改進的用于過繼細胞治療的細胞培養(yǎng)方法
【專利摘要】一種改進的培養(yǎng)用于細胞治療應(yīng)用之細胞的方法，其包括在抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞的存在下并且以最高1ml/cm2的培養(yǎng)基體積與表面面積比(如果生長表面不含透氣性材料)和以最高2ml/cm2的培養(yǎng)基體積與表面面積比(如果生長表面包含透氣性材料)來培養(yǎng)期望細胞。在生產(chǎn)循環(huán)開始時，期望細胞的表面密度為低于0.5×106個細胞/cm2，并且期望細胞的表面密度加抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞的表面密度為至少約1.25×105個細胞/cm2。
【專利說明】改進的用于過繼細胞治療的細胞培養(yǎng)方法
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請是于2010 年 12 月 8 日提交的題為 “ MPROVED METHODS OF CELL CULTUREFOR ADOPTIVE CELL THERAPY”的美國專利N0.12/963，597 (下文中稱為“母案”)的部分繼續(xù)申請，所述母案要求于2009年12月8日提交的標題也為“MPROVED METHODS OFCELLCULTURE FOR ADOPTIVE CELL THERAPY” 的美國臨時申請 N0.61/267，761 的權(quán)益，這些申請通過引用整體并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明一般地涉及培養(yǎng)細胞的方法，并且更具體地，涉及培養(yǎng)用于細胞治療的細胞。

【背景技術(shù)】
[0004]細胞培養(yǎng)是細胞治療的成本和復(fù)雜性的主要貢獻者。使用現(xiàn)有方法，培養(yǎng)細胞的方法既耗時間又昂貴。通常，為了產(chǎn)生大量細胞，采取分階段進行的體外培養(yǎng)方法。在最早階段，期望細胞是放入細胞培養(yǎng)裝置中的細胞組合物內(nèi)的相對小的群體。在該階段，細胞組合物通常包含期望細胞的來源(例如外周血單核細胞)、刺激期望細胞生長和/或抗原呈遞的飼養(yǎng)細胞。使細胞所處的培養(yǎng)基處于一般非擾動狀態(tài)的培養(yǎng)裝置和方法是受歡迎的，因為細胞保持相對非擾動。這樣的裝置包括標準組織培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)袋。分階段的培養(yǎng)方法一般由以下組成:使細胞組合物消耗(deplete)培養(yǎng)基的生長底物(例如葡萄糖)，去除經(jīng)消耗的培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基更換經(jīng)消耗的培養(yǎng)基，以及重復(fù)以上過程直至得到期望量的期望細胞。當期望細胞群體增加并且需要額外的生長表面時，經(jīng)常將細胞組合物移至另一些裝置中以起始新的生產(chǎn)階段。然而，使用常規(guī)方法，當生長表面上的細胞群體增大時，期望細胞的群體生長速率降低。最終結(jié)果是，生產(chǎn)出可觀的期望細胞群體是非常耗時并且復(fù)雜的。
[0005]本領(lǐng)域現(xiàn)有的用于產(chǎn)生對埃巴病毒具有抗原特異性的T淋巴細胞(T lymphocyteswith antigen specificity to Epstein Barr virus, EBV-CTL)的生產(chǎn)方法提供了生產(chǎn)復(fù)雜性的一個實例。用于EBV-CTL之最優(yōu)擴增的常規(guī)方法使用標準24-孔組織培養(yǎng)板，每個孔中具有用于細胞處于其上的2cm2表面積，并且由于氣體傳遞的需要而將培養(yǎng)基體積限制為lml/cm2。該培養(yǎng)方法開始是，使包含外周血單核細胞(peripheral bloodmononuclear cell, PBMC)的細胞組合物處于經(jīng)福照的抗原呈遞細胞系(其可為類淋巴母細胞系(lymphoblastoid cell line, LCL)的存在下,表面密度(即，每cm2生長表面的細胞)比為約40: 1，具有約1\10乍81?:/0112和2.5\104經(jīng)輻照的抗原呈遞細胞/0112。這激起細胞組合物中的EBV-CTL群體在量上擴增。9天后，在以4: I的新表面密度比存在經(jīng)輻照的抗原呈遞LCL并且最小表面密度為約2.5 X 105EBV-CTL/cm2的情況下，再次選擇性擴增EBV-CTL0使培養(yǎng)基體積限制在最大比率為lml/cm2生長表面面積，以使氧能夠達到細胞，這限制了諸如葡萄糖等生長溶質(zhì)。結(jié)果，可實現(xiàn)的最大表面密度為約2X106EBV-CTL/cm2。因此，每周最大的細胞擴增是約8倍(即，2X106EBV-CTL/cm2除以2.5X 105EBV_CTL/cm2)或更低。EBV-CTL的持續(xù)擴增需要每周將EBV-CTL轉(zhuǎn)移至具有抗原再刺激的其他24-孔板中，并且每周更換兩次24-孔板每個孔中的培養(yǎng)基和生長因子。因為常規(guī)方法在EBV-CTL表面密度接近每個孔可能的最大量時導(dǎo)致EBV-CTL群體的擴增速率減慢，所以必需在長的生產(chǎn)時間(經(jīng)常長達4周至8周)中重復(fù)這些操作，以得到用于細胞輸注和質(zhì)量控制測量(例如無菌度、一致度和效力測定)的足夠量的EBV-CTL。
[0006]EBV-CTL的培養(yǎng)只不過是細胞治療固有的復(fù)雜細胞生產(chǎn)方法的一個實例。需要更實際的用于細胞治療的可縮短生產(chǎn)時間同時降低生產(chǎn)成本和復(fù)雜性的培養(yǎng)細胞之方法。
[0007]我們建立了在整個生產(chǎn)過程中提高群體生長速率的新方法,并且通過這樣做降低了生產(chǎn)細胞所需的復(fù)雜性和時間。
[0008]主要的非粘附細胞，例如抗原特異性T細胞、自然殺傷細胞(natural killercell, NK)、調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell, Treg)、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumorinfiltrating lymphocyte, TIL)、骨髓浸夕聞淋巴細胞(marrow infiltrating lymphocyte,TIL)以及胰島，通常是生產(chǎn)的焦點。旨在增加期望細胞(常常被稱為效應(yīng)細胞)之群體的許多生產(chǎn)方法常常在共培養(yǎng)條件下依靠其他細胞類型來刺激期望細胞的生長和/或抗原特異性。在共培養(yǎng)中使用的細胞常常稱為飼養(yǎng)細胞和/或抗原呈遞細胞。在一些情況下，共培養(yǎng)物轉(zhuǎn)變成在沒有飼養(yǎng)細胞和/或抗原呈遞細胞的情況下擴增期望的細胞群體，例如TIL生產(chǎn)。在沒有效應(yīng)細胞的情況下生產(chǎn)抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞也是普遍的。此夕卜，有時培養(yǎng)旨在維持細胞群體的健康而不是增加群體本身，例如用于糖尿病治療的胰島培養(yǎng)。因此，用于過繼細胞治療(Adoptive Cell Therapy)的細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)裝置和生產(chǎn)方法必須處理多種可能的生產(chǎn)應(yīng)用。
[0009]為了能夠?qū)挿秶厥褂眠^繼細胞治療，需要大大地簡化細胞生產(chǎn)方法，并使之更便宜。然而，本領(lǐng)域現(xiàn)有的用于生產(chǎn)的裝置和方法不能實現(xiàn)這一點。以下簡略地解釋為什么情況會如此。
[0010]過繼細胞治療領(lǐng)域現(xiàn)有的廣泛依靠的裝置是靜態(tài)細胞培養(yǎng)裝置，S卩，細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶和透氣性袋。這些靜態(tài)裝置旨在使細胞在培養(yǎng)期間彼此靠近地存在，以促進共培養(yǎng)物之間的通信和/或使非共培養(yǎng)物保持物理靜止。出于熟練的技術(shù)人員所公知的多種生物學(xué)原因，這種物理非擾動狀態(tài)是有益的。此外，靜態(tài)細胞培養(yǎng)裝置不復(fù)雜，并且在其運行過程中不需要持續(xù)使用輔助設(shè)備來灌注培養(yǎng)基或使氣體通過裝置、例如通過鼓泡、攪拌或震蕩設(shè)備來攪拌培養(yǎng)基和/或使細胞不沉淀至裝置的底部。因此，靜態(tài)裝置與標準實驗室和細胞培養(yǎng)設(shè)備(例如孵育器)是相容的，并且對輔助設(shè)備具有最小的依賴性，或沒有依賴性。雖然靜態(tài)裝置具有所描述的優(yōu)點，但是它們也存在固有的問題，妨礙了有效的和實用的生產(chǎn)用于過繼細胞治療的細胞。
[0011]這些固有問題之一是培養(yǎng)基可在生長表面以上存在的高度受限，根據(jù)制造商的建議，范圍從在板和瓶中的約0.3cm的上限至透氣性袋中的2.0cm0因此，板和瓶具有不高于0.3ml/cm2的受限的培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比，并且透氣性袋被限制為不高于
2.0ml/cm2。將板、瓶和袋的設(shè)計限制與其在過繼細胞治療領(lǐng)域中使用的現(xiàn)有方案相結(jié)合，使細胞密度狹窄地限制在0.5 X 16至2.0X 16細胞/ml的范圍，并且這固有地依靠以至少0.5X 16細胞/cm2的表面密度啟始培養(yǎng)。這些限制導(dǎo)致了多種問題使得用于過繼細胞治療的細胞生產(chǎn)無法實施，所述問題包括，在方法中的裝置量過多、維持培養(yǎng)物的過度勞動量、高的污染風險和/或生產(chǎn)細胞的長持續(xù)時間。培養(yǎng)袋具有的獨有問題是，培養(yǎng)袋的日常處理導(dǎo)致細胞從它們所存在的位置受到擾動，并散布于培養(yǎng)基中。
[0012]在Wilson等的共同未決美國公開N0.2005/0106717 Al (以下稱為Wilson’ 717)和Wilson的2008/0227176 Al (以下稱為Wilson’ 176)中已經(jīng)介紹了板、瓶和袋的替代裝置，并且在母案中介紹了用于培養(yǎng)的替代方法，所述母案公開了用于過繼細胞治療領(lǐng)域之細胞生產(chǎn)方法的特別強力的改進。Wilson’717描述了多種新的透氣裝置，其使得培養(yǎng)方法能夠在垂直方向上進行擴展，越過了板、瓶和袋的培養(yǎng)基高度限制和培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比的限制，使得能夠更有效地利用物理空間。Wi I son ’ 176基于Wi I son ’ 717建立，使得能夠在指定量的物理空間中存在甚至更大的生長面積。母案公開了使得能夠?qū)^繼細胞治療領(lǐng)域中常用的細胞進行更有效的共培養(yǎng)的發(fā)現(xiàn)，包括教導(dǎo)避開本領(lǐng)域現(xiàn)有的關(guān)于細胞表面密度的限制以提供寬范圍的意想不到的益處。
[0013]本發(fā)明基于母案和進一步改進了(特別是用于過繼細胞治療領(lǐng)域的)細胞生產(chǎn)之效率和實用性的新發(fā)現(xiàn)建立，并且基于Wilson’ 717和Wilson’ 176建立以使本文公開的多種新方法得以實施。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]已發(fā)現(xiàn)，通過使用在整個生產(chǎn)過程中允許周期性地重建非常規(guī)條件的分階段生產(chǎn)方法使得用于細胞治療的細胞生產(chǎn)比當前的可能以更短時間和更經(jīng)濟的方式來進行。所述非常規(guī)的條件包括期望細胞的表面密度(即，細胞/cm2)降低、期望細胞與抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞的新的比，和/或使用包含具有增加培養(yǎng)基體積與表面面積之比的透氣材料的生長表面。
[0015]本發(fā)明的實施方案涉及改進的培養(yǎng)用于細胞治療應(yīng)用之細胞的方法。它們包括通過使用使期望細胞群體在整個生產(chǎn)過程中保持比常規(guī)方法更高之生長速率的多種新方法來減少生產(chǎn)期望數(shù)量的期望細胞所需的時間、成本和復(fù)雜性的方法。
[0016]本發(fā)明的一個方面依靠分階段進行培養(yǎng)過程和在一個或更多個階段的開始時建立允許期望細胞群體的生長速率超過當前可能的生長速率的條件。在培養(yǎng)的至少一個階段，并且優(yōu)選幾乎所有階段，建立包括以下的初始條件:期望細胞以非常規(guī)地低表面密度和非常規(guī)的抗原呈遞細胞(和/或飼養(yǎng)細胞)/期望細胞的比存在于非透氣性或透氣性生長表面上。通過使用本發(fā)明該方面的新實施方案，期望細胞群體可在更短的時間內(nèi)經(jīng)歷比常規(guī)方法允許的更多次翻倍，從而縮短生產(chǎn)時間。
[0017]本發(fā)明的另一個方面依靠分階段進行培養(yǎng)過程和在一個或更多個階段的開始時建立使得期望細胞群體的生長速率超過當前可能之生長速率的條件。在培養(yǎng)的至少一個階段，并且優(yōu)選幾乎所有階段，建立包括以下的條件:期望細胞以非常規(guī)地高培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比存在于包含透氣性材料的生長表面上。通過使用本發(fā)明該方面的新實施方案，期望細胞群體可在更短的時間內(nèi)經(jīng)歷比常規(guī)方法允許的更多次翻倍，從而縮短生產(chǎn)時間。
[0018]本發(fā)明的另一個方面依靠分階段進行培養(yǎng)方法和在每個階段建立使得期望細胞群體的生長速率超過當前可能的生長速率的條件。在培養(yǎng)的至少一個階段，并且優(yōu)選幾乎所有階段，建立包括以下的初始條件:期望細胞以非常規(guī)地低表面密度(即，細胞/cm2)和非常規(guī)的抗原呈遞細胞(和/或飼養(yǎng)細胞)/期望細胞比存在于包含透氣性材料的生長表面上，并且存在非常規(guī)地高培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比。通過使用本發(fā)明該方面的新實施方案，期望細胞群體可在更短的時間內(nèi)經(jīng)歷比常規(guī)方法允許的更多次翻倍，從而縮短生產(chǎn)時間。
[0019]我們發(fā)現(xiàn)了另外的細胞培養(yǎng)方法，其教導(dǎo)避開過繼細胞治療領(lǐng)域中的現(xiàn)有方法并基于母案的公開內(nèi)容建立以使得所述培養(yǎng)和/或制備細胞的方法比現(xiàn)有的方法學(xué)更實用并且更有成本效率。
[0020]在本發(fā)明使用透氣性細胞培養(yǎng)裝置來培養(yǎng)細胞的一個實施方案中，當從表面密度(細胞/cm2)和細胞密度(細胞/ml)比常規(guī)方法低之狀態(tài)處于透氣性裝置中時，細胞能夠啟始生長(outgrowth)。
[0021]在本發(fā)明的使用透氣性細胞培養(yǎng)裝置來培養(yǎng)細胞的另一個實施方案中,在任意指定時間測定培養(yǎng)物中有多少細胞所需的細胞計數(shù)可替換為在任意指定的時間在培養(yǎng)基中取溶質(zhì)樣品并使用其來預(yù)測培養(yǎng)物中的群體。
[0022]在本發(fā)明的使用透氣性細胞培養(yǎng)裝置來培養(yǎng)細胞的另一個實施方案中，提高培養(yǎng)基體積比生長表面面積以相對于本領(lǐng)域現(xiàn)有方法降低進給頻率，或甚至完全消除在培養(yǎng)開始后對進給培養(yǎng)物的需要。
[0023]在本發(fā)明的使用透氣性細胞培養(yǎng)裝置來培養(yǎng)細胞的另一個實施方案中，進一步提高培養(yǎng)基體積比生長表面面積以使細胞群體在達到其最大群體后可以高生存力存在的時間更長。
[0024]在本發(fā)明的另一個實施方案中，公開了透氣性細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置，其能夠降低培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基體積而無細胞損失、濃縮細胞而無需使用離心并且在從裝置中移出細胞之前提高細胞密度。
[0025]在本發(fā)明的另一個實施方案中，公開了用于新透氣性細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置的方法，其能夠降低培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基體積而無細胞損失以使培養(yǎng)過程中操作者應(yīng)當選擇進給培養(yǎng)物時對裝置數(shù)量之增加的需要最小化。
[0026]在本發(fā)明的使用透氣性細胞培養(yǎng)裝置來培養(yǎng)細胞的另一個實施方案中，公開了通過在培養(yǎng)過程中使用APC來快速生產(chǎn)CAR T細胞并改進殺傷能力的方法。
[0027]在本發(fā)明的使用透氣性細胞培養(yǎng)裝置來培養(yǎng)細胞的另一個實施方案中，本發(fā)明的方法能夠以正比例線性地放大以增加生長表面的表面積。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]考慮結(jié)合附圖詳細描述的本發(fā)明的多個實施方案時，本發(fā)明可更完整的理解，其中:
[0029]圖1A示出實施例1中的抗原特異性T細胞群體在初始刺激后的第一個七天中經(jīng)歷至少7次細胞翻倍。
[0030]圖1B示出顯示通過實施例1的四聚物分析確定的細胞組合物內(nèi)T細胞群體隨著時間的擴增量級。
[0031]圖1C，實施例1中經(jīng)過23天的時間段內(nèi)抗原特異性T細胞的群體生長速率逐漸降低。
[0032]圖2示出了描述實施例1中抗原特異性T細胞的潛在擴增與觀察到的擴增倍數(shù)之間的差異的表格。
[0033]圖3A示出實施例2中在刺激后抗原特異性T細胞的存在。
[0034]圖3B示出實施例2中當表面密度從IXlOfVcm2降低至3.1 X 1 Vcm2同時保持4:I的抗原特異性T細胞與抗原呈遞細胞比時抗原特異性T細胞群體的擴增。
[0035]圖3C示出實施例2中當表面密度從IX 1fVcm2降低至3.1 X 1 Vcm2同時存在固定數(shù)量的抗原呈遞細胞時抗原特異性T細胞群體的擴增。
[0036]圖4示出當繼續(xù)進行圖3中描述的工作時得到的結(jié)果的實例，其進一步證明，當期望細胞需要其他細胞的支持時，只要期望細胞存在充分的飼養(yǎng)細胞和/或抗原呈遞細胞供應(yīng)，非常規(guī)地低期望細胞表面密度就可起始群體擴增。
[0037]圖5示出直方圖，其通過以三種不同的細胞密度(CTL/cm2)起始培養(yǎng)證明重復(fù)期望細胞群體擴增量級的能力。
[0038]圖6示出了用于生成數(shù)據(jù)的透氣性受試裝置(fixture)的截面圖。
[0039]圖7A示出與實施例5中采取的常規(guī)方法相比根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的抗原特異性T細胞的生長曲線。
[0040]圖7B示出，對于實施例5，如通過流式細胞正向比側(cè)向散射分析測定的，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的抗原特異性T細胞的細胞生存力比常規(guī)方法顯著更高。
[0041]圖7C示出，對于實施例5，如通過膜聯(lián)蛋白-PI 7AAD (Annexin-PI 7AAD)測定的，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的抗原特異性T細胞的細胞生存力比常規(guī)方法顯著更高。
[0042]圖7D示出，對于實施例5,如通過CFSE標記細胞的每日流式細胞分析所測定的,在本發(fā)明的新方法中產(chǎn)生的細胞的優(yōu)異生長表現(xiàn)出與使用常規(guī)方法培養(yǎng)的細胞相同的細胞特異性生長速率，證實降低的細胞死亡導(dǎo)致提高的細胞擴增速率。
[0043]圖8A示出在無需更換培養(yǎng)基的情況下如何能夠擴增EVB-CTL超越常規(guī)方法中可能的擴增。
[0044]圖8B示出，如通過對EBER的Q-PCR評價的，實施例6的培養(yǎng)條件如何不改變最終細胞制品。
[0045]圖8C示出，如通過對B細胞標志物⑶20的Q-PCR評價的，實施例6的培養(yǎng)條件如何不改變最終細胞制品。
[0046]圖9示出了一個示例性實例，其中我們通過實驗證明非常低的期望細胞和抗原呈遞細胞的累積表面密度(在該情況下，AL-CTL細胞和LCL細胞組合以產(chǎn)生表面密度為30，000細胞/cm2的細胞組合物)不能起始AL-CTL群體的生長。
[0047]圖1OA呈現(xiàn)了實施例8的數(shù)據(jù)，其示出了兩種培養(yǎng)細胞的新方法如何在23天時間內(nèi)比常規(guī)方法生產(chǎn)更多細胞。
[0048]圖1OB示出了在實施例8的受試裝置中培養(yǎng)的細胞的照片。
[0049]圖1OC示出，在實施例8中，兩種新培養(yǎng)方法和常規(guī)方法都產(chǎn)生具有相同表型的細胞。
[0050]圖1OD示出，對于實施例8，其中用來自EBV的LMP1、LMP2、BZLF I和EBNAl的EBV肽表位刺激T細胞并且經(jīng)HLA-A2-LMP2肽五聚體染色法染色的代表性培養(yǎng)物示出相似的肽特異性T細胞頻率。
[0051]圖1OE示出，如通過51Cr釋放測定評價的，對于實施例8中的新方法和常規(guī)方法，細胞保持它們的溶細胞活性和特異性并殺傷自體EBV-LCL，并且對與EBV-LCL錯配的EBV-LCL殺傷低。
[0052]圖11示出了在常規(guī)情況下期望細胞群體在生長表面上的擴增與使用本發(fā)明之一個方面的期望細胞類型的群體擴增相比較的圖示。
[0053]圖12示出了可通過利用包含透氣性材料和超過lml/cm2或2ml/cm2的非常規(guī)地高培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比的生長表面得到的優(yōu)點的實例。
[0054]圖13示出了新方法的圖示，在常規(guī)情況下在生長表面上的擴增期望細胞群體的新方法與在本發(fā)明的一個實施方案下期望細胞類型的群體擴增相比較，在該實施方案中，完成時的細胞表面密度比常規(guī)的表面密度大得多。
[0055]圖14示出了還提供超過常規(guī)方法之另外的優(yōu)點的另一種細胞生產(chǎn)的新方法。
[0056]圖15示出圖14中描述的每種生產(chǎn)方法的比較以證明新方法的強大，以及為什么其可用于在多個階段調(diào)節(jié)生產(chǎn)方案從而充分地獲得效率。
[0057]圖16示出了在新方法中操作者如何調(diào)節(jié)生產(chǎn)方案以在生產(chǎn)過程中增進效率的實例。
[0058]圖17A示出了在1.0E+06細胞/cm2下的實驗條件和結(jié)果的代表性電子表格。
[0059]圖17B示出了在0.5E+06細胞/cm2下的實驗條件和結(jié)果的代表性電子表格。
[0060]圖17C示出了在0.25E+06細胞/cm2下的實驗條件和結(jié)果的代表性電子表格。
[0061]圖17D示出了在0.125E+06細胞/cm2下的實驗條件和結(jié)果的代表性電子表格。
[0062]圖17E示出了在0.0625E+06細胞/cm2下的實驗條件和結(jié)果的代表性電子表格。
[0063]圖18比較了群體增加相對于圖17A至圖17E中詳述的每種實驗條件之表面密度的擴增倍數(shù)。
[0064]圖19A示出在相同的起始條件(除了葡萄糖濃度之外)下培養(yǎng)K562細胞的實驗條件和典型結(jié)果的代表性電子表格。
[0065]圖19B示出了在兩種起始葡萄糖條件下在11天的時間階段內(nèi)細胞群體的擴增。
[0066]圖19C示出了每種培養(yǎng)條件的葡萄糖消耗速率。
[0067]圖19D示出了每種培養(yǎng)條件的葡萄糖消耗速率。
[0068]圖19E示出了使用公式計算預(yù)測的群體中的細胞數(shù)量與通過對培養(yǎng)物進行手動計數(shù)來測定的細胞數(shù)量的重疊圖，起始葡萄糖濃度為240mg/dl。
[0069]圖19F示出了對于在葡萄糖濃度為240mg/dl起始的培養(yǎng)物,使用公式計算預(yù)測的群體中的細胞數(shù)量與通過手動計數(shù)測定的細胞數(shù)量的重疊圖。
[0070]圖20示出了在多種培養(yǎng)基進給條件下群體生長的圖示(對生長表面面積歸一化)。
[0071]圖21示出了總結(jié)了證明使用葡萄糖消耗作為細胞群體替代檢測之能力的實驗在第O天、第9天和第16天之條件的電子表格。
[0072]圖22k示出本發(fā)明之細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置1000的一個實施方案的一個實例之截面圖，所述裝置1000配置成實施所公開的新細胞培養(yǎng)方法和/或新細胞回收方法。
[0073]圖22B示出了在培養(yǎng)的任何指定細胞生產(chǎn)階段起始時的靜態(tài)培養(yǎng)之初始狀態(tài)的細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置1000。
[0074]圖22C示出了準備在減小的培養(yǎng)基體積中回收細胞的細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置1000。
[0075]圖22D示出了將細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置1000重新定向成從初始的水平細胞培養(yǎng)位置偏離角1026的位置，以重新定位回收培養(yǎng)基1024。
[0076]圖23A示出了在培養(yǎng)開始時和在培養(yǎng)進行中評價A的條件。
[0077]圖23B示出了在培養(yǎng)開始時和在培養(yǎng)進行中評價B的條件。
[0078]圖23C示出了在培養(yǎng)開始時和在培養(yǎng)進行中評價C的條件。
[0079]圖23D示出了培養(yǎng)過程中多個時間點的培養(yǎng)物中的總活細胞。
[0080]圖23E示出在培養(yǎng)開始時和培養(yǎng)結(jié)束時CAR T細胞表達的百分比。
[0081]圖23F示出培養(yǎng)過程中CAR T細胞的總擴增倍數(shù)。
[0082]圖23G證明在評價A中預(yù)測的活細胞群體代表了手動技術(shù)測定的細胞群體。
[0083]圖23H示出了由條件A和條件B得到的細胞殺傷表達PSCA之腫瘤細胞的能力。
[0084]圖231總結(jié)了對PSCA具有特異性的CAR T細胞群體擴增的并排比較。
[0085]圖24A示出了具有不同生長面積的三種透氣性培養(yǎng)裝置的群體生長曲線。
[0086]圖24B示出了歸一化為表面密度后的圖24A的群體生長曲線。

【具體實施方式】
[0087]定義
[0088]粘附細胞:貼附至生長表面的細胞
[0089]抗原呈遞細胞(APC):起觸發(fā)期望細胞對特定抗原進行應(yīng)答之作用的細胞。
[0090]CTL:細胞毒性T細胞
[0091]細胞密度:細胞數(shù)目/單位體積培養(yǎng)基的比(細胞/ml)
[0092]期望細胞:生產(chǎn)方法旨在在量上進行擴增和/或回收的特定類型的細胞。一般而言，期望細胞是非粘附的，并且實例包括，調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、天然殺傷細胞(NK)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、原代T淋巴細胞(primary T lymphocyte)和多種抗原特異性細胞，以及許多其他細胞(所有這些細胞還都可進行遺傳改造以改進其功能、體內(nèi)持久性或安全性)。臨床用途所需的細胞可與飼養(yǎng)細胞和/或抗原呈遞細胞一起擴增，所述飼養(yǎng)細胞和/或抗原呈遞細胞可包括PBMC、PHA母細胞、0KT3T、B母細胞、LCL和K562，(天然的或經(jīng)遺傳改造以表達抗原和/或表位以及共刺激分子，例如41BBL、0X40、⑶80、⑶86、HLA以及許多其他分子)，這些細胞可用肽或其他相關(guān)抗原刺激(pulse)，或不進行刺激。
[0093]EBV:埃巴病毒
[0094]EBV-CTL:特異性識別EBV感染的細胞或者表達或通過其T細胞表面受體呈遞來源于EBV之肽的T細胞。
[0095]EBV-LCL:埃巴病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴母細胞樣細胞系(B lymphoblastoid cellline)ο
[0096]飼養(yǎng)細胞:作用為引起期望細胞在量上擴增的細胞?？乖蔬f細胞也可在一些環(huán)境中充當飼養(yǎng)細胞。
[0097]生長表面:培養(yǎng)裝置內(nèi)細胞處于其上的區(qū)域。
[0098]起始培養(yǎng):一般是指在培養(yǎng)過程開始時和/或在生產(chǎn)循環(huán)開始時的條件。
[0099]培養(yǎng)基更換:與飼喂細胞同義，并且一般是通過其用新鮮培養(yǎng)基補充舊培養(yǎng)基的過程。
[0100]PBMC:來源于外周血的外周血單核細胞，其是一些期望細胞的來源，并且其可充當飼養(yǎng)細胞。
[0101]效應(yīng)細胞(R):會對刺激細胞產(chǎn)生反應(yīng)的細胞。
[0102]靜態(tài)細胞培養(yǎng):一種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞的方法，其中除非當為了日常處理將培養(yǎng)裝置從一處移動至另一處時和/或當周期性地進給新鮮培養(yǎng)基等時的情況之外，不攪拌或不混合所述培養(yǎng)基。一般而言，靜態(tài)培養(yǎng)中的培養(yǎng)基通常是處于靜止狀態(tài)的。其不經(jīng)歷例如在以下系統(tǒng)中發(fā)生的受迫運動，灌注系統(tǒng)(其中培養(yǎng)基持續(xù)地移動通過容器)、振蕩系統(tǒng)(其中物理地振蕩培養(yǎng)裝置以使培養(yǎng)基運動)、攪拌系統(tǒng)(其中攪拌棒在裝置內(nèi)運動以攪拌培養(yǎng)基和細胞)，或用于在整個培養(yǎng)持續(xù)時間中迫使培養(yǎng)基運動或混合的任何其他機械或設(shè)備。細胞沉降至裝置中的生長表面，這里細胞以非擾動狀態(tài)存在(偶然的進給時間除外)，此時通過以下方式向培養(yǎng)物提供新鮮培養(yǎng)基:首先移出培養(yǎng)基，然后添加培養(yǎng)基，通過添加培養(yǎng)基而不移出培養(yǎng)基，或者通過移出培養(yǎng)基和細胞并將培養(yǎng)基和細胞分配于新裝置中并向這些裝置中添加新鮮培養(yǎng)基。通常不用泵來輔助供給過程。例如，透氣性細胞培養(yǎng)袋通常依靠重力或泵以封閉系統(tǒng)的方式使流體運動到培養(yǎng)袋中和從培養(yǎng)袋中流出。絕大部分的培養(yǎng)持續(xù)時間是其中細胞和培養(yǎng)基處于靜止和非攪拌狀態(tài)的時間。本發(fā)明涉及靜態(tài)細胞培養(yǎng)方法。
[0103]經(jīng)刺激的:抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞對期望細胞具有的作用。
[0104]刺激細胞:會影響效應(yīng)細胞的細胞。
[0105]表面密度:裝置中細胞依靠在其上的生長表面之每單位面積的細胞量。
[0106]懸浮細胞:不需要貼附至生長表面的細胞，與非粘附細胞同義
[0107]為了嘗試找到新方法來簡化用于過繼T細胞治療的期望細胞群體的生產(chǎn)，進行的一系列實驗已經(jīng)打開了更高效的用于細胞治療應(yīng)用的細胞培養(yǎng)的大門。描述了本發(fā)明的許多示例性實例和多個方面以指示如何能實現(xiàn)相對于常規(guī)方法縮短生產(chǎn)時間并降低復(fù)雜性的能力。
[0108]實施例1:證明常規(guī)方法的限制。
[0109]本實施例的數(shù)據(jù)證明了用于在標準24孔組織培養(yǎng)板(即，2cm2表面面積每孔)中使用每孔2ml培養(yǎng)基體積(g卩，1.0cm的培養(yǎng)基高度和lmi/cm2的培養(yǎng)基體積與表面面積之比)來生產(chǎn)EBV-CTL的常規(guī)培養(yǎng)方法的限制。
[0110]培養(yǎng)的階段1，第O天:通過以下起始EBV-CTL群體的擴增:將來自正常供體的PBMC的細胞組合物(約I X 16細胞/ml)與經(jīng)Y-輻照(40Gy)的抗原呈遞自體EBV-LCL以40: I的比(PBMC: LCL)以及l(fā)ml/cm2的培養(yǎng)基體積與生長表面比培養(yǎng)，從而在添加有45% Click 培養(yǎng)基(Irvine Scientific, Santa Ana, CA)和 2mM GlutaMAX-1 以及 10% FBS的RPMI1640中建立表面密度為約I X 16細胞/cm2的細胞組合物。
[0111]培養(yǎng)的階段2，第9至16天:在第9天，從階段I產(chǎn)生的細胞組合物中收集EBV-CTL,以0.5X106EBV-CTL/cm2的表面密度將其重懸于新鮮培養(yǎng)基中，并且用經(jīng)輻照的自體 EBV-LCL 再刺激，CTL: LCL 比為 4: I (表面密度 0.5X 106CTL/cm2:1.25X 15LCL/cm2)。在第13天，移出24-孔板每個孔的2ml培養(yǎng)基體積中的1ml，并用Iml含有重組人IL-2 (IL-2) (50U/mL) (Proleukin ；Chiron, Emeryville, CA)的新鮮培養(yǎng)基替換。
[0112]培養(yǎng)的階段3，第17至23天:每周兩次添加IL_2來重復(fù)階段2的條件，并在第23天終止培養(yǎng)。雖然終止了培養(yǎng)，但是可能已經(jīng)繼續(xù)進行類似(mimicked)階段2和3的額外培養(yǎng)階段。
[0113]用作細胞毒性測定之靶細胞的細胞系和腫瘤細胞細胞淋巴瘤)和K562 (慢性紅細胞系白血病(chronic erythroid leukemia))得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collect1n, ATCC, Rockville, MD, USA)。將所有細胞用含有10%熱滅活的胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、25IU/mL青霉素和25mg/mL鏈霉素(都來自 B1Whittaker，Walkersville，MD)的 RPMI IMO 培養(yǎng)基(GIBC0-BRL，Gaithersburg，MD)中維持培養(yǎng)。將細胞保持在37°C包含5% CO2的濕潤氣氛下。
[0114]免疫表型:
[0115]細胞表面:用以下物質(zhì)對細胞表面染色:來自Becton-Dickinson (MountainView, CA，USA)的藻紅蛋白(PE)、異硫氰酸熒光素(FITC)、多甲藻黃素葉綠素蛋白(per1din chlorophyll protein, PerCP)以及與別藻藍蛋白(APC)綴合的抗⑶3、0)4、CD8、CD56、CD16、CD62L、CD45R0、CD45RA、CD27、CD28、CD25、CD44 之單克隆抗體(MAb)。使用與PE綴合的四聚體(Baylor College of Medicine)和與APC綴合的五聚體(ProimmuneLtd, Oxford, UK)來定量EBV-CTL前體頻率。對于細胞表面染色和五聚體染色，我們在FACSCalibur流式細胞儀上分別獲得了 10，000和100，000個活的事件，并使用Cell Quest軟件(Becton Dickinson)分析數(shù)據(jù)。
[0116]CFSE標記以測量細胞分裂:為了評估翻倍速率，將2X 17PBMC或EBV特異性的CTL(EBV-CTL)洗滌兩次，并重懸于850 μ I含有0.1 %小牛血清(FBS) (Sigma-Aldrich)的IX磷酸緩沖鹽水(PBS)中。在染色之前，將一份羧基-熒光素二乙酸，琥珀酰亞胺酯(carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester, CFSE) (1mM,于二甲亞諷中)(Celltracetm CFSE 細胞增殖試劑盒(C34554) Invitrogen)解凍，用 IXPBS 以 I: 1000 稀釋，將150 μ I稀釋液添加至細胞懸浮液(標記濃度為I μ Μ)中。在室溫用CFSE孵育細胞10分鐘。隨后向細胞懸浮液中添加Iml FBS，接著在37°C孵育10分鐘。然后，用IXPBS洗滌細胞兩次，計數(shù)并用所述抗原刺激。
[0117]膜聯(lián)蛋白V-7-AAD染色:為了確定我們的培養(yǎng)物中凋亡細胞和壞死細胞的百分t匕，我們根據(jù)制造商的使用說明(BD Pharmingentm#559763, San Diego, CA)進行了膜聯(lián)蛋白V-7-AAD染色。簡言之，用冷PBS洗滌來自24-孔板或G-Rex的EBV-CTL，將其以I X 16細胞/ml的濃度重懸于IX結(jié)合緩沖液中，用膜聯(lián)蛋白V-PE和7-AAD在室溫(25°C )于黑暗中染色15分鐘。在孵育細胞后立即通過流式細胞術(shù)分析細胞。
[0118]鉻釋放測定:如前文所述，我們在標準的4-小時51Cr釋放測定中評價EBV-CT的細胞毒活性。對于期望細胞，我們使用了自體的和HLA I類和II類錯配的EBV轉(zhuǎn)化的類淋巴母細胞系(EBV-LCL)以測量MHC限制性殺傷和MHC非限制性殺傷，還使用了 K562細胞系以測量自然殺傷細胞活性。分別使用在培養(yǎng)基中單獨孵育的或在I % Triton X-100孵育的鉻標記的期望細胞來測定自發(fā)的51Cr釋放和最大51Cr釋放。一式三份孔的平均特異性裂解百分比如下計算:[(測試計數(shù)-自發(fā)計數(shù))/ (最大計數(shù)-自發(fā)計數(shù))]X 100。
[0119]酶聯(lián)免疫斑點(ELI spot)測定:使用ELI spot分析來定量響應(yīng)抗原刺激分泌IFN Y之T細胞的頻率和功能。用經(jīng)輻照的LCL(40Gy)或LMPl、LMP2、BZLFl和EBNAlpepmixes (稀釋至 I μ g/ml) (JPT Technologies GmbH, Berlin, Germany),或稀釋至2 μ M 終濃度的 EBV 肽 HLA-A2GLCTLVAML = GLC、HLA_A2CLGGLLTMV = CLG、HLA_A2_FLYALALLL=FLY 和 HLA-A2911LLARLFLY = ILL (Genemed Synthesis, Inc.San Anton1, Texas)來刺激在24孔板或G-Rex中擴增的CTL系，并且單獨的CTL充當陰性對照。將CTL以I X 16/ml 重懸于 ELIspot 培養(yǎng)基[(補充了 5%人血清(Valley B1medical, Inc.，Winchester,Virginia)和 2-mM L-谷氨酸胺(GlutaMAX-1, Invitrogen, Carlsbad, CA)的 RPMI1640 (Hyclone, Logan, UT)]中。
[0120]用10 μ g/mL 抗-1FN-Y 抗體(Catcher-mAB91-DIK, Mabtech, Cincinnati, OH)包被 96 孔篩選板(MultiScreen，#MAHAS4510，Millipore，Bedford，MA)，于 4°C過夜，然后洗滌并用ELIspot培養(yǎng)基于37°C封閉I小時)。在所述板上孵育效應(yīng)細胞和刺激細胞20小時，然后洗漆所述板并用與生物素綴合的抗-1FN-Y單克隆抗體(Detector-mAB(7-B6_l-生物素，Mabtech) 二次孵育，接著用抗生物素蛋白:生物素化的辣根過氧化物酶復(fù)合物(Vectastain Elite ABC Kit (標準))，#PK6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA)孵育，然后用AEC底物(Sigma，St.Louis，MO)顯色。每種培養(yǎng)條件一式三份進行。將所述板送至Zellnet Consulting, New York, NY用于評價。對形成斑點的單元(SFC)和輸入細胞數(shù)進行作圖。
[0121]統(tǒng)計學(xué)分析:體外數(shù)據(jù)以平均值±1SD示出。使用學(xué)生t檢驗來測定樣品間差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性，并且將P <.05接受為指示顯著性差異。
[0122]如圖1A所示，在這些培養(yǎng)條件下，抗原特異性T細胞群體在初始刺激后的第一個七天中經(jīng)歷至少7次細胞翻倍。因此，我們預(yù)期T細胞每周擴增128倍(如通過抗原特異性T細胞頻率乘以細胞組合物中的總細胞數(shù)所測量的)。圖1B中示出了第一、第二和第三次刺激后四聚體陽性細胞的頻率。在第O天，對兩種EBV四聚體RAK和QAK有反應(yīng)的T細胞頻率分別為0.02%和0.01 %。在第O天進行單次刺激后，到第9天，細胞組合物中四聚體陽性的T細胞頻率分別從0.02%和0.01%升高至2.7%和1.25%。因此，如由RAK和QAK所測量的，得到了存在于細胞組合物中的抗原特異性四聚體陽性的T細胞的百分比升高135倍和125倍。此外，在培養(yǎng)階段I的第O天進行單次刺激后，到第9天(存在約1.1XlO6細胞/cm2)在細胞組合物中觀察到細胞的表面密度提高1.1倍(數(shù)據(jù)未示出)。因為PBMC組合物中的大多數(shù)細胞對刺激性抗原不具有特異性，所以觀察到總細胞數(shù)總體上幾乎沒有增加，但是組合物中的抗原特異性細胞群體在培養(yǎng)第一階段過程中的擴增倍數(shù)約280，如圖1C所示。遺憾的是，雖然通過CSFE測得在培養(yǎng)的第二階段和第三階段中具有同樣的細胞翻倍數(shù)，但是在培養(yǎng)的第二和第三階段中抗原特異性T細胞擴增的這種速率不能保持，在第二階段中僅為5.7并且在第三階段中僅為4.3。圖2示出了舉例說明抗原特異性T細胞的潛在擴增與觀察到的擴增倍數(shù)之間的差異的表格(η = 3)。
[0123]實施例1證明，在第一周的迅猛生產(chǎn)之后，生產(chǎn)期望細胞所花的時間量通常被延長，因為在后續(xù)的培養(yǎng)階段中期望細胞的群體擴增速率降低。
[0124]實施例2:縮短增加期望細胞群體所需的時間量可通過在任意指定的一個或更多個培養(yǎng)階段的開始降低期望細胞群體的細胞表面密度來實現(xiàn)。
[0125]我們假定，與第一次刺激后相比，第二次T細胞刺激后期望細胞的群體擴增速率降低是由于受限的細胞培養(yǎng)條件導(dǎo)致活化誘導(dǎo)的細胞死亡(activat1n induced celldeath, Al⑶)。例如，參照圖3A，在第一次刺激時，PBMC的EBV抗原特異性T細胞組成最多占到群體的2%，因此抗原特異性T細胞的接種密度小于2X 104/cm2，剩余的PBMC充當非增殖飼養(yǎng)細胞(視作圖3A中的CFSE陽性細胞)，其維持最優(yōu)的細胞-細胞接觸以允許抗原特異性CTL增殖。相比之下，在第9天的第二次刺激時，大多數(shù)T細胞是抗原特異性的，并且雖然組合物的總細胞大約相同，但是增殖細胞的密度高了 50倍至100倍。結(jié)果，在再刺激時，大多數(shù)細胞增殖，并且可因此快速消耗和耗盡其養(yǎng)分和O2供給。
[0126]為了確定限制培養(yǎng)條件是否對次優(yōu)的T細胞生長速率負責，我們測量了以較低細胞密度鋪板的經(jīng)活化T細胞的擴增。方法如先前的實施例1所述。
[0127]我們將經(jīng)活化EBV特異性T細胞接種于標準24孔板的孔中(每個孔具有2cm2生長表面面積)，以翻倍稀釋來產(chǎn)生范圍從I X 1Vcm2至3.1 X 1Vcm2的降低的表面密度，同時保持效應(yīng)細胞和刺激細胞的比(R: S)為4: 1，如圖3B所示。用1.25X 1Vcm2的起始CTL表面密度達到了最大CTL擴增(4.7± 1.1倍)，但是進一步稀釋降低擴增速率，如圖3B所示。我們推測，該受限的稀釋效果可能由于缺乏細胞-細胞接觸所致，因此我們用固定數(shù)量的飼養(yǎng)細胞(以1.25 X 105/cm2的表面密度鋪板的EBV-LCL)培養(yǎng)表面密度從I X 16至3.1 X 14翻倍稀釋的EBV-CTL，并且在7天周期中評價細胞擴增。我們觀察到CTL擴增從用表面密度為IX 1fVcm2的EBV-CTL時全程僅2.9±0.8倍大幅升高至用表面密度為
3.1 X 1Vcm2的EBV-CTL時的34.7± 11倍擴增，如圖3C所示。重要的是，培養(yǎng)條件的這種改變沒有使細胞的功能或抗原特異性發(fā)生變化(數(shù)據(jù)未示出)。因此，經(jīng)活化抗原特異性T細胞群體能夠進行比常規(guī)培養(yǎng)方法所允許的更大的擴增。注意，無論起始表面密度是多少，刺激后所達到的最大表面密度(1.7X 1Vcm2至2.5X106/cm2)都相同。
[0128]因此，常規(guī)培養(yǎng)條件是限制性的，指示需要將培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比提高至超過常規(guī)的lml/cm2以使期望細胞群體能夠超過常規(guī)方法的表面密度限制。此外，通過在任何培養(yǎng)階段開始時使期望細胞群體的表面密度降低至低于常規(guī)方法可得到抗原特異性CTL擴增提高約34倍。這在細胞治療中具有重大影響，因為(where)生產(chǎn)開始時的細胞量常常是十分受限的。例如，通過將受限量的期望細胞以降低的表面密度分布于增加的表面面積上，因為群體生長速率相對于常規(guī)表面密度大幅提高，所以可在更短的時間內(nèi)得到更大的期望細胞群體。
[0129]實施例3:包含期望細胞和/或抗原呈遞細胞的細胞群體的最小表面密度可允許以非常低表面密度接種的期望細胞群體生長。
[0130]圖4示出當繼續(xù)進行圖3中描述的工作時我們獲得的結(jié)果的實例，其進一步證明當期望細胞需要其他細胞的支持時，只要期望細胞存在充分的飼養(yǎng)細胞和/或抗原呈遞細胞供應(yīng)，非常規(guī)地低期望細胞表面密度就可起始擴增。在這些實驗中，我們繼續(xù)證明具有從R: S比為8:1的約1.0 X 16期望細胞/cm2至R: S比為1: 32的僅約3900期望細胞/cm2之間的表面密度和R: S比的總細胞組合物如何可使期望細胞在我們中斷測試時極大地擴增至超過起始表面密度的50倍。
[0131]實施例4:證明允許通過以非常規(guī)地低的期望細胞表面密度起始、使群體擴增、結(jié)束階段以及重復(fù)條件來分階段重復(fù)生產(chǎn)過程的能力來提供了可重復(fù)的結(jié)果。
[0132]我們以如圖5所示的三種期望細胞表面密度(CTL/cm2)繼續(xù)實施例3所述的評估。每種特異性接種密度能夠一致地達到相同的擴增倍數(shù)。將對推斷繼續(xù)進行更詳細的的描述，因為它們涉及大大縮短期望細胞群體的生產(chǎn)時間的能力。
[0133]實施例5:在包含透氣性材料的生長表面培養(yǎng)期望細胞，而且同時提高培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比使期望細胞群體在指定的培養(yǎng)階段可翻倍之次數(shù)的數(shù)值相對于常規(guī)方法增加,并且使可達到的表面密度升高。
[0134]細胞系和腫瘤細胞、免疫表型、CFSE標記、膜聯(lián)蛋白V-7-AAD染色、鉻釋放測定、酶聯(lián)免疫斑點(ELIspot)測定、逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)和T淋巴細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及統(tǒng)計學(xué)分析如實施例I中所述。
[0135]受試裝置(以下一般稱為“G-Rex”)如圖6所示來構(gòu)造。每個G-RexlO的底20包含約0.005英寸至0.007英寸厚的透氣性硅酮膜。Wilson的未決美國公開N0.2005/0106717Al是與使用的替代透氣性材料有關(guān)的許多其他信息來源之一，并且其可用于教導(dǎo)熟練的技術(shù)人員關(guān)于透氣性培養(yǎng)裝置的形狀、特征以及對本發(fā)明的許多實施方案有益處的其他有益性質(zhì)。在實施例3中，G-Rex(稱為“G-Rex40”)具有1cm2的生長表面面積，細胞組合物(項30所示)處于所述生長表面上，細胞組合物的性質(zhì)在整個實驗中按照其中所述的變化。除非另有說明，否則培養(yǎng)基體積(項40所示)為30mL，從而建立培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比為3ml/cm2。
[0136]以4: I的常規(guī)CTL: LCL比在G_Rex40裝置中培養(yǎng)活化EBV特異性CTL和經(jīng)輻照的自體EBV-LCL。將EBV-CTL以5 X 15細胞/cm2的表面密度接種在G_Rex40中，并且將EBV-CTL群體擴增的速率與以同樣的表面密度接種于標準24孔板中的EBV-CTL進行比較，所述24孔板具有的培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比為lml/cm2。3天后，如圖7A(p =0.005)中所示，在沒有任何培養(yǎng)基更換的情況下，G-Rex40中的EBV-CTL從5 X 105/cm2增加至7.9X 1fVcm2的中位數(shù)(范圍從5.7X 1fVcm2至8.lX106/cm2)。相比之下，在常規(guī)24孔板中培養(yǎng)了 3天的EBV-CTL到第3天僅從5 X 1Vcm2的表面密度增加至1.8X 106/cm2的中位數(shù)(范圍從1.7 X 1fVcm2至2.5 X 106/cm2)。在G_Rex40中，通過補充培養(yǎng)基可進一步提高表面密度，但是在24孔板中通過補充培養(yǎng)基或IL2不能使表面密度提高。例如，在第7天補充培養(yǎng)基和IL-2后，G-Rex40中的EBV-CTL表面密度進一步提高至9.5 X 16細胞/cm2 (范圍從 8.5 X 106/cm2 至 11.0X 106/cm2)(數(shù)據(jù)未示出)。
[0137]為了理解在G-Rex裝置中的優(yōu)異細胞擴增背后的機制，我們在培養(yǎng)的第5天使用流式細胞正向比側(cè)向散射分析來評估0KT3刺激的外周血T細胞的生存力。由于培養(yǎng)物中存在可能會干擾分析的殘余的經(jīng)輻照EBV-LCL，所以在該測定中不能評估EBV-CTL。如圖7B所示，G-Rex40培養(yǎng)物中的細胞生存力顯著更高(G-Rex40中89.2%生存對24孔板中49.9%生存)。然后，我們使用膜聯(lián)蛋白-PI 7AAD來分析每天的培養(yǎng)物，持續(xù)7天，以對活細胞和凋亡/壞死細胞進行區(qū)分，并且一致地觀察到與G-Rex中的T細胞相比，24孔板中擴增的T細胞的生存力更低，如圖7C所示。這些數(shù)據(jù)指示，增殖細胞存活的積累提高對G-Rex裝置中相對于24孔板增加有貢獻。
[0138]為了確定在G-Rex對24-孔板中是否有來自細胞分裂數(shù)增加的貢獻，在第O天用CFSE標記T細胞，并將其分配至具有40ml培養(yǎng)基體積的G-Rex40裝置中以及每個孔具有2ml培養(yǎng)基體積的24孔板中。每天的流式細胞分析證明從第I天至第3天的細胞分裂數(shù)沒有差異。但是，從第三天開始，培養(yǎng)于G-Rex40中的期望細胞群體繼續(xù)以超過逐漸降低之2ml孔速率的速率增加，指示培養(yǎng)條件已經(jīng)變得受限制，如圖7D所示。因此，在G-Rex40受試裝置中期望細胞的大群體是由相對于常規(guī)方法的細胞死亡降低和保持的增殖造成的。
[0139]實施例6:通過使用非常規(guī)高的培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比以及使用包含透氣性材料的生長表面，可在生產(chǎn)過程中降低對進給培養(yǎng)物的需要，而且同時得到非常規(guī)高的期望細胞表面密度。
[0140]通過使用用于EBV: LCL之起始和擴增的G-Rex受試裝置證實了這一點。為了本實施例的目的，G-Rex2000是指圖8所描述的裝置，不同之處在于底部包含10cm2生長表面面積，并且有2000ml培養(yǎng)基體積容量可供使用。使EBV-LCL在不改變細胞表型的情況下在G-Rex2000中進行培養(yǎng)和擴增。將EBV-LCL以I X 15細胞/cm2的表面密度鋪板于G-Rex2000中，同時添加100ml完全RPMI培養(yǎng)基以產(chǎn)生10ml/cm2的培養(yǎng)基體積與表面面積之比。為了進行對比，將EBV-LCL以5X 15細胞/cm2的表面密度鋪板于T175瓶中，同時添加30ml完全RPMI培養(yǎng)基以產(chǎn)生約0.18ml/cm2的培養(yǎng)基體積與表面面積之比。如圖8A所示，在不需要任何操作或培養(yǎng)基更換的情況下，培養(yǎng)于G-Rex2000中的EBV-LCL比培養(yǎng)于T175瓶中的EBV-LCL擴增更多。如圖8B和圖8C所示，如通過對EBER和B細胞標記CD20的Q-PCR所評價的，該培養(yǎng)條件不改變最終的細胞制品。
[0141]實施例7:當在培養(yǎng)開始時沒有足夠的飼養(yǎng)細胞和/或抗原細胞存在時，期望細胞可不發(fā)生擴增。但是，可改變細胞組合物以包括另外的細胞類型來充當飼養(yǎng)細胞和/或抗原呈遞細胞從而允許擴增。
[0142]圖9示出了一個示例性實例，其中我們通過實驗證明非常低的期望細胞和抗原呈遞細胞的累積表面密度(在該情況下，AL-CTL細胞和LCL細胞組合以產(chǎn)生表面密度為30，OOO細胞/cm2的細胞組合物)不能起始AL-CTL群體的生長。然而，通過改變組合物以包含另一種細胞類型來充當飼養(yǎng)細胞可使該相同的細胞組合物生長。在這種情況下，我們評價了三個各種形式的表面密度為約0.5X 16細胞/cm2的經(jīng)輻照K562細胞的飼養(yǎng)層，并且在所有情況下，從直方圖第一圓柱描述的初始細胞組合物擴增AL-CTL群體，在14天中，從僅15，000細胞/cm2的表面密度變成4.0X 16細胞/cm2的表面密度。我們還證明，相對于添加第三種細胞類型，增加LCL群體實現(xiàn)了相似的有利結(jié)果。任意選擇用于LCL或K562的高表面密度以證實當細胞組合物包含充分數(shù)量的飼養(yǎng)細胞和/或抗原特異性細胞時可使用非常低的期望細胞群體來起始生長。當飼養(yǎng)細胞短缺、昂貴或制備麻煩時，建議將其表面密度降低至低于0.5X 16細胞/cm2。一般而言，并且如我們已經(jīng)證明的，當抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞處于細胞組合物中時，添加的抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞以及期望細胞的表面密度應(yīng)當優(yōu)選為至少約0.125 X 16細胞/cm2以在細胞組合物中產(chǎn)生足夠的表面密度從而起始期望細胞群體的擴增。此外，為了獲得超過標準表面密度限制的持續(xù)擴增，同時使用在本實施例中使用包含透氣性材料的生長表面和4ml/cm2的培養(yǎng)基體積與表面面積之比。
[0143]實施例8:降低期望細胞表面密度、改變效應(yīng)細胞與刺激細胞之比、提高培養(yǎng)基與生長表面面積之比以及周期性地以低表面密度培養(yǎng)物將細胞分布于包含透氣性材料的生長表面上，使得與其他方法相比，能夠在更短的時間周期內(nèi)生產(chǎn)更多的期望細胞并簡化生產(chǎn)過程。
[0144]為了進一步評價我們簡化和縮短期望細胞之生產(chǎn)的能力，我們使用用于EBV-CTL起始和擴增的G-Rex受試裝置。為了本實施例的目的，G-Rex500是指圖6所描述的裝置，不同之處在于底部包含10cm2生長表面面積并且有500ml培養(yǎng)基體積容量可供使用。
[0145]對于EBV-CTL生產(chǎn)的起始階段，我們將PBMC以lX106/cm2的表面密度接種于G-Rex40(總量=17的PBMC分布于G_Rex40的1cm2生長表面面積上)中，并以40: I的PBMC: EBV-LCL比用EBV-LCL刺激它們。對于CTL的生產(chǎn)，在第一刺激中優(yōu)選該40: I比來維持效應(yīng)T細胞的抗原特異性。在培養(yǎng)的起始階段后，在第9天起始第二階段，其中將I X 17效應(yīng)T細胞從G-Rex40轉(zhuǎn)移至G_Rex500受試裝置。為了起始培養(yǎng)的階段2，將200ml的CTL培養(yǎng)基放置于G-Rex500中，從在階段2開始時建立培養(yǎng)基體積與表面面積之比為2ml/cm2，生長表面上2.0cm的培養(yǎng)基高度。階段2開始時的期望細胞表面密度為I X 15CTL/cm2，并且抗原呈遞細胞的表面密度為5 X 105LCL/cm2，從而產(chǎn)生非常規(guī)的1: 5的期望細胞與抗原呈遞細胞比。該階段二的細胞密度以及R: S比在所有經(jīng)篩選的供體中產(chǎn)生了一致的EBV-CTL擴增。四天后(第13天)，將IL-2 (50U/ml終濃度)直接添加至培養(yǎng)物(如為200ml的新鮮培養(yǎng)基)中，使培養(yǎng)基體積與表面面積之比為4ml/cm2。在第16天，收集細胞并計數(shù)。獲得的CTL的中位數(shù)表面密度為6.5 X 1fVcm2 (范圍從2.4 X 16至3.5 X 17)。
[0146]與常規(guī)方案相比，使用允許提高培養(yǎng)基體積與表面面積之比(即，高于lml/cm2)的包含透氣性材料的生長表面、較低的細胞表面密度(即，低于0.5X 1fVcm2)以及改變的效應(yīng)細胞與刺激細胞比(低于4: I)縮短生產(chǎn)時間。圖1OA示出了實施例8的該G-Rex方法與使用實施例1中的常規(guī)方法和實施例5中所述之G-Rex方法的比較。如所示的，常規(guī)方法需要23天來提供與任意一種G-Rex在約10天中所能提供的一樣多的期望細胞。在23天后，實施例8的G-Rex方法能夠生產(chǎn)比實施例G-Rex方法多23.7倍的期望細胞，以及比實施例1的常規(guī)方法多68.4倍的期望細胞。此外，在不需要額外抗原呈遞細胞刺激的情況下，期望細胞直至第27至30天還在繼續(xù)分裂，前提在于當細胞表面密度高于7 X 1Vcm2時將培養(yǎng)物分開。
[0147]雖然不能使用光學(xué)顯微鏡清楚地查看G-Rex中的CTL，但是可通過眼或倒置顯微鏡觀察CTL的簇，并且細胞在培養(yǎng)的第9、16和23天的外觀在圖1OB中示出。如圖1OC所示，G-Rex中的培養(yǎng)不改變擴增的細胞的表型，細胞組合物中高于90%是⑶3+細胞(96.7±1.7對92.8±5.6 ;G-Rex對 24孔板)，其主要為 CD8+(62.2% ±38.3 對75% ±21.7)。對活化標志物⑶25和⑶27以及記憶標志物⑶45R0、⑶45RA和⑶62L的評價證明在各培養(yǎng)條件下擴增的EBV-CTL之間不具有實質(zhì)性差異。抗原特異性也未受培養(yǎng)條件的影響，如通過ELIspot和五聚體分析所測量的。圖1OD示出，其中用來自EBV的LMP1、LMP2、BZLFl和EBNAl肽表位刺激T細胞并且經(jīng)HLA-A2-LMP2肽五聚體染色法染色的代表性培養(yǎng)物示出相似的肽特異性T細胞頻率。此外，如圖1OE所示，如通過51Cr釋放測定評價的，經(jīng)擴增的細胞保持了它們的溶細胞活性和特異性并且殺傷自體EBV-LCL (在20: I的E: T比時62% ±12對57% ±8 ；G-Rex對24孔板)，而對HLA錯配的EBV-LCL具有低殺傷(20:1比時15% ±5對 12% ±7)。
[0148]對改進的用于細胞治療之細胞生產(chǎn)的多種新方法的討論:已經(jīng)呈現(xiàn)了實施例1至8以向熟練的技術(shù)人員證明可怎樣使用多種條件來加快和簡化用于細胞治療的研究應(yīng)用和臨床應(yīng)用的細胞生產(chǎn)，所述多種條件包括在生產(chǎn)循環(huán)開始時降低期望細胞群體的表面密度、降低效應(yīng)細胞和刺激細胞之間的表面密度比、生長表面包含透氣性材料和/或提高培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比。雖然實施例1至8涉及抗原特異性T細胞的生產(chǎn)，但是這些新培養(yǎng)條件可應(yīng)用于與臨床有關(guān)的(或者概念小鼠模型的臨床前證據(jù)所需的)多種重要的懸浮細胞，其包括:調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、天然殺傷細胞(NK)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、原代T淋巴細胞、廣泛種類的抗原特異性細胞，以及許多其他細胞(所有這些細胞還都可進行遺傳改造以改進其功能、體內(nèi)持久性或安全性)。細胞可與飼養(yǎng)細胞和/或抗原呈遞細胞一起擴增，所述飼養(yǎng)細胞和/或抗原呈遞細胞可包括PBMC、PHA母細胞、0KT3T、B母細胞、LCL和K562，(天然表達或經(jīng)遺傳改造以表達抗原和/或表位以及共刺激分子，例如41BBL、0X40L、ra80、ra86、HLA以及許多其他分子)，這些細胞可用肽和/或相關(guān)抗原進行刺激，或不進行刺激。
[0149]非常規(guī)地低起始表面密度:本發(fā)明的一個方面是發(fā)現(xiàn)了可通過使用更低的期望細胞表面密度來相對于常規(guī)方法縮短生產(chǎn)時間。在該方式中，期望細胞能夠在其最小細胞表面密度和最大細胞表面密度之間具有比常規(guī)方法所允許的更大數(shù)值差。優(yōu)選地，當期望細胞群體生長的數(shù)量開始降低，但是期望細胞的量尚不足夠多來終止生產(chǎn)時，再次以低起始表面密度將期望細胞重新分布(redistribute)于包含透氣性材料的另外的生長表面上。
[0150]現(xiàn)在描述一個實施例，以解釋如何應(yīng)用我們的新細胞生產(chǎn)方法，所述方法依賴于在任意指定培養(yǎng)階段開始時較低的表面密度。圖11示出了在常規(guī)情況下期望細胞群體在生長表面上的擴增與使用本發(fā)明之一個方面的期望細胞類型的群體擴增相比較的圖示。在該新方法中，生產(chǎn)階段開始時期望細胞的表面密度低于常規(guī)表面密度。為了著重于該新方法的優(yōu)點，該解釋不描述最初得到期望細胞群體的過程。培養(yǎng)的“天”從“O”開始，以使熟練的技術(shù)人員更容易地確定該新方法的相對時間優(yōu)點。在本實施例中，常規(guī)方法的各生產(chǎn)循環(huán)都以0.5X 16期望細胞/cm2的常規(guī)表面密度開始，而本實施例的各生產(chǎn)循環(huán)都以低得多的0.125X 106期望細胞/cm2的非常規(guī)表面密度開始。因此，在本實施例中需要常規(guī)方法所需的4 (即，500，000/125，000)倍的表面面積來起始培養(yǎng)。在本實施例中，常規(guī)方法的期望細胞在第14天達到2X 16細胞/cm2的最大表面密度。因此，Icm2的生長面積提供了 2X 16細胞/cm2，然后使用0.5X 16細胞/cm2的常規(guī)起始密度將所述細胞重新分布于4cm2生長面積上(即，4cm2乘以0.5X 16細胞=2X 16細胞)，使得生產(chǎn)可繼續(xù)進行。該循環(huán)重復(fù)另一個14天，這時再次達到最大細胞表面密度，4cm2生長表面的單位面積提供了2.0X 16細胞，總計為8.0 X 16細胞，然后將這些細胞分布于16cm2的生長面積上，并且重復(fù)生長循環(huán)以經(jīng)過42天提供總計32 X 16細胞。
[0151]圖11中描述的新方法，與使用在生產(chǎn)開始時將500，000期望細胞沉積于Icm2的常規(guī)方法不同，將這500，000細胞均勻地分布于4cm2生長面積上，以在第O天產(chǎn)生125，000期望細胞/cm2的非常規(guī)地低起始表面密度。在該實施例中，和常規(guī)方法一樣，該新方法的生長速率在第7天將要降低。本新方法中的細胞具有IXlO6細胞/cm2的表面密度。因此，在生長速率將要降低的時間點，該培養(yǎng)階段已經(jīng)生產(chǎn)了4X106細胞，然后使用0.125X 106細胞/cm2的起始表面密度將所述細胞重新分布于32cm2的生長面積上(即，32cm2乘以0.125X 16細胞=4X 16細胞)，使得階段2的生產(chǎn)可繼續(xù)進行。該生產(chǎn)循環(huán)或階段重復(fù)另一個7天至14天，此時再次達到最大細胞表面密度，32cm2生長表面的單位面積包含1.0 X 16期望細胞，從而在僅14天中產(chǎn)生了總計32 X 16細胞。注意，每個生產(chǎn)循環(huán)結(jié)束時，該新方法如何提供了和常規(guī)方法一樣的終表面密度除以起始表面密度的倍數(shù)。然而，通過在細胞進入生長之前降低起始細胞表面密度以及完成各生產(chǎn)階段，極大縮短了生產(chǎn)時間。該實施例描述了如何通過相對于常規(guī)細胞表面密度降低期望細胞密度(在該情況下降低至0.125X 16細胞/cm2)在常規(guī)方法的僅33%的時間內(nèi)(14天對42天)提供相同量的期望細胞。
[0152]雖然我們使用0.125X 16細胞/cm2來定量該優(yōu)點，但是熟練的技術(shù)人員應(yīng)當清楚本發(fā)明的該實施例證明任何低于常規(guī)細胞表面密度的降低都將縮短生產(chǎn)持續(xù)時間。此外，熟練的技術(shù)人員將意識到，在本文呈現(xiàn)的該新方法和其他新方法中，所描述的細胞生長速率以及細胞生長降低發(fā)生的時間點僅用于舉例說明的目的，并且實際速率將基于多種條件(例如培養(yǎng)基組合物、細胞類型等)在各個應(yīng)用中不同。此外，對于指定的應(yīng)用，熟練的技術(shù)人員將意識到，本發(fā)明該方面的優(yōu)點是，在任何具體應(yīng)用中使細胞表面密度降低至低于常規(guī)細胞表面密度導(dǎo)致生產(chǎn)時間縮短，其中在該例證性的實例中使用的具體常規(guī)表面密度可在不同應(yīng)用之間不同。
[0153]因此，現(xiàn)在描述了本發(fā)明方法的一個方面，當有需要通過使用降低細胞表面密度來使生產(chǎn)存在于細胞組合物中的指定量的期望細胞的生產(chǎn)時間最小化時。期望細胞應(yīng)當以非常規(guī)低的細胞表面密度沉積在生長表面上，以使得:
[0154]a.期望細胞在抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞的存在下，并且如果生長表面不包含透氣性材料則培養(yǎng)基體積與表面面積之比小于lml/cm2，如果生長表面包含透氣性材料則培養(yǎng)基體積與表面面積之比小于2ml/cm2，并且
[0155]b.在生產(chǎn)循環(huán)開始時優(yōu)選的表面密度條件使得靶細胞表面密度優(yōu)選低于0.5 X 16細胞/cm2并且更優(yōu)選如圖4所述降低，并且
[0156]c.期望細胞的表面密度加抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞的表面密度優(yōu)選為至少約 1.25X 15 細胞/cm2。
[0157]基于以上實例，建議技術(shù)人員驗證，如果嘗試將抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞的表面密度進一步降低至低于1.25X 105細胞/cm2，則期望細胞群體的擴增不受到限制。我們選擇1.25 X 15細胞/cm2是基于證明當通過充分供應(yīng)抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞進行擴增時可實現(xiàn)密度非常規(guī)低的期望細胞群體生長的目標。
[0158]使用包含透氣性材料的生長表面和更高的培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比可簡化并縮短生產(chǎn)。本發(fā)明的另一個方面是發(fā)現(xiàn)使用包含透氣性材料的生長表面和超過常規(guī)比的培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比，以及重復(fù)隨著時間的推移而使用提高生長表面面積之量的生產(chǎn)循環(huán)將縮短生產(chǎn)時間。
[0159]現(xiàn)在呈現(xiàn)了一個示例性的實施例以示出這些條件如何能縮短生產(chǎn)的持續(xù)時間。圖12補充了討論以示出可通過利用包含透氣性材料的生長表面和超過lml/cm2或2ml/cm2的非常規(guī)地高培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比得到的優(yōu)點的一個實例。接下來的討論旨在向熟練的技術(shù)人員證明如何通過使用這樣的方法使包括以下的數(shù)種選項變得可用:縮短生產(chǎn)時間、降低所用的生長表面面積的量和/或降低勞動和污染風險。熟練的技術(shù)人員意識到，圖12和相關(guān)討論僅僅是一個實例，并且不限制本發(fā)明的范圍。
[0160]假定該示例性實施例的包含期望細胞群體的細胞組合物消耗約Iml每“X”時間周期。圖12示出了兩種生產(chǎn)方法，標為“常規(guī)方法”和“新方法”。在生長開始時，每種方法都以表面密度為0.5 X 1Vcm2的期望細胞開始。但是，新方法中的生長表面包含透氣性材料，并且培養(yǎng)基體積與表面面積之比為2ml/cm2，相比之下，常規(guī)方法為lml/cm2。在時間周期“X”中，常規(guī)方法的期望細胞群體達到了 2X106/cm2的表面密度平臺并且耗盡了養(yǎng)分，而新方法的額外培養(yǎng)基體積允許生長繼續(xù)，并且期望細胞表面密度為3X 106/cm2。如果新方法繼續(xù)進行，則其達到4X 1fVcm2的表面密度。因此，產(chǎn)生了許多有益的選擇。新方法可在“X”時間之前終止并生產(chǎn)比常規(guī)方法更多的細胞，可在“X”時間處終止并生產(chǎn)常規(guī)方法1.5倍的細胞，或者可繼續(xù)進行直至耗盡培養(yǎng)基的養(yǎng)分并在兩倍的時間內(nèi)產(chǎn)生2倍于常規(guī)方法的期望細胞，但無需控制裝置來進給。對于常規(guī)方法，為了得到同樣多的細胞，必須收獲細胞并且重起所述過程，增加了勞動和可能的污染風險。因為細胞治療應(yīng)用通常僅能夠用固定數(shù)量的細胞開始，所以常規(guī)方法不允許簡單增加生產(chǎn)開始時的表面面積的選擇。
[0161]圖13繼續(xù)了圖12的實施例以顯示多于一個生產(chǎn)循環(huán)如何可成為進一步的益處。圖13示出了在常規(guī)方法下期望細胞群體在生長表面上的擴增與在本發(fā)明的一種新方法下期望細胞類型的群體擴增相比較的圖示，其中新方法的表面密度超過了常規(guī)方法的表面密度。為了著重于進行該實施方案，該解釋不描述得到期望細胞群體的方法。培養(yǎng)的“天”從“O”開始，以使熟練的技術(shù)人員更容易地確定本發(fā)明該方面的相對時間優(yōu)點。在該實施例中，兩種培養(yǎng)物都在“第O天”使用0.5 X 15細胞/cm2的常規(guī)期望細胞表面密度起始。在該示例性實例中，常規(guī)方法的生長表面也包含透氣性材料。但是，常規(guī)方法的培養(yǎng)基體積與生長表面之比為lml/cm2，相比之下，新方法的為4ml/cm2。如圖13所示，當在約4天中表面密度為約1.5 X 16細胞/cm2時，常規(guī)方法中的期望細胞群體的生長速率開始降低，并且在14天內(nèi)達到2 X 16細胞/cm2的最大表面密度。此時，以0.5X106/cm2的表面密度將期望細胞群體分布于1.0ml/cm2新鮮培養(yǎng)基中的4cm2生長面積上,在另一個14天中達到2 X 16細胞/cm2，并且在28天內(nèi)提供8 X 16期望細胞。相比之下，當在大概約10至11天中表面密度為約3 X 16細胞/cm2時，新方法中的期望細胞群體的生長速率開始降低，并且在28天中可達到4X 16細胞/cm2的最大表面密度。但是，為了加快生產(chǎn)，當期望細胞群體仍然處于高速率生長時即結(jié)束循環(huán)。因此，在約10至11天以0.5X 1fVcm2的表面密度將3X 16細胞重新分布于4.0ml/cm2新鮮培養(yǎng)基中的6cm2生長表面面積上，在大概另一個10至11天中期望細胞群體達到3 X 16細胞/cm2的表面密度，并且在約21天中提供18 X 16期望細胞。因此，與常規(guī)方法相比，新方法在約75%的時間中生產(chǎn)了超過2倍數(shù)量的期望細胞。
[0162]我們已經(jīng)能夠在包含透氣性材料的生長表面上得到超過1X 16細胞/cm2的細胞表面密度，這證實我們的發(fā)明使用的高表面密度方面未受到該實施例中描述的密度的限制。
[0163]因此，現(xiàn)在描述了本發(fā)明的另一個實施例，當需要通過使用降低細胞表面密度來使生產(chǎn)存在于細胞組合物中的指定量的期望細胞的生產(chǎn)時間最小化時:
[0164]a.將期望細胞接種于包含透氣性材料的生長表面面積(growth surface area)上，并且在抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞存在下，且培養(yǎng)基體積與表面面積之比為至少2ml/cm2,并且
[0165]b.在生產(chǎn)循環(huán)開始時建立優(yōu)選表面密度條件以使得靶細胞表面密度處于約0.5X 16細胞/cm2的常規(guī)密度以內(nèi)，并且
[0166]c.使期望細胞群體擴增超過約2X 16細胞/cm2的常規(guī)表面密度，并且
[0167]d.如果想要更多的期望細胞，則將期望細胞重新分布于另外的包含透氣性材料的生長表面上，并重復(fù)步驟a至d直至得到足夠的期望細胞。
[0168]當使用這些新方法時，可通過將起始培養(yǎng)的以下特征進行組合獲得進一步的益處:使用非常規(guī)地低表面面積、使用期望細胞和/或飼養(yǎng)細胞的新表面密度比、利用包含透氣性材料的生長表面面積、利用非常規(guī)地高培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比，以及按循環(huán)進行生產(chǎn)。在任意的生產(chǎn)循環(huán)中這些條件可不同以達到期望的結(jié)果，例如在生產(chǎn)時間的縮短、表面面積的利用和進給頻率之間取得平衡。
[0169]圖14示出了另一種新方法，其中相對于常規(guī)方法仍得到進一步的優(yōu)點。與本文所述的其他示例性實例一樣，熟練的技術(shù)人員將意識到，此處的描述并不限制本發(fā)明的范圍，而是用于描述如何得到改進生產(chǎn)效率的優(yōu)點。
[0170]在該實施例中，期望細胞在常規(guī)條件下每周翻倍。培養(yǎng)的“天”從“O”開始，以使熟練的技術(shù)人員更容易地確定該實施方案的相對時間優(yōu)點。此外，不重復(fù)之前描述的與飼養(yǎng)細胞和/或抗原呈遞細胞表面密度比有關(guān)的問題以簡化該實施例。出于舉例說明目的，假定常規(guī)條件中在“第O天”生產(chǎn)時存在期望細胞起始群體為500，000,并且翻倍時間為7天。常規(guī)方法以0.5X 16細胞/cm2的表面密度和lml/cm2的培養(yǎng)基體積與表面面積之比開始。如所示的，當期望細胞的群體達到2 X 16細胞/cm2的表面密度時，以0.5 X 16細胞/cm2的表面密度將所述細胞分布于另外的表面面積上，并重新開始生產(chǎn)循環(huán)。該實例的新方法以0.06X 16細胞/cm2的表面密度、包含透氣性材料的生長表面面積和6ml/cm2培養(yǎng)基體積與表面面積之比開始。如所示的，當群體接近生長平臺的開始時，將細胞重新分布于更大的生長表面面積。在這種情況下，通過注意常規(guī)方法中平臺期(plateau)的起始來確定群體到達平臺，此時細胞表面密度為培養(yǎng)基體積與表面面積之比的1.5倍(B卩，約1.5 X 16細胞/ml)。因此，在約第9天表面密度為約4.5 X 16細胞/cm2時，將細胞分布于36cm2的生長表面面積上，并重新開始生產(chǎn)循環(huán)。
[0171]圖15對圖14中描述的每種生產(chǎn)方法的比較進行制表，并延伸至各階段，以顯示新方法的強大，以及為什么在多個階段調(diào)節(jié)生產(chǎn)方案從而充分地獲得效率是明智的。注意，在僅完成生產(chǎn)循環(huán)的第二階段后，新方法就勝過了常規(guī)方法，在僅約一半的時間內(nèi)就能提供接近1.37倍的細胞，且僅需要61%的表面面積。然而，注意生產(chǎn)循環(huán)的第三階段如何創(chuàng)造了相應(yīng)于表面面積增加的大幅細胞增加。因此，應(yīng)當以該生產(chǎn)循環(huán)為模式，以預(yù)期如何在該過程的各循環(huán)中調(diào)節(jié)初始的細胞表面密度和/或最終細胞表面密度從而為任意指定的方法獲得優(yōu)化的效率水平。
[0172]例如，圖16示出了在新方法中技術(shù)人員可以如何改變變量以在生產(chǎn)過程中獲得效率的實例。例如，可進行將循環(huán)3的起始(starting)表面密度從0.06細胞/cm2提高至0.70細胞/cm2以及將最終表面密度從4.5細胞/cm2變化為7.5細胞/cm2。提高最終表面密度的實質(zhì)是將培養(yǎng)基體積與表面面積之比從初始的6ml/cm2提高至更大的數(shù)字。培養(yǎng)基體積比表面面積越大，循環(huán)保持在快速生長期(即，平臺期前的群體擴增)中越長。在這種情況下，我們已經(jīng)允許了額外5天來完成快速生長期，并且將培養(yǎng)基體積與表面面積之比提高至約8ml/cm2。在該實施例中，這樣做允許在34天中用合理的表面面積生產(chǎn)超過3萬億細胞。例如，我們已經(jīng)制造并測試了具有625cm2包含透氣性材料之生長表面的裝置。很明顯，這是比常規(guī)方法更優(yōu)異的生產(chǎn)細胞的方法。
[0173]因此，現(xiàn)在描述了本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，當需要通過使用降低細胞表面密度來使生產(chǎn)存在于細胞組合物中的指定量之期望細胞的生產(chǎn)時間最小化時:
[0174]a.將期望細胞接種于包含透氣性材料的生長表面面積上，并且在抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞存在下，且培養(yǎng)基體積與表面面積之比為至少2ml/cm2，并且
[0175]b.在生產(chǎn)循環(huán)開始時建立優(yōu)選的表面密度條件以使得靶細胞表面密度低于常規(guī)密度，優(yōu)選為約0.5 X 16期望細胞/cm2至約3900期望細胞/cm2并且期望細胞與抗原呈遞細胞和/或飼養(yǎng)細胞的總數(shù)為至少約1.25 X 15細胞/cm2，并且
[0176]c.允許期望細胞群體擴增超過約2 X 16細胞/cm2的常規(guī)表面密度，并且
[0177]d.如果想要更多的期望細胞，則將期望細胞重新分布于另外的包含透氣性材料的生長表面上，并重復(fù)步驟a至d直至獲得足夠的期望細胞。
[0178]本發(fā)明提供了細胞培養(yǎng)裝置和方法，所述裝置和方法允許優(yōu)異得多的細胞生產(chǎn)，特別是對于過繼細胞治療領(lǐng)域。其允許相對于本領(lǐng)域現(xiàn)有裝置和方法的多種益處，所述益處包括:縮短提供指定數(shù)量的細胞所需的時間、期望細胞群體從初始細胞量擴增更大的倍數(shù)、減少和甚至消除培養(yǎng)基更換頻繁的能力、簡化添加細胞因子的方法、減少甚至消除需要計數(shù)細胞以測定其量的能力、大大減少培養(yǎng)后需要與細胞分離的培養(yǎng)基的量的能力、產(chǎn)生更高效的抗原特異性細胞群體的能力，以及線性放大的能力。
[0179]實施例9:通過在培養(yǎng)方法開始時建立新培養(yǎng)條件以在靜態(tài)透氣性培養(yǎng)裝置中產(chǎn)生細胞的更有效的方法。
[0180]進行靜態(tài)細胞培養(yǎng)實驗，其中在受試裝置中培養(yǎng)K562細胞，所述裝置配置成具有包含透氣性硅酮材料的生長表面并且具有允許在生長表面上存在1cm培養(yǎng)基的壁高度。如在Wilson’ 717中更完整描述的，用生長表面支持物使生長表面保持在基本水平的位置。以超過生長表面1cm的培養(yǎng)基高度將培養(yǎng)基放入受試裝置中，建立lOml/cm2的培養(yǎng)基體積與生長面積比。將K562細胞引入受試裝置，并將該裝置放在37°C、5% C02和95% R.H的細胞培養(yǎng)箱中，借此，使細胞能夠沉降至生長表面。不對培養(yǎng)基進行灌注或受迫攪拌，并且不驅(qū)使氣體流過生長表面，而是通過環(huán)境氣氛的隨機運動來進行與生長表面的接觸。
[0181]出于舉例說明的目的，圖17A、圖17B、圖17C、圖17D和圖17E示出了實驗條件和典型結(jié)果的代表性電子表格。建立以下初始靜態(tài)培養(yǎng)條件，表面密度范圍從1.0E+06細胞/cm2至6.25E+04細胞/cm2，細胞密度范圍從1.0E+05細胞/ml至6.25E+03細胞/ml，并且所有條件中生長表面上存在的培養(yǎng)基具有恒定的1cm高度，并且所有培養(yǎng)基是葡萄糖濃度為240mg/dl的相同制劑。靜態(tài)培養(yǎng)的初始狀態(tài)是第O天，并且在第4天、第8天、第11天評估細胞計數(shù)和葡萄糖濃度。
[0182]圖18比較了相對于圖17A至圖17E中詳述的每種實驗條件之表面密度增加的群體擴增倍數(shù)。通過用第11天的細胞表面密度除以第O天的細胞表面密度來確定各條件的擴增倍數(shù)。在表面密度下限為5.0E+05細胞/cm2和培養(yǎng)基高度上限為2.0cm的一系列評價中，我們得出結(jié)論，K562在透氣性袋中最佳的擴增倍數(shù)是約4.8倍。因此，虛線6示出了本領(lǐng)域現(xiàn)有的使用透氣性袋的K562生產(chǎn)方法的典型擴增倍數(shù)。我們的實驗中建立的各表面密度條件產(chǎn)生了超過本領(lǐng)域現(xiàn)有的群體擴增的群體擴增。注意，由于初始靜態(tài)培養(yǎng)表面密度降低至0.125E+06，增加細胞群體擴增倍數(shù)的能力極大地提高，隨后進一步的降低不那么有利，盡管仍然遠比本領(lǐng)域現(xiàn)有方法優(yōu)異。
[0183]進行了另一些觀察，其中我們還探索了特別地涉及將葡萄糖作為在任何指定時間存在之細胞數(shù)的潛在替代量度，以及在不進給的情況下進行延長培養(yǎng)的能力。
[0184]實施例10:無需細胞計數(shù)測定存在于靜態(tài)透氣性培養(yǎng)裝置中的群體之細胞量的新方法。
[0185]我們觀察到，盡管培養(yǎng)基以靜態(tài)狀態(tài)存在，并且在取樣之前(僅除了裝置的日常處理)不進行機械受迫混合，例如灌注、震蕩或攪拌，葡萄糖消耗速率始終指示培養(yǎng)物中的細胞數(shù)。該發(fā)現(xiàn)為進一步簡化過繼細胞治療領(lǐng)域打開了大門。例如，計數(shù)細胞以測定培養(yǎng)進展如何的操作是使用于過繼細胞治療的細胞生產(chǎn)無法實施的許多因素之一。使用替測量來代替細胞計數(shù)結(jié)合本文的本發(fā)明，給細胞生產(chǎn)帶來了更多簡化。
[0186]我們發(fā)現(xiàn)，可使用培養(yǎng)物的葡萄糖濃度作為培養(yǎng)物之群體的替代指示(indicator)。對于其中細胞存在于包含指定類型之透氣性材料的生長表面上的培養(yǎng)物，知曉培養(yǎng)物達到最大表面所需的最小總培養(yǎng)基體積以及培養(yǎng)物達到最大表面密度所需的葡萄糖濃度的總降低，為對培養(yǎng)物之群體中的細胞數(shù)的替代預(yù)測打好了基礎(chǔ)。具有了這些知識后，起始培養(yǎng)(或培養(yǎng)階段)的技術(shù)人員(one)應(yīng)確定培養(yǎng)基的基線葡萄糖濃度、培養(yǎng)基的基線體積，并且應(yīng)追蹤在群體估計時間進行葡萄糖濃度測量之前添加至培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基體積。估計的群體中的細胞數(shù)是與達到最大細胞密度所需的葡萄糖濃度之總降低的比例乘以與達到最大表面密度乘以所需的最小培養(yǎng)基體積的比例并且乘以在生長表面上可能的最大表面密度的函數(shù)。
[0187]我們向本發(fā)明多個公開內(nèi)容中描述的培養(yǎng)物應(yīng)用該方法，其中實驗裝置的生長表面包含約0.006英寸至0.0012英寸厚的_■甲基娃麗。進行了一系列實驗以確定細胞達到最大表面密度所需的最小培養(yǎng)基體積，以及相應(yīng)的葡萄糖濃度的總降低。對于具有包括K562、LCL和T細胞等多種細胞類型的培養(yǎng)，葡萄糖濃度的總降低為約250mg/dl。我們能夠建立預(yù)測培養(yǎng)物中細胞數(shù)的關(guān)系式，如下所示，其中:
[0188]A =培養(yǎng)基的基線葡萄糖濃度
[0189]B =在群體估計時測量的葡萄糖濃度
[0190]C =達到最大表面密度所需的葡萄糖濃度的總降低
[0191]D=培養(yǎng)基的基線體積
[0192]E =基線后添加的培養(yǎng)基體積
[0193]F =達到最大表面密度所需的最小總培養(yǎng)基體積
[0194]G =最大表面密度
[0195]E=生長表面的表面積
[0196][(A-B)/C] X[(D+E)/F] XGXE =估計的裝置中培養(yǎng)群體的細胞數(shù)。注意，與最小培養(yǎng)基體積的比例不能大于100%，因為額外的培養(yǎng)基不會使表面密度提高至超過最大容積。例如，如果培養(yǎng)需要1ml達到最大表面密度，并且培養(yǎng)基的基線體積+添加的培養(yǎng)基體積大于1ml,技術(shù)人員應(yīng)使用100%作為與最小培養(yǎng)基體積的比例。
[0197]注意，該預(yù)測式需要細胞培養(yǎng)應(yīng)用的知識，細胞存在于包含熟練的技術(shù)人員選擇之透氣性材料的生長表面的條件下的最大細胞密度(和/或最大表面密度)?？蛇M行實驗來做出測定。例如，為了測定我們實驗裝置的包含透氣性材料(如前文所述的二甲基硅酮)的生長表面上K562細胞的最大細胞表面密度，我們增加培養(yǎng)基高度直至表面密度不能再升高。支持K562的最大可達到表面密度(約12.0E+06細胞/cm2)所需的最小培養(yǎng)基體積確定為1ml,并且相應(yīng)的葡萄糖濃度的總降低為250mg/ml。
[0198]以下是關(guān)于如何使用該信息以評估K562培養(yǎng)物中細胞數(shù)的示例性實例。對于第一個實例，假定在培養(yǎng)開始后不添加培養(yǎng)基并且存在這些條件:
[0199]基線培養(yǎng)基體積=1ml
[0200]基線葡萄糖濃度=475mg/dl
[0201]添加的培養(yǎng)基=Oml
[0202]葡萄糖樣品=300mg/dl
[0203]生長表面的表面積=10cm2
[0204]然后將按照以下進行計算:
[0205][(475mg/dl-300mg/dl)/250mg/dl)X (10ml+0ml)/10ml]X12E+06 細胞/cm2X 10cm2 = 840 X 16 細胞。
[0206]對于另一個實施例，假定在培養(yǎng)開始后不添加培養(yǎng)基并且存在這些條件:
[0207]基線培養(yǎng)基體積=6ml
[0208]基線葡萄糖濃度=475mg/dl
[0209]添加的培養(yǎng)基=2ml
[0210]葡萄糖樣品=300mg/dl
[0211]生長表面的表面積=10cm2
[0212]然后將按照以下進行計算:
[0213][ ((475mg/dl-300mg/dl) /250mg/dl) X (6ml+2ml) /10ml] X 12E+06 細胞 /cm2X 10cm2 = 672 X 16 細胞。
[0214]對于又一個實施例，假定在培養(yǎng)開始后不添加培養(yǎng)基并且存在這些條件:
[0215]基線培養(yǎng)基體積=6ml
[0216]基線葡萄糖濃度=475mg/dl
[0217]添加的培養(yǎng)基=7ml
[0218]葡萄糖樣品=300mg/dl
[0219]生長表面的表面積=10cm2
[0220]然后，因為添加到培養(yǎng)物的總培養(yǎng)基體積超過了達到最大表面密度所需的最小總培養(yǎng)基體積，所以與最小培養(yǎng)基體積的比例變成100%，因此，比值等于1，并且將按照以下進行計算:
[0221][ ((475mg/dl-300mg/dl) /250mg/dl) X (I) ] X 12E+06 細胞 /cm2X100cm2 =840 X 16 細胞。
[0222]熟練的技術(shù)人員應(yīng)當清楚，通過預(yù)先確定當存在于包含特定透氣性材料的生長表面上時特定的細胞類型在培養(yǎng)基中可達到的最大細胞密度(細胞/cm2)，可使用替代的關(guān)系式來估計培養(yǎng)物中的細胞數(shù)。在這種情況下，該關(guān)系式應(yīng)為以下的函數(shù):(與達到最大細胞密度所需的葡萄糖濃度之總降低的比例)X (培養(yǎng)開始時的培養(yǎng)基體積+向培養(yǎng)物中添加的培養(yǎng)基體積)X (最大細胞密度)。建議，在累積的培養(yǎng)基體積大于達到最大表面密度所需的最小培養(yǎng)基體積的情況下，應(yīng)當用最小培養(yǎng)基體積代替累積體積(因為額外的培養(yǎng)基體積不會使表面密度增加至超過其最大值)。
[0223]為了幫助理解該式的預(yù)測能力，我們將培養(yǎng)物的細胞數(shù)預(yù)測包括于圖17A至圖1E示出之條件的每個電子表格的第10行(通過生長表面面積歸一化)。將第10行與第12行的計數(shù)之細胞進行對比，示出如何能夠通過使用葡萄糖而非細胞計數(shù)以合理的可信度在指定時間測定培養(yǎng)物中的細胞數(shù)量。事實上，由于不能確保在計數(shù)之前使細胞均勻混合到培養(yǎng)基中，細胞計數(shù)可能不那么準確。因此，基于葡萄糖的測量可更加有益。在一個優(yōu)選實施方案中，在至少4天內(nèi)，更優(yōu)選5天內(nèi)，更優(yōu)選6天內(nèi)，更優(yōu)選7天內(nèi)，更優(yōu)選8天內(nèi)不進行細胞計數(shù)，并且甚至更優(yōu)選直至培養(yǎng)終止時才進行細胞計數(shù)。
[0224]進行了更多實驗來確定，當培養(yǎng)開始時的葡萄糖濃度不同時指示裝置中葡萄糖消耗與活細胞之間的關(guān)系的式是否準確。受試裝置與前文的那些描述一致。出于舉例說明的目的，圖19A示出在除了葡萄糖濃度之外相同的起始條件下培養(yǎng)K562細胞的實驗條件和典型結(jié)果的代表性電子表格，所述葡萄糖濃度為培養(yǎng)開始時240mg/dl對475mg/dl。將結(jié)果以圖表的方式描述于圖19B、圖19C、圖19D、圖19E和圖19F中。將通過細胞計數(shù)得到的群體生長和通過葡萄糖消耗預(yù)測的群體生長對表面密度歸一化。
[0225]圖19B示出了在各條件下在11天的時間周期內(nèi)群體的擴增。群體生長速率稍有不同，但是在11天內(nèi)達到了約相同的數(shù)量。圖19C示出了每種培養(yǎng)條件下葡萄糖消耗速率。圖19D示出了每種培養(yǎng)條件下葡萄糖消耗速率。圖19E示出了對起始葡萄糖濃度為240mg/dl之培養(yǎng)物使用細胞數(shù)量之計算公式預(yù)測的值與通過手動計數(shù)測定的細胞數(shù)量的重疊圖。圖19F示出了對起始葡萄糖濃度為475mg/dl之培養(yǎng)物使用細胞數(shù)量之計算公式預(yù)測的值與通過手動計數(shù)測定的細胞數(shù)量的重疊圖。注意到公式的預(yù)測能力與手動細胞計數(shù)相近。這還證明，本發(fā)明的多種實施方案可用于與用培養(yǎng)基中溶質(zhì)濃度的替代測量來代替細胞計數(shù)頻率并減少甚至消除細胞計數(shù)頻率的方法進行組合。
[0226]當技術(shù)人員希望使用Wilson’717或Wilson’ 176中描述的透氣性裝置時,這是相對于細胞計數(shù)的特別強大的優(yōu)點。熟練的技術(shù)人員將意識到在這樣的裝置中得到準確的細胞分布的困難，以及潛在的由于細胞在培養(yǎng)基中的不良分布導(dǎo)致的錯誤計數(shù)。因此，僅依靠培養(yǎng)基樣品的替代測量代替實際的細胞計數(shù)在過繼細胞治療領(lǐng)域中具有極大的益處。
[0227]具備了該知識后，包括Wilson’ 717或Wilson’ 176所描述的那些在內(nèi)的透氣性裝置的制造商可提供簡化的細胞生產(chǎn)方法，其可通過提供包含含有透氣性材料之生長表面的透氣性培養(yǎng)裝置以及提供使用說明和/或傳播涉及本發(fā)明公開內(nèi)容的信息來無需細胞計數(shù)而容易地測定透氣性裝置內(nèi)培養(yǎng)物中的活細胞數(shù)。
[0228]實施例11:通過在培養(yǎng)過程開始時建立新條件以限制靜態(tài)培養(yǎng)物中的進給頻率從而提供在靜態(tài)透氣性培養(yǎng)裝置中復(fù)雜性更低產(chǎn)生細胞的方法。
[0229]我們進行了一系列實驗以確定通過使用本文公開的新方法相對于本領(lǐng)域現(xiàn)有的需要每兩至三天進行進給的培養(yǎng)方法降低進給頻率的能力。
[0230]在包含具有含透氣性材料之表面面積的生長表面和容積因培養(yǎng)基高度可變的的裝置中進行實驗。以下描述了比較培養(yǎng)基體積和進給頻率的實驗來舉例說明我們的發(fā)現(xiàn)。將K562細胞和培養(yǎng)基引入裝置，并將它們放在37C、5% C02和95% R.H的細胞培養(yǎng)箱中，由此使細胞能夠以前文描述確定的有利于優(yōu)異群體擴增倍數(shù)的0.125E+06細胞/cm2之表面密度沉降至生長表面。
[0231]培養(yǎng)基以2.5cm、5.0cmU0.0cm或15.0cm的高度存在于包含硅酮并且具有10cm2表面面積的生長表面上方。如在Wilson’ 717中更完整描述的，用生長表面支持物使生長表面保持在基本水平的位置。因此，實驗條件包括2.5ml/cm2、5.0ml/cm2、10.0ml/cm2和15.0ml/cm2的培養(yǎng)基體積與生長表面之表面面積的比。因此，初始細胞密度分別為0.05E+06 細胞 /ml,0.025E+06 細胞 /ml,0.0125E+06 細胞 /ml 和 0.008E+06 細胞 /ml。
[0232]不向10.0ml/cm2或15.0ml/cm2條件中添加另外的培養(yǎng)基。2.5m I/cm2條件的初始培養(yǎng)基體積，通過在第11天添加2.5ml/cm2的新鮮培養(yǎng)基而翻倍，通過在第14天添加另一份2.5ml/cm2的新鮮培養(yǎng)基而成為三倍，并且通過在第17天添加另一份2.5ml/cm2的新鮮培養(yǎng)基而成為四倍。5.0ml/cm2條件的初始培養(yǎng)基體積通過在第11天添加5.0ml/cm2的新鮮培養(yǎng)基而翻倍。最終，2.5m I/cm2和5.0ml/cm2條件保持為10.0ml/cm2的新鮮培養(yǎng)基。
[0233]圖20示出了在多種培養(yǎng)基進給條件下對生長表面面積歸一化的群體生長圖解。
[0234]注意到所有條件最終都達到大約相同的活細胞數(shù)量。然而，不依賴于在培養(yǎng)期間添加培養(yǎng)基的條件比其他條件更快到達最大活細胞數(shù)量。例如，2.5ml/cm2條件花了 20天到達最大密度，而在培養(yǎng)開始后不接收新鮮培養(yǎng)基的條件到達相同的最大活細胞數(shù)量僅花了 11天。此外，在不進給的條件中群體的生長速率優(yōu)異得多。此外重要的是，以15.0cm高度的培養(yǎng)基起始培養(yǎng)的條件相對于10.0cm條件示出了將細胞的高生存力持續(xù)時間延長的能力。例如，在15.0cm中，相對高的生存力在達到最大細胞群體后保持約4天的時間，而在10.0cm的條件下，其在約I至2天后即迅速降低。此處創(chuàng)造的實際益處是具有更長的一段時間來回收細胞的生產(chǎn)方法。過繼細胞治療領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將意識到這一點的價值，因為存在許多原因使技術(shù)人員從更長的細胞回收時間窗得出價值，從獲得質(zhì)量控質(zhì)測量結(jié)果的延遲到改變患者的病癥。
[0235]熟練的技術(shù)人員將意識到，與用于本領(lǐng)域現(xiàn)有的用于過繼細胞治療的方法相比，所有實驗培養(yǎng)條件都表現(xiàn)出優(yōu)異的細胞群體擴增速率，但是應(yīng)清楚，不僅在開始培養(yǎng)時相對于本領(lǐng)域現(xiàn)有方法降低表面密度是有益的，還可能通過增加培養(yǎng)基高度和/或提高培養(yǎng)基與生長面積比來縮短用于生產(chǎn)期望細胞數(shù)所需的持續(xù)時間。熟練的技術(shù)人員應(yīng)當意識至IJ，由于采用了更低的表面密度和更大的培養(yǎng)基高度和/或提高的培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比，在群體擴增速率方面將得到改進，并且促使在培養(yǎng)基的使用和應(yīng)用的需要之間取得平衡。如果尋求更長的收獲細胞時間窗同時使細胞保持高生存力，可在培養(yǎng)開始時可提供更多培養(yǎng)基。注意，即使技術(shù)人員以本領(lǐng)域現(xiàn)有的表面密度或更高的表面密度(例如2.0E+06或更高)來起始，所述方法仍然可為優(yōu)異的，因為本發(fā)明的實施方案可降低進給頻率并且降低對細胞群體快速失去生存力的擔心?？偟膩碚f，已經(jīng)證明了廣泛的選擇。為了用最小的進給頻率和縮短的生產(chǎn)持續(xù)時間來生產(chǎn)細胞群體，用于生產(chǎn)的最優(yōu)選初始培養(yǎng)條件是，細胞密度低于0.5E+06細胞/cm2并且最優(yōu)選約0.125E+06細胞/cm2，以及培養(yǎng)基高度為約5.0cm或更高并且更優(yōu)選10.0cm至15.0cm，和/或培養(yǎng)基體積比生長表面面積為約5.0ml/cm2或更高并且更優(yōu)選10.0ml/cm2至15.0ml/cm2，和/或初始細胞密度約0.025E+06細胞/ml或更低并且更優(yōu)選約0.0125E+06細胞/ml至約0.008E+06細胞/ml。
[0236]實施例12:限制存在于靜態(tài)透氣性培養(yǎng)裝置中的共培養(yǎng)物的進給頻率并且測定細胞群體大小而無需計數(shù)細胞(即使部分細胞正在死亡亦如此)的新方法。
[0237]過繼細胞治療經(jīng)常依靠與因為其受過輻照正在死亡的細胞(例如APC)或者由于離開身體而導(dǎo)致正在死亡的細胞(例如PBMC)的共培養(yǎng)。共培養(yǎng)應(yīng)用的一個好實例是在對來自PBMC群體的CMV-CTL (巨細胞病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞)的培養(yǎng)。初始地，CMV-CTL群體相對于總PBMC群體是非常小的百分比。隨著培養(yǎng)進行，PBMC開始死亡，并且CMV-CTL開始生長。在培養(yǎng)結(jié)束時，細胞組合物中CMV-CTL的頻率已經(jīng)極大地提高了。前文公開的本發(fā)明的性質(zhì)(包括與本領(lǐng)域現(xiàn)有方法相抵觸的那些性質(zhì)，例如降低細胞密度)可用于降低應(yīng)用(例如這些)的進給頻率。
[0238]我們進行了靜態(tài)細胞培養(yǎng)實驗以評估在共培養(yǎng)物中存在正在死亡細胞的情況下葡萄糖測量預(yù)測細胞群體的能力。實驗裝置包含含有透氣性硅酮并且表面面積為10cm2的生長表面。如在Wilson’717中更完整描述的，生長表面包含硅酮并且被生長表面支持物保持在基本水平的位置。圖21示出了總結(jié)第O天、第9天和第16天至條件的電子表格。將PBMC培養(yǎng)基引入實驗裝置，并將該裝置放在37C、5% C02和95% R.H的細胞培養(yǎng)箱中，借此，使細胞能夠以5.0E+05細胞/cm2的表面密度沉降至生長表面。培養(yǎng)基以10.0cm的高度存在，并且細胞密度為5.0E+04。在第O天、第9天和第16天進行葡萄糖測量。除了日常處理之外，培養(yǎng)培養(yǎng)基和細胞不通過用機械設(shè)備輔助的受迫混合(例如灌注、振蕩或攪拌等)進行混合。第3行示出抗原特異性T細胞(CMV-CTL)的百分比提高至細胞組合物群體的約27.9%，并且第4行示出CMV-CTL擴增倍數(shù)(按照總?cè)后w的百分比)如何在第9天后降低。這是因為PBMC在死亡。
[0239]第19行證實了培養(yǎng)基中溶質(zhì)的替代測量預(yù)測培養(yǎng)物中細胞數(shù)量的能力。注意到該預(yù)測值幾乎與通過計數(shù)評估的細胞群體相同。因此，使用替代測量來定量細胞群體的能力即使在細胞組合物中的組成正在死亡的細胞組合物中也是可用的。
[0240]實施例13:能夠簡化培養(yǎng)基更換方法的新靜態(tài)透氣性細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置以及用于在細胞生產(chǎn)過程完成后極大降低從培養(yǎng)基中分離細胞所需之努力的新方法。
[0241]圖22k示出本發(fā)明之細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置1000的一個實施方案的一個實例的截面圖，所述裝置1000配置成實施所公開的新細胞培養(yǎng)方法和/或新細胞回收方法。細胞移出導(dǎo)管1004的細胞移出開口 1002存在于生長表面1006的附近。培養(yǎng)基移出導(dǎo)管1010的培養(yǎng)基移出開口 1008接近生長表面1006存在。生長表面1006包含透氣性材料。對于熟練的技術(shù)人員，存在許多信息來源去了解合適的包括Wilson’ 717的透氣性材料。優(yōu)選地，生長表面1006是不滲透液體的并且不是多孔的(non-porous)。從生長表面1006到內(nèi)部體積1014的上擋邊(confine) 1012的距離定義出了培養(yǎng)基可存在的空間體積。雖然培養(yǎng)基可在可延伸至超過上擋邊1012之高度的培養(yǎng)基移出導(dǎo)管1010和細胞移出導(dǎo)管1004中存在，但是出于描述該實施方案的目的，熟練的技術(shù)人員應(yīng)認為最大培養(yǎng)基高度是從內(nèi)部體積1014的底部至上擋邊1012的最遠距離。細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置不需要攪拌機械或任何其他機械來混合細胞和/或培養(yǎng)基。
[0242]圖22B示出了在培養(yǎng)的任何指定細胞生產(chǎn)階段起始時處于靜態(tài)培養(yǎng)之初始狀態(tài)的細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置1000。細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置1000以這樣的位置存在，其中生長表面1006定向為水平位置并且細胞沉降于生長表面1006。在該示例性實施方案中，生長表面支持物1018用于將生長表面保持在水平位置同時允許環(huán)境氣體與生長表面1006接觸而無需泵或其他機械以驅(qū)使氣體通過生長表面1006。熟練的技術(shù)人員可參考Wilson’ 717關(guān)于如何配置生長表面支持物1018的信息，熟練的技術(shù)人員。雖然培養(yǎng)基1020可以任意水平存在于內(nèi)部體積1014的擋邊以內(nèi)，但是優(yōu)選地，整個培養(yǎng)基的最高位置1022與生長表面1006平行，如所示出的。細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置1000存在于適于細胞培養(yǎng)的氣氛中，并且處于適于細胞培養(yǎng)的溫度下。環(huán)境氣體通過隨機運動與生長表面1006的透氣性材料接觸，并且無需使用泵或其他機械來迫使氣體去向生長表面1006或離開生長表面 1006。
[0243]由從最低培養(yǎng)基位置到最高培養(yǎng)基位置的距離確定培養(yǎng)基高度，在這種情況下，在培養(yǎng)開始時從生長表面1006到培養(yǎng)基最高培養(yǎng)基位置1022的距離成為了初始靜態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基高度。已經(jīng)沉降于生長表面1006的細胞1016的數(shù)量與培養(yǎng)基1020之體積的比是初始靜態(tài)培養(yǎng)細胞密度。生長表面1006上的細胞1016的數(shù)量與生長表面1006表面面積的比是初始靜態(tài)培養(yǎng)表面密度。培養(yǎng)基1020體積與生長表面1006之表面面積的比是初始靜態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比。細胞以靜態(tài)培養(yǎng)的狀態(tài)存在，并且培養(yǎng)持續(xù)一段時間。如縱貫本公開內(nèi)容所描述的，所述時間段可包括或不包括基于包括以下變量的培養(yǎng)基補充步驟:初始靜態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基高度、初始靜態(tài)培養(yǎng)細胞密度、初始靜態(tài)培養(yǎng)表面密度和/或初始靜態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比。
[0244]圖22C示出了另一些步驟以從細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置1000中回收減少體積之培養(yǎng)基中的細胞。通過培養(yǎng)基移出導(dǎo)管1010中的培養(yǎng)基移出開口 1008移出培養(yǎng)基，同時不抽出細胞1016。在該步驟后，示出的剩余培養(yǎng)基作為細胞回收培養(yǎng)基1024。所剩余的細胞回收培養(yǎng)基越少，從培養(yǎng)基分離細胞的過程將變得越不復(fù)雜，該過程是用于過繼細胞治療的本領(lǐng)域現(xiàn)有方法所固有的并且目前依靠大量的離心。然而，關(guān)鍵是技術(shù)人員注意不損失顯著量的細胞同時減小培養(yǎng)基體積。優(yōu)選地，損失少于10%的細胞，并且更優(yōu)選幾乎不損失細胞。為了進一步指導(dǎo)，我們描述了一個我們使用本發(fā)明該方面的實施例。在與圖22A所示相似的具有包含透氣性硅酮并且表面面積為10cm2的生長表面的透氣性裝置中，培養(yǎng)培養(yǎng)基體積為2000ml，并且在培養(yǎng)基體積減少時以20cm的高度存在，從而形成培養(yǎng)基體積比生長表面面積為200 (ml/cm2)，并且在培養(yǎng)基減少時生長表面上存在的培養(yǎng)細胞群體為約10億細胞，我們已經(jīng)證明了避免明顯的細胞損失同時得到100倍的培養(yǎng)基體積減少和建立細胞回收時的一系列條件的能力，其特征在于細胞回收培養(yǎng)基高度僅為0.2cm(當生長表面處于水平位置時測定)并且細胞回收培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比僅為0.2ml/em2。然后，我們混合培養(yǎng)基(在這種情況下通過在裝置中漩動(swirl)培養(yǎng)基)，這容易的使細胞從生長表面升起，并且將細胞分布到細胞回收培養(yǎng)基中。接著，我們通過細胞移出導(dǎo)管中的細胞移出開口移出細胞。細胞移出開口位于沿著裝置的邊緣，我們使裝置傾斜以能夠在細胞移出開口的位置處收集培養(yǎng)基。收集細胞和細胞回收培養(yǎng)基后，我們檢測細胞回收培養(yǎng)基中的細胞濃度，并且其為驚人的約5000萬細胞/ml。因此，我們能夠在沒有本領(lǐng)域現(xiàn)有的過繼細胞治療之靜態(tài)細胞培養(yǎng)方法所使用的任何離心設(shè)備的情況下從50萬細胞/ml的初始細胞密度以100的系數(shù)濃縮細胞，僅留下將經(jīng)歷用于細胞回收的進一步過程的級分。大體上，我們能夠?qū)⑿枰M行離心的培養(yǎng)基體積從2000ml減少至僅20ml，并且整個過程花費小于約I分鐘。
[0245]培養(yǎng)基移出導(dǎo)管的培養(yǎng)基移出開口的位置優(yōu)選位于當生長表面處于水平位置時距生長表面0.2cm或更遠。例如，對于本發(fā)明的許多細胞培養(yǎng)方法中來說，當生長表面處于水平位置時，距生長表面0.2cm至2.0cm允許顯著的體積減少。當生長表面處于水平位置時，培養(yǎng)基移出開口與生長表面之間的距離上限優(yōu)選為把將減少培養(yǎng)基以進行細胞回收時培養(yǎng)基的典型培養(yǎng)基高度考慮在內(nèi)的距離。例如，如果技術(shù)人員希望相對于本領(lǐng)域現(xiàn)有的靜態(tài)細胞培養(yǎng)方法將需要離心的培養(yǎng)基體積減少50%,則培養(yǎng)基移出導(dǎo)管的培養(yǎng)基移出開口應(yīng)位于培養(yǎng)基高度的50%處(假定該裝置設(shè)計成使得培養(yǎng)基完全存在于生長表面以上。由于實驗室空間的使用非常寶貴，裝置高度應(yīng)與期望培養(yǎng)基存在于其中的高度差不多。因此，為了提供相對于本領(lǐng)域現(xiàn)有方法處理的培養(yǎng)基體積至少降低至二分之一的選擇，一個好的經(jīng)驗法則是將裝置設(shè)計成在使用期間具有等于一般培養(yǎng)基高度或剛剛超過一般培養(yǎng)基高度的高度，并且將培養(yǎng)基移出導(dǎo)管的培養(yǎng)基移出開口定位于距生長表面約0.2cm(當生長表面處于水平位置時)至按照從裝置內(nèi)部測量的從裝置頂部到生長表面約一半的地方(halfway point)。例如，如果從裝置中生長培養(yǎng)基的上擋邊至生長表面的距離代表裝置中培養(yǎng)基的潛在高度，當生長表面處于水平位置時，培養(yǎng)基移出開口應(yīng)優(yōu)選位于生長表面上方0.2cm或更高，并且位于潛在的培養(yǎng)基高度的50%或更低。在不確定培養(yǎng)基高度將位于哪里的情況下，可在裝置中存在多于一個培養(yǎng)基移出導(dǎo)管。
[0246]細胞移出導(dǎo)管的細胞移出開口優(yōu)選位于沿著裝置的下邊緣，并且可收集細胞回收培養(yǎng)基而無需重新定向裝置。但是，如果期望的話，可重新定向裝置。圖22D示出了將細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置1000重新定向到從初始的水平細胞培養(yǎng)位置偏離角1026的位置，以相對于細胞移出導(dǎo)管1004的細胞移出開口 1002重新定位回收培養(yǎng)基1024(具有細胞1016分布于其中)，由此隨后可抽出細胞回收培養(yǎng)基1024。
[0247]但是，細胞移出導(dǎo)管的細胞移出開口不需要位于沿著裝置的下邊緣。一旦完成了使細胞混合于細胞回收培養(yǎng)基中的步驟后，可通過以下方法從裝置的任何位置移出細胞回收培養(yǎng)基:簡單地旋轉(zhuǎn)裝置直至細胞回收培養(yǎng)基位于細胞移出開口，然后通過細胞移出導(dǎo)管取出細胞回收培養(yǎng)基。熟練的技術(shù)人員應(yīng)意識到，該導(dǎo)管無需按照所示而是可為任何配置。關(guān)鍵設(shè)計特征是如前文所述的將培養(yǎng)基移出開口放置在相對于生長表面的優(yōu)選位置的能力。因此，該導(dǎo)管可以是簡單的如位于裝置側(cè)壁中的隔板(septum)或復(fù)雜的如伸縮管。熟練的技術(shù)人員還應(yīng)清楚，所述細胞培養(yǎng)和細胞回收方法不需要依賴于封閉系統(tǒng)配置，但是還可通過開放系統(tǒng)配置中的簡單方法來實施。例如，我們用在Wilson’717中描述的開放系統(tǒng)類型，使用移液管作為培養(yǎng)基移出導(dǎo)管且作為細胞移出導(dǎo)管進行了所述方法并充重復(fù)了上文描述的步驟，同時達到了上文描述的濃度。
[0248]為了獲得在本發(fā)明多個實施方案中描述的提高細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比的優(yōu)點，細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置的內(nèi)部高度應(yīng)當優(yōu)選為在任何具體應(yīng)用中至少大于2.0cm0此外，為了促進細胞培養(yǎng)和細胞回收，細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置優(yōu)選使用生物相容性材料構(gòu)造，透明的以允許肉眼評估，并且剛性的以允許容易地處理。
[0249]用于從本發(fā)明的細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置中移出培養(yǎng)基而不移出細胞的方法的發(fā)現(xiàn)創(chuàng)造了相對于本領(lǐng)域現(xiàn)有的用于過繼細胞治療的靜態(tài)細胞培養(yǎng)方法的另外的優(yōu)點，并且涉及培養(yǎng)基更換方法。雖然本公開內(nèi)容描述了避免移出或更換培養(yǎng)基以補充培養(yǎng)基的新方法，但是可存在技術(shù)人員希望進行那種過程的情況。本領(lǐng)域現(xiàn)有方法導(dǎo)致當移出和更換培養(yǎng)基時移出了細胞，因此，習慣做法是移出基質(zhì)，將其分布于一個或更多個新裝置中，然后向所有裝置添加培養(yǎng)基。因此，每當進行進給時，就存在越來越多的裝置。這在我們的新方法中不會發(fā)生，因為當通過可如移液管般簡單的導(dǎo)管去移出培養(yǎng)基時，我們本發(fā)明的細胞回收方法把細胞留在裝置中。不需要使用任何篩、過濾器或離心裝置來減少培養(yǎng)基體積而不損失細胞?？珊唵蔚匾瞥雠囵B(yǎng)基并向同一裝置中添加培養(yǎng)基直至細胞群體達到最大表面密度。
[0250]在培養(yǎng)基移出和更換的情況下，以及描述了技術(shù)人員可如何在不損失細胞的情況下移出培養(yǎng)基至高度為僅0.2cm，現(xiàn)在容易見到通過培養(yǎng)基移出導(dǎo)管的培養(yǎng)基移出開口的簡單地移出培養(yǎng)基至期望高度進行培養(yǎng)基更換，而不移出細胞，然后添加培養(yǎng)基至任何期望的體積或高度。
[0251]因此，基于本公開內(nèi)容，熟練的技術(shù)人員應(yīng)當尋求創(chuàng)立靜態(tài)透氣性細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置的優(yōu)選實施方案，其包含:
[0252]a.包含透氣性材料的生長表面，以及
[0253]b.當裝置運行時處于水平位置的生長表面，以及
[0254]c.包含培養(yǎng)基移出開口的培養(yǎng)基移出導(dǎo)管，以及
[0255]d.包含細胞移出開口的細胞移出導(dǎo)管，以及
[0256]e.內(nèi)部的體積，以及
[0257]f.定義出內(nèi)部體積最高位置的上擋邊
[0258]g.從上擋邊到生長表面的距離為潛在培養(yǎng)基高度，并且上擋邊與生長表面的距為超過2.0cm,以及
[0259]h.當生長表面處于水平位置時,存在于生長表面上方的培養(yǎng)基移出導(dǎo)管在生長表面上方的距離為至少0.2cm，并且不超過50%的潛在培養(yǎng)基高度。
[0260]所述裝置應(yīng)當優(yōu)選地包括Wilson’717中描述的裝置的相關(guān)方面。此外，基于該知識，包括Wilson’ 717中描述的那些在內(nèi)的透氣性裝置的制造商可通過向使用者提供包含含有透氣性材料的生長表面、培養(yǎng)基移出導(dǎo)管、培養(yǎng)基移出開口、細胞移出導(dǎo)管、細胞移出開口的細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置并且提供使用說明和/或傳播信息來促進更有效的細胞培養(yǎng)方法:
[0261]a.向裝置中添加細胞和培養(yǎng)基，以及
[0262]b.細胞是哺乳動物的并且是非粘附細胞類型，以及
[0263]c.將細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置放置在適于細胞培養(yǎng)的氣氛中以及適于細胞培養(yǎng)的溫度下，并且是生長表面定向為水平位置，并且細胞存在于生長表面上，以及
[0264]d.使細胞沉降于所述生長表面上，以及
[0265]e.已經(jīng)沉降于生長表面的細胞數(shù)量與培養(yǎng)基體積的比是初始靜態(tài)培養(yǎng)細胞密度，以及
[0266]f.沉降于生長表面的細胞的數(shù)量與生長表面之表面面積的比是初始靜態(tài)培養(yǎng)表面密度，以及
[0267]g.培養(yǎng)基體積與生長表面之表面積的比是初始靜態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比，以及
[0268]h.從最低培養(yǎng)基位置到最高培養(yǎng)基位置的距離為初始靜態(tài)培養(yǎng)基高度，以及
[0269]1.使細胞處于靜態(tài)培養(yǎng)狀態(tài)一段時間，并且還包括用于從細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置回收細胞的步驟，所述步驟包括:
[0270]j.預(yù)細胞回收步驟，其包括通過培養(yǎng)基移出導(dǎo)管中的培養(yǎng)基移出開口移出部分培養(yǎng)基并且不取出細胞，裝置中剩余的培養(yǎng)基體積是細胞回收培養(yǎng)基體積，以及
[0271]k.當生長表面處于水平位置時從細胞回收培養(yǎng)基的最高位置至細胞回收培養(yǎng)基的最低位置的距離是細胞回收培養(yǎng)基高度，以及
[0272]1.細胞回收培養(yǎng)基體積與生長表面之表面積的比是細胞回收培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比，以及
[0273]m.細胞回收培養(yǎng)基體積與培養(yǎng)基體積之比為培養(yǎng)基減少百分比，并且細胞回收步驟包括:
[0274]η.使細胞混合于細胞回收培養(yǎng)基中，以及
[0275]0.回收培養(yǎng)基中的細胞數(shù)量與細胞回收培養(yǎng)基之體積的比是回收的細胞密度，以及
[0276]p.通過所述細胞移出導(dǎo)管中的細胞移出開口從細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置移出細胞和細胞回收培養(yǎng)基。
[0277]優(yōu)選地，細胞回收培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比為至少0.2ml/cm2，并且培養(yǎng)基減少百分比為至少50%。對熟練的技術(shù)人員建議，該方法能夠利用本發(fā)明的任何實施方案(包括期望的初始靜態(tài)培養(yǎng)細胞密度、初始靜態(tài)培養(yǎng)表面密度、初始靜態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基體積與表面面積之比和/或初始靜態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)基高度)以提供本文所描述的優(yōu)點。此外，促進(encouraged)熟練的技術(shù)人員意識到,所述方法包括用于胰島。
[0278]實施例14:使用靜態(tài)透氣性培養(yǎng)裝置來優(yōu)異生產(chǎn)CAR T細胞的新方法。
[0279]在包含具有含透氣性材料之表面面積的生長表面和容積因培養(yǎng)基高度可變的實驗裝置中進行實驗。如在Wilson’ 717中更完整描述的，生長表面包含硅酮且表面面積為100cm2，并且被生長表面支持物保持在基本水平的位置。
[0280]評價了用于擴增經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原特異性T細胞(CAR T細胞)的三種條件。評價A包括存在K652APC細胞的CAR T細胞，并且包括1cm高度的培養(yǎng)基。評價B包括不存在K652APC細胞的CAR T細胞，并且包括1cm高度的培養(yǎng)基。評價C根據(jù)本領(lǐng)域現(xiàn)有方法培養(yǎng)CAR T細胞。
[0281]圖23A示出了在培養(yǎng)開始時和培養(yǎng)進程中評價A的條件。注意，培養(yǎng)開始時APC與CAR T細胞的比為2: 1，并且培養(yǎng)基以1cm的高度存在。圖23B示出了在培養(yǎng)開始時和培養(yǎng)進程中評價B的條件。注意，在培養(yǎng)開始時不存在APC，并且培養(yǎng)基以1cm的高度存在。圖23C示出了在培養(yǎng)開始時和培養(yǎng)進程中評價C的條件。注意，培養(yǎng)開始時APC與CAR T細胞的比為2: 1，并且培養(yǎng)基以2cm的高度存在。
[0282]與過繼細胞治療領(lǐng)域中現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)不同，在培養(yǎng)基更換期間通過向新鮮培養(yǎng)基中添加細胞因子(例如IL2)來進行細胞因子刺激。因此，細胞因子刺激與培養(yǎng)基更換同時進行。但是，如本發(fā)明多個實施方案所公開的，大大地降低了進給頻率，甚至消除了進給。因此，我們還使用了條件A和條件B來評價在沒有培養(yǎng)基更換的情況下添加細胞因子的能力。我們簡單地以相同的頻率并且以使培養(yǎng)基具有與本領(lǐng)域現(xiàn)有方法每ml相同的量添加IL2來代替培養(yǎng)基更換，并且不使培養(yǎng)基經(jīng)歷任意種類的受迫混合來使IL2分布于培養(yǎng)基中的。
[0283]圖.23D示出了在培養(yǎng)的多個時間點培養(yǎng)物中的總活細胞。如所能見到的，條件A的總活細胞數(shù)量遠比任意替代條件中的優(yōu)異。23E示出在培養(yǎng)開始時和培養(yǎng)終止時CAR T細胞表達的百分比。直方圖A表示條件A，直方圖B表示條件B，并且直方圖C表示條件C。條件B證明了在培養(yǎng)開始時在培養(yǎng)物中不提供APC的缺點。如果在培養(yǎng)開始時提供APC，則CAR表達從初始的約40%狀態(tài)提高至培養(yǎng)結(jié)束時的約80%狀態(tài)。圖23F示出培養(yǎng)期間CART細胞的總擴增倍數(shù)。清楚的是條件A能夠比條件C中示出的本領(lǐng)域現(xiàn)有方法產(chǎn)生大得多的擴增倍數(shù)。
[0284]還注意到，如圖23G所示，評價A中預(yù)測的活細胞群代表了通過手動計數(shù)測定的細胞群體。此外，用于評價A和評價B的裝置能夠在培養(yǎng)結(jié)束時使用前文公開的方法抽出培養(yǎng)基，從100ml的狀態(tài)到20ml的狀態(tài)而不損失細胞。
[0285]另一個重要的發(fā)現(xiàn)涉及培養(yǎng)中APC的存在。顯而易見的，從條件A回收的T細胞由于更多強化的T細胞產(chǎn)物而具有更大的殺傷表達相關(guān)抗原(PSCA)之腫瘤細胞的能力，在培養(yǎng)結(jié)束時，所述T細胞產(chǎn)物相對于其在培養(yǎng)開始時的狀態(tài)在群體中具有更高的表達CAR之T細胞(CAR-PSCA)百分比。通過比較，由于其在培養(yǎng)開始時不含APC，條件B不能在所有的培養(yǎng)周期內(nèi)提高細胞群體中表達CAR之T細胞(CAR-PSCA)的百分比。
[0286]圖23H示出了從條件A和條件B得到的細胞殺傷表達PSCA之腫瘤細胞并且避免殺傷不表達PSCA抗原之細胞的能力。效應(yīng)細胞與表達PSCA抗原之細胞(Dul45和Capanl)或不表達PSCA抗原之細胞(293T)的比為40: I。效應(yīng)細胞(S卩，CAR T細胞)得自培養(yǎng)之第11天的條件A和條件B的培養(yǎng)物。
[0287]圖231并排總結(jié)了使用為條件A描述的初始培養(yǎng)條件(不同之處是APC的抗原表達分別為PSCA和Mucl)，對PSCA和Mucl具有特異性的CAR T細胞群體擴增的對比?？梢娭罥J，本發(fā)明的新初始條件能夠在比本領(lǐng)域現(xiàn)有條件更短時間內(nèi)在常規(guī)培養(yǎng)器皿(ware)中生產(chǎn)大得多的CART細胞數(shù)量。熟練的技術(shù)人員將意識到，所述優(yōu)點不限于識別PSCA或Mucl抗原的CAR T細胞，而是可以用于識別任何抗原的CAR T細胞。
[0288]在更短時間內(nèi)生產(chǎn)更多細胞、增加細胞因子而不需要進行培養(yǎng)基更換或?qū)ε囵B(yǎng)基進行受迫混合、消除向培養(yǎng)物進給新鮮培養(yǎng)基的需要、避免手動計數(shù)細胞的需要、以及在細胞回收時將細胞存在于其中的培養(yǎng)基之量減少至培養(yǎng)結(jié)束時存在之體積的僅2%的能力證實了本發(fā)明的能量克服了本領(lǐng)域現(xiàn)有的用于過繼細胞治療之細胞生產(chǎn)方法中固有的許多問題。
[0289]實施例15:本發(fā)明的方法能夠相對于生長表面的表面面積進行正比例放大。
[0290]我們進行了實驗以評估本文以及母案中所描述的培養(yǎng)方法的可放大性。從小的生長面積移動到大的生長面積而無需重建方案來優(yōu)化培養(yǎng)過程是強力的優(yōu)點。為了確定情況是否如此，我們比較了在包含透氣性硅酮的表面面積為1cm2UOOcm2以及640cm2的生長表面上起始的K562培養(yǎng)結(jié)果。初始條件包括0.125E+06細胞/cm2的表面密度和1cm的培養(yǎng)基高度。培養(yǎng)開始后不補充培養(yǎng)基。
[0291]圖24A示出具有不同生長面積的三種透氣性培養(yǎng)裝置的群體生長曲線。系列I表示在640cm2裝置中培養(yǎng)物的活細胞擴增，系列2表示在10cm2裝置中的擴增，并且系列3表示1cm2裝置中的擴增。圖24B示出了曲線歸一化為表面密度的圖24A的群體生長曲線，并且清楚地證明線性的可放大性。
[0292]在熟練的技術(shù)人員尋求通過在垂直方向放大培養(yǎng)來增加生長表面面積的情況下，鼓勵他們回顧Wilson’ 176,并將意識到可使用Wilson’ 176中描述的裝置來進行本發(fā)明的多個實施方案。
[0293]優(yōu)選實施方案的一般描述:出于該公開內(nèi)容的目的，生長表面是裝置中細胞處于其上并且包含透氣性材料的區(qū)域。透氣性材料可為細胞培養(yǎng)領(lǐng)域中技術(shù)人員知曉的任何材料，并且優(yōu)選為液體不可透過的并且為無孔的。本發(fā)明的裝置和培養(yǎng)方法可在不驅(qū)使氣體通過包含透氣性材料之生長表面的情況下發(fā)生作用。這些方法適于靜態(tài)細胞培養(yǎng)。
[0294]優(yōu)選的細胞類型:在本發(fā)明的一些實施方案中，如果培養(yǎng)物包含單一的細胞類型，則細胞優(yōu)選為抗原呈遞細胞，并且更優(yōu)選LCL或K562。如果培養(yǎng)物包含共培養(yǎng)物，優(yōu)選地，其包含與APC或飼養(yǎng)細胞組合的效應(yīng)細胞(即期望細胞或祀細胞)，并且可包括或不包括珠(bead)。珠可成為APC或飼養(yǎng)細胞的替代物。如果存在APC，則它們優(yōu)選是專職性抗原呈遞細胞，并且更優(yōu)選K562或LCL類型，并甚至更優(yōu)選是經(jīng)輻照的。如果存在的話，除非它們是胰島，否則效應(yīng)細胞優(yōu)選來源于外周血或骨髓，并且更優(yōu)選是T細胞、NK、Treg, TIL或MIL。如果效應(yīng)細胞是T細胞，則它們優(yōu)選地是天然存在的抗原特異性T細胞或經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原特異性T細胞。
[0295]優(yōu)選的表面密度:在本發(fā)明的一些實施方案中，細胞存在于包含透氣性材料的生長表面上并且優(yōu)選表面密度低于0.5E+06。熟練的技術(shù)人員將意識到，本公開內(nèi)容表面密度從允許低于0.5E+06的類似降低以相對于過繼細胞治療領(lǐng)域的現(xiàn)有方法提高群體擴增速率，降的越低越優(yōu)選。因此，例如，我們已經(jīng)證明表面密度為0.25E+06、0.125E+06和0.0625E+06的群體擴增速率超過本領(lǐng)域現(xiàn)有方法。因此，促使熟練的技術(shù)人員意識到，表面密度不需要限制在僅我們的實施例所記載的值，該可能性不是離散值，而是類似值。例如，對本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員建議了，以0.49E+06的表面密度起始培養(yǎng)將允許相對于以0.5E+06的表面密度起始培養(yǎng)改進群體的“擴增倍數(shù)”，盡管我們沒有提供使用該特定表面密度的實施例。因此，建議熟練的技術(shù)人員采用本發(fā)明的實施例中和母案中所示出表面密度的類似理解，并且不限于本文所呈現(xiàn)的離散值。
[0296]優(yōu)選的細胞密度:在本發(fā)明的一些實施方案中，細胞存在于包含透氣性材料的生長表面上并且優(yōu)選細胞比培養(yǎng)基密度為低于0.5E+06。熟練的技術(shù)人員將意識到,本公開內(nèi)容允許細胞比培養(yǎng)基密度從低于0.5E+06的類似降低以相對于過繼細胞治療領(lǐng)域現(xiàn)有方法降低培養(yǎng)基補充頻率，降的越低越優(yōu)選。因此，例如，我們已證實如何通過從本領(lǐng)域現(xiàn)有方法的下限0.5E+06細胞/ml降低細胞比培養(yǎng)基密度來降低培養(yǎng)基補充頻率，同時能夠保持細胞群體能夠以超過本領(lǐng)域現(xiàn)有方法的速率擴增。促使熟練的技術(shù)人員意識到，表面密度不需要限制在僅我們的實施例所記載的值，可能的值不是離散值而是類似值。優(yōu)選地，熟練的技術(shù)人員應(yīng)當尋求根據(jù)他們希望得到的屬性將細胞比培養(yǎng)基密度降低至低于0.5E+06至他們認為合適的任何特定值。因此，雖然我們用本文和母案中的多個實施例中鑒定的離散的細胞比培養(yǎng)基密度描述了降低細胞比培養(yǎng)基密度的優(yōu)點，但是本發(fā)明不限于本文所呈現(xiàn)的離散數(shù)值。
[0297]提高的培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比:在本發(fā)明的一些實施方案中，細胞存在于包含透氣性材料的生長表面上，并且通過提高培養(yǎng)基體積與生長表面的表面積的比來得到優(yōu)點。熟練的技術(shù)人員將意識到，本公開內(nèi)容允許培養(yǎng)基體積與生長表面之表面面積之比的類似提高，以當與本發(fā)明的諸如降低表面密度等其他要素組合時提供許多優(yōu)點。因此，雖然我們通過使用具有本文和母案中具有離散值的實施例來描述這些相關(guān)優(yōu)點，但是本發(fā)明不限于本文呈現(xiàn)的離散數(shù)值，并且促使熟練的技術(shù)人員意識到，所呈現(xiàn)的值以及值的組合正通過所述值的類似詮釋來引導(dǎo)他們獲得所述優(yōu)點。因此，本發(fā)明不限于本文呈現(xiàn)的離散數(shù)值。
[0298]增加的培養(yǎng)基高度:在本發(fā)明的一些實施方案中，細胞存在于包含透氣性材料的生長表面上，并且通過相對于本領(lǐng)域現(xiàn)有方法增加培養(yǎng)基高度來得到優(yōu)點。熟練的技術(shù)人員將意識到，本公開內(nèi)容允許在培養(yǎng)基高度上的類似增加，以當與本發(fā)明的諸如降低表面密度等其他要素組合時提供許多優(yōu)點。因此，雖然我們通過使用本文和母案中的具有離散值的實例來描述這些相關(guān)優(yōu)點，但是本發(fā)明不限于本文呈現(xiàn)的離散數(shù)值，并且促使本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員意識到，所呈現(xiàn)的值以及值的組合正通過所述值的類似詮釋來引導(dǎo)他們獲得所述優(yōu)點。因此，本發(fā)明不限于本文呈現(xiàn)的離散數(shù)值。
[0299]培養(yǎng)基中溶質(zhì)變化速率代替計數(shù)細胞的替代測量:在本發(fā)明的一些實施方案中，細胞存在于包含透氣性材料的生長表面上，并且通過不必進行計數(shù)細胞的情況下確定培養(yǎng)物中有多少細胞來得到優(yōu)點。熟練的技術(shù)人員將意識到，本公開內(nèi)容示出了葡萄糖濃度的降低(decay)如何提供培養(yǎng)物中細胞數(shù)量的量度的實例。熟練的技術(shù)人員還將意識到，葡萄糖僅是培養(yǎng)基中被細胞利用的的一種可測量底物，并且根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，熟練的技術(shù)人員可依靠培養(yǎng)基中諸如乳酸鹽等其他底物的濃度消耗和/或提高來指示細胞數(shù)量。因此，本發(fā)明的該實施方案的發(fā)明方面是這樣的發(fā)現(xiàn)，在以任何新表面密度、細胞密度、培養(yǎng)基高度和/或培養(yǎng)基體積比生長面積條件起始的靜態(tài)培養(yǎng)中測量底物是確定細胞群體的擴增進展的好方法。因此，本發(fā)明不限于葡萄糖底物。因此，本發(fā)明不限于本文提供的離散數(shù)值。
[0300]移出培養(yǎng)基而不損失細胞:在本發(fā)明的一些實施方案中，細胞以多種有利的表面密度存在于包含透氣性材料的生長表面上，并且存在于相對于本領(lǐng)域現(xiàn)有方法增加的培養(yǎng)基高度(和/或提高的培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比)下。隨后通過相對于本領(lǐng)域現(xiàn)有方法降低培養(yǎng)基高度(和/或降低培養(yǎng)基體積與生長表面面積之比)而不損失細胞來得到優(yōu)點。熟練的技術(shù)人員將意識到，本公開內(nèi)容允許改進的培養(yǎng)基更換方法(其中不需要在過程中添加更多的裝置)和/或改進的細胞回收方法(其中需要處理更小的培養(yǎng)基體積來回收細胞)。雖然我們通過使用具有離散值的實例來描述這些相關(guān)優(yōu)點，但是本發(fā)明不限于本文呈現(xiàn)的離散數(shù)值，并且促使本領(lǐng)域的那些普通技術(shù)人員意識到，所呈現(xiàn)的值以及值的組合正通過這些值的類似詮釋來引導(dǎo)他們得到所述優(yōu)點。例如，培養(yǎng)基可以任何高度存在，優(yōu)選大于2.0cm(例如2.lcm、2.5cm、6.08cm、10.0cm及以上)。優(yōu)選培養(yǎng)基移出導(dǎo)管的培養(yǎng)基移出開口處于生長表面上方0.2cm或更高的因此可優(yōu)選以0.2cm及以上的任意高度存在(只要其在移出培養(yǎng)基時時低于培養(yǎng)基高度且不損失細胞)，從而減少從培養(yǎng)基分離細胞和/或不迫使使用者在培養(yǎng)基更換期間將細胞移動到其他裝置。因此，本發(fā)明不限于本文呈現(xiàn)的離散數(shù)值。
[0301]透氣性培養(yǎng)裝置:在本發(fā)明的一些實施方案中，我們描述了一些發(fā)現(xiàn)，包括以低于常規(guī)知識之極限的表面密度起始培養(yǎng)物、使提供細胞因子的操作最小化、相對于本領(lǐng)域現(xiàn)有方法提高細胞群體生長速率的培養(yǎng)基提供策略以及縮短新細胞培養(yǎng)裝置的生產(chǎn)時間(包括對Wilson’ 717和Wilson’ 176的方法的改進)的能力。此外，裝置制造商和供應(yīng)商應(yīng)當意識到，包括Wilson’ 717和Wilso’ 176中描述的那些在內(nèi)的透氣性裝置的提供應(yīng)當包括通過無論任何形式(紙質(zhì)、電子、網(wǎng)站等)的使用說明、方案等向此類裝置的使用者傳播本發(fā)明和/或母案的新方法。因此，本發(fā)明的范圍包括由透氣性裝置的制造商和/或供應(yīng)商提供的使用說明和/或本發(fā)明方法的宣傳。
[0302]雖然這樣描述本發(fā)明，但是，顯而易見的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過許多方式改變本發(fā)明以擁有本公開內(nèi)容的益處。這樣的變化不應(yīng)視為脫離本發(fā)明的精神和范圍，并且對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的這樣的改造旨在包含于以下權(quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)。
[0303]在本文中引用的每個申請、專利和論文以及在每個所述申請、專利和論文(包括在每個公布專利的答復(fù)期間；“申請引用的文件”)中引用的每個文件或參考文獻、未決的美國公開N0.2005/0106717 Al和2008/0227176 Al，以及每個與這些申請和專利相應(yīng)的和/或從這些申請和專利要求優(yōu)先權(quán)的PCT和外國申請或?qū)＠?，以及在文件中引用的每個申請中引用或參考的每個文件都明確地并入本文。
[0304]以上文件通過引用的任何并入限制為使得不并入與本文明確的公開內(nèi)容相違背的主題事項。以上文件通過引用的任何并入還限制為使得文件中包括的權(quán)利要求不通過引用并入本文。以上文件通過引用的任何并入還限制為使得，除非清楚地包括于本文中否則文件中提供的任何限定都不通過引用并入本文。
[0305]出于詮釋本發(fā)明的權(quán)利要求的目的，明確指出，除非在權(quán)利要求中記載了特定術(shù)語“用于......的方法”或“用于......的步驟”，否則不援引U.S.C.第112節(jié)第6段的條款。
[0306]本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到可對本公開內(nèi)容進行許多改造而不脫離本文所述發(fā)明的精神。因此，并非旨在將本發(fā)明的范圍限制于所描述的實施方案和實施例。相反，本發(fā)明的范圍應(yīng)當通過所附權(quán)利要求及其等同物來詮釋。
【權(quán)利要求】
1.一種靜態(tài)動物細胞培養(yǎng)和細胞回收裝置，其包含: 內(nèi)部體積；以及 生長表面，其包含透氣性材料； 上擋邊，其定義出所述內(nèi)部體積的最上位置； 細胞移出導(dǎo)管，其包含細胞移出開口 ； 培養(yǎng)基移出導(dǎo)管，其包含培養(yǎng)基移出開口 ；其中 所述培養(yǎng)基移出開口與所述生長表面之間的距離大于所述細胞移出開口與所述生長表面之間的距離；并且 所述裝置不包含用于驅(qū)使氣體通過所述生長表面之所述透氣性材料的泵或其他機械。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述透氣性材料是液體不可透過的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述透氣性材料不是多孔的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其不包含用于混合細胞和/或培養(yǎng)基的攪拌機械或任何其他機械。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述上擋邊與所述生長表面之間的距離為2.0cm或更大。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中生長支持表面與所述生長表面接觸，所述生長表面處于水平位置并且當所述裝置培養(yǎng)細胞時氣體與所述生長表面接觸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述培養(yǎng)基移出導(dǎo)管與所述生長表面之間的距離是所述上擋邊與所述生長表面之間的距離的50%或更小。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述培養(yǎng)基移出導(dǎo)管與所述生長表面之間的距離為0.2cm或更大。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其中所述培養(yǎng)基移出導(dǎo)管與所述生長表面之間的距離為2.0cm或更小。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述細胞移出導(dǎo)管與所述生長表面之間的距離為0.2cm或更小。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其包含至少一個連接所述上擋邊與所述生長表面的壁，其中至少一個壁與所述生長表面垂直。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的裝置，其中所述細胞移出開口定位于至少一個壁與所述生長表面接觸的位置附近。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其包含多于一個培養(yǎng)基移出導(dǎo)管，各個培養(yǎng)基移出導(dǎo)管與所述生長表面之間的距離不同。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的裝置，其中至少一個所述培養(yǎng)基移出導(dǎo)管與所述生長表面之間的距離為所述生長表面與所述上擋邊之間的距離的50 %或更小。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其包含排出過濾器。
【文檔編號】C12M3/06GK104379727SQ201380025756
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月18日
【發(fā)明者】胡安·F·韋拉, 克利娜·M·魯尼, 安·M·利恩, 約翰·R·威爾遜 申請人:威爾遜沃夫制造公司