專利名稱：用于主動或過繼性細胞療法的類漿細胞樹突細胞系的制作方法
用于主動或過繼性細胞療法的類漿細胞樹突細胞系艦本發(fā)明涉及在半同種異體的背景下利用類漿細胞樹突細胞系(pDC)誘導和擴增細胞毒素效應物的方法。本發(fā)明還涉及PDC系在獲得用于治療和/或預防傳染病或癌癥的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及包含PDC的疫苗以及治療癌癥或傳染病的方法。樹突細胞樹突細胞在免疫反應中是關鍵的參與者它們負責吸收抗原并處理所述抗原，目的是將其遞呈給T淋巴細胞。存在不同類型的樹突細胞，可以通過它們的個體發(fā)育和它們的功能性能來區(qū)分它們來自表達CDllc、CD13和CD33分子的前體的髓樣樹突細胞(mDC)， 以及類漿細胞樹突細胞(PDC)，其特征在于IL3受體(CD123)的表達非常強以及能夠在IL3 和CD40L的作用下或病毒存在的情況下成熟。pDC在1997年由G. Grouard等從扁桃體中特定鑒定(Grouard G等，J Exp Med.，1997 ;185 :1101-1111)；它們也在血液中(0，Doherty U.等，Immunology, 1994 ； 82 :487-493 ；Robinson SP.等，Eur J Immunol. 1999 ;29 :2769-2778)、淋巴結(jié)中(Cella M.等，Nat Med.，1999 ；5 :919-923)以及胸腺中(Res PC.等，Blood, 1999 ；94 :2647-2657 ； Bendriss-Vermare N.等，J Clin Invest.，2001 ；107 :835-844)進行描述。這些細胞特征在于其類漿細胞型形態(tài)學和其表型。pDC表達CD4、HLA-DR和CD45RA分子并且缺乏髓樣標記CDllc和CD13 (Cella M.等，Nat Med.，1999 ;5 :919-923)或缺乏細胞系特異性標記諸如CD3、CD14和CD19， 盡管有時觀察到 CD2、CD5 或 CD7 的表達(Cella M.等，Nat Med.，1999 ；5 :919-923 ；Res PC.等，Blood.，1999 ;94 :2647-2657)。最近，鑒定由pDC特異性表達的凝集素BDCA2已經(jīng)成為可能；BDCA4發(fā)現(xiàn)于pDC上但是在單核細胞衍生的DC上也存在(Dzionek A.等， J Immunol.，2000 ； 165 :6037-6046)。一種支持這些細胞屬于淋巴系的想法的理由在于這樣的事實，即它們表達編碼 preTalpha 鏈(Res PC.等，Blood.，1999 ；94 =2647-2657)、 類-λ 14. 1 和 SpiB(Bendriss-Vermare N.等，J Clin Invest. ,2001 ； 107 :835-844)的 mRNA。這些細胞非常強地表達IL-3受體而表達GM-CSF受體是弱的(Cella M.等，Nat Med.，1999 ；5 :919-923 ；Rissoan MC.等，Science.，1999 ；283 :1183-1186)，并且這兩種細胞因子促進 pDC 的存活(Grouard G.等，J Exp Med. ,1997 ；185 :1101-1111 ；Kohrgruber N.等，JImmunol.，1999 ； 163 :3250-3259 ;Robinson SP.等，Eur J Immunol. , 1999 ；29 2769-2778)，否則pDC在體外會非常迅速地死亡。共刺激分子⑶80和⑶86不存在或弱表達(Grouard G.等，J Exp Med.，1997 ；185 :1101-1111)，并且在未成熟階段，這些細胞不能激活 T 淋巴細胞(Kohrgruber N.等，J Immunol.，1999 ； 163 :3250-3259)。另一方面，在 IL-3、⑶40L或病毒存在的情況下，pDC成熟，強表達抗原遞呈輔助分子(⑶40、⑶80、⑶86和 HLA-DR)并且然后變得能夠激活同種異體T細胞的增殖(Kohrgruber N.等，J Immunol.， 1999 ；163 :3250-3259 ；Grabbe S.等，Immunol Today.，2000 ；21 :431-433 ；Kadowaki N.等， J Exp Med. ,2000 ； 192 =219-226) 0取決于負責其成熟的刺激物(IL3或病毒)，pDC將 will polarize the response of the naive T lymphocytes that they activate,moreorless strictly, toward a Thl or Th2 profile(Rissoan MC.等，Science. ,1999 ；283 1183-1186 ；Cella Μ.等，Nat. Immunol.，2000 ；1 :305-310 ；Kadowaki N.等，J Exp Med.， 2000 ；192 :219-226)。pDC 也被描述用于誘導調(diào)節(jié) CD 和 CD4T 反應(Gilliet& Liu, Hum. Immunol. 63,2002 ；Wei 等，Cancer Res. 65(12) ,2005 ；Gilliet & Liu, J. Exp. Med. ,195(6), 2002)。腫瘤或傳染病環(huán)境中的樹突細胞在腫瘤情況中，pDC經(jīng)常表現(xiàn)出未成熟的狀態(tài)和致耐受性功能(Perrot等，The J. of I mm. , 2007 ； Hartmann 等，Cancer Res. ,63,2003 ； Treilleux 等，Clinical Cancer Res.，10，2004)。應當注意，通過pDC的乳腺癌浸潤與不利的患者存活預測相關，這表示在所述癌癥進展中的作用(Treilleux等，2004)，或者在腫瘤微環(huán)境中在其功能抑制中的作用。在病毒感染情況中，由于pDC分泌干擾素-α以及由于其遞呈病毒抗原以便激活細胞毒素⑶8+Τ淋巴細胞的能力，pDC在引發(fā)抗病毒反應中具有重要作用(Hoefel等，2008， Immunity 27 :481-492 ；Di Pucchio,2008, Nature Immunol, adv online publication)。主動免疫治療和同種異型免疫治療很多臨床試驗展示了自體髓樣樹突細胞(mDC)刺激抗腫瘤免疫反應的能力 (Thurner 等，I"9，J.Exp· Med. 190(11) :1669-78 ；Palucka 等，2OO5, J. Immunother. 28 (2) 158-68)。在大多數(shù)的這些試驗中，mDC產(chǎn)生自取自患者的單核細胞，并在細胞因子存在下培養(yǎng)幾天，而且這有時包括細胞成熟的另外步驟。這些mDC的生產(chǎn)因此必須針對每位患者個體進行，并且直到此刻利用自體mDC進行的臨時試驗不提供充足的臨床功效以改進總體的患者存活(Banchereau 等，2005，Nat. Rev. Immunol. 5(4) :296-306)。在同種異型的環(huán)境中細胞疫苗的免疫原性可以被改進；因此在免疫治療方案中利用半同種異型mDC或利用辦同種異型腫瘤系已經(jīng)得到證明(Hus等，2005，Leukemia 19: 1621-1627 ;Holtl 等，2005，Cancer Immunol Immunother. 54 :663-670)。mDC 可以從 MUTZ3 系獲得，其是得自白血病的CD34+髓樣細胞系。mDC從該細胞系的獲取是復雜的(用GM-CSF、 IL-4和TNF- α刺激，然后通過添加TNF- α、IL-6、IL-1 β和PGE2成熟)。這些MUTZ-3-衍生的mDC被描述為能夠體外誘導腫瘤抗原特異性細胞毒T淋巴細胞(Santegoets等，2006 Cancer Immunol. Immunother. 55 1480-1490, US 2004/(^65998)。然而，反應的誘導水平非常低，僅有0. 4%抗原特異性細胞毒T細胞從T淋巴細胞中獲得。此外，利用CD80共刺激因子分子轉(zhuǎn)染的KS乳腺癌系也能夠誘導腫瘤抗原特異性 T 細胞(Guckel，2005，Cancer Immunol. Immunother. ,54 :129-140)并且已經(jīng)用在 I/II 期臨床試驗中。然而，所誘導的反應就由該系(Her-2/Neu)所表達的抗原被限制，并且未使得誘導針對其他腫瘤或病毒抗原的反應成為可能。本發(fā)明提供對目前免疫治療策略問題的解決方案，所述問題涉及在執(zhí)行所述方案以及其工業(yè)化方面的困難，涉及缺乏治療效果，以及涉及所述策略針對高度定向的病理狀態(tài)被開發(fā)并且因此具有非常嚴格的應用領域這樣的事實。具體而言，本發(fā)明的主題是在半同種異型的環(huán)境中利用pDC系誘導和擴增特異性效應物的方法，所述系生產(chǎn)藥物特別是疫苗的用途，以及本發(fā)明的主題還是預防和/或治療癌癥和/或傳染病的方法。
本發(fā)明的說明本發(fā)明涉及體外誘導和擴增特異性效應物的方法，其包括通過用至少一種抗原孵化PDC系獲得脈沖類漿細胞樹突細胞(pDC)，所述脈沖pDC隨后被輻射并且與外周血單核細胞接觸(PBMC)并培養(yǎng)。該脈沖且輻射的pDC和PBMC共享至少一個主要組織相容性復合物 (CMH)等位基因。特異性效應物樹木的更大的擴增可以通過至少一個另外的回合獲得，即使得自上述培養(yǎng)的細胞與脈沖且輻射的PDC接觸，之后進行培養(yǎng)步驟。本發(fā)明也涉及誘導和擴增特異性效應物的方法，其包括通過用至少一種抗原孵化 PDC系獲得脈沖類漿細胞樹突細胞(pDC)，所述脈沖pDC隨后被輻射，所述脈沖且輻射的pDC 被注射到生物體中。該PDC與其所注射進入的生物體的PBMC共享至少一個CMH等位基因。 所述脈沖且輻射的PDC的注射可以被重復。在本發(fā)明的上下文下，術語“生物體”最特定地定義了人或人源化小鼠。術語“細胞系”適用于體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞。初級哺乳動物細胞在培養(yǎng)物中不繁殖，或者在有限次數(shù)的分裂之后在培養(yǎng)物中停止繁殖。根據(jù)本發(fā)明的細胞系能夠不確定地繁殖，哺乳動物細胞的原代或繼代培養(yǎng)是不能的。根據(jù)本發(fā)明的人類漿細胞樹突細胞 (pDC)系的這些性質(zhì)使得通過這些細胞的體外繁殖或增殖而有利地獲得大量的細胞成為可能。在本發(fā)明的一個實施方式中，pDC系得自pDC白血病細胞。歐洲專利EP 1 572 989 Bl描述了從這些白血病的細胞獲得和培養(yǎng)pDC細胞系的方法。該專利最特定地描述了人 PDC系，稱為GEN2. 2，根據(jù)布達佩斯條約第6. 1條，其于2002年12月M日以保藏號CNCM 1-2938 保藏在 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [French National Collection of Microorganism Cultures], Institut Pasteur,25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris)，并且以及描述了人類漿細胞樹突細胞系，稱為GEN3，根據(jù)布達佩斯條約第6. 1條，其于2003年10約16日以保藏號CNCM 1-3110保藏在CNCM。這些系可以在本發(fā)明的完全優(yōu)選的實施方式中使用。術語“脈沖”表示pDC細胞(系)用抗原孵化。在本發(fā)明的上下文中，術語“抗原”定義了由免疫系統(tǒng)的細胞識別并且能夠觸發(fā)細胞介導的免疫反應的分子。根據(jù)本發(fā)明的抗原可以是天然或或修飾的，腫瘤的或微生物的(特別是細菌或病毒)抗原、蛋白質(zhì)、糖肽、糖蛋白或磷酸化蛋白質(zhì)。抗原可以被引入pDC系培養(yǎng)基中，或者可以通過用允許表達所述抗原的載體轉(zhuǎn)染的pDC系表達。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，抗原是可以從腫瘤或病毒起源的抗原蛋白質(zhì)獲得的肽。在本發(fā)明的一個特定實施方式中，可以從腫瘤抗原獲得的肽可以選自包括在下述序列中的肽抗原 CEA、NY-BRl、Her-2/Neu、PSA、RAGE-I、PRAME、TRP-2、MAGE-A1、MAGE-A2、 MAGE-A4、MAGE-A9、MAGE-AlO, MAGE-C2、MUC-U p53、hTERT、存活素、黑素-A/MART-1 (SEQ ID No. 1)、GPlOO (SEQ ID No. 2)、酪氨酸酶(SEQ ID No. 3)、MAGE-A3 (SEQ ID No. 4)或 NY-ES01 (SEQ IDNo. 5)，其是修飾或未修飾的。
在本發(fā)明的另一實施方式中，可以從病毒抗原獲得的肽可以選自包括在下述序列中的肽HIV病毒的抗原env、nef、gp41、gpl20、gag序列(SEQ ID No. 6)或pol序列 (SEQ ID No. 7)，HBV病毒的HBc或HBs，HCV病毒的核、NS3或NS5，流感病毒的Flu Ml (SEQ IDNo. 8)，CMV 病毒的 CMVpp65 (SEQ ID No. 9)，EBV 病毒的 BMLFl (SEQ ID No. 10)、LMP2 (SEQ ID No. 11)、EBNA-2(SEQ ID No. 12)或 EBNA_3a(SEQ ID No. 13)，其是修飾或未修飾的。在本發(fā)明的上下文中，術語“特異性效應物”適用于能夠識別特異性抗原或來自該抗原的產(chǎn)物的免疫細胞。在本發(fā)明的一個特定實施方式中，特異性效應物是細胞毒性效應物，并且最特定地，這些細胞毒性效應物是對所使用的抗原特異性的T淋巴細胞，特別是CD8+。本發(fā)明的主題也是pDC系生產(chǎn)用于預防和/或治療傳染病或癌癥的藥物的應用。 因此，本發(fā)明的主題也是包含脈沖且輻射PDC系的藥物或非藥物組合物，包含細胞培養(yǎng)物的組合物，所述培養(yǎng)物包含脈沖且輻射PDC系以及還包含PBMC，所述pDC和PBMC共享至少一個主要組織相容性復合物(CMH)等位基因，但也是包含特異性效應物的組合物，所述特異性效應物能夠通過如上所述的誘導或擴增特異性效應物的方法獲得。所述系可以以試劑盒的形式提供，其也包含PBMC，所述pDC和PBMC共享至少一個 CMH等位基因。在一個特定的形式中，試劑盒還可以包含至少一種抗原。本發(fā)明的主題也是疫苗，其特征在于其包含脈沖且輻射的pDC系作為激活免疫系統(tǒng)的制劑，對于所述疫苗而言在疫苗接種方法的上下文中被施用是可能的。根據(jù)另一方面，本發(fā)明的主題是預防和/或治療癌癥和/或傳染病的方法，其特征在于輻射且脈沖的PDC系被注射入生物體中，所述生物體的PBMC和pDC共享至少一個主要組織相容性復合物(CMH)等位基因。根據(jù)又一方面，本發(fā)明的主題還是預防和/或治療癌癥和/或傳染病的方法，其特征在于通過用至少一種抗原孵化PDC系而獲得的特異性效應物——脈沖pDC隨后被輻射并與PBMC接觸并孵化，被注射，所述pDC和PBMC共享至少一個主要組織相容性復合物(CMH)
等位基因。在傳染病中，可以提到媒介是微生物諸如細菌、真菌、酵母或可選地病毒的疾病， 并且更特定地是由于流感病毒(例如flu)、HIV病毒(例如AIDS)、CMV (細胞巨化病毒)、 EBV(EB病毒，例如單核細胞增多癥)、HBV和HCV(例如肝炎)的感染，以及由于突然出現(xiàn)的病毒引起的疾病。在可以預防性或治療性治療的癌癥中，可以提到黑素瘤、乳腺癌、肺癌或另外前列腺癌以及病毒誘導的癌癥。本發(fā)明也根據(jù)其一些方面在下面的實施例中詳細描述。


圖1 特異性初級和記憶⑶8T反應的體外誘導在第⑶0天和第7天得自健康供體的PBMC培養(yǎng)的特異性CD8+T細胞百分比的流式細胞計量術分析，其中PDC系GEN2. 2用肽(分別地，病毒肽CMV pp65和腫瘤肽MelA)利用四聚體脈沖。所指示的百分比對應于CD8+T細胞中四聚體+細胞的百分比。圖2 反復刺激對擴增特異性⑶8T細胞的功效
2a)在第0天和第40天，得自健康供體的PBMC培養(yǎng)的CD8+T細胞流式細胞計量術分析，其PDC系GEN2. 2在IL-2的存在下每周刺激后，用CMVpp65或MelA肽脈沖。所指示的百分比對應于CD8+T細胞中四聚體+細胞的百分比。2b)四聚體+⑶8+T細胞的百分比的改變，以及2c)每周刺激帶有用MelA在IL_2 (FluMl四聚物作為對照)存在的情況下脈沖的 PDC的PBMC后，MelA-特異性⑶8T細胞的絕對數(shù)的擴增(X IO6)。箭號指示執(zhí)行的重復刺激(restim)。圖3 多特異性⑶8T反應的同時誘導在第七天(3a)或第21天，得自健康供體的PBMC培養(yǎng)CD8+T特異性細胞流式細胞計量術分析，其PDC系GEN2. 2用得自病毒抗原(得自EBV病毒BMLF1和LMP2，圖3a)或腫瘤抗原(黑素瘤MelA、GP100、TYR、MAGE-3，圖北)的不同肽的混合物脈沖。所指示的百分比對應于⑶8+T細胞中四聚體+細胞的百分比。圖4 生成特異性⑶8T細胞在體外以HLA-和抗原-限制方式起作用4a)通過用脈沖和輻射的GEN2. 2pDC系培養(yǎng)PBMC (HLA-A2供體)生成的MelA-特異性⑶8T細胞的細胞毒素活性的抗原-限制和HLA-A2-限制，關于黑素瘤系Me275和A375 系是HLA-A2，theMe275和COLO系表達MelA抗原。4b) IFN γ的分泌物和⑶107的表面表達，其通過脈沖和輻射的GEN2. 2pDC系在重復刺激(左面板和中間面板)或無重復刺激(右面板；_)后在用FluMl肽或控制肽(LMP2) 沖擊的T2細胞上生成FluMl-特異性CD8T細胞；效應物/靶(E/T)比率=10/1。圖5 將根據(jù)本發(fā)明的脈沖和輻射pDC系與外源或內(nèi)源骨髓DCs相比較，關于誘導高親和性且高活性的特異性CD8T細胞5a)在第20天，得自健康供體的PBMC培養(yǎng)的特異性⑶8+T細胞百分比的流式細胞計量術分析，所述PBMC分別地具有pDC系GEN2. 2 (GEN)或用MelA肽脈沖的同種異型或自體髓樣樹突狀細胞，在細胞因子存在的情況下每周刺激后。所指示的百分比對應于CD8+T 細胞中四聚體+細胞的百分比。5b)在PBMC培養(yǎng)的第20天，MelA-特異性⑶8+T細胞絕對數(shù)的擴增。其中所述分別地具有PDC系GEN2. 2 (GEN)、或用MelA肽脈沖的同種異型或自體髓樣樹突狀細胞，在㈠ 或IL-2或IL-15細胞因子存在的情況下每周刺激后。5c)分別具有pDC系(GEN2. 2)、或同種異型(mDC alio)或自體髓樣樹突狀細胞 (mDC auto)生成的特效CD8T細胞的親和性的對照，由標貼后四聚物分解的時間函數(shù)來測
Mo5d)分別具有pDC系GEN2. 2)、或同種異型(mDC alio)或自體髓樣樹突狀細胞(mDC auto)生成的特效CD8T細胞的活性的對照，由其用肽的漸減濃縮物沖擊的T2細胞細胞毒素活性測量。C和d的結(jié)果作為獲得的大信號百分比表達(分別為四聚物最大標記的和最大細胞毒性)。圖6 根據(jù)本發(fā)明的由脈沖pDC系生成的特異性CD8T細胞在體內(nèi)起作用6a)在使用源自HLA-A2+供體的PBMC通過沖擊且輻射GEN2. 2pDC系擴增的 CMVpp65-特異性或FluMl-特異性⑶8T細胞的內(nèi)部過繼轉(zhuǎn)移后，NOD-SCID b2m^小鼠中人系腫瘤HLA-A2+和CMVpp65+的生長的進行。圖中展示代表性試驗。箭頭指示特異性T細胞的注射。6b)腫瘤移植20天后的腫瘤尺寸對照。每個點代表一只人化小鼠。6c)在所述T細胞過繼移植之后，根據(jù)本發(fā)明由脈沖且輻射pDC系生成的特異性 ⑶8T細胞的抗原限制和HLA限制的治療功效。在使用源自HLA-A2+供體的PBMC通過沖擊且輻射GEN2. 2pDC系擴增的CMVpp65_特異性或FluMl-特異性CD8T細胞的內(nèi)部過繼轉(zhuǎn)移后，移植在NOD-SCID b2m-/"免疫缺陷小鼠中的表達或不表達CMVpp65+抗原的HLA-A2+或 HLA-A2-人系腫瘤生長的進展。圖7 在人源化小鼠模型中接種根據(jù)本發(fā)明的脈沖和輻射pDC系的反應7a)用人HLA-A2 PBMC腹膜內(nèi)再造NOD-SCID Mm+免疫缺陷鼠并且用根據(jù)本發(fā)明的脈沖和輻射PDC以同樣的腹膜內(nèi)的方式接種一周。圖表顯示四聚物+CD8+T細胞在接種位點(免疫位點)，在循環(huán)中，分別在第一次接種后的第9天(D9)和第30天(D30)在動物的淋巴器官(脾臟)用經(jīng)CMVpp65或臨認肽脈沖的？0(系接種。所示百分比對應于⑶8+T 細胞中的四聚物+細胞的百分比。7b)在第0天之前的特異性⑶8+T細胞，接種后，用經(jīng)CMVpp65或MelA肽脈沖的和輻射的PDC系接種(1個疫苗和3個加強劑量)在人源化小鼠的各個器官中。每個點表示一個人源化小鼠。圖8 在人源化小鼠模型中接種根據(jù)本發(fā)明的脈沖和輻射pDC系后產(chǎn)生的應CD8T 細胞的治療效果8a)人源化小鼠用GEN2. 2系接種，用CMVpp65肽(GEN_pp65)脈沖后輻照，從該人源化小鼠的腹腔灌洗(左板)和從脾臟(右板)純化的CD8T細胞的體內(nèi)細胞毒性活性，相對于用CMVpp65肽(GEN-pp60或無關的肽(上板)脈沖的T2細胞，和相對于表達或不表達 CMVpp65 抗原的 HLA-A2+ 或 HLA-A2-系(下板)。GRE 是 HLA-A2+，COL 是 HLA-A2-。8b)植入人源化NOD-SCID免疫缺陷小鼠的HLA_A2+MelA+黑素瘤系的腫瘤生長進程，該免疫缺陷小鼠用以MelA或FluMl肽脈沖和輻照的pDC系GEN2. 2 (GEN)免疫接種。8c)在接種的人源化小鼠的腫瘤位點水平顯示出存在Mel A-特異性CD8T細胞的存在的腫瘤懸浮液的細胞流量計數(shù)分析。圖9 根據(jù)本發(fā)明的脈沖和輻照的pDC系能夠誘導和擴增CD8T細胞，其是特異性的并對黑素瘤患者有作用9a) PMBC培養(yǎng)物(來自黑素瘤的HLA-A2+患者)在DO和在D15-20的CD8+T細胞的細胞流量計數(shù)分析，以來自MelA、GP100、MAGE3和酪氨酸酶(TYR)抗原脈沖并輻照的pDC 系。顯示的百分比對應于⑶8+T細胞中的四聚物+細胞的百分比。9b)通過根據(jù)本發(fā)明脈沖的pDC系所產(chǎn)生的MelA-特異性⑶8+T細胞的細胞毒性活性，使用來自黑素瘤HLA-A2+患者的PBMC，相對于用MelA肽或?qū)φ针拿}沖的T2細胞。圖10 特異性的初始和記憶⑶8T細胞的誘導的體外反應來自健康供體的PBMC培養(yǎng)物在第0天的不同時間的特異性CD8+T細胞的百分比， 用肽(分別是病毒性肽Flu Ml和腫瘤肽MelA)脈沖的pdc系GEN2. 2，使用四聚物進行細胞流量計數(shù)分析。所示百分比對應于CD8+T細胞中的四聚物+細胞的百分比。每個點表示的結(jié)果獲得自一個供體(對于Flu η = 20，對于MelA η = 18)。平均數(shù)用水平杠表示，所示百分比是達到的最大值。圖11 輻射對于pDC系的激活效果和所述激活的pDC系誘導特異性T細胞反應的效果lla)HLA-A2分子的表達水平以及已被輻照或未輻照的刺激分子在Pdc系的表面的細胞流量計數(shù)分析，隨后培養(yǎng)M小時，與在相同條件下處理的骨髓樣DCs相比較。lib)在存在TLR7 (滅活流感病毒Flu)或TLR9 (CpGA)配體的條件下，HLA-A2和 CD40分子在Pdc系表面的表達水平的細胞流量計數(shù)分析，所述細胞系已被輻照或未被輻照，并隨后培養(yǎng)M小時。lie)在PBMC培養(yǎng)物(源自健康供體)7天后，特異性的⑶8+T細胞的百分比的比較性細胞流量計數(shù)分析，用已被輻照或未被輻照的PDC系GEN2. 2，隨后用Flu肽脈沖。所示百分比對應于CD8+T細胞中的四聚物+細胞的百分比。圖12 使用來自I-IV期黑素瘤患者的PBMC和TIL的pdc系在體外擴增特異性抗癌抗菌素CD8+T細胞的效果源自黑素瘤(I至IV期)患者的PBMC(n = 12)和TIL (n = 6)用Pdc系培養(yǎng)，所述Pdc系用腫瘤肽(a-b)或四種腫瘤肽(MelA、GP100、TYR和/或MAGE-3) (c-d)的混合物進行脈沖，隨后輻照。在存在IL2的條件下，每周再刺激所述培養(yǎng)物。a-d)用脈沖的和輻照的pDC系的PBMC (a, b)或TIL (c, d)的培養(yǎng)期間(20天)的四聚物+CD+T細胞的百分比的細胞流量計數(shù)分析。用PBMC(a)或TIL(c)進行的代表性試驗被示出(D20分析)，用四聚物+CD8+百分比的初始測量(DO)，和第7、14和20天后的培養(yǎng)的測量。每個點表示一個患者，水平橫杠代表平均值，所示百分比是達到的最大值。e-h)使用PBMC和TIL的用脈沖的和輻照的Pdc系誘導的抗癌抗菌素T淋巴細胞的特異性和功能性的分析。e)由T淋巴細胞分泌的IFNy分泌物的測量，該分泌物產(chǎn)自以 MelA或GP100脈沖的pDC系而得的PBMC，由流式細胞計數(shù)法，在用無關的肽或?qū)φ针拿}沖后的T2細胞再激發(fā)(用PBMC(n = 6)和TIL(n = 2)進行8的代表性試驗)。所示百分比對應于四聚物+⑶8+T細胞產(chǎn)生的IFNy的百分比。f-h)測量產(chǎn)生的T淋巴細胞的細胞毒性(51Cr釋放)。由PBMC或TIL培養(yǎng)物在 15至20天后純化的T淋巴細胞被用作對比脈沖的T2細胞系、同種異體和自體的黑素瘤細胞及自體CD45+的非腫瘤細胞的細胞毒性試驗的效應物。f)用肽MelA脈沖的pDC系激活 PBMC (患者#9)，用四種肽類Me 1A、GP100、TYR和MAGE-3的混合物脈沖的pDC系激活TIL (患者#11)。這些實驗是代表性的12個用PBMC進行，6組用TIL進行。g)自體腫瘤細胞的溶菌百分比與自體⑶45+非腫瘤細胞相比較，比較在最初和刺激之后進行。這兩組實驗所分析的六個TIL樣本的代表。h)在用四種腫瘤肽混合物脈沖的pDC細胞系刺激之前和刺激之后，通過TIL的所示靶的溶菌效率的比較。所示出的溶菌百分比的平均+/_標準誤差測量為60 1的比率(n = 6)。
實施例實施例Ι-pDC系GEN2. 2使得利用來自健康個體的細胞體外誘導對目的抗原特異性的初級和記憶CD8T反應成為可能借助來自HLA-A2+健康志愿受試者的外周血單核細胞(PBMC)在半同種異型的環(huán)境中GEN2. 2細胞誘導抗原特異性⑶8T反應的能力通過培養(yǎng)GEN2. 2系的細胞(下文 GEN2. 2細胞)進行測試，用目的肽脈沖并輻射。為了用目的肽脈沖GEN2. 2細胞，所述細胞在無FCS的完全RPMI培養(yǎng)基(補充有 ImM丙酮酸鈉、20 μ g/ml慶大霉素、10 μ M非必需氨基酸的RPMI 1640 Glutamax公司)被洗滌三次，并以IXlO6Ail再懸浮。細胞被補充lOOng/ml的β 2-微球蛋白并在37°C孵化10 分鐘(孵化器)。然后以10 μ M的比例加入目的肽。然后將細胞懸液在規(guī)則攪拌下在37°C 孵化3小時(孵化器)。然后洗滌細胞，在30Gy下輻射，并在補充有10%胎牛血清的完全 RPMI培養(yǎng)基中以2X 105/ml再懸浮。通過菲可利用來自健康供體的血袋純化PBMC。將它們以2X 106/ml再懸浮于補充有10%胎牛血清的完全RPMI培養(yǎng)基中。脈沖且輻射的GEN2. 2 細胞與 HLA-A2+ 半同種異型 PBMC 在 24-孔板(2X105GEN2. 2+2 X 106PBMC/2ml)中在 37°C 共培養(yǎng)7天。在實驗開始(DO)以及培養(yǎng)7天之后(D7)測定CD8 T細胞的表型。通過用四聚體標記分析⑶8 T細胞的特異性(圖1)。PBMC與用得自病毒或腫瘤抗原的肽脈沖且輻射的pDC系GEN2. 2的共培養(yǎng)使得在僅7天的培養(yǎng)物中高效地誘導和擴增對目的肽特異性的CD8 T細胞成為可能。利用該策略， 我們展示了針對腫瘤抗原MelA、GP100、MAGE-3、酪氨酸酶和NY-ESOl定向的初級應答的誘導，以及針對病毒抗原FluMl、CMVpp65、raV BMLFl和^V LMP2定向的記憶應答的誘導。實施例2-被脈沖和輻射的pDC系使用于感興趣的抗原的CD8 T細胞的大量擴增成為可能。為了優(yōu)化特異性T細胞的誘導，在IL2存在的情況下，將該細胞用脈沖且輻射的 GEN2.2細胞有規(guī)律地刺激。在此，如上述方法培養(yǎng)所述特異性T細胞。培養(yǎng)7天之后，將細胞恢復、沖洗、計數(shù)和以2X 106/ml懸浮于補充有10%胎牛血清的完全RPMI培養(yǎng)基中。將它們用加入200U/ml的IL2的以2X 105/ml比例的脈沖且輻射的GEN2. 2細胞放回到24-孔板中培養(yǎng)。該過程每七天重復。在每次重復刺激之前評估特定使用肽的CD8 T細胞的百分比和絕對數(shù)。如圖2所示，在細胞因子存在的情況下，用脈沖且輻射的GEN2. 2系重復刺激，使特定使用肽的，具有非常高效力的CD8 T細胞的大量擴增成為可能。這可以導致特定感興趣的肽(獲得多于97%的四聚物CD8 T細胞)的CD8 T細胞的獨有擴增及其伴隨擴增(以 20000000因子絕對數(shù)的特效⑶8 T細胞增加)，二者均用于病毒抗原和腫瘤抗原。實施例3-pDC系GEN2. 2使得對多特異性的初級和記憶⑶8 T反應的同時誘導成為可能為了評估誘導多目的T反應的可能性，同時用源自病毒抗原(BMLF1，LMP2)或源自腫瘤抗原(黑素A、GP100、酪氨酸酶、MAGE-3)的幾個肽脈沖GEN2. 2系細胞，然后輻射。它們隨后用HLA-A2+半同種異體PBMC培養(yǎng)，根據(jù)上面描述的條款。在這些PBMC中，最初的在 CD8+T淋巴細胞中的四聚物細胞(BMLFl、LMP2、MelA、GP100、TYR或MAGE-3)的百分比嚴格地少于0. 05%。在七天(對EBV、BMLF和LMP2肽，圖3a)或在21天用兩次重復刺激的培養(yǎng) (對MelA、GP100、TYR和MAGE-3，圖北)，通過四聚物標志分析具體到使用的每種肽的⑶8 T 細胞的擴增。用各種肽的混合物脈沖的pDC系的使用，使得在病毒模式和腫瘤模式中，同時誘導具體到使用的每種肽的CD8 T細胞成為可能。
實施例4-由pDC系GEN2. 2生成的特定T細胞在生物體外展示了非常優(yōu)良的功能性使用三種方法評估由pDC系GEN2. 2生成的⑶8 T細胞細胞毒試驗、干擾素Y分泌物和具體的重復刺激后⑶107的薄膜表達。由GEN2. 2系生成特異性T細胞的細胞因子的活性通過51Cr釋放試驗評估。在此， 在帶有已經(jīng)用MelA肽脈沖和輻射的GEN2. 2細胞的半同種異體PBMC的刺激后，將該細胞恢復并將⑶8+T淋巴細胞純化(EasyS?、? T負選擇法)和用51Cr-標記的靶細胞以不同的比率(E T比率范圍60 1到7.5 1)放在一起4個小時。隨后分析伏在表面的51Cr。 抗-MelA T細胞，例如，能夠有效地溶解HLA-A2+腫瘤細胞，其表達黑素-A(Me27Q但在不表達MelA(A37Q或不是HLA-A2 (C0L0829)(圖4a)的腫瘤細胞上不具有細胞毒素活性。特異性T細胞的效應物能力也根據(jù)特異性再刺激之后其分泌IFNy和表達表面 ⑶107的能力來評估?；诖耍诤幸呀?jīng)用fluMl肽脈沖和輻射的GEN2. 2細胞的半同種異型PBMC激發(fā)后，回收和計數(shù)細胞并進行標上四聚體標記(在環(huán)境溫度下30分鐘)。洗滌后，將細胞以IX 106/200 μ 1懸浮于含有10% FCS的RPMI培養(yǎng)基中。任選地添加已經(jīng)用目的肽(fluMl)或?qū)φ针?LMP2)脈沖的T2細胞(效應物細胞再刺激細胞比=10 1)。 對于IFN γ分泌，將細胞在37°C再刺激5小時30分鐘，在布雷菲地菌素A (GolgiPlug，1 μ 1/ ml)存在，進行最后的3小時。在表面抗原(⑶3、⑶8)標記之后，然后進行IFNy的胞內(nèi)標記(圖4b)。為了測量⑶107表達，在再刺激的整個持續(xù)期間添加抗-⑶107a和抗-⑶107b 抗體(20ml/106個細胞)，并且將細胞在37°C孵化證，在莫能菌素(GolgiSTOP，0. 67 μ 1/ml) 存在下進行最后4小時。然后進行表面抗原(CD3、CD8)的標記(圖4b)。在四聚體CD8+T細胞上分析IFN γ和⑶107標記。因此，由GEN系產(chǎn)生的抗-FluMl⑶8+T細胞在用FluMl-脈沖T細胞再刺激之后能夠分泌IFN γ并表達⑶107，而在用利用另一種肽(T2 LMP2)脈沖的 T2細胞再刺激之后或者再刺激不存在的情況下則不能(圖4b)。由pDC系GEN2. 2產(chǎn)生的抗原-特異性⑶8 T細胞因此能夠以HLA-限制性方式殺死表達這種抗原的靶細胞。在正確的HLA情況下，在用呈遞它們具有特異性的肽的細胞再刺激之后，它們特異性地分泌IFNy并表達⑶107。實施例5-相比髓樣樹突狀細胞(mDC)，pDC系GEN2. 2使得以更大功效誘導和擴增對目的抗原具有特異性的CD8 T細胞成為可能并且在所述T細胞上賦予更大的功能能力我們比較了 pDC系GEN2.2與同種異型或自體髓樣樹突狀細胞(mDC)誘導特異性 CD8 T細胞的能力并評價了它們的功能性質(zhì)。為了產(chǎn)生mDC，通過負排序(使用EasySep 試劑盒，按照生產(chǎn)商的建議)從PBMC 純化單核細胞，并以0. 5 X IO6個細胞/ml在含有10% FCS的RPMI培養(yǎng)基中在GM-CSF (500U/ ml)和IL4 (10ng/ml)存在下培養(yǎng)6天。然后如實施例1所述用目的肽脈沖mDC和GEN2. 2細胞，輻射，并用為半-同種異型或自體(對于mDC而言)的HLA-A2+PBMC培養(yǎng)。在IL2(200U/ ml)或IL15 (5ng/ml)存在下每7天進行再刺激。在用利用MelA脈沖的GEN2. 2細胞、同種異型mDC或自體mDC刺激PBMC之后，在培養(yǎng)的第7天和第20天，分別評價四聚體CD8 T細胞的百分比(圖5a)和絕對數(shù)(圖恥)。在基本條件下或者存在細胞因子的情況下，與同種異型或自體mDC相比，GEN2. 2系使得能夠以大得多的效力誘導抗-MelA T細胞。在各種條件下所產(chǎn)生的CD8 T細胞的親和性通過四聚體在37°C的解離進行測量?；诖耍M行特異性⑶8 T細胞的四聚體標記G°C，30分鐘)。洗滌之后，在37°C孵化細胞。在各種孵化時間之后(從0到16h)，回收并固定細胞進行流式細胞計量術分子。將四聚體的解離評價為初始四聚體標記百分比(圖5c)。根據(jù)⑶8 T細胞在用減小的肽濃度(從1到0. 0001 μ Μ) 脈沖的Τ2細胞上的細胞毒性活性測量CD8 T細胞的親和力。細胞毒性表達為所觀察到的最大細胞毒性百分比(圖5d)。與由同種異型或自體mDC產(chǎn)生的抗-MelA T細胞相比，由 GEN2. 2系產(chǎn)生的抗-MelA T細胞表現(xiàn)出更高的親和性和更高的親和力。pDC系GEN2. 2對誘導特異性T細胞比mDC有效得多(在相同的條件下獲得的四聚體+細胞百分比更高)，并且特別是對擴增特異性T細胞比mDC有效得多(利用pDC的擴增相比mDC大十倍)。另外，GEN2. 2系在特異性T細胞上賦予更大的功能能力，因為與利用 mDC產(chǎn)生的細胞相比它們獲得更大的親和性和更大的親和力。實施例6-由pDC系產(chǎn)生的特異性T細胞通過過繼轉(zhuǎn)移在體內(nèi)展示出非常優(yōu)良的抗腫瘤活性根據(jù)由pDC系GEN2. 2體外產(chǎn)生的特異性T細胞在抑制移植在免疫缺陷小鼠中的人腫瘤發(fā)展的能力，體內(nèi)評價它們的功能功效。通過將1至2. 5X IO6個腫瘤細胞皮下注射入側(cè)腹中在N0D-SCIDb2m+小鼠中建立腫瘤。平行地，如上所述，利用GEN2. 2系體外產(chǎn)生對目的抗原具有特異性的⑶8 T細胞。 在通過負排序(按照生產(chǎn)商的建議使用EasySep ^^劑盒)選擇⑶8+T細胞之后，然后將 1至5X IO6個⑶8+T細胞通過4-5天間隔的4個注射進行腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)移。然后測量腫瘤生長的進展。圖6a顯示在抗-CMVpp65或抗-FluMl⑶8+T系細胞過繼轉(zhuǎn)移之后GRE pp65腫瘤 (HLA-A2+CMVpp65+)生長的進展。圖6b顯示在用抗_CMVpp65或抗_FluMlCD8+T細胞處理之后，在其移植之后20天腫瘤大小的比較(每個點代表一只小鼠)。通過GEN系體外產(chǎn)生的抗-CMVpp65 T細胞因此使得抑制HLA_A2+CMVpp65+腫瘤的發(fā)展成為可能。所觀察到的注射細胞的治療功效是HLA-限制和抗原限制的，原因在于這種治療沒有使得抑制非HLA-A2的腫瘤的發(fā)展成為可能(COL pp65)，或者沒有使得抑制不表達其所定向的抗原的腫瘤的發(fā)展成為可能(GRE IE)(圖6c)。實施例7-pDC系能過通過接種體內(nèi)誘導特異性的初級或記憶性的T細胞反應為了評估pDC系GEN2. 2誘導特異性的T細胞體內(nèi)反應的能力，建立人源化小鼠的模型(用人的免疫系統(tǒng)重建的免疫缺陷小鼠)。對于此，50X 106 PBMC腹膜內(nèi)被注射入NOD-SCID Mm-/-小鼠。第二天，用感興趣的肽脈沖并輻照的5X IO6 GEN2.2細胞進行腹膜內(nèi)注射?？蛇x地，接種每星期重復一次。在接種后的不同時間(CMV疫苗的9天，MelA疫苗的30天以后)，在免疫位點(灌洗)評估特異性CD8+T細胞的誘導，在循環(huán)系統(tǒng)中和輔助淋巴腺器官(脾臟，淋巴結(jié))中。對于此，血樣從被犧牲的小鼠采樣。用15ml的RPMI培養(yǎng)基腹膜內(nèi)灌洗使得能夠從免疫位點恢復細胞。 然后去除淋巴腺器官，并且用2. 5mg/ml膠原酶的消化以后制備細胞懸浮液。特異性⑶8 T 細胞的四聚物標記被執(zhí)行。圖7a顯示的實施例得自每個案子的一只小鼠，圖7b顯示在PBMC 中的四聚物+CD8 T細胞的初始水平，和所得到的對CMV或MelA接種的所有反應。因此，用根據(jù)本發(fā)明脈沖的PDC系的接種能夠非常有效地誘導特異性CD8 T體內(nèi)反應，所述反應在免疫位點也在循環(huán)系統(tǒng)和輔助淋巴器官中。我們展示了對用病毒抗原FluMl、EBV BMLFU EBV LMP2和CMVpp65接種的體內(nèi)反應和用腫瘤抗原MelA、GP100、MAGE 3和酪氨酸酶接種的反應。產(chǎn)品的注射(脈沖的，被輻照的pDC系GEN2.2)在體內(nèi)使得能夠在接受者中直接誘導特異性T反應，即是病毒抗原也是腫瘤抗原。與已知的參考水平相比，得到的反應水平是高的。這展示使用產(chǎn)品作為細胞疫苗的可行性。這種效力為這個產(chǎn)品作為細胞疫苗的治療有效性的臨床概念提供證明。實施例8-在用pDC系接種體內(nèi)產(chǎn)生的特異性T細胞顯示了非常好的功能性我們評估了在接種以后誘導的體內(nèi)反應的治療效力，首先，通過特異性CD8 T細胞的前體內(nèi)細胞毒素活性來評估，第二，通過對腫瘤體內(nèi)擴增的作用來評估用50 X IO6PBMC腹膜內(nèi)注射重建NON-SCID b2m^小鼠，之后用CMV衍生肽 (CMVpp65)脈沖并輻照的5X 106GEN2. 2細胞進行接種。在接種以后的九天，從取自免疫位點和取自器官的樣品純化CD8+T細胞從從免疫站點拿取的樣品被純化，并且從淋巴腺器官 (EasySep試劑盒進行負排序，根據(jù)制造者的推薦規(guī)范使用)，并且對比用CMVpp65肽或?qū)φ针?flu Ml)脈沖T2細胞，評估其細胞毒素的活性(圖8a)，和在HLA-A2+腫瘤細胞(GRE PP65)或HLA A2腫瘤細胞(COL pp65)上，表達對應的抗原或不表達對應的抗原(GRE IE) (圖8a)。如圖8a所顯示，在接種后體內(nèi)產(chǎn)生的特異性⑶8 T細胞顯示T2細胞在表達特異性抗原的HLA-A2+腫瘤細胞上的細胞毒性活性。為了評估用根據(jù)本發(fā)明的脈沖PDC系在發(fā)展的腫瘤上接種的治療效果，用 50X IO6PBMC細胞腹膜內(nèi)注射重建NOD-SCID b2m^小鼠，所述小鼠之后用從MelA或(Flu Ml)獲得的肽脈沖的GEN2.2系的5X106細胞進行接種，每周一次。在第一接種后的五到十天，在肋腹皮下植入10X106HLA-A2+MelA+腫瘤細胞(Me275)。觀察腫瘤細胞的生長進程 (圖8b)。在將所述腫瘤細胞植入后的1個月，通過流式細胞計數(shù)法分析腫瘤懸浮液在腫瘤位點研究MelA-特異性CD8 T細胞的存在(圖8c)。因此，以根據(jù)本發(fā)明的脈沖pDC系的接種能夠抑制HLA-A2+腫瘤的發(fā)展，所述HLA-A2+腫瘤表達用于脈沖GEN細胞的相關抗原。 CD8 T細胞對通過接種產(chǎn)生的相關肽是特異性的，該CD8 T細胞能夠遷移到抗原的表達位點和腫瘤細胞溶解位點。該實施例顯示出通過接種體內(nèi)誘導的特異性⑶8 T細胞由接種顯示出HLA受限和抗原受限的體外細胞毒素功效，并且所述特異性CD8T細胞能夠遷移到特異性抗原的表達位點，并能夠抑制腫瘤發(fā)展。實施例9-pDC系GEN2. 2使得誘導和擴增⑶8T細胞成為可能，所述⑶8T細胞對于相關抗原是特異性和功能性的，使用來自癌癥患者的細胞為了分析根據(jù)發(fā)明的脈沖pDC系是否能夠擴增癌癥患者的特異性T細胞反應，我們培養(yǎng)從IV期黑素瘤的HLA-A2患者獲得的PBMC，所述培養(yǎng)使用以來自MelA、GP100、MAGE 3或酪氨酸酶的肽，與實施例2中使用相同的方法。在用脈沖的GEN細胞刺激前和3次刺激之后通過流式細胞計數(shù)法分析特異性CD8+T細胞(圖9a)。所產(chǎn)生的CD8 T細胞的功能性隨后通過測量T2細胞上的細胞毒性來評估，所述T2細胞用相關肽或?qū)φ针?FluMl)根據(jù)實施例4中相同方法進行脈沖(圖9b)。因此，使用來自癌癥患者的細胞，pDC系GEN2. 2能夠誘導對各種腫瘤抗原特異性的CD8 T細胞的大量擴增。產(chǎn)生的T細胞的細胞毒素的活性證實他們的抗癌抗菌素的功能性。
實施例10-pDC系GEN2. 2能夠在所有的測試供體上誘導針對相關抗原特異性的最初和記憶的⑶8 T反應在半同種異體條件下，測試GEN2. 2細胞誘導抗原特異性CD8+T反應能力，在存在來自HLA-A*0201+健康志愿者供體的PBMC的條件下，該測試通過培養(yǎng)脈沖且輻照的pDC系進行。使用黑素A肽，記憶反應的誘導被評估；使用流行性感冒模板的flu Ml肽來評估記憶反應的誘導。為了用感興趣的肽脈沖GEN2. 2細胞，在不帶有FCS的完全RPMI培養(yǎng)基(RPMI 1640 Glutamax公司，用ImM丙酮酸鈉，20 μ g/ml慶大霉素、100 μ M非必須氨基酸補充)中洗滌所述細胞3次，并且以IXlO6Ail重懸。細胞用lOOng/ml的β 2-微球蛋白補充，并在 37 0C (孵化器)中孵化10分鐘。感興趣的肽隨后以10μΜ(Πιι Ml)或IyM(MelA)的比例增加。細胞懸浮液隨后在37°C (孵化器)下孵化3小時，伴隨規(guī)則攪拌。隨后洗滌細胞， 30Gy輻照，以2X105/ml在補充有10%的胎牛血清的完全RPMI培養(yǎng)基中再懸。使用聚蔗糖純化來自健康供體的血液袋的PBMC。在以10%的胎牛血清補充的完全RPMI培養(yǎng)基中以 2XlOVml濃度將它們重懸。在37°C下，在M孔板中用HLAA2+半同種異體的PBMC中培養(yǎng)脈沖和輻照的GEN2. 2細胞(2X105GEN2. 2+2 X IO6 PBMC/2ml)達7到20天。在與Mel A模型中進行培養(yǎng)物的每周再刺激，添加IL 2(200U/ml)。在實驗開始時(DO)和在培養(yǎng)7天后 (D7)對CD8 T細胞的表型評估用于測量抗FluMl的反應，及在7、14和20天后評估用于測量抗MelA反應。⑶8 T細胞的特異性通過四聚物標記被分析(圖10)。培養(yǎng)7天后，流感病毒抗原特異性的四聚物+T淋巴細胞的百分比平均是11% (0. 到49% )(由不同供體PBMC制備的20培養(yǎng)物)。培養(yǎng)20天后，直接針對MelA的抗癌抗菌素T淋巴細胞的百分比平均是22% 到60%)(由不同供體PBMC制備的18培養(yǎng)物)?？?Flu和抗MelA四聚物+T淋巴細胞的各自最初的百分比是平均0. 23%和0. 02%。在本例中，我們證實使用這個方案，在初始和記憶反應中，100%供體(HLA A*0201)放大抗原特異性T淋巴細胞是可能的。實施例11-pDC系的輻照誘導成熟pDC系的脈沖和輻照細胞誘導HLA_A*0201特異性T淋巴細胞的擴增。與髓樣樹突細胞比較，我們評估了輻照對PDC成熟的影響。由單核細胞準備的髓樣樹突細胞(MoDCs)通過負排序(使用EasyS印⑧試劑盒， 根據(jù)制造者的推薦規(guī)范)從PBMC純化，在存在GM-CSF(500U/ml)和IL4(10ng/ml)的條件下，在包含10% FCS的RPMI培養(yǎng)基中以，0. 5X106cells/ml培養(yǎng)6天。GEN2. 2系的細胞和髓樣樹突細胞(二個不同供體)在包含10% FCS的RPMI培養(yǎng)基被輻照(30格雷) 小時，然后進行表型。⑶40、⑶80、⑶86和HLA-A2分子的表示水平由流式細胞計數(shù)法檢測(圖Ila)。輻照誘導了這四種分子特異性地在pDC中增加，而沒有在MoDC中增加。pDC的輻照效果與強pDC成熟誘導物效果的比較，所述誘導物即流感病毒(Flu， TLR7配體)和CpG 2336 (TLR9配體)。GEN2. 2線的細胞被輻射(30格雷)或未被輻射，并且在存在或缺乏滅活流感病毒或CpG 2336的條件下培養(yǎng)M小時。細胞然后表型，HLA-A2 表達和CD40表達由流式細胞計數(shù)法測量。輻射誘導GEN2. 2系統(tǒng)的細胞的成熟，所述最大程度的成熟在存在TLR7或TLR9配體時被觀察到(圖lib)。
為了評估輻射GEN2. 2細胞導致的成熟對T反應誘導的影響，GEN2. 2系的細胞用 Flu肽脈沖，可選地隨后進行輻射。根據(jù)以上所述的方案，用HLA-A2+半同種異體PBMC培養(yǎng)所述細胞。對Flu肽特異性的CD8 T細胞的擴增，通過在第7天進行四聚物標記來進行分析(圖11c)。未經(jīng)輻射的pDC不能誘導特異性T淋巴細胞的增殖。因此輻射是所述方法的
基本元素。實施例12 脈動和輻射的pDC系能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤抗原-特異性CD8T細胞的大量擴增，該抗原-特異性⑶8 T細胞來自黑色素瘤患者的PBMC和TIL在半同種異體條件下，GEN2. 2細胞誘導來自黑素瘤患者的T淋巴細胞的腫瘤抗原特異性⑶8 T反應的能力通過培養(yǎng)GEN2. 2 (下文稱為GEN2. 2細胞)系細胞進行測試，所述 GEN2. 2細胞已經(jīng)用感興趣的肽或感興趣的肽的四種混合物脈沖，并輻射，使用來自黑素瘤 HLA-A2+患者的外周血單核細胞(PBMC)或腫瘤過濾T淋巴細胞(TIL)。使用聚蔗糖凈化來自黑素瘤個體的血管(n = 12)的PBMC。對黑素A、GP100、酪氨酸酶和MAGE3抗原特異性的四聚物+CD8+T細胞的百分比進行最初的測量，所述百分比平均在0. 02%和0. 03%之間。從以機械方式撕裂的腫瘤活組織切片純化腫瘤細胞和TIL，然后將其用酶法(膠原酶+脫氧核糖核酸酶)消化。這些細胞懸浮液中包含的腫瘤細胞利用它們與塑料附著的特性而將它們與TIL分離。這些腫瘤細胞在包含10% FCS的RPMI培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并在凍結(jié)之前擴增，用在某些實驗中作為自體同源的腫瘤細胞源。對黑素A、GP100、酪氨酸酶和 MAGE3抗原特異性的四聚物+CD8+T細胞的百分比最初在TIL中測量，所述百分比的平均值分別為 0. 17%,0. 2%,0. 05%和 0. 3%oGEN2. 2系的細胞使來自患者的PBMC和TIL的腫瘤抗原特異性T淋巴細胞擴增的能力被評價。如上所述，用感興趣的肽(每種肽濃度ΙΟμΜ)或所研究的四種腫瘤抗原衍生的肽混合物(每種肽濃度2. 5 μ Μ)對GEN2. 2細胞進行脈沖。簡而言之，細胞懸浮液與所述一種或若干種肽在37°C下孵化3小時，隨后洗滌細胞，在30格雷條件下輻射，并在補充10%胎牛血清的完全RPMI培養(yǎng)基中以2X 105/ml進行重懸。PBMC或TIL在補充10%胎牛血清的完全RPMI培養(yǎng)基中以2X106/ml進行重懸。 在37°C下，在M孔板中將HLA-A2+半同種異體淋巴細胞與脈沖和輻照的GEN2. 2細胞一同培養(yǎng)(2X10tEN2. 2+2\106卩8厘(或1117&111)7天。添加IL 2 QOOU/ml)，相同條件下，每隔七天進行培養(yǎng)物再刺激。在培養(yǎng)7、14和20天(D7、D14，D21)后對⑶8 T細胞的表型進行評估。通過四聚物標記，對使用PBMC(圖1 和b)和使用TIL的⑶8 T細胞的特異性進行分析。PBMC與pDC細胞系GEN2. 2的共培養(yǎng)能夠在僅有7天的培養(yǎng)物中以非常好的效果誘導和擴增針對感興趣肽特異性的CD8 T細胞，所述pDC細胞系GEN2. 2細胞已經(jīng)被源自腫瘤抗原的肽脈沖和輻射。我們證明直接針對MelA、GP100、MAGE 3或酪氨酸酶的腫瘤抗原的反應是能夠使用這樣的方法的，所述反應來自黑素瘤患者的樣本，不考慮該患者的疾病階段。來自患者的PBMC針對至少兩種所研究的四種抗原之外的抗原發(fā)生應答，TIL針對這些抗原中的至少三種應發(fā)生答。二種方法被用于評價由脈沖的pDC細胞系GEN2. 2細胞產(chǎn)生的⑶8 T細胞的功能性細胞毒性試驗和特異性再刺激之后的IFNY分泌物。為了評估再刺激之后的IFNY分泌物，回收培養(yǎng)后擴增的細胞并計數(shù)，并進行四聚物標記(室溫下30分鐘)。洗滌后，細胞以1 X 106/200 μ 1懸浮在包含10% FCS的RPMI 培養(yǎng)基中。添加用感興趣肽(MelA或GP100)或?qū)φ针?流感Flu)脈沖的T2細胞(效應物細胞再刺激細胞比率=10 1)。37°C下細胞被再刺激5小時，后的3個小時在存在布雷菲德菌素A(GolgiPlug，濃度1 μ 1/ml)的條件下進行。在標記表面抗原(⑶3、⑶8)后，進行細胞內(nèi)標記IFN γ (圖12e)。在四聚物+⑶8+T細胞上進行對IFNY標記的分析。因此， 通過GEN細胞系產(chǎn)生的抗MelA⑶8+T細胞能夠在用經(jīng)MelA脈沖的T2細胞再刺激之后特異性地分泌IFN γ，而不能在用經(jīng)其它肽(T2Flu)脈沖的T2細胞再刺激之后特異性地分泌 IFN γ，而GP100特異性T細胞能夠在經(jīng)GP100脈沖的T2細胞表面上分泌IFN γ，而不能在經(jīng)過Flu脈沖的Τ2細胞表面上分泌IFN γ (圖12b)。通過51Cr釋放試驗評估GEN2. 2系產(chǎn)生的特異性T細胞的細胞毒性的活性。為此， 用經(jīng)MelA肽脈沖和輻射的GEN2. 2細胞對來自黑素瘤患者的半同種異體PBMC刺激之后，細胞被回收，且⑶8+T淋巴細胞被純化(通過負極選擇的fesykp⑶8 T排序)，并與51Cr標記的靶細胞放置在一起4小時(E T比例范圍是60 1到7.5 1)。隨后檢驗上清液層中的51Cr。例如，抗MelA T細胞能夠有效溶解表達黑素-A的HLA-A2+腫瘤細胞(Me275 和Mel89)，但對于不表達MelA(A37Q或不是HLA A2 (C0L0829)的腫瘤細胞沒有細胞毒性的活性(圖12f)。用CD8+T細胞進行相似實驗，所述CD8+T細胞來自用經(jīng)所研究的四種腫瘤肽的混合物脈沖的GEN2. 2系刺激的TIL培養(yǎng)物。圖12f的實施例(TIL患者#11)表示，在 HLA-A2環(huán)境下，所產(chǎn)生的含有對MelA、PlOO和MAGE3特異性的四聚物+細胞(圖12c)的淋巴細胞使表達這些抗原中的至少一種抗原的靶細胞溶解。由經(jīng)所研究的四種腫瘤肽的混合物脈沖的GEN2. 2系產(chǎn)生的特異性T細胞的細胞毒性還針對患者的自體同源的腫瘤細胞和自體同源的非腫瘤細胞(純化CD45+白細胞)進行測定。圖12g示出針對兩個患者的兩個實施例，TIL最初的細胞毒性不是針對自體同源的腫瘤細胞，TIL在用經(jīng)四種肽混合物脈沖后的GEN細胞刺激之后得到了摧毀自體同源腫瘤細胞的能力。自體同源的非腫瘤細胞部分未被溶解。使用來自五個患者的樣本能夠再現(xiàn)這些結(jié)果(圖12h)。因此，通過來自患者PBMC和TIL的pDC細胞系GEN2. 2產(chǎn)生的腫瘤抗原特異性⑶8 T細胞能夠以HLA受限方式殺死表達該抗原的靶細胞和自體同源的腫瘤細胞，但不會殺死自體同源的非腫瘤細胞。在正確的HLA環(huán)境下，以細胞表達特異性的肽的方式刺激之后，所述腫瘤抗原特異性⑶8 T細胞特異性地分泌IFN γ。
權利要求
1.一種體外誘導和擴增特異性效應物的方法，其包含如下步驟a)通過孵化具有至少一種抗原的類漿細胞樹突細胞(PDC)系獲得脈沖的類漿細胞樹突細胞；b)輻射步驟a)中所獲細胞；c)將步驟b)中所獲的經(jīng)過脈沖和輻射的類漿細胞樹突細胞與外周血單核細胞(PBMC) 相接觸，培養(yǎng)所述外周血單核細胞和經(jīng)過脈沖和輻射的類漿細胞樹突細胞，此二者共享至少一個主要組織相容性復合物(CMH)等位基因。
2.如權利要求1所述的誘導和擴增特異性效應物的方法，其包含至少一個再刺激步驟，該步驟包括d)將步驟c)中獲得的細胞與步驟b)中獲得的經(jīng)脈沖和輻射的類漿細胞樹突細胞系再次接觸，并培養(yǎng)。
3.一種用于誘導和擴增特異性效應物的方法，其包含下述步驟a)通過孵化具有至少一種抗原的類漿細胞樹突細胞系獲得脈沖的類漿細胞樹突細胞；b)輻射步驟a)中所獲細胞；c)將脈沖和輻射的類漿細胞樹突細胞系注射到到有機體中，所述類漿細胞樹突細胞與其所注射的有機體的外周血單核細胞共享至少一個主要組織相容性復合物等位基因。
4.如權利要求3所述的誘導和擴增特異性效應物的方法，其中步驟b)所得的脈沖、輻射的類漿細胞樹突細胞系的注射至少重復一次。
5.如上述權利要求中任一項所述的誘導和擴增特異性效應物的方法，其特征在于，所述特異性效應物是對所用抗原特異性的T淋巴細胞。
6.如權利要求5所述的誘導和擴增特異性效應物的方法，其特征在于，所述T淋巴細胞是 CD8+。
7.如上述權利要求中任一項所述的誘導和擴增特異性效應物的方法，其特征在于，所述抗原是腫瘤或微生物源，更特別地是病毒源。
8.如權利要求7所述的誘導和擴增特異性效應物的方法，其特征在于，所述抗原是肽。
9.如權利要求8所述的誘導和擴增特異性效應物的方法，其特征在于，所述能夠從腫瘤源的抗原獲得的肽，選自包括在以下抗原序列中的肽CEA、NY-BRl、Her-2/Neu, PSA、 RAGE-I、PRAME、TRP-2、MAGE-A 1、MAGE-A2、MAGE-A4、MAGE-A9、MAGE-AlO, MAGE-C2、MUC-1、 p53、hTERT、存活素、黑素-A/MART-1、GP100、酪氨酸酶、MAGE-A3或NY-ESOl，它們是修飾的或未修飾的。
10.如權利要求8所述的誘導和擴增特異性效應物的方法，其特征在于，所述能夠從病毒源的抗原獲得的肽，選自包括在以下抗原序列中的肽env、nef、gp41、gpl20、gag或HIV 病毒的pol、HBc或HBV病毒的HBs、core、NS3或HCV病毒的NS5、流感病毒的Flu Ml、巨細胞病毒的PP65、BMLFl、LMP2、EBNA-2或EBV病毒的EBNA_3a，它們是修飾的或未修飾的。
11.如上述權利要求任一項所述的誘導和擴增特異性效應物的方法，其特征在于所述類漿細胞樹突細胞系由類漿細胞樹突細胞的白血病細胞獲得。
12.如權利要求11所述的誘導和擴增特異性效應物的方法，其特征在于，所述類漿細胞樹突細胞系是GEN2. 2系或GEN3系。
13.經(jīng)脈沖和輻射的類漿細胞樹突細胞系在制造用于預防和/或治療傳染病或癌癥的藥物中的用途。
14.一種包含經(jīng)過脈沖和輻射的類漿細胞樹突細胞系的組合物。
15.一種包含細胞培養(yǎng)物的組合物，所述培養(yǎng)物包含外周血單核細胞(PBMC)和經(jīng)過脈沖和輻射的類漿細胞樹突細胞系，所述外周血單核細胞和經(jīng)過脈沖和輻射的類漿細胞樹突細胞系共享至少一個主要組織相容性復合物(CMH)等位基因。
16.一種組合物，其包含能夠通過權利要求1所述方法獲得的特異性效應物。
17.一種疫苗，其特征在于，其包含經(jīng)過脈沖和輻射的類漿細胞樹突細胞系-用作激活免疫的藥劑。
18.—種試劑盒，其包含類漿細胞樹突細胞系和外周血單核細胞，所述類漿細胞樹突細胞系和外周血單核細胞(PBMC)共享至少一個主要組織相容性復合物(CMH)等位基因。
19.如權利要求18所述的試劑盒，其還包含至少一種抗原。
20.一種用于預防或治療癌癥和/或傳染病的方法，其特征在于，將經(jīng)過輻射和脈沖的類漿細胞樹突細胞系注射進有機體中，該類漿細胞樹突細胞系和所述有機體共享至少一個主要組織相容性復合物(CMH)等位基因。
21.一種用于預防或治療癌癥和/或傳染病的方法，其特征在于，注射根據(jù)權利要求1 所述方法獲得的所述特異性效應物。
22.—種接種疫苗的方法，包括給藥如權利要求17所述的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種誘導和擴增特異性效應物的方法，其包括通過孵化具有至少一種抗原的類漿細胞樹突細胞(pDC)系獲得脈沖的類漿細胞樹突細胞，所述脈沖的pDC隨后經(jīng)過輻射并與外周血單核細胞(PBMC)相接觸，并培養(yǎng)或注射到有機體中。所述PBMC和經(jīng)過脈沖和輻射的pDC共享至少一個主要組織相容性復合物(CMH)等位基因。
文檔編號C12N5/0784GK102165057SQ200980117458
公開日2011年8月24日 申請日期2009年5月15日 優(yōu)先權日2008年5月16日
發(fā)明者卡羅利娜·阿斯波爾德, 洛朗斯·夏佩羅-迪博納, 若埃爾·普呂馬 申請人:法國血液機構(gòu)