的組合，做到這一點(diǎn)。然而，應(yīng)該注意到，富集的不是暗示不存在其它DNA或RNA序列，而僅僅是感興趣序列的相對(duì)量被顯著增加了。術(shù)語“顯著的”用來指對(duì)于制造這種增加的人而言，增加的水平是有效的，一般是指相對(duì)于其它核酸而言增加至大約至少2倍，更優(yōu)選至少5-10倍或甚至更高。該術(shù)語也不是暗示沒有來自其它來源的DNA或RNA。來自其它來源的DNA可能例如包含來自酵母或細(xì)菌基因組的DNA，或者克隆載體例如pUC19。該術(shù)語不同于天然發(fā)生的事件，例如病毒感染或腫瘤型生長(zhǎng)，在后兩者中，一種mRNA的水平可能相對(duì)于其它種類的mRNA被自然地增加。也就是說，該術(shù)語是指僅包括人類干涉從而提高所需核酸比例的那些情況。
分離的DNA序列比自然環(huán)境中相對(duì)更純(該水平應(yīng)該至少2-5倍于天然水平，例如以mg/ml計(jì))。通過PCR獲得的各種序列可以被純化至電泳均一性。通過這種PCR反應(yīng)獲得的DNA分子可以得自總DNA或者得自總RNA。這些DNA序列不是天然存在的，而是優(yōu)選通過對(duì)部分純化的天然存在的物質(zhì)(例如信使RNA(mRNA))的操作而獲得的。例如，從mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)涉及構(gòu)建合成物質(zhì)(cDNA)，可以通過從攜帶所述cDNA文庫(kù)的細(xì)胞中克隆選擇，可以從所述合成文庫(kù)中分離出單個(gè)純cDNA克隆。包括從mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)和分離不同的cDNA克隆的該方法，導(dǎo)致天然信息的大約106倍純化。因而，特別考慮了至少一個(gè)數(shù)量級(jí)、優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)數(shù)量級(jí)、更優(yōu)選四個(gè)或五個(gè)數(shù)量級(jí)的純化。
術(shù)語“編碼…的基因”是指編碼感興趣蛋白或多肽的核酸序列。所述核酸序列可以或者是DNA分子或者是RNA分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述分子是一種DNA分子。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述分子是一種RNA分子。當(dāng)作為RNA分子存在時(shí)，它將包括指導(dǎo)宿主細(xì)胞的核糖體開始翻譯(例如起始密碼子ATG)和指導(dǎo)核糖體結(jié)束翻譯(例如終止密碼子)的序列。在起始密碼子和終止密碼子之間是一個(gè)可讀框(ORF)。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉這些術(shù)語的含義。
術(shù)語“昆蟲細(xì)胞系”是指來源于昆蟲并且對(duì)桿狀病毒感染敏感的細(xì)胞系。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這類細(xì)胞系和利用所述細(xì)胞系所需的技術(shù)。昆蟲細(xì)胞系的代表性實(shí)例包括草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(sf9)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)(Hi-5)細(xì)胞系。
術(shù)語“粉紋夜蛾(High-5)細(xì)胞”和“草地貪夜蛾(sf9)細(xì)胞”是指與桿狀病毒表達(dá)載體結(jié)合使用的昆蟲細(xì)胞系。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些細(xì)胞系和獲得它們的方法。
術(shù)語“佐劑”是指當(dāng)人們?cè)噲D在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)所選抗原或免疫原(例如需要免疫應(yīng)答針對(duì)的蛋白或多肽)的免疫應(yīng)答時(shí)，與所選抗原或免疫原一起提供、以增強(qiáng)所述免疫應(yīng)答的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉合適佐劑的選擇和使用。批準(zhǔn)用于人類的佐劑包括鋁鹽和MF59(Singh和O’Hagan，Nature Biotech 171075-81，1999)。其它佐劑正在開發(fā)之中(出處同上)，可以結(jié)合本發(fā)明使用。
術(shù)語“匙孔血藍(lán)蛋白”是指從匙孔(keyhole limpet)分離的、在免疫方法中通常用作載體蛋白的一種蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉術(shù)語匙孔血藍(lán)蛋白的含義。
術(shù)語“細(xì)胞因子”是指主要從白細(xì)胞中分泌的生長(zhǎng)因子家族，通常是可溶性(糖)蛋白。細(xì)胞因子刺激體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答以及激活吞噬細(xì)胞。細(xì)胞因子不僅由免疫系統(tǒng)內(nèi)的各種細(xì)胞類型合成、貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)(淋巴因子、白介素、單核因子、腫瘤壞死因子、干擾素)，而且也由與血液學(xué)(產(chǎn)生集落刺激因子)、腫瘤學(xué)(產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子)和細(xì)胞生物學(xué)(產(chǎn)生肽類生長(zhǎng)因子、熱激蛋白和其它應(yīng)激蛋白)研究相關(guān)的其它細(xì)胞合成、貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)。
從淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子被稱為淋巴因子，而由單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子被稱為單核因子。許多淋巴因子也被稱為白介素(IL)，因?yàn)樗鼈儾粌H由白細(xì)胞分泌，而且它們也能夠影響白細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答。具體地說，白介素作為靶向造血來源細(xì)胞的生長(zhǎng)因子起作用。
術(shù)語“生長(zhǎng)因子”是指結(jié)合細(xì)胞表面上的受體并且隨后激活細(xì)胞增殖和/或分化的蛋白質(zhì)。許多生長(zhǎng)因子是相當(dāng)通用的，可以用來刺激各種各樣細(xì)胞類型進(jìn)行細(xì)胞分裂，而其它生長(zhǎng)因子對(duì)特定的細(xì)胞類型是特異性的。
術(shù)語“趨化因子”是指一類小的促炎細(xì)胞因子，它們作為白細(xì)胞的化學(xué)引誘劑和激活物起作用，代表一個(gè)超過30種趨化細(xì)胞因子的超家族。它們使來自血液或骨髓的免疫系統(tǒng)細(xì)胞活化和遷移至感染部分和受傷組織協(xié)調(diào)進(jìn)行(orchestrate)。趨化因子在骨髓中存在并且進(jìn)而發(fā)育為成熟免疫細(xì)胞的原始干細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖中也起重要作用。它們參與各種各樣的急性和炎性疾病，并且主要通過與七跨膜螺旋類受體結(jié)合而發(fā)揮其作用。
趨化因子的分子量通常在8-11kDa之間變動(dòng)，在1-100ng/ml的濃度范圍內(nèi)有活性，由各種各樣的細(xì)胞類型產(chǎn)生。趨化因子的產(chǎn)生通常由外源性刺激物和內(nèi)源性介質(zhì)例如IL-1、TNF-α和PDGF誘導(dǎo)。趨化因子與特定的細(xì)胞表面受體結(jié)合，可以被認(rèn)為是看來不如一級(jí)促炎細(xì)胞因子多效的二級(jí)細(xì)胞因子，因?yàn)樗鼈儾皇瞧渌?xì)胞因子的有效誘導(dǎo)物，并且在炎癥和修復(fù)方面表現(xiàn)出更加專化的功能。
術(shù)語“粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子”或“GM-CSF”是指小的(小于20 kDa)的分泌型蛋白。它與特定的細(xì)胞表面受體結(jié)合，起骨髓細(xì)胞的種特異性刺激物的作用。它刺激若干造血細(xì)胞譜系(包括樹突細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞)的生長(zhǎng)和分化。特別是，這種細(xì)胞因子也通過增加T細(xì)胞增殖(Santoli等，J.Immunol.1988，141(2)519-26)、增加粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上粘著分子的表達(dá)(Young等，J.Immunol.1990，145(2)607-15；Grabstein等，Science 1986，232(4749)506-08)和增強(qiáng)抗原呈遞(Morrissey等，J.Immunol，1987，139(4)1113-9；Heufler等，J.Exp.Med.1988，167(2)700-05；Smith等，J.Immunol.1990，144(5)1777-82)，在使細(xì)胞免疫定型方面起作用。
術(shù)語“單核細(xì)胞趨化蛋白-3”或“MCP-3”是指一種主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子。MCP-3具有廣譜的趨化活性，吸引單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。Minty等，Eur Cytokine Netw 4(2)99-110，1993以及Opdenakker等，Biochem Biophys Res Commun.，191(2)535-42，1993于1993年克隆了所述cDNA。最近Proost等，J.Leukoc Biol.59(1)67-74，1996綜述了其特性。
術(shù)語“表達(dá)載體”是指一種設(shè)計(jì)用來在表達(dá)載體中正確插入所選感興趣基因時(shí)表達(dá)所述基因(通常為一種蛋白質(zhì))的重組DNA構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解該術(shù)語。表達(dá)載體通常在插入感興趣基因的位點(diǎn)的5’端包括一個(gè)啟動(dòng)子，而在所述位點(diǎn)的3’端包括一個(gè)終止子區(qū)。通常，利用所選的限制性酶切位點(diǎn)將感興趣的基因插入適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)。術(shù)語“表達(dá)載體”也指已經(jīng)插入了編碼感興趣產(chǎn)物的感興趣基因的諸如上述的DNA構(gòu)建體。
術(shù)語“桿狀病毒表達(dá)載體”是指在用于所述桿狀病毒系統(tǒng)時(shí)設(shè)計(jì)用來表達(dá)所選基因的DNA構(gòu)建體。設(shè)計(jì)在所述桿狀病毒系統(tǒng)中發(fā)揮作用的任何潛在的桿狀病毒或表達(dá)載體都可以用于本發(fā)明。同樣，術(shù)語“表達(dá)載體”是一類包括桿狀病毒表達(dá)載體具體實(shí)施方案的表達(dá)載體，但“表達(dá)載體”可以除了可以在昆蟲細(xì)胞系中起作用外，還可以在昆蟲細(xì)胞系之外的細(xì)胞和細(xì)胞系中起作用。
術(shù)語“允許…表達(dá)”是指將表達(dá)載體置于所述感興趣基因?qū)⒃谄渲斜磉_(dá)的環(huán)境中。這通常是指將所述表達(dá)載體插入到合適的細(xì)胞類型中，其中宿主細(xì)胞組分將識(shí)別所述啟動(dòng)子和基因表達(dá)所必需的其它區(qū)，并且將引起感興趣基因的表達(dá)。所述表達(dá)通常包括兩個(gè)步驟轉(zhuǎn)錄和翻譯。表達(dá)也可以用得自細(xì)胞的組分而在體外進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些技術(shù)，這些技術(shù)在Sambrook等(Sambrook，F(xiàn)ritsch，和Maniatis，″Molecular CloningA Laboratory Manual″，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，1989)中有敘述。在優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)或多肽。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)產(chǎn)物是Vβ/IgGγ1、Vβ/Cκ、Vβ/Cλ、Vα/Cκ、Vα/Cλ或Vα/IgGγ1。
術(shù)語“分泌信號(hào)序列”是指一種肽序列。當(dāng)該序列被符合讀框地翻譯為與所選多肽的氨基末端連接的肽時(shí)，所述分泌信號(hào)序列將通過與宿主細(xì)胞的機(jī)器相互作用，而引起所選多肽被分泌。作為分泌過程的一部分，這種分泌信號(hào)序列將被切除，在被輸出后僅留下感興趣的多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用蜜蜂蜂毒肽分泌信號(hào)序列。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，使用人胎盤堿性磷酸酶分泌信號(hào)序列。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用與來源于特定患者的免疫球蛋白基因相關(guān)的內(nèi)源性分泌序列。然而，本發(fā)明不受這些分泌信號(hào)序列的限制，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它分泌信號(hào)序列取代這些分泌信號(hào)序列，或除此之外可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它分泌信號(hào)序列。術(shù)語“分泌信號(hào)序列”也指編碼所述分泌肽的核酸序列。
術(shù)語“ELISA”是指“酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定”，其中通過使蛋白與ELISA板的塑料孔結(jié)合、然后用該蛋白特異性的抗體檢測(cè)進(jìn)行蛋白定量或鑒定，來確定蛋白的存在或濃度。
術(shù)語“啟動(dòng)子控制”是指表達(dá)載體中DNA的布置，其中啟動(dòng)子被置于感興趣基因的5’，使得從所述DNA序列轉(zhuǎn)錄出mRNA分子。這種mRNA分子然后由宿主細(xì)胞機(jī)器進(jìn)行翻譯。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉這一術(shù)語的含義。
術(shù)語“A蛋白”、“G蛋白”和“L蛋白”是指能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白分子而不與抗原結(jié)合位點(diǎn)相互作用的特定細(xì)菌蛋白。A蛋白是一種從金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中分離的、結(jié)合免疫球蛋白分子Fc區(qū)的多肽。G蛋白是一種從人G組鏈球菌菌株(G148)中分離的對(duì)免疫球蛋白G(IgG)具有親和性的細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白。L蛋白是一種由厭氧細(xì)菌種大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus)的某些菌株表達(dá)的免疫球蛋白輕鏈結(jié)合蛋白。
術(shù)語“分離”當(dāng)指蛋白或多肽時(shí)，是指將天然存在的多肽或蛋白質(zhì)從其正常細(xì)胞環(huán)境中取出，或者是指將在表達(dá)系統(tǒng)(例如本文所述的桿狀病毒系統(tǒng))中合成的多肽或蛋白質(zhì)從所述表達(dá)系統(tǒng)的其它組分中取出。因此，所述序列可以在無細(xì)胞溶液中，或者被置于不同的細(xì)胞環(huán)境中。該術(shù)語不是暗示所述序列是存在的唯一氨基酸鏈，而是它基本上無(純度至少大約90-95％)與其天然相連的基于非氨基酸的物質(zhì)。
當(dāng)提及多肽時(shí)，利用術(shù)語“富集的”意指所述特定的氨基酸序列在感興趣的細(xì)胞或溶液中，在所存在的總氨基酸序列中所占的比率比在正常細(xì)胞或患病細(xì)胞或者在所述序列從中取出的細(xì)胞中所占的比率大得多(2-5倍)。人們可以通過優(yōu)先降低所存在的其它氨基酸序列的量，或者通過優(yōu)先增加所述特定感興趣氨基酸序列的量，或者通過這兩種方法的組合，做到這一點(diǎn)。然而，應(yīng)該注意到，富集的不是暗示不存在其它氨基酸序列，而僅僅是感興趣序列的相對(duì)量被顯著增加了。術(shù)語顯著的在此用來指對(duì)于制造這種增加的人而言，增加的水平是有效的，一般是指相對(duì)于其它氨基酸序列而言增加至大約至少2倍，更優(yōu)選至少5-10倍或甚至更高。該術(shù)語也不是暗示沒有來自其它來源的氨基酸序列。其它來源的氨基酸序列可能例如包含由酵母或細(xì)菌基因組、或者克隆載體例如pUC19編碼的氨基酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述氨基酸序列是一種上述嵌合蛋白。該術(shù)語意指僅包括人類干涉以增加所需氨基酸序列比例的那些情況。
對(duì)于某些目的而言，氨基酸序列為純化形式也是有利的。術(shù)語“純化的”當(dāng)涉及多肽時(shí)，并不需要絕對(duì)純(例如均一的制劑)；而是表明所述序列與在天然環(huán)境中相比相對(duì)的純。與天然水平相比，這一水平應(yīng)該至少為2-5倍(例如以mg/ml計(jì))。特別考慮了至少一個(gè)數(shù)量級(jí)、優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)數(shù)量級(jí)、更優(yōu)選四個(gè)或五個(gè)數(shù)量級(jí)的純化。所述物質(zhì)最好無功能上顯著水平的污染，例如純度為90％、95％或99％。
術(shù)語“在操作上連接的”是指這樣的DNA布置，其中控制區(qū)(例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)與相連的感興趣DNA基因連接，以便引起所述基因轉(zhuǎn)錄，并因此允許其翻譯。術(shù)語“在操作上連接的”也可以指編碼加工信號(hào)的DNA序列(例如分泌信號(hào)序列)與編碼多肽的基因相連，形成一個(gè)可讀框。在轉(zhuǎn)錄和翻譯后，分泌信號(hào)序列具有使已翻譯的多肽輸出的潛力。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉該術(shù)語的含義。有用嵌合蛋白的功能衍生物本文也提供本發(fā)明多肽或核酸的功能衍生物。所謂“功能衍生物”是指本發(fā)明多肽或核酸的“化學(xué)衍生物”、“片段”或“變異體”，下面有這些術(shù)語的定義。功能衍生物保留了所述蛋白的至少一部分功能，例如與所述蛋白特異性的抗體的反應(yīng)性、酶活性、或者通過非催化結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的結(jié)合活性，這使得可以按照本發(fā)明應(yīng)用所述功能衍生物。在本領(lǐng)域中眾所周知，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，許多不同的核酸序列可以編碼同一種氨基酸序列。同樣，在本領(lǐng)域中也眾所周知，可以進(jìn)行氨基酸的保守改變，以得到保留原始功能性的蛋白或多肽。在這兩種情況下，所有的變換都計(jì)劃包括在本說明書中。
本發(fā)明范圍內(nèi)包括本文所述分離的核酸分子的功能等同物。遺傳密碼的簡(jiǎn)并性允許某些密碼子被決定同一氨基酸的其它密碼子所取代，并且因此可以得到同一種蛋白質(zhì)。所述核酸序列可以有相當(dāng)大的改變，因?yàn)槌琢虬彼岷蜕彼嶂猓阎陌被岫伎梢杂刹恢挂环N密碼子編碼。因此，可以合成本發(fā)明基因的部分或全部，得到與自然界中發(fā)現(xiàn)的序列顯著不同的核酸序列。然而，其所編碼的氨基酸序列卻將得以保存。
所述復(fù)合體的“化學(xué)衍生物”含有不是所述蛋白正常部分的額外的化學(xué)部分。所述蛋白或肽的共價(jià)修飾包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。如下所述，這類修飾可以通過使所述肽的靶氨基酸殘基與能夠與所選側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生化劑反應(yīng)，而被引入到所述分子中。最常使半胱氨酰殘基與α-鹵代乙酸(和相應(yīng)的胺)例如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)，得到羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。也通過與溴代三氟丙酮、氯乙酰磷酸(chloroacetyl phosphate)、N-烷基馬來酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫、甲基·2-吡啶基二硫、對(duì)氯汞苯甲酸、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯代-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑反應(yīng)，使半胱氨酰殘基衍生化。
組氨酰殘基通過與焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反應(yīng)而衍生化，因?yàn)檫@種試劑對(duì)組氨酰側(cè)鏈具有相對(duì)特異性。對(duì)溴苯甲酰甲基溴也是有用的；該反應(yīng)最好在0.1M二甲基胂酸鈉中于pH6.0下進(jìn)行。
使賴氨酰殘基和氨基末端殘基與琥珀酸酐或其它羧酸酐反應(yīng)。用這些試劑衍生化有逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基電荷的作用。用于使含伯胺殘基衍生化的其它合適試劑包括亞氨酸酯，例如吡啶甲亞氨酸甲酯(methylpicolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氫化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2，4-戊二酮；和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。
精氨酰殘基通過與一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)而加以修飾，所述常規(guī)試劑中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生化要求反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行，因?yàn)殡夜倌軋F(tuán)的pKa值高。此外，這些試劑可以與賴氨酸的基團(tuán)以及與精氨酸的α-氨基反應(yīng)。
酪氨酰殘基是用于通過與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)而引入波譜標(biāo)記的眾所周知的修飾的靶。最常見的是，用N-乙酰咪唑和四硝基甲烷來分別生成O-乙酰酪氨酰種類和3-硝基衍生物。
羧基側(cè)鏈(天冬氨?；蚬劝滨?通過與碳二亞胺(R’-N-C-N-R’)例如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基(4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺反應(yīng)而被選擇性修飾。此外，通過與銨離子反應(yīng)，使天冬氨酰殘基和谷氨酰殘基轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０孵埢凸劝滨０孵埢?br> 通常將谷氨酰胺酰殘基和天冬酰胺酰殘基分別脫酰胺為相應(yīng)的谷氨酰殘基和天冬氨酰殘基?；蛘?，在溫和的酸性條件下將這些殘基脫酰胺。任一種形式的這些殘基都落入本發(fā)明范圍內(nèi)。
用雙官能試劑衍生化是有用的，例如可用于使所述蛋白的組分肽相互交聯(lián)，或者與復(fù)合體中的其它蛋白交聯(lián)、與水不溶性支持基質(zhì)或者與其它大分子載體交聯(lián)。常用的交聯(lián)劑包括例如1，1-雙(重氮乙酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯(N-hydroxysuccinimide esters)例如與4-疊氮水楊酸形成的酯、同雙官能亞氨酸酯包括二琥珀酰亞胺基酯例如3，3’-二硫代雙(丙酸琥珀酰亞胺基酯)和雙官能馬來酰亞胺例如雙-N-馬來酰亞氨基-1，8-辛烷。衍生化試劑例如甲基-3-[對(duì)疊氮苯基]二硫醇丙亞氨酸酯產(chǎn)生能夠在光存在時(shí)形成交聯(lián)的光敏中間體?；蛘?，用美國(guó)專利第3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440號(hào)中所述的反應(yīng)性水不溶性基質(zhì)例如溴化氰活化的糖類和反應(yīng)性基質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的固定化。
其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化；絲氨酰殘基或蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化；賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈α-氨基的甲基化(Creighton，T.E.，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，第79-86頁，(1983))；N末端胺的乙?；约霸谀承┣闆r下C末端羧基的酰胺化。
這類衍生化部分可以改進(jìn)穩(wěn)定性、溶解性、吸收、生物半壽期等。另一方面，所述部分可以消除或減弱所述蛋白復(fù)合體的任何不想要的副作用等。能夠介導(dǎo)這類效應(yīng)的部分公開于例如Remington’sPharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)。
氨基酸殘基有缺失、插入和/或取代的蛋白質(zhì)的功能衍生物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備。例如，所述功能衍生物的經(jīng)修飾組分可以用定點(diǎn)誘變技術(shù)(如Adelman等，1983，DNA 2183所例舉的)來產(chǎn)生，其中采用例如如上所述的技術(shù)，對(duì)所述DNA編碼序列中的核苷酸進(jìn)行修飾，使得經(jīng)修飾的編碼序列被修飾，此后在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)這種重組DNA?；蛘撸帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法，通過直接化學(xué)合成，可以常規(guī)制備氨基酸有缺失、插入和/或取代的蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)的功能衍生物通常表現(xiàn)出與天然蛋白質(zhì)相同性質(zhì)的生物活性。
術(shù)語“片段”用來指來源于蛋白質(zhì)的氨基酸序列的、其長(zhǎng)度小于其所來源的全長(zhǎng)多肽的一種多肽。這樣的片段可以例如通過蛋白酶剪切所述全長(zhǎng)蛋白質(zhì)來產(chǎn)生。最好是，通過適當(dāng)?shù)匦揎椌幋a所述蛋白質(zhì)的DNA序列以便在所述天然序列的C末端、N末端和/或所述天然序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸，來重組獲得所述片段。人們會(huì)理解，這類片段可能保留天然蛋白或多肽的一個(gè)或多個(gè)特征性部分、功能或特征。這類保留的特征的實(shí)例包括催化活性；底物專一性；與完整細(xì)胞中其它分子的相互作用；調(diào)節(jié)功能；或者與對(duì)天然復(fù)合體或其表位特異性的抗體結(jié)合。
計(jì)劃在本發(fā)明范圍內(nèi)的另一種功能衍生物是一種“變異型”多肽，所述多肽相對(duì)于天然多肽而言或者缺乏一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或者含有額外的或取代的氨基酸。通過適當(dāng)修飾所述蛋白質(zhì)的DNA編碼序列以便在所述天然序列的C末端、N末端和/或所述天然序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)加入、去除和/或修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸的密碼子，可以從天然存在的復(fù)合體組分衍生所述變異體。如上所述，人們理解，具有加入的、取代的和/或額外的氨基酸的這類變異體保留了所述天然蛋白的一個(gè)或多個(gè)特征性部分。
本發(fā)明的其它方面涉及本發(fā)明嵌合蛋白的應(yīng)用。優(yōu)選的應(yīng)用包括藥物應(yīng)用和獸醫(yī)應(yīng)用，其中將有效量的按照本發(fā)明的嵌合蛋白(最好以按照本發(fā)明的組合物)給予患者。這樣，所述嵌合蛋白接觸患者的細(xì)胞，所述接觸此后誘發(fā)所需的生物應(yīng)答。使用本發(fā)明嵌合蛋白的方法包括在生物體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法、在生物體內(nèi)產(chǎn)生抗體(B細(xì)胞免疫應(yīng)答)的方法、誘導(dǎo)生物體的T細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法以及治療T細(xì)胞病理的方法。本發(fā)明也包括通過給予本發(fā)明的嵌合蛋白治療受治療者以便增強(qiáng)能夠改變T細(xì)胞病理的免疫應(yīng)答的方法。
通常，這些方法通過給予所述生物體有效量的按照本發(fā)明的嵌合蛋白來完成。“有效量”是指導(dǎo)致誘發(fā)所需生物應(yīng)答的量。這種量的構(gòu)成將所有變化，并且取決于各種各樣的因素，包括具體的嵌合蛋白、待誘發(fā)的所需生物應(yīng)答、嵌合蛋白的制劑、待治療生物體的年齡、體重、性別和健康狀況、給藥方案、待治療或預(yù)防的癥癥或疾病等?？梢越o予本發(fā)明嵌合蛋白和組合物的生物體包括哺乳動(dòng)物，最好是選自牛、犬、馬、貓、羊、豬和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的哺乳動(dòng)物。特別優(yōu)選的生物體是人類。
可以將本文所述的化合物本身給予人類患者，或者所述化合物可以以其中與其它有效成分混合的藥用組合物給予人類患者，或者以聯(lián)合療法或者在合適的載體或賦形劑中給予人類患者。用于配制和給予本申請(qǐng)化合物的技術(shù)可以在″Remington’s Pharmaceutical Sciences，″Mack Publishing Co.，Eaton，PA，最新版中找到。給藥途徑合適的給藥途徑可以例如包括口服、直腸、經(jīng)粘膜或腸溶給藥；胃腸外給藥，包括肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接室內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解可以作出使組合物適合于具體給藥途徑的各種改變。
另一方面，人們可以以局部方式而非系統(tǒng)性方式給予所述化合物，例如通過將所述化合物通常以緩釋制劑的形式直接注射到實(shí)體瘤中。組合物/制劑本發(fā)明的藥用組合物可以以本身已知的方法生產(chǎn)，例如借助常規(guī)混合、溶解、制粒、制糖錠、研磨、乳化、包囊、包藏或凍干法生產(chǎn)。
因此，按照本發(fā)明使用的藥用組合物可以以常規(guī)方式，采用一種或多種生理上可接受的載體包括賦形劑和有助于將所述活性化合物加工為可以藥用的制劑的輔料來配制。合適的制劑取決于所選的給藥途徑。
對(duì)于注射而言，本發(fā)明的藥物可以配制到水溶液中，最好是配制在生理上相容的緩沖液例如Hank氏溶液、Ringer氏溶液或者生理鹽水緩沖液中。對(duì)于經(jīng)粘膜給藥而言，在制劑中使用適于穿透所述屏障的滲透劑。這類滲透劑是本領(lǐng)域眾所周知的。
對(duì)于口服給藥，可以通過將所述活性化合物與本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的載體混合，可以容易地配制所述化合物。這類載體使本發(fā)明的化合物能夠配制為可供待治療患者口服攝入的片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑等。合適的載體包括賦形劑，例如填充劑，諸如糖包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑，例如玉米淀粉、小麥淀粉、水稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽例如藻酸鈉。
給糖錠核心提供合適的包衣。為此，可以使用濃縮糖溶液，它可以任選地含有阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波泊爾膠(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物?？梢约尤肴玖匣蛏刂疗瑒┗蛱清V包衣中，以供標(biāo)識(shí)或鑒定活性化合物劑量的不同組合。
可以口服使用的藥用制劑包括用明膠制備的鎖口型膠囊以及用明膠和增塑劑例如甘油或山梨醇制備的軟密封膠囊。鎖口型膠囊可以含有與以下物質(zhì)混合的所述有效成分填充劑例如乳糖、粘合劑例如淀粉、和/或潤(rùn)滑劑例如滑石粉或硬脂酸鎂、和任選的穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，可以將所述活性化合物溶于或懸浮于合適的液體例如脂肪油、液體石蠟或液態(tài)聚乙二醇中。另外，可以加入穩(wěn)定劑。用于口服給藥的所有制劑都應(yīng)該為適合于這類給藥的劑量形式。
對(duì)于口腔含化給藥，所述組合物可以采用以常規(guī)方式制備的片劑或錠劑形式。
對(duì)于吸入給藥，按照本發(fā)明使用的化合物可以以借助于合適的推進(jìn)劑(例如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適氣體)，從加壓包裝或霧化器供給的氣霧劑噴霧形式方便地給藥。就加壓氣霧劑而言，可以通過提供一個(gè)閥以給予一個(gè)計(jì)量量，來確定劑量單位?？梢耘渲坪兴龌衔锖秃线m粉劑基質(zhì)(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物、供吸入器或吹入器用的例如明膠膠囊和藥筒。
所述化合物可以配制用于通過注射胃腸外給藥，例如通過大劑量注射或連續(xù)輸注給藥。注射用制劑可以以單位劑型存在，例如在安瓿或多劑量容器中，并且加入防腐劑。所述組合物可以采用諸如油性或水性溶媒中的混懸劑、溶液劑或乳劑的形式，并且可以含有配制劑(formulatory agent)，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
用于胃腸外給藥的藥用制劑包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，所述活性化合物的混懸劑可以配制為適當(dāng)?shù)挠托宰⑸溆没鞈覄：线m的親脂性溶劑或溶媒包括脂肪油例如芝麻油、或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯、或者脂質(zhì)體。含水注射用混懸劑可以含有提高混懸劑粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖?；鞈覄┮部梢匀芜x地含有合適的穩(wěn)定劑或提高所述化合物溶解度以允許配制高濃縮溶液的藥劑。
或者，所述有效成分可以為粉劑形式，以供在使用前用合適的溶媒例如無菌無熱原水重建。
除前述制劑外，所述化合物也可以配制為緩釋制劑。這類長(zhǎng)效制劑可以通過植入(皮下植入或肌內(nèi)植入)或者通過肌內(nèi)注射給藥。因此，例如所述化合物可以用合適的聚合材料或疏水性材料(例如可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂或者作為微溶性衍生物(例如作為微溶性鹽)來配制。
本發(fā)明疏水性化合物的藥用載體是一種包含苯甲醇、非極性表面活性劑、水混溶性有機(jī)聚合物和水相的助溶劑體系。所述助溶劑體系可以是VPD助溶劑體系。VPD是一種3％w/v苯甲醇、8％w/v非極性表面活性劑polysorbate 80和65％w/v聚乙二醇300、用無水乙醇定容的溶液。VPD助溶劑體系(VPDD5W)包含用5％葡萄糖水溶液以1∶1稀釋的VPD。這種助溶劑體系很好地溶解疏水性化合物，其自身在系統(tǒng)給藥時(shí)產(chǎn)生的毒性低。自然，助溶劑體系的比率在不破壞其溶解性和毒性特征的情況下，可以有相當(dāng)大的變化。此外，所述助溶劑組分的身份可以改變例如，可以使用其它低毒性非極性表面活性劑來代替polysorbate 80；聚乙二醇的比率大小可以改變；其它生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；以及可以用其它糖或多糖替代葡萄糖。
另一方面，可以使用疏水性藥用化合物的其它給藥系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是眾所周知用于疏水性藥物的給藥溶媒或載體的實(shí)例。某些有機(jī)溶劑例如二甲基亞砜也可以使用，盡管通常以更大的毒性為代價(jià)。另外，所述化合物可以用緩釋系統(tǒng)來給藥，例如含有所述治療藥的固態(tài)疏水性聚合物的半透性基質(zhì)。各種緩釋材料已經(jīng)很好地確立，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。緩釋膠囊可以根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)，在數(shù)周至100天內(nèi)釋放所述化合物。根據(jù)所述治療藥的化學(xué)性質(zhì)和生物穩(wěn)定劑，可以使用用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的其它策略。
所述藥用組合物也可以包含合適的固相或凝膠相載體或賦形劑。這類載體或賦形劑的實(shí)例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物例如聚乙二醇。
本發(fā)明的許多化合物可以作為具有藥學(xué)上相容的相反離子的鹽來提供。藥學(xué)上相容的鹽可以用許多酸來形成，所述酸包括但不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。鹽在相應(yīng)的游離堿形式的水性溶劑或其它質(zhì)子溶劑中往往更易溶解。有效量適用于本發(fā)明的藥用組合物包括其中包含足以達(dá)到其計(jì)劃目的量的有效成分的組合物。更具體地講，治療有效量是指化合物有效預(yù)防、減輕或緩解病癥或延長(zhǎng)所治療的受治療者的生存的量。治療有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，尤其是根據(jù)本文提供的詳細(xì)公開內(nèi)容。
本文所述化合物的毒性和療效可以用標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法用細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物來確定，例如確定LD50(使群體的50％致死的劑量)和ED50(在群體的50％中治療有效的劑量)。毒性和療效的劑量比是治療指數(shù)，它可以以LD50和ED50之比來表示。優(yōu)選表現(xiàn)出高治療指數(shù)的化合物。根據(jù)這些細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用來制訂人用的劑量范圍。這類化合物的劑量最好在包括ED50但具有很低毒性或無毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。所述劑量可以在該范圍內(nèi)變動(dòng)，這取決于所用的劑型和使用的給藥途徑。實(shí)際的制劑、給藥途徑和劑量可以由各個(gè)醫(yī)師根據(jù)患者的病癥來選擇(參見例如Fingl等，1975，″ThePharmacological Basis of Therapeutics，″第1章第1頁)。
給藥量和給藥間隔可以單獨(dú)進(jìn)行調(diào)整，以提供足以保持所需效應(yīng)或提供最低有效濃度(MEC)的所述活性部分的血漿水平。MEC對(duì)于每種化合物而言會(huì)有所變化。達(dá)到MEC所必需的劑量將取決于各個(gè)特征和給藥途徑。然而，可以用HPLC測(cè)定或生物測(cè)定來測(cè)量血漿濃度。
給藥間隔也可以用MEC值來確定。應(yīng)該采用維持血漿水平在所述時(shí)間的10-90％、優(yōu)選30-90％、更優(yōu)選50-90％內(nèi)高于MEC的給藥方案，來給予化合物。
就局部給藥或選擇性吸收而言，所述藥物的有效局部濃度可能與血漿濃度不相關(guān)。
當(dāng)然，組合物的給藥量將取決于所治療的受治療者、受治療者的體重、疾患的嚴(yán)重程度、給藥方式和主治醫(yī)師的判斷。包裝如果需要，所述組合物可以在可以含有一個(gè)或多個(gè)單位劑型的包裝或分配裝置中提供，所述單位劑型含有所述有效成分。所述包裝可以例如包含金屬箔或塑料箔，例如泡罩片。所述包裝或分配裝置可以附有給藥說明。所述包裝或分配器也可以附帶與容器相連的、由管理藥物生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定形式的、反映出該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)所述形式的多核苷酸給予人類或動(dòng)物的通知。這類通知例如可以是美國(guó)食品與藥品管理局批準(zhǔn)的處方藥的標(biāo)簽，或者是批準(zhǔn)的產(chǎn)品說明書。也可以制備包含在相容藥用載體中配制的本發(fā)明化合物的組合物，將其置于合適的容器中，并且配有有關(guān)治療所指明病癥的標(biāo)簽。標(biāo)簽上指明的合適病癥可以包括治療腫瘤、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、治療糖尿病等。
實(shí)施例在以下描述中，將參考免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法。敘述所參考的這類已知方法的出版物和其它材料通過引用全部結(jié)合到本文中，如同全文敘述一樣。實(shí)施例1.組織加工，以便進(jìn)行T細(xì)胞淋巴瘤獨(dú)特型(Id)的鑒定和克隆在無菌條件下按照臨床指定的方法，對(duì)得自外周淋巴結(jié)的腫瘤樣品進(jìn)行活組織檢查，用所述樣品產(chǎn)生患者獨(dú)特型特異性重組Vα和Vβ-Ig嵌合蛋白。將剩余的淋巴結(jié)活檢材料在液氮中貯存于組織細(xì)胞庫(kù)中，以備將來使用。
細(xì)胞分離通過迫使患者活檢淋巴瘤組織通過一次性0.38mm鋼篩網(wǎng)并且同時(shí)浸入無菌PBS中，獲得患者淋巴結(jié)活檢樣本的單細(xì)胞懸浮液。分散的細(xì)胞用PBS洗滌2次，然后重新懸浮和計(jì)數(shù)。加工10％比率的所述細(xì)胞，以進(jìn)行總RNA提取，剩余的細(xì)胞在重新懸浮于含有30％胎牛血清和10％DMSO的RPMI 1640組織培養(yǎng)基中之后，在液氮中保存。所有臨床樣品的加工都在生物安全櫥中進(jìn)行。
總RNA制備用RNeasy Kit(Qiagen)，按照生產(chǎn)商的說明，分離得自勻漿淋巴結(jié)細(xì)胞的總RNA?？俁NA通過分光光度法定量。
cDNA合成和來自T淋巴瘤細(xì)胞的編碼TCR Vα和Vβ鏈的基因的PCR擴(kuò)增T淋巴瘤細(xì)胞受體的Vα和Vβ鏈都用5’RACE系統(tǒng)(GibcoBRL)，完全按照生產(chǎn)商的描述方法來鑒定，具體描述如下用大約5.0μg總RNA作為模板，用Cα特異性引物CADS3或Cβ特異性引物CBDS3(參見表1)引發(fā)第一鏈DNA，進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。然后按照生產(chǎn)商的建議進(jìn)行PolydC加尾。然后用生產(chǎn)商提供的5’引物和第二Cα特異性反義引物CADS2或Cβ特異性反義引物CBDS2，進(jìn)行Vα和Vβ鑒定，每種所述反義引物對(duì)于cDNA合成所述的相應(yīng)引物而言是內(nèi)部引物(參見表1)。
(CB/IgG1小寫字母代表為產(chǎn)生Apa I克隆位點(diǎn)以形成IgG1嵌合蛋白所作出的改變。指定C/G和G/T的堿基表示由于Cβ1和Cβ2之間的差異所致的在那兩個(gè)位置上使用的任一種堿基。)(CA/IgK小寫字母代表為產(chǎn)生Dra III克隆位點(diǎn)以形成具有κ輕鏈的嵌合蛋白所作出的改變。)PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序按照生產(chǎn)商的建議，將得自多個(gè)反應(yīng)、經(jīng)測(cè)定含有Vα和Vβ鏈的腫瘤特異性序列的PCR產(chǎn)物，直接克隆到質(zhì)粒pCR2.1-TOPO中，然后導(dǎo)入到Top10感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞(Invitrogeh)中。用QIAPrep Spin Miniprep Kit(Qiagen)，從羧芐青霉素抗性菌落制備24種小量制備的DNA質(zhì)粒，并通過分光光度法定量。用Cy5/Cy5.5染料引物循環(huán)測(cè)序試劑盒(Dye Primer Cycle SequencingKit)(Visible Genetics)，對(duì)200ng的每種質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。在測(cè)序反應(yīng)完成后，樣品在OpenGene DNA自動(dòng)測(cè)序系統(tǒng)(Automated DNASequencing System)上電泳，數(shù)據(jù)用GeneObjects軟件包(Visible Genetics)加工。用SEQUENCHER Version 4.1.2 DNA分析軟件(GENE CodesCorp.)，進(jìn)行另外的分析，包括序列比對(duì)。如果一種Vα或Vβ的腫瘤特異性序列存在于75％的所述樣品中，例如所述24種中的18種或更多種形成一個(gè)共有序列組，則將考慮所述腫瘤特異性序列。當(dāng)可得到時(shí)，比較兩個(gè)獨(dú)立的活檢樣品。實(shí)施例2.含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈恒定區(qū)的桿狀病毒表達(dá)載體pTRABacVαHCγ1和pTRABacVβHCγ1的構(gòu)建將分泌信號(hào)序列克隆到p2Bac中pTRABacHuLCκHCγ1和pTRABacHuLCλHCγ1構(gòu)建體的基礎(chǔ)載體是p2Bac(圖2，SEQ ID NO5，Invitrogen，Carlsbad，CA)。將兩種分泌信號(hào)序列克隆到該基礎(chǔ)載體中，構(gòu)建第一種中間桿狀病毒表達(dá)載體p2BacM。概括地說，首先利用編碼定位以置于桿狀病毒AcNPV P10啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下的蜜蜂蜂毒肽分泌信號(hào)序列氨基末端結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)寡核苷酸，修飾載體p2Bac。對(duì)于蜂毒肽序列的克隆，2μgp2Bac用Not I和Spe I于37℃消化4小時(shí)。所述線性載體在通過1％瓊脂糖凝膠電泳后用Qiaex II樹脂(Qiagen，Chatsworth，CA)純化。然后，經(jīng)純化的DNA用50μl水洗脫，并測(cè)定DNA濃度。將引物MelS/N(SEQ ID NO16)和MeIN/S(SEQ ID NO17)各1μg與10μl消化緩沖液M(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)混合，加熱至70℃達(dá)5分鐘，然后冷卻至室溫，以使互補(bǔ)引物退火。10％的退火引物用Not I和Spe I于37℃，在20μl反應(yīng)物中消化4小時(shí)，經(jīng)消化的引物在通過15％聚丙烯酰胺凝膠電泳后用Qiaex H樹脂來純化，然后測(cè)定退火引物的DNA濃度。p2Bac載體和退火蜂毒肽片段的DNA以1∶10的載體與插入片段比進(jìn)行連接。用感受態(tài)XLl-Blue大腸桿菌(Stratagene，San Diego，CA)，用連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長(zhǎng)過夜。采用標(biāo)準(zhǔn)方案制備小量制備菌落，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序以檢查所述構(gòu)建。所得的載體p2BacM含有所述蜂毒肽分泌信號(hào)序列。
類似地對(duì)p2BacM載體進(jìn)行進(jìn)一步修飾，以編碼AcNPV多角體啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下的人胎盤堿性磷酸酶分泌信號(hào)序列的氨基末端結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建第二種中間桿狀病毒表達(dá)載體p2BacMA。用來導(dǎo)入、克隆所述堿性磷酸酶序列方法一般如下所述用Bam HI和Eco RI消化2μgp2BacM質(zhì)粒，線性載體通過瓊脂糖凝膠和Qiaex II樹脂進(jìn)行凝膠純化，并用50μl水洗脫。測(cè)定所述載體的DNA濃度。將引物APB/E(SEQID NO18)和APE/B(SEQ ID NO19)各1μg在10μl消化緩沖液M中混合，加熱至70℃達(dá)5分鐘，然后冷卻至室溫，以使互補(bǔ)引物退火。10％的退火引物用Bam HI和Eco RI于37℃在20μl反應(yīng)物中消化4小時(shí)。然后經(jīng)消化的引物通過15％聚丙烯酰胺凝膠和Qiaex II樹脂純化。也測(cè)定經(jīng)消化引物的DNA濃度。然后，使線性p2BacM載體和堿性磷酸酶片段以1∶10的載體與插入片段比進(jìn)行連接，用感受態(tài)XL1-Blue大腸桿菌，用連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長(zhǎng)過夜。制備小量制備菌落，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序以檢查所述構(gòu)建。所得的中間載體p2BacMA將含有人胎盤堿性磷酸酶的分泌信號(hào)序列。再將p2BacMA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到缺乏dcm甲基化酶活性的SCS-110大腸桿菌菌株(Stratagene)中，以供隨后將κ恒定區(qū)克隆到甲基敏感性Stu I位點(diǎn)中。
IgGγ1和輕鏈恒定區(qū)的擴(kuò)增和克隆從自人細(xì)胞系9F12(ATCC#HB8177)中提取的RNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增人單克隆抗體9F12的人κ恒定區(qū)和人IgGγ1恒定區(qū)。將κ恒定區(qū)克隆到所述堿性磷酸酶信號(hào)序列之后。將IgGγ1恒定區(qū)插入到所述蜂毒肽分泌信號(hào)序列的下游，從而構(gòu)建載體(pTRABacHuLCκHCγ1，圖5a)。通過用λ輕鏈恒定區(qū)取代κ輕鏈恒定區(qū)，產(chǎn)生含有人λ輕鏈恒定區(qū)的載體(pTRABacHuLCλHCγ1，圖5b)。從慢性淋巴細(xì)胞白血病的細(xì)胞RNA制劑中，通過RT-PCR分離出所述輕鏈?？寺〕绦虻脑敿?xì)描述如下。
9F12κ恒定區(qū)片段和IgGγ1恒定區(qū)片段的擴(kuò)增用RNeasy Kit(Qiagen)，按照生產(chǎn)商的說明，從9FI2細(xì)胞(ATCC#HB8177)提取總RNA。用SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO BRL，Rockville，MD)和oligo(dT)引物，合成單鏈cDNA。用1/20的合成單鏈cDNA，在具有Expand HighFidelty Taq(Roche)的100μlPCR反應(yīng)物中，使用κ和IgGγ1特異性寡核苷酸(分別為SEQ ID NO22加上SEQ ID NO23和SEQ ID NO20加上SEQ ID NO21)進(jìn)行擴(kuò)增。來自擴(kuò)增9FI2免疫球蛋白的片段通過1.5％SeaKem瓊脂糖和Qiaex II樹脂純化，并用50μl水洗脫。測(cè)定所述片段的DNA濃度。將純化的9F12免疫球蛋白片段分別連接到TA-II(Invitrogen)PCR克隆載體中。用感受態(tài)XLI-Blue大腸桿菌，用所述連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長(zhǎng)過夜。制備小量制備的菌落，并對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。
將9F12κ恒定區(qū)插入到所述表達(dá)載體中對(duì)于κ恒定區(qū)，用Stu I和Hind III消化5μg含有κ恒定區(qū)的質(zhì)粒DNA和2μg從SCS110大腸桿菌中純化的載體p2BacMA的DNA。含有κ恒定區(qū)的320bp片段和含有p2BacMA載體的7.1kb片段用Quiex II凝膠純化，然后用50μl水洗脫。測(cè)定這兩種片段的DNA濃度。然后用Rapid Ligation Kit(Roche)連接純化的片段。用感受態(tài)XL1-Blue大腸桿菌，用所述連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長(zhǎng)過夜。制備小量制備的細(xì)菌菌落，并對(duì)所述重組DNA進(jìn)行測(cè)序，以證實(shí)κ恒定區(qū)的正確插入。所得的質(zhì)粒載體為pTRABacLCκ。
將IgGγ1恒定區(qū)加入到所述載體中通過首先用Spe I和Xba I消化5μg含有IgGγ1恒定區(qū)的質(zhì)粒DNA和2μg載體pTRABacLCκ的質(zhì)粒DNA，將IgGγ1恒定區(qū)加入到所述載體中。用瓊脂糖填料(agaroseplugs)和Quiex II凝膠純化IgGγ1恒定區(qū)的1kb片段和pTRABacLCκ載體的7.4kb片段，并用50μl水洗脫。測(cè)定這兩種片段的DNA濃度。然后用Rapid Ligation Kit(Roche)連接純化的片段。用感受態(tài)XL1-Blue大腸桿菌，用所述連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長(zhǎng)過夜。制備小量制備的菌落，通過限制性分析和對(duì)限制位點(diǎn)測(cè)序，確定連接和IgGγ1插入的方向。所得的重組載體為pTRABacHuLCκHCγ1。
進(jìn)一步精修該質(zhì)粒-pTRABacHuLCκHCγ1，以便分別在所述蜂毒肽分泌序列和Cγ1區(qū)序列之間以及在所述堿性磷酸酶分泌序列和Cκ區(qū)序列之間加入翻譯終止密碼子。為了完成這些修飾，采用Spe I+Apa I消化，使pTRABacHuLCκHCγ1載體線性化。然后將所述線性化載體與退火的互補(bǔ)引物γ1-stuff1(SEQ ID NO53)和γ1-stuff 1’(SEQ ID NO54)連接，以引入符合讀框的終止密碼子。隨后采用以Stu I(AGGCCT)+Dra III(CACnnnGTG)消化，使通過這種修飾得到的載體線性化，然后與退火的互補(bǔ)引物κ-Stuff1(SEQ ID NO55)和κ-stuff1’(SEQ ID NO52)連接，以引入符合讀框的終止密碼子。這些修飾的凈效應(yīng)分別在圖6C和6D中所示的序列中指出。(加入的序列以雙下劃線和粗體突出。)將λ恒定區(qū)加入到所述載體中用RNeasy試劑盒(Qiagen)，從得自表現(xiàn)出λ輕鏈獨(dú)特型的慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)患者的純化外周血淋巴細(xì)胞(PBL)中獲得總RNA。
用大約2.0μg總RNA作為模板，采用SuperScript PreamplificationSystem(Gibco BRL)，按照生產(chǎn)商的建議，進(jìn)行第一鏈cDNA合成。用Oligo(dT)進(jìn)行引發(fā)。用1/20的所述合成單鏈cDNA，用與Vλ信號(hào)序列的一部分相同的上游引物(TTGCTTACTG CACAGGATCC GTG；SEQID NO47)和與λ恒定區(qū)的最后幾個(gè)密碼子以及3’非翻譯區(qū)的一部分互補(bǔ)的下游引物(TGCCGTCGGC AGGAGGTATT TCATTATGACTGTCTCCTTG CTATTATGAA CATTCTGTAG GGGCCA；SEQ IDNO48)，在PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物克隆到pCRII載體(Invitrogen)中，測(cè)序以證實(shí)身份。選擇含有正確λ恒定區(qū)序列的質(zhì)粒作為第二PCR的模板。在該反應(yīng)中，利用一種含有工程Dra III限制位點(diǎn)、對(duì)應(yīng)于λ恒定區(qū)中緊接Jλ下游的序列的有義寡核苷酸Cλ-5’(SEQ IDNO49)、和一種跨越緊接λ恒定區(qū)的終止密碼子的含Hind III反義寡核苷酸引物Cλ-3’(SEQ ID NO50)。將所得的PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1-TOPO載體中并測(cè)序。用Hind III限制時(shí)，從所述質(zhì)粒的某些質(zhì)粒中釋放出含所述λ恒定區(qū)序列的片段，這取決于所述插入片段的取向。凝膠分離這一限制性片段，在用Hind III消化線性化后，將其克隆到pTRABacHuLCκHCγ1(圖5A)中，產(chǎn)生一種含有λ恒定區(qū)和κ恒定區(qū)的中間質(zhì)粒。用Stu I和Dra III限制這種質(zhì)粒，導(dǎo)致除去所述κ序列。然后將這種線性化質(zhì)粒與退火的互補(bǔ)引物λ-stuff1(SEQ ID NO51)和λ-stuff1’連接，產(chǎn)生最終形式的pTRABacHuLCλHCγ1(圖5B)。
在pTRABacHuLCκHCγ1和/或pTRABacHuLCλHCγ1構(gòu)建中使用的所有寡核苷酸引物一覽表可以在以下表2和表3中找到。
采用或者pTRABacHuLCκHCγ1或pTRABacHuLCλHCγ1，有可能將含有單一克隆序列Stu I和Dra III的任何Vα或Vβ鏈的基因插入到κ或λ恒定區(qū)和所述堿性磷酸酶信號(hào)序列之間，以及將含有單一克隆序列SpeI和Apa I的任何Vβ或Vα鏈的基因插入到IgGλ1恒定區(qū)和蜂毒肽分泌信號(hào)序列之間。然后用所得的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)到草地貪夜蛾(Sf-9)昆蟲細(xì)胞中，產(chǎn)生出芽的重組桿狀病毒。然后將所述重組的桿狀病毒在Sf-9細(xì)胞中連續(xù)擴(kuò)增，產(chǎn)生高滴度的重組桿狀病毒原液。然后用這種高滴度的重組桿狀病毒原液感染粉紋夜蛾(High-5)細(xì)胞，以供隨后生產(chǎn)TCR/Ig嵌合蛋白。
實(shí)施例3.將患者來源的獨(dú)特型Vα和/或Vβ鏈的基因插入到表達(dá)載體中在如上所述分離Vα和/或Vβ鏈的腫瘤衍生序列之后，制備含有所述蜂毒肽前導(dǎo)肽的末端40個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物(對(duì)于Vβ鏈克隆而言)(SEQ ID NO8-ACTAGTTTTT ATGGTCGTGT ACATTTCTTACATCTATGCG)、含有所述堿性磷酸酶前導(dǎo)肽的末端31個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物(對(duì)于Vα鏈克隆而言)(SEQ ID NO9-AGGCCTGAGGCTACAGCTCT CCCTGGGC)和含有根據(jù)如上所述的分析中測(cè)定的相應(yīng)的Vα或Vβ基因的前20個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物。使用來自α鏈或β鏈恒定區(qū)與CA的堿基對(duì)4-36互補(bǔ)的反向寡核苷酸引物(CA/IgK；SEQID NO15)和與CB的堿基對(duì)6-35互補(bǔ)的反向寡核苷酸引物(CB/IgG1SEQ ID NO14)。如前所述鑒定為具有克隆Vα或Vβ序列的重組質(zhì)粒用作第二輪PCR的模板。循環(huán)條件如上所述。
將Vα區(qū)插入到表達(dá)載體中用限制性酶Stu I和Dra III消化從序列已證實(shí)的質(zhì)粒制備物中擴(kuò)增的PCR衍生DNA片段，然后在瓊脂糖凝膠上分離。將預(yù)測(cè)的含Vα基因的大約360bp片段洗脫出，然后插入到合適的桿狀病毒免疫球蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)移載體。概括地將，用Stu I和Dra III消化PCR衍生Vα產(chǎn)物和2μg對(duì)應(yīng)的pTRABacHuLCκHCγ1或pTRABacHuLCλHCγ1盒載體。用瓊脂糖凝膠填料和Qiaex II樹脂純化來自患者來源的Vα鏈的360bpDNA片段和線性pTRABacHuLCκHCγ1或pTRABacHuLCλHCγ1載體的8.4kb片段，并用50μl水洗脫。測(cè)定這兩種片段的DNA濃度，然后用Rapid Ligation試劑盒(Roche)連接所述片段。用感受態(tài)XL1-Blue大腸桿菌，用所述連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后將其平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長(zhǎng)過夜。制備小量制備的菌落，通過限制性分析和測(cè)序，證實(shí)所述重組DNA質(zhì)粒。所得的載體命名為pTRABacVαHuLCκHCγ1或pTRABacVαHuLCλHCγ1。
將Vβ鏈插入到表達(dá)載體中通過限制性酶Spe I和Apa I消化從序列已證實(shí)的質(zhì)粒制備物中擴(kuò)增的PCR衍生DNA片段。凝膠純化切下的含有Vβ基因的大約360bp片段，將其插入到含有連接的Vα基因的合適的桿狀病毒免疫球蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)移載體pTRABacVαHuLCκHCγ1或pTRABacVαHuLCλHCγ1中、或者插入到不含連接的Vα基因的pTRABacHuLCκHCγ1中。概括地講，用Spe I和Apa I消化PCR衍生Vβ產(chǎn)物和2μg pTRABacVαHuLCκHCγ1、pTRABacVαHuLCλHCγ1、pTRABacHuLCκHCγ1載體的DNA。用瓊脂糖凝膠填料和Qiaex II樹脂凝膠純化Vβ鏈的360bp片段和pTRABacVαHCγ1、pTRABacVαHuLCκHCγ1或pTRABacVαHuLCλHCγ1載體的8.8kb片段或者pTRABacHuLCκHCγ1載體的8.4kb片段，并用50μl水洗脫。測(cè)定這兩種片段的DNA濃度，然后用Rapid Ligation試劑盒(Roche)連接所述片段。用感受態(tài)XL1-Blue大腸桿菌，用所述連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，隨后將其平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長(zhǎng)過夜。制備小量制備的菌落，并對(duì)所述重組DNA質(zhì)粒測(cè)序。所得的載體命名為pTRABacVαHuLCκVβHCγ1或pTRABacVαHuLCλVβHCγ1或者pTRABacHuLCκVβHCγ1。
實(shí)施例4.用含Vα和/或Vβ鏈獨(dú)特型的桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞系和產(chǎn)生重組嵌合蛋白昆蟲細(xì)胞的生長(zhǎng)用經(jīng)修飾的桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染兩個(gè)已建立的昆蟲細(xì)胞系(Sf9和High-5)，以產(chǎn)生重組VH/免疫球蛋白和/或VL/免疫球蛋白嵌合蛋白。所有的昆蟲細(xì)胞都于28℃在140-150rpm下、在一次性無菌通氣(vented)搖瓶(Coming)內(nèi)含有50μg/L慶大霉素的ESF-921無血清昆蟲培養(yǎng)基(表達(dá)系統(tǒng)LLP)中生長(zhǎng)，液體的體積不超過50％。每2-3天將細(xì)胞傳代。將來自每批產(chǎn)物工作細(xì)胞庫(kù)的或每6周的工作細(xì)胞庫(kù)的冷凍細(xì)胞解凍(低溫保藏培養(yǎng)基10％DMSO，40％ESF-921培養(yǎng)基，50％High-5條件培養(yǎng)基)，以確保有不因桿狀病毒感染而取消(retractile to)的連續(xù)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞原液。
Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染和重組測(cè)定用BacVector-3000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen)，將含有Vα和/或Vβ區(qū)的基因和編碼免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)的基因的經(jīng)修飾桿狀病毒表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞中。從瓊脂糖上層中挑出10個(gè)單獨(dú)的噬斑。來自分離的噬斑的病毒用來感染T-25燒瓶?jī)?nèi)5ml ESF-921培養(yǎng)基中接種的50％融合的Sf9細(xì)胞。用兩種引物(SEQ ID NO37-TTTACTGTTT TCGTAACAGTTTTG)和(SEQ ID NO38-GGTCGTTAAC AATGGGGAAG CTG)，通過PCR測(cè)試在T-25燒瓶中擴(kuò)增的克隆病毒分離物，以確保分離的噬斑的克隆性和沒有野生型病毒污染。概括地說，按照Bac Vector手冊(cè)(Novagen)中所述，用供應(yīng)的Eufectin脂質(zhì)試劑，將200ng重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與三重切割的Bac-Vector-3000一起共轉(zhuǎn)染。將該轉(zhuǎn)染混合物連續(xù)5倍稀釋。將100微升等份樣品接種到含有2.5×106Sf9貼壁細(xì)胞的60mm組織培養(yǎng)皿中。1小時(shí)后，在細(xì)胞上鋪上4ml ESF-921培養(yǎng)基中的1％瓊脂糖溶液。在t＝轉(zhuǎn)染后144小時(shí)用中性紅(Sigma，St.Louis，MO)使活細(xì)胞染色后，從在瓊脂糖上層中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中挑出10個(gè)單獨(dú)的克隆。將病毒從噬斑塞狀物(plug)中過夜洗脫到1ml ESF-921培養(yǎng)基中。在T-25燒瓶中，接種5ml ESF-921培養(yǎng)基中50％融合的Sf-9細(xì)胞，用0.5ml洗脫的克隆病毒感染。感染后96小時(shí)，從T-25燒瓶中取出0.5ml培養(yǎng)基；離心除去細(xì)胞，通過硝化纖維素上的斑點(diǎn)印跡分析，分析上清液中的免疫球蛋白活性。如下所述，也通過PCR檢驗(yàn)出不存在野生型病毒。
將含有重組桿狀病毒的感染性上清液(10μl)加入到90μl含有6μg蛋白酶K的裂解緩沖液中，所述裂解緩沖液含有10mM Tris pH8.3、50mM KCl、0.1mg/ml明膠、0.45％ Nonidet P-40和0.45％ Tween-20。將混合物于60℃加熱1小時(shí)，通過于95℃保溫10分鐘使蛋白酶K變性。取出25μl經(jīng)加熱的混合物，在冷卻后加入到新PCR管中，然后加入另外25μl混合物，所述混合物含有10mM Tris pH8.3、50mMKCl、0.1mg/ml明膠、0.45％NP-40、0.45％Tween-20、每種dNTP各400μM、5mM MgCl2、每種PCR引物各50pM(終濃度)和2.5U Taq聚合酶(Roche)。將病毒DNA擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)92℃1min，然后58℃1min和72℃1min。用重組桿狀病毒引物PH正向引物(SEQ ID NO37)和PH反向引物(SEQ ID NO38)，擴(kuò)增表達(dá)所述T細(xì)胞受體基因部分的多角體基因座。采用瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產(chǎn)物。用這些引物組，重組桿狀病毒將擴(kuò)增一種1300bp的片段，而野生型桿狀病毒將產(chǎn)生一種大約800bp的片段。污染野生型病毒的重組病毒將擴(kuò)增出這兩種大小的片段。
在Sf9昆蟲細(xì)胞中制備高滴度病毒原液將得自T-25原代培養(yǎng)物的2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到T-75燒瓶?jī)?nèi)含有50％融合的Sf9細(xì)胞的10mlESF-921培養(yǎng)基中，讓細(xì)胞于28℃生長(zhǎng)120小時(shí)。將5ml第二代T-75培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)移到含有50ml2×106細(xì)胞/ml的Sf9細(xì)胞的150ml搖瓶中，讓細(xì)胞于28℃生長(zhǎng)120小時(shí)。將來自150ml搖瓶的25ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1升搖瓶中的500ml 2×106細(xì)胞/ml的Sf9細(xì)胞中，于28℃生長(zhǎng)。當(dāng)通過錐蟲藍(lán)染色(t＝感染后大約120-144小時(shí))記錄到培養(yǎng)物達(dá)到20％活細(xì)胞時(shí)，以3000×g離心收獲病毒培養(yǎng)物，將其分配到50ml無菌管中，將一半管貯存于4℃，而其余管貯存于-80℃。然后，用這種所收獲的500ml高滴度(＞1×108pfu/ml)病毒原液感染High-5昆蟲細(xì)胞，以供嵌合蛋白生產(chǎn)用。用Baculovirus Rapid Titer Kit(桿狀病毒快速滴度試劑盒)(Clontech，Palo Alto，CA)測(cè)定病毒滴度(pfu/ml)。
High-5昆蟲細(xì)胞中TCR/Ig嵌合蛋白的生產(chǎn)與Sf-9細(xì)胞相比，High-5昆蟲細(xì)胞(BTI-TN-5B1-4)分泌更高水平(2-20×)的重組免疫球蛋白，是選擇用于TCR/Ig嵌合蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞系。將對(duì)數(shù)早期的High-5細(xì)胞(1.0-2.0×106細(xì)胞/ml)以5×105細(xì)胞/ml接種到具有通氣封口(vented closure)的1升一次性培養(yǎng)瓶中的ESF921培養(yǎng)基(ExpressionSystems LLP)中。培養(yǎng)瓶于28℃以140-150rpm振搖，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)調(diào)節(jié)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的體積，使其不超過500ml。當(dāng)細(xì)胞密度在500ml培養(yǎng)基中達(dá)到1.5-2.5細(xì)胞/ml時(shí)，用高滴度重組桿狀病毒原液，以大約0.5∶1(pfn∶細(xì)胞)的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染培養(yǎng)瓶中細(xì)胞。然后將培養(yǎng)瓶于28℃以140-150rpm振搖。每天檢查細(xì)胞活力，在感染后96小時(shí)內(nèi)活力未降至＜50％時(shí)收獲培養(yǎng)物。實(shí)施例5.包含Vα-免疫球蛋白和Vβ-免疫球蛋白的嵌合蛋白的純化通過以大約5,000×g離心60分鐘，然后通過0.2μPES無菌過濾裝置過濾，除去細(xì)胞和碎片。通過用A蛋白High-Trap柱(AmershamPharmacia，Piscataway，NJ)親和色譜，從澄清的組織培養(yǎng)基中純化嵌合蛋白，然后以50％飽和的硫酸銨沉淀。純化的嵌合蛋白經(jīng)過大小分離，然后通過FPLC色譜法以交換到緩沖液PBS中。蛋白純化所用的所有試劑都是USP生物技術(shù)級(jí)(GenAr，Mallinckrot Baker，Parris，KY)，內(nèi)毒素由生產(chǎn)商檢驗(yàn)。用無菌USP級(jí)水制備所有緩沖液和其它溶液。緩沖液和其它溶液在生物安全櫥中制備，并且通過0.2μm PES過濾裝置過濾除菌。
嵌合蛋白的A蛋白Sepharose親和純化從生長(zhǎng)中的培養(yǎng)瓶中取出組織培養(yǎng)基，以5,000×g離心60分鐘以沉淀細(xì)胞和碎片。用0.2μ PES過濾裝置，將上清液過濾除菌。加入Tris緩沖液(1M，pH7.4)至經(jīng)過濾的含有VH和/或VL-免疫球蛋白嵌合蛋白的培養(yǎng)基中至終濃度為20mM。將緩沖的組織培養(yǎng)上清液上樣至帶有一個(gè)蠕動(dòng)泵的5ml HighTrap重組A蛋白Sepharose親和柱(Amersham Pharmacia)，流速為1-5ml/min，在干凈的燒瓶中收集流通液(flow-through)。柱子用25ml PBS(pH7.4)以5ml/min洗滌。逆轉(zhuǎn)流向，柱子用另外25ml PBS洗滌。用0.05M檸檬酸(pH3.5)以1ml/min反向洗脫柱子，收集各1ml的流分。立即加入大約0.3ml 1M Tris(pH9.0)至洗脫出的1ml流分中調(diào)節(jié)pH大約8.0?？梢砸韵嗤绞绞褂冒ǖ幌抻贕蛋白、L蛋白或能夠與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的任何蛋白的其它蛋白柱。
嵌合蛋白的硫酸銨沉淀通過分光光度法鑒定從A蛋白Sepharose中洗脫出的含有Vα和/或Vβ-Ig的流分。將峰流分合并，并測(cè)定體積。然后滴加等體積的飽和硫酸銨溶液并混合。讓沉淀于室溫靜置15分鐘，然后通過以5000×g離心沉降。將沉淀的Vα和/或Vβ-Ig嵌合蛋白重新溶于無菌水中。用Hig Trap脫鹽柱(AmershamPharmacia)，將Vα和/或Vβ-Ig嵌合蛋白交換到PBS緩沖液中，最后通過0.2μ濾器過濾除菌。實(shí)施例6.嵌合蛋白和匙孔血藍(lán)蛋白(KLh)綴合當(dāng)純化后，如下通過戊二醛交聯(lián)將Vα和/或Vβ-Ig嵌合蛋白與GMP級(jí)KLH(VACMUNE，Biosyn Corporation)綴合。將至少5mg純化的無菌獨(dú)特型嵌合蛋白與等量的KLH在15ml無菌圓錐形管中混合，用PBS將終體積調(diào)至9ml。滴加1ml 1％戊二醛(25％1級(jí)水溶液，Sigma)至終濃度為0.1％。然后于室溫下將管緩慢搖動(dòng)4小時(shí)。綴合物在無菌DispoDialyzers(Spectrum Labs)中對(duì)2升無菌PBS透析，在至少24小時(shí)內(nèi)在生物安全通風(fēng)櫥中更換3次緩沖液。從透析室中無菌取出最終Vα和/或Vβ-Ig嵌合蛋白-KLH綴合物，將其轉(zhuǎn)移至一個(gè)無菌管中，混合，然后等份分裝到管形瓶中。給終產(chǎn)物的每個(gè)管形瓶標(biāo)上批號(hào)、患者標(biāo)識(shí)號(hào)、瓶號(hào)和裝瓶日期。用最后一批管形瓶中的10％檢驗(yàn)無菌情況，選擇一個(gè)小瓶，測(cè)試內(nèi)毒素。實(shí)施例7.產(chǎn)品檢驗(yàn)含桿狀病毒DNA序列的生產(chǎn)批料上清液收獲1ml等份的被感染昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)培養(yǎng)物上清液樣品，通過在臺(tái)式離心機(jī)中以3000 rpm離心5分鐘除去細(xì)胞碎片。將至少0.1ml這種含有桿狀病毒顆粒的澄清上清液以1∶9的體積比與裂解緩沖液(10mM Tris pH8.3，50mM KCl，0.1mg/ml明膠，0.45％Nonidet P-40和0.45％Tween-20)混合，用蛋白酶K(終濃度60μg/ml)于60℃蛋白水解1小時(shí)，然后于95℃15分鐘使蛋白酶K變性。然后將25μl這種裂解液與另外25μl含有每種dNTP各400μM、5mM MgCl2、25pmol寡核苷酸(SEQ ID NO32和SEQ IDNO35；或SEQ ID NO36和SEQ ID NO37)(參見表4)和2.5U Taq聚合酶(Roche)的上述裂解緩沖液混合，以便進(jìn)行PCR反應(yīng)。循環(huán)條件是(i)最初于92℃變性2分鐘，(ii)后接92℃、58℃和72℃各1分鐘的40個(gè)循環(huán)，和(iii)于72℃7分鐘的最后延伸。對(duì)PCR產(chǎn)物根據(jù)預(yù)期大小進(jìn)行評(píng)價(jià)，并通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行定量。隨后，用兩種或更多種嵌套引物對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。用OpenGene Automated DNASequencing System(自動(dòng)DNA測(cè)序系統(tǒng))(Visible Genetics)和序列分析軟件，如上所述測(cè)定完整的Vα和/或Vβ核苷酸序列，并且與pTRABac(NHL-FV-8786-XXX)載體中對(duì)應(yīng)于患者獨(dú)特型的V基因序列進(jìn)行比較。
采用抗人IgG ELISA的免疫球蛋白測(cè)定分析所述嵌合蛋白微量滴定板的各孔用100μl 3μg/ml山羊抗人IgG重鏈特異性抗體(Fischer，Pittsburg，PA)在碳酸鹽緩沖液中的稀釋液于4℃包被過夜，用100μlTBS(50mM Tris，150mM NaCl，pH7.5)洗滌2次。然后各孔用200μlTBSB(TBS+1％BSA)于22℃封閉1小時(shí)。將100μl稀釋的樣品以2倍連續(xù)稀釋液以雙份重復(fù)加入到各孔中，于22℃保溫1小時(shí)。用純化的人IgG1/κ或IgG1/λ標(biāo)準(zhǔn)(Sigma，St.Louis，MO)重復(fù)所述分析。各孔用200μlTBST(TBS+0.1％Tween20)洗滌4次。檢測(cè)抗體山羊抗人H和L-HRP(Chemicon，Temecula，CA)在TSBS中以1∶2000稀釋，加入100μl至各孔中并于22℃保溫1小時(shí)。各孔用200μl TBST洗滌6次。加入100μl底物(TMB1組分，KPL Inc.，Gaithersburg，MD)至各孔中，顯色30分鐘，然后根據(jù)OD650色譜圖測(cè)定樣品。從Hi Trap脫鹽柱洗脫的主峰蛋白必須對(duì)應(yīng)于人IgG ELISA活性。實(shí)施例8.嵌合蛋白的濃度和純度生產(chǎn)上清液中桿狀病毒中Vα和/或Vβ基因的DNA序列必須等同于所述生產(chǎn)載體中的所述DNA序列。所述嵌合蛋白的濃度基于OD280必須超過0.5mg/ml，并且必須對(duì)應(yīng)于人IgG ELISA活性。
表4顯示了用于確立終產(chǎn)物身份的引物序列的概述。
實(shí)施例9.Vα和/或Vβ-Ig嵌合蛋白和/或其與細(xì)胞因子的綴合物的共同給予用含有所述蜂毒肽前導(dǎo)肽末端40個(gè)核苷酸和鼠Vβ12的前20個(gè)核苷酸的5’寡核苷酸(SEQ.ID.NO56TTACTAGTTT TTATGGTCGTGTACATTTCT TACATCTATG CTGACGCTGG AGTTACCCAG A)和與鼠Cb5’端和人IgG1互補(bǔ)的3’寡核苷酸(SEQ.ID.NO57AGGAGACCTT GGGTGGAGTC GGGCCCTTCA GATCCTC)，如上所述克隆由鼠T細(xì)胞淋巴瘤系RMA所表達(dá)的TCR Vβ12基因(如下述文獻(xiàn)所述Van Hall等，Identification of a Novel Tumor-Specific CTLEpitope Presented by RMA，EL-4，and MBL-2 Lymphomas Reveals TheirCommon Origin.J.Immunol.，165869-877；2000)。將所得的PCR產(chǎn)物(圖X，參見最后一頁)克隆到pTRABacHuLCκHCγ1的Spe I/ApaI位點(diǎn)中，產(chǎn)生載體pTRABacHuLCκVβ-RMAHCγ1。如上所述在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)TCR Vβ-RMAHCγ1嵌合蛋白并將其純化。作為這類蛋白質(zhì)應(yīng)用的一個(gè)實(shí)例(圖9)，給C57/B16小鼠接種10,000RMAT細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，隨后在36小時(shí)后用一種組合物治療，所述組合物包含濃度為500μg/ml的RMA特異性Vβ-Ig嵌合蛋白和濃度為100,000IU/ml的細(xì)胞因子GM-CSF。每日給予這種疫苗1次，并且每日給予GM-CSF3次。在14天的間隔后，重復(fù)完全相同的治療方案。以這種方式注射的小鼠中的60％在腫瘤植入后40天仍存活，而超過90％的對(duì)照小鼠死于腫瘤攻擊。
RMA Vb PCR產(chǎn)物的序列如下(包括所述蜜蜂蜂毒肽信號(hào)序列)ACTAGTTTTT ATGGTCGTGT ACATTTCTTACATCTATGCG GACGCTGGAG TTACCCAGAC ACCCAGACATGAGGTGGCAG AGAAAGGACA AACAATAATC CTGAAGTGTGAGCCAGTTTC AGGCCACAAT GACCTTTTCT GGTACAGACA GACCAAGATACAGGGACTAG AGTTGCTGAG CTACTTCCGC AGCAAGTCTC TTATGGAAGATGGTGGGGCT TTCAAGGATC GATTCAAAGC TGAGATGCTA AATTCATCCTTCTCCACTCT GAAGATTCAA CCTACAGAAC CCAAGGACTC AGCTGTGTATCTGTGTGCCA GCAGTACCGG GACAGAAACG CTGTATTTTG GCTCAGGAACCAGACTGACT GTTCTCGAGG ATCTGAAGGG CCC(SEQ ID NO58).
現(xiàn)在已經(jīng)全面地描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，在不偏離本發(fā)明精神和范圍和無需過度實(shí)驗(yàn)的情況下，可以在等同參數(shù)、濃度和條件的寬范圍內(nèi)實(shí)施本發(fā)明。
盡管已經(jīng)在本發(fā)明的具體實(shí)施方案方面描述了本發(fā)明，但應(yīng)該理解，本發(fā)明能夠進(jìn)行進(jìn)一步的修改。這種應(yīng)用計(jì)劃包括一般而言按照本發(fā)明的原理并且包括在本說明書之外的、在本發(fā)明所屬領(lǐng)域已知或常規(guī)的實(shí)踐范圍內(nèi)的、適用于前文所述的在所附權(quán)利要求書范圍內(nèi)的基本特征的本發(fā)明的任何變化、應(yīng)用或修改。
序列表<110>法弗里爾公司(FAVRILLE，INC.)<120>用于改變T細(xì)胞介導(dǎo)病理的方法和組合物<130>032077.002.WO<140>PCT/US01/25203<141>2001-08-10<150>60/266,133<151>2001-02-01<150>60/224,722<151>2000-08-11<150>60/224,723<151>2000-08-11<160>58<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>22<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Leu Gly Pro Cys Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg1 5 10 15Leu Gln Leu Ser Leu Gly20<210>2<211>66<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>2atggtgggac cctgcatgct gctgctgctg ctgctgctag gcctgaggct acagctctcc 60ctgggc66<210>3<211>21<212>PRT<213>意大利蜜蜂(Apis mellifera)<400>3Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile1 5 10 15Ser Tyr Ile Tyr Ala20<210>4<211>63<212>DNA<213>意大利蜜蜂(Apis mellifera)<400>4atgaaattct tagtcaacgt tgcactagtt tttatggtcg tgtacatttc ttacatctat 60gcg 63<210>5<211>7125<212>DNA<213>苜蓿銀蚊夜蛾核型多角體病毒<220><223>表達(dá)載體<400>5gcagttcgtt gacgccttcc tccgtgtggc cgaacacgtc gagcgggtgg tcgatgacca 60gcggcgtgcc gcacgcgacg cacaagtatc tgtacaccga atgatcgtcg ggcgaaggca 120cgtcggcctc caagtggcaa 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gaaagaatgc 1020gtagaaggaa agaaaaatgt cgtcgacatg ctgaacaaca agattaatat gcctccgtgt 1080ataaaaaaaa tattgaacga tttgaaagaa aacaatgtac cgcgcggcgg tatgtacagg 1140aagaggttta tactaaactg ttacattgca aacgtggttt cgtgtgccaa gtgtgaaaac 1200cgatgtttaa tcaaggctct gacgcatttc tacaaccacg actccaagtg tgtgggtgaa 1260gtcatgcatc ttttaatcaa atcccaagat gtgtataaac caccaaactg ccaaaaaatg 1320aaaactgtcg acaagctctg tccgtttgct ggcaactgca agggtctcaa tcctatttgt 1380aattattgaa taataaaaca attataaatg ctaaatttgt tttttattaa cgatacaaac 1440caaacgcaac aagaacattt gtagtattat ctataattga aaacgcgtag ttataatcgc 1500tgaggtaata tttaaaatca ttttcaaatg attcacagtt aatttgcgac aatataattt 1560tattttcaca taaactagac gccttgtcgt cttcttcttc gtattccttc tctttttcat 1620ttttctcctc ataaaaatta acatagttat tatcgtatcc atatatgtat ctatcgtata 1680gagtaaattt tttgttgtca taaatatata tgtctttttt aatggggtgt atagtaccgc 1740tgcgcatagt ttttctgtaa tttacaacag tgctattttc tggtagttct tcggagtgtg 1800ttgctttaat tattaaattt atataatcaa tgaatttggg atcgtcggtt ttgtacaata 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taaatattcc ggattattca taccgtccca ccatcgggcg tgctagcgga 2760tccgagctcg agatctgcag ctggtaccat ggaattcgaa gcttgtcgtt ggatggaaag 2820gaaaagagtt ctacagggaa acttggaccc gcttcatgga agacagcttc cccattgtta 2880acgaccaaga agtgatggat gttttccttg ttgtcaacat gcgtcccact agacccaacc 2940gttgttacaa attcctggcc caacacgctc tgcgttgcga ccccgactat gtacctcatg 3000acgtgattag gatcgtcgag ccttcatggg tgggcagcaa caacgagtac cgcatcagcc 3060tggctaagaa gggcggcggc tgcccaataa tgaaccttca ctctgagtac accaactcgt 3120tcgaacagtt catcgatcgt gtcatctggg agaacttcta caagcccatc gtttacatcg 3180gtaccgactc tgctgaagag gaggaaattc tccttgaagt ttccctggtg ttcaaagtaa 3240aggagtttgc accagacgca cctctgttca ctggtccggc gtattaaaac acgatacatt 3300gttattagta catttattaa gcgctagatt ctgtgcgttg ttgatttaca gacaattgtt 3360gtacgtattt taataattca ttaaatttat aatctttagg gtggtatgtt agagcgaaaa 3420tcaaatgatt ttcagcgtct ttatatctga atttaaatat taaatcctca atagatttgt 3480aaaataggtt tcgattagtt tcaaacaagg gttgtttttc cgaaccgatg gctggactat 3540ctaatggatt ttcgctcaac gccacaaaac ttgccaaatc ttgtagcagc aatctagctt 3600tgtcgatatt cgtttgtgtt ttgttttgta ataaaggttc gacgtcgttc aaaatattat 3660gcgcttttgt atttctttca tcactgtcgt tagtgtacaa ttgactcgac gtaaacacgt 3720taaataaagc tagcttggac atatttaaca tcgggcgtgt tagctttatt aggccgatta 3780tcgtcgtcgt cccaaccctc gtcgttagaa gttgcttccg aagacgattt tgccatagcc 3840acacgacgcc tattaattgt gtcggctaac acgtccgcga tcaaatttgt agttgagctt 3900tttggaatta tttctgattg cgggcgtttt tgggcgggtt tcaatctaac tgtgcccgat 3960tttaattcag acaacacgtt agaaagcgat ggtgcaggcg gtggtaacat ttcagacggc 4020aaatctacta atggcggcgg tggtggagct gatgataaat ctaccatcgg tggaggcgca 4080ggcggggctg gcggcggagg cggaggcgga ggtggtggcg gtgatgcaga cggcggttta 4140ggctcaaatg tctctttagg caacacagtc ggcacctcaa ctattgtact ggtttcgggc 4200gccgtttttg gtttgaccgg tctgagacga gtgcgatttt tttcgtttct aatagcttcc 4260aacaattgtt gtctgtcgtc taaaggtgca gcgggttgag gttccgtcgg cattggtgga 4320gcgggcggca attcagacat cgatggtggt ggtggtggtg gaggcgctgg aatgttaggc 4380acgggagaag gtggtggcgg cggtgccgcc ggtataattt gttctggttt agtttgttcg 4440cgcacgattg tgggcaccgg cgcaggcgcc gctggctgca caacggaagg tcgtctgctt 4500cgaggcagcg cttggggtgg tggcaattca atattataat tggaatacaa atcgtaaaaa 4560tctgctataa gcattgtaat ttcgctatcg tttaccgtgc cgatatttaa caaccgctca 4620atgtaagcaa ttgtattgta aagagattgt ctcaagctcc gcacgccgat aacaagcctt 4680ttcattttta ctacagcatt gtagtggcga gacacttcgc tgtcgtcgac tcgagttcta 4740tagtgtcacc taaatcgtat gtgtatgata cataaggtta tgtattaatt gtagccgcgt 4800tctaacgaca atatgtccat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag 4860ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc 4920ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt 4980tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag 5040gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 5100cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 5160caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 5220ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca 5280gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 5340gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 5400atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg 5460caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 5520gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 5580accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 5640ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 5700gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca 5760acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 5820atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 5880ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 5940gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 6000gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 6060tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 6120taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 6180cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 6240gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 6300gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 6360agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 6420aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 6480agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 6540cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 6600accgaactga gatacctaca gcgtgagcat tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 6660aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 6720ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 6780cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 6840gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 6900tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 6960agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc 7020aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca ggttaacctg gcttatcgaa 7080attaatacga ctcactatag ggagaccggc agatcgatct gtcga 7125<210>6<211>8420<212>DNA<213>未知生物<220><223>未知生物的描述pTRABacHuLCHC1 DNA序列<400>6gcagttcgtt gacgccttcc tccgtgtggc cgaacacgtc gagcgggtgg tcgatgacca 60gcggcgtgcc gcacgcgacg cacaagtatc tgtacaccga atgatcgtcg ggcgaaggca 120cgtcggcctc caagtggcaa tattggcaaa ttcgaaaata tatacagttg ggttgtttgc 180gcatatctat cgtggcgttg ggcatgtacg tccgaacgtt gatttgcatg caagccgaaa 240ttaaatcatt gcgattagtg cgattaaaac gttgtacatc ctcgctttta atcatgccgt 300cgattaaatc gcgcaatcga gtcaagtgat caaagtgtgg aataatgttt tctttgtatt 360cccgagtcaa gcgcagcgcg tattttaaca aactagccat cttgtaagtt agtttcattt 420aatgcaactt tatccaataa tatattatgt atcgcacgtc aagaattaac aatgcgcccg 480ttgtcgcatc tcaacacgac tatgatagag atcaaataaa gcgcgaatta aatagcttgc 540gacgcaacgt gcacgatctg tgcacgcgtt ccggcacgag ctttgattgt aataagtttt 600tacgaagcga tgacatgacc cccgtagtga caacgatcac gcccaaaaga actgccgact 660acaaaattac cgagtatgtc ggtgacgtta aaactattaa gccatccaat cgaccgttag 720tcgaatcagg accgctggtg cgagaagccg cgaagtatgg cgaatgcatc gtataacgtg 780tggagtccgc tcattagagc gtcatgttta gacaagaaag ctacatattt aattgatccc 840gatgatttta ttgataaatt gaccctaact ccatacacgg tattctacaa tggcggggtt 900ttggtcaaaa tttccggact gcgattgtac atgctgttaa cggctccgcc cactattaat 960gaaattaaaa attccaattt taaaaaacgc agcaagagaa acatttgtat gaaagaatgc 1020gtagaaggaa agaaaaatgt cgtcgacatg ctgaacaaca agattaatat gcctccgtgt 1080ataaaaaaaa tattgaacga tttgaaagaa aacaatgtac cgcgcggcgg tatgtacagg 1140aagaggttta tactaaactg ttacattgca aacgtggttt cgtgtgccaa gtgtgaaaac 1200cgatgtttaa tcaaggctct gacgcatttc tacaaccacg actccaagtg tgtgggtgaa 1260gtcatgcatc ttttaatcaa atcccaagat gtgtataaac caccaaactg ccaaaaaatg 1320aaaactgtcg acaagctctg tccgtttgct ggcaactgca agggtctcaa tcctatttgt 1380aattattgaa taataaaaca attataaatg ctaaatttgt tttttattaa cgatacaaac 1440caaacgcaac aagaacattt gtagtattat ctataattga aaacgcgtag 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1.一種改變患者的T細(xì)胞介導(dǎo)病理的方法，所述方法包括給予一種包含嵌合蛋白的組合物；所述嵌合蛋白包含TCR Vβ區(qū)或Vα區(qū)的至少一部分和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分；其中所述Vβ區(qū)或Vα區(qū)與來自具有所述T細(xì)胞介導(dǎo)病理的所述患者T細(xì)胞的特定TCR相關(guān)；所述組合物的所述給予改變所述患者的所述T細(xì)胞介導(dǎo)病理。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物還包含第二種嵌合蛋白，所述第二種嵌合蛋白包含TCR Vα區(qū)或Vβ區(qū)的至少一部分和第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)包含人IgGγ1恒定區(qū)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述嵌合蛋白的所述TCR Vα區(qū)或Vβ區(qū)是Vβ。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述嵌合蛋白的所述TCR Vα區(qū)或Vβ區(qū)是Vα。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述嵌合蛋白在所述Vα區(qū)或Vβ區(qū)和免疫球蛋白恒定區(qū)的所述部分之間還包含一個(gè)接頭區(qū)；其中所述接頭區(qū)是所述TCR Cβ區(qū)或Cα區(qū)的一部分，但不是完整的Cβ區(qū)或Cα區(qū)，或者所述接頭區(qū)是一個(gè)合成接頭區(qū)。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所述第二種嵌合蛋白在所述Vα區(qū)或Vβ區(qū)和免疫球蛋白恒定區(qū)的所述部分之間還包含一個(gè)第二接頭區(qū)；其中所述接頭區(qū)是所述TCR Cβ區(qū)或Cα區(qū)的一部分，但不是完整的Cβ區(qū)或Cα區(qū)，或者所述接頭區(qū)是一個(gè)合成接頭區(qū)。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述第一種嵌合蛋白的所述TCRVα區(qū)或Vβ區(qū)是Vβ，而所述第二種嵌合蛋白的所述TCR Vα區(qū)或Vβ區(qū)是Vα。
9.權(quán)利要求2的方法，其中所述第二種免疫球蛋白恒定區(qū)包含人κ或λ恒定區(qū)。
10.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述TCR Vβ區(qū)是完整的Vβ區(qū)。
11.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述Vβ區(qū)包括完整的Vβ區(qū)，而所述Cβ的部分包含來自TCRβ鏈恒定區(qū)(Cβ)的前9個(gè)氨基酸。
12.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述TCR Vα區(qū)是完整的Vα區(qū)。
13.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述Vα區(qū)包括完整的Vα區(qū)，而所述接頭區(qū)包含來自TCRα鏈恒定區(qū)(Cα)的前9個(gè)氨基酸。
14.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述第一種或第二種免疫球蛋白的恒定區(qū)選自人IgGγ1恒定區(qū)、人IgGγ2恒定區(qū)、人IgGγ3恒定區(qū)、人IgGγ4恒定區(qū)、人IgA1恒定區(qū)、人IgA2恒定區(qū)、人IgM恒定區(qū)、人IgD恒定區(qū)、人IgE恒定區(qū)、人κ鏈恒定區(qū)和人λ鏈恒定區(qū)。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述嵌合蛋白通過包括下述步驟的方法生產(chǎn)從具有所述T細(xì)胞介導(dǎo)病理的所述患者的T細(xì)胞中分離出編碼所述TCR Vβ區(qū)或Vα區(qū)的基因；將編碼所述TCR Vβ區(qū)或Vα區(qū)的所述基因、接頭區(qū)和編碼所述免疫球蛋白恒定區(qū)的基因插入到表達(dá)載體中，以允許所述第一種嵌合蛋白表達(dá)；通過將所述表達(dá)載體導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞系中，生產(chǎn)所述嵌合蛋白；并且分離所述嵌合蛋白。
16.權(quán)利要求15的方法，所述方法還包括下述步驟將編碼所述TCR Vβ區(qū)或Vα區(qū)的基因、接頭區(qū)和編碼第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分的基因插入到所述表達(dá)載體中，以允許所述第二種嵌合蛋白表達(dá)。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中所述第一種或第二種嵌合蛋白的所述接頭區(qū)是所述TCR Cβ區(qū)或Cα區(qū)的一部分，但不是完整的Cβ區(qū)或Cα區(qū)，或者所述接頭區(qū)是一個(gè)合成接頭區(qū)。
18.權(quán)利要求15或16的方法，所述方法還包括將所述嵌合蛋白與載體蛋白綴合的步驟。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述載體蛋白是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。
20.權(quán)利要求1的方法，其中還將所述組合物與細(xì)胞因子或趨化因子一起共同給予。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述細(xì)胞因子是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述趨化因子是單核細(xì)胞趨化蛋白3(MCR3)。
23.權(quán)利要求15的方法，其中所述表達(dá)載體是一種桿狀病毒表達(dá)載體。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述桿狀病毒表達(dá)載體包含蜜蜂蜂毒肽分泌信號(hào)序列和人胎盤堿性磷酸酶分泌信號(hào)序列。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述桿狀病毒表達(dá)載體還包含桿狀病毒AcNPV p10啟動(dòng)子和AcNPV多角體蛋白啟動(dòng)子，其中所述p10啟動(dòng)子控制蜜蜂蜂毒肽，并且所述多角體蛋白啟動(dòng)子控制人胎盤堿性磷酸酶。
26.權(quán)利要求25的方法，其中編碼所述TCR Vβ區(qū)的所述基因和編碼所述第一種免疫球蛋白恒定區(qū)的所述基因在所述桿狀病毒表達(dá)載體中受所述p10啟動(dòng)子控制，編碼所述TCR Vα區(qū)的所述基因和編碼所述第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的所述基因在所述桿狀病毒表達(dá)載體中受多角體蛋白啟動(dòng)子控制。
27.權(quán)利要求25的方法，其中編碼所述TCR Vβ區(qū)或Vα區(qū)的所述基因和編碼所述免疫球蛋白恒定區(qū)的所述基因，在所述桿狀病毒表達(dá)載體中或者受所述p10啟動(dòng)子的控制，或者受所述多角體蛋白啟動(dòng)子控制。
28.權(quán)利要求15的方法，其中編碼所述第一種免疫球蛋白恒定區(qū)的所述基因包含人IgGγ1基因。
29.權(quán)利要求16的方法，其中所述第二種免疫球蛋白恒定區(qū)包含人κ或λ恒定區(qū)基因。
30.權(quán)利要求15或16的方法，其中編碼所述免疫球蛋白恒定區(qū)的所述基因選自人IgGγ1恒定區(qū)、人IgGγ2恒定區(qū)、人IgGγ3恒定區(qū)、人IgGγ4恒定區(qū)、人IgA1恒定區(qū)、人IgA2恒定區(qū)、人IgM恒定區(qū)、人IgD恒定區(qū)、IgE恒定區(qū)、人κ恒定區(qū)和人λ恒定區(qū)。
31.權(quán)利要求15的方法，其中所述第一種嵌合蛋白是TCR Vβ-Cβ-IgGγ1、TCR Vα-Cα-κ或TCR Vα-λ。
32.權(quán)利要求16的方法，其中所述第一種和第二種嵌合蛋白是TCR Vβ-Cβ-IgGγ1和TCR Vα-Cα-κ、或者TCR Vβ-Cβ-IgGγ1和TCR Vα-Cα-λ。
33.權(quán)利要求13的方法，其中所述昆蟲細(xì)胞系是粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)(Hi-5)或草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(sf9)細(xì)胞系。
34.權(quán)利要求15或16的方法，其中通過ELISA分析所述嵌合蛋白的表達(dá)。
35.權(quán)利要求15或16的方法，其中所述嵌合蛋白用選自A蛋白、G蛋白、L蛋白和能夠與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的其它蛋白的蛋白來分離。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述能夠結(jié)合免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的其它蛋白是一種抗免疫球蛋白抗體。
37.權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)病理是一種T細(xì)胞淋巴瘤。
38.權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)病理是選自以下的一種自身免疫病多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、炎性腸病、重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和甲狀腺炎。
39.一種用于改變患者的T細(xì)胞介導(dǎo)病理的組合物，所述組合物包含嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含TCR Vβ區(qū)或Vα區(qū)的至少一部分和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分，其中所述Vβ區(qū)或Vα區(qū)與來自具有所述T細(xì)胞介導(dǎo)病理的所述患者的T細(xì)胞克隆的特定TCR相關(guān)。
40.權(quán)利要求39的組合物，其中所述嵌合蛋白在所述Vα區(qū)或Vβ區(qū)和免疫球蛋白恒定區(qū)的所述部分之間還包含一個(gè)接頭區(qū)；其中所述接頭區(qū)是所述TCR Cβ區(qū)或Cα區(qū)的一部分，但不是完整的Cβ區(qū)或Cα區(qū)，或者所述接頭區(qū)是一個(gè)合成接頭區(qū)。
41.一種權(quán)利要求39的組合物，所述組合物還包含第二種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含TCR Vβ區(qū)和Vα區(qū)的至少一部分和第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分，其中所述Vβ區(qū)和Vα區(qū)與來自具有所述T細(xì)胞介導(dǎo)病理的所述患者的T細(xì)胞克隆的特定TCR相關(guān)。
42.權(quán)利要求40的組合物，其中所述嵌合蛋白在所述Vα區(qū)或Vβ區(qū)和免疫球蛋白恒定區(qū)的所述部分之間還包含一個(gè)接頭區(qū)；其中所述接頭區(qū)是所述TCR Cβ區(qū)或Cα區(qū)的一部分，但不是完整的Cβ區(qū)或Cα區(qū)，或者所述接頭區(qū)是一個(gè)合成接頭區(qū)。
43.權(quán)利要求39或40的組合物，其中所述嵌合蛋白按照權(quán)利要求13或14生產(chǎn)。
44.權(quán)利要求39或40的組合物，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)選自人IgGγ1恒定區(qū)、人IgGγ2恒定區(qū)、人IgGγ3恒定區(qū)、人IgGγ4恒定區(qū)、人IgA1恒定區(qū)、人IgA2恒定區(qū)、人IgM恒定區(qū)、人IgD恒定區(qū)、人IgE恒定區(qū)、人κ鏈恒定區(qū)和人λ鏈恒定區(qū)。
45.權(quán)利要求39的組合物，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)包含與所述TCR的所述Vβ區(qū)在操作上連接的IgGγ1恒定區(qū)。
46.權(quán)利要求39的組合物，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)包含與所述TCR的所述Vα區(qū)在操作上連接的κ或λ恒定區(qū)。
47.權(quán)利要求40的組合物，其中所述兩種嵌合蛋白是Vβ-IgGγ1和Vα-κ、或者Vβ-IgGγ1和Vα-λ。
48.權(quán)利要求39或40的組合物，所述組合物還包含一種載體蛋白。
49.權(quán)利要求48的組合物，其中所述載體蛋白是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。
50.權(quán)利要求39或40的組合物，還將所述組合物與細(xì)胞因子或趨化因子一起共同給予。
51.權(quán)利要求50的組合物，其中所述細(xì)胞因子是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF。
52.權(quán)利要求50的組合物，其中所述趨化因子是單核細(xì)胞趨化蛋白3(MCP3)。
53.權(quán)利要求39或40的組合物，其中所述組合物包括免疫治療藥。
54.權(quán)利要求39的組合物，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)病理是一種T細(xì)胞淋巴瘤。
55.權(quán)利要求39的組合物，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)病理是選自以下的一種自身免疫病多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、炎性腸病、重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和甲狀腺炎。
56.權(quán)利要求39的組合物，所述組合物還通過注射、吸入、口服或經(jīng)皮給藥來給予。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于改變患者的T細(xì)胞介導(dǎo)病理的方法。該方法包括給予包含至少一種和/或兩種嵌合蛋白質(zhì)的組合物。每種嵌合蛋白質(zhì)包含得自具有T細(xì)胞介導(dǎo)病理的患者的特定T細(xì)胞的TCR的或者V
文檔編號(hào)A61P35/00GK1468124SQ01817067
公開日2004年1月14日 申請(qǐng)日期2001年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月11日
發(fā)明者D·P·戈德, R·J·肖佩斯, D P 戈德, 肖佩斯 申請(qǐng)人:法弗里爾公司