專利名稱：Hm1.24抗原的表達(dá)增強(qiáng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為骨髓瘤中HM1.24抗原表達(dá)增強(qiáng)劑的α干擾素和γ干擾素，以及IRF-2蛋白質(zhì)的使用。
背景技術(shù)：
骨髓瘤(myeloma)也稱之為漿細(xì)胞瘤(plasmacytoma)、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma)，是一種腫瘤疾病，特征為單克隆漿細(xì)胞積聚于骨髓內(nèi)。骨髓瘤是一種產(chǎn)生、分泌免疫球蛋白的末端分化B細(xì)胞，即在骨髓內(nèi)漿細(xì)胞主要以單克隆形式增加的疾病，在該患者的血清中可以檢測出單克隆的免疫球蛋白或者是其構(gòu)成成分L鏈、H鏈。
到目前為止骨髓瘤的治療主要使用化療制劑，還沒有找到使腫瘤完全消失、延長骨髓瘤患者生存時(shí)間的那樣的有效的治療劑，所以期待著具有治療骨髓瘤效果的藥劑的出現(xiàn)。
Goto，T等人報(bào)道了將人骨髓瘤細(xì)胞免疫小鼠可獲得單克隆抗體(鼠抗HM1.24抗體)(Blood(1994)84，1922-1930)。如果將抗HM1.24抗體用于移植了人骨髓瘤細(xì)胞的小鼠，由于該抗體特異地聚集在腫瘤組織(小阪昌明等人，日本臨床(1995)53，627-635)，表明抗HM1.24抗體有可能應(yīng)用于通過放射性同位素標(biāo)記進(jìn)行腫瘤部位的診斷，放射免疫療法等導(dǎo)彈療法。
另外，Blood(1994)84，1922-1930文獻(xiàn)報(bào)道說在體外，抗HM1.24抗體對人骨髓瘤細(xì)胞株RPM 18226具有細(xì)胞毒活性。而且表明嵌合了鼠抗HM1.24抗體的嵌合抗HM1.24抗體以及人源化的再構(gòu)成抗HM1.24抗體能特異地結(jié)合骨髓瘤細(xì)胞，而且具有細(xì)胞毒活性(Blood(1999)93，3922-3930)。
因此，HM1.24抗原在作為末端分化B細(xì)胞的骨髓瘤細(xì)胞中特異地高表達(dá)，由于識別該抗原的抗HM1.24抗體與細(xì)胞表面的HM1.24抗原按比例結(jié)合，發(fā)揮殺傷細(xì)胞活性，所以人們認(rèn)為使用抗HM1.24抗體的免疫療法對多發(fā)性骨髓瘤是一種有效的療法。因此，如果能夠增強(qiáng)作為抗HM1.24抗體的抗原在細(xì)胞表面的表達(dá)量的話，有希望通過用更少量的抗體獲得同等的細(xì)胞毒活性，而且會使副作用進(jìn)一步降低。
另外。人們已經(jīng)知道作為表現(xiàn)出抑制病毒增殖活性的物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)的干擾素現(xiàn)在在哺乳類動(dòng)物中分為α、β、γ和ω四類，具有各種各樣的生理活性(Pestka，S.，et.al.，Ann.Rev.Biochem.(1987)56，727-777；Langer，J.A.，et.al.，Immunology Today(1988)9，393-400)。然而，有關(guān)α干擾素和γ干擾素在骨髓瘤細(xì)胞中具有使HM1.24抗原的表達(dá)量增加作用的報(bào)道還沒有見到。
另外，已經(jīng)證實(shí)干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor)(IRF)-1和2是IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。IRF-1和2通常與同一個(gè)基因調(diào)控序列結(jié)合，IRF-1起著轉(zhuǎn)錄激活因子的作用，而IRF-2起著轉(zhuǎn)錄抑制因子的拮抗作用。另外已經(jīng)證實(shí)可使IRF-2高表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞使細(xì)胞飽和密度的上升，在甲基纖維素凝膠中形成菌落，在裸鼠中致瘤性，顯然IRF-2起著癌基因的功能。
最近的研究進(jìn)展表明IRF-2是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的組蛋白H4表達(dá)所必需的。而且IRF-2在肌肉細(xì)胞中能使血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular celladhesion molecule-1，VCAM-1)增加，在VCAM-1活化中IRF-2的酸性區(qū)域(182至218)在起作用也已經(jīng)弄清楚了。由此可知IRF-2不僅起著轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用，而且起著轉(zhuǎn)錄激活因子的作用。
但是，IRF-2蛋白質(zhì)結(jié)合HM1.24抗原基因的啟動(dòng)子(HM1.24啟動(dòng)子)，激活該啟動(dòng)子一事還未知。
發(fā)明的公開現(xiàn)在所進(jìn)行的骨髓瘤治療就象上面所述，是不完全的治療，人們期待著導(dǎo)致骨髓瘤完全消失、延長患者生存時(shí)間的劃時(shí)代的治療劑或治療方法。利用抗HM1.24抗體治療骨髓瘤在特異性和有效性方面有可能成為劃時(shí)代的治療劑，人們期待著能更有效發(fā)揮抗HM1.24抗體作用的治療方法。
所以本發(fā)明的目的就在于提供通過使HM1.24抗原在骨髓瘤細(xì)胞的表達(dá)量增加，使抗HM1.24抗體的骨髓瘤抑制作用增強(qiáng)的手段。
本發(fā)明人按照提供的有關(guān)方法，探索使HM1.24抗原表達(dá)量增加的藥劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α干擾素和γ干擾素具有所希望的活性，直至完成本發(fā)明。
因此本發(fā)明提供以α干擾素和γ干擾素為有效成分的，具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(HM1.24抗原)的骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)劑。
本發(fā)明提供骨髓瘤制劑，含有有效成分(1)α干擾素或γ干擾素，以及(2)能特異結(jié)合具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且具有細(xì)胞毒活性的抗體。
上述的骨髓瘤最典型的是多發(fā)性骨髓瘤。
上述的抗體最好是單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體，最理想的是具有細(xì)胞毒活性的抗體。
本發(fā)明人另外還探索了HM1.24啟動(dòng)子的激活劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IRF-2蛋白質(zhì)具有所希望的活性，直至完成本發(fā)明。
因此本發(fā)明還提供以IRF-2蛋白質(zhì)為有效成分的增強(qiáng)具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(HM1.24抗原)在骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)的增強(qiáng)劑。
本發(fā)明還提供IRF-2蛋白質(zhì)為有效成分的HM1.24啟動(dòng)子的激活劑。
本發(fā)明還提供骨髓瘤制劑，含有有效成分(1)IRF-2蛋白質(zhì)，以及(2)能特異結(jié)合具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且具有細(xì)胞毒活性的抗體。
上述的骨髓瘤最典型的是多發(fā)性骨髓瘤。
上述的抗體最好是單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體，最理想的是具有細(xì)胞毒活性的抗體。
因此本發(fā)明還提供含有以增強(qiáng)IRF-2蛋白質(zhì)表達(dá)的化合物為有效成分的在骨髓瘤細(xì)胞中增強(qiáng)HM1.24抗原表達(dá)的表達(dá)增強(qiáng)劑。
本發(fā)明還提供含有以增強(qiáng)IRF-2蛋白質(zhì)表達(dá)的化合物為有效成分的HM1.24啟動(dòng)子的激活劑。
另外本發(fā)明還提供篩選HM1.24抗原表達(dá)增強(qiáng)劑的方法。
另外本發(fā)明還提供作為治療骨髓瘤患者的試劑盒，其中包括(1)能特異結(jié)合具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且具有細(xì)胞毒活性的抗體，以及(2)指導(dǎo)將上述抗體與增強(qiáng)具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)的藥劑組合用于患者的指導(dǎo)書。
上述骨髓瘤例如為多發(fā)性骨髓瘤。上述抗體最好是人源化抗HM1.24抗體。而上述增強(qiáng)具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)表達(dá)的藥劑最好是α干擾素或γ干擾素。
本發(fā)明還提供含有能特異結(jié)合具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)并且具有細(xì)胞毒活性的抗體的治療骨髓瘤患者的藥物組合物，用于與增強(qiáng)具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)的藥劑組合向患者給藥。
上述骨髓瘤為多發(fā)性骨髓瘤。上述抗體最好是人源化抗HM1.24抗體。而上述增強(qiáng)具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)表達(dá)的藥劑最好是α干擾素或γ干擾素。
圖2表示使用作為標(biāo)記的IgG(對照)或抗HM1.24抗體通過流式細(xì)胞儀對α干擾素不存在(上)、存在下(下)培養(yǎng)的患者骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行分析的結(jié)果。
圖3表示通過對經(jīng)插入了編碼HM1.24抗原的基因的啟動(dòng)子區(qū)域的報(bào)道質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的U266細(xì)胞在α干擾素不存在或各種α干擾素濃度下培養(yǎng)后熒光素酶活性進(jìn)行測定的結(jié)果。
圖4表示通過對經(jīng)插入了編碼HM1.24抗原的基因的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)從轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)到上游151bp，或到上游77bp序列的報(bào)道質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的U266細(xì)胞或HEL細(xì)胞在α干擾素(1000U/ml)存在下培養(yǎng)后熒光素酶活性進(jìn)行測定的結(jié)果。
圖5表示使用作為標(biāo)記的IgG(對照)或抗HM1.24抗體通過流式細(xì)胞儀對γ干擾素不存在(上)、存在下(下)培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞株U266進(jìn)行分析的結(jié)果。
圖6表示使用作為標(biāo)記的IgG(對照)或抗HM1.24抗體通過流式細(xì)胞儀對γ干擾素不存在(上)、存在下(下)培養(yǎng)的患者骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行分析的結(jié)果。
圖7是表示通過向U266培養(yǎng)細(xì)胞添加IFN-α而產(chǎn)生的結(jié)合于HM1.24啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子的量隨時(shí)間的變化的電泳照片圖。NE(-)代表沒有添加核提取物。0h表示添加沒有IFN-α刺激的核提取物。0.5～8h代表添加經(jīng)IFN-α(1000U/ml)刺激后的不同時(shí)間段的核提取物，+cold表示添加未標(biāo)記的ISRE2探針50ng，+cold unrelated表示添加未標(biāo)記的adp序列50ng。
圖8是表示用各種抗體鑒定結(jié)合HM1.24啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子的電泳照片圖。NE(-)代表沒有添加核提取物。0h表示添加沒有IFN-α刺激的核提取物。8h表示添加IFN-α(1000U/ml)刺激后8h的核提取物。+cold表示添加未標(biāo)記的ISRE2探針50ng，+cold unrelated表示添加未標(biāo)記的adp序列50ng。添加的抗體都是2μg。
圖9是表示將HM1.24啟動(dòng)子報(bào)道質(zhì)粒和IRF-2表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入U(xiǎn)266細(xì)胞，測定報(bào)道活性的結(jié)果圖。
發(fā)明實(shí)施方案α干擾素或γ干擾素本發(fā)明使用的α干擾素或γ干擾素只要具有使HM1.24抗原表達(dá)量增加的活性也可以使用其變種。在測定HM1.24抗原表達(dá)量時(shí)，就象實(shí)施例記載的那樣，可以使用從骨髓瘤細(xì)胞株或骨髓瘤患者提取的骨髓瘤細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測。作為變種可以是諸如通過缺失、或置換、或插入、或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)、或很多個(gè)氨基酸殘基等手段變異的α干擾素或γ干擾素。
作為將缺失、置換或插入導(dǎo)入蛋白的方法可以使用改變對應(yīng)的基因的部位特異性變異誘變法(Hashimoto-Gotoh，Gene(1995)152，271-275，Zoller，Methods Enzymol.(1983)100，468-500，Kramer，Nucleic Acids Res.(1984)12，9441-8456，Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，488-492，[新細(xì)胞工學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 東京大學(xué)醫(yī)學(xué)研究所 制癌研究部(1993)p241-248])。
另外，也可以利用使用了市售PCR的[部位特異性的變異誘變體系(GIBCO-BRL)或[QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit](Stragene公司生產(chǎn))]。另外，蛋白質(zhì)中的氨基酸的變異有時(shí)在自然界中也會發(fā)生。而據(jù)Mark，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666文獻(xiàn)報(bào)道，這樣導(dǎo)入變異的蛋白具有與原來蛋白同樣的活性。
在氨基酸殘基的置換中，最好在性質(zhì)被保存的氨基酸之間進(jìn)行。例如，在疏水性氨基酸(A，L，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)、親水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)、含有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G，A，V，L，I，P)、含有羥基側(cè)鏈的氨基酸(S，T，Y)、含有硫原子側(cè)鏈的氨基酸(C，M)、含有羧酸和酰胺側(cè)鏈的氨基酸(D，N，E，Q)、含有堿基側(cè)鏈的氨基酸(R，K，H)、含有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(H，F(xiàn)，Y，W)之間的置換。
作為變種也可以使用α干擾素或γ干擾素的肽段。最好是含有與α干擾素或γ干擾素受體結(jié)合的部位的肽段。理想的是由100個(gè)以上，更理想是由130個(gè)、150個(gè)，最理想的是由160個(gè)以上連續(xù)的氨基酸殘基構(gòu)成的肽段。
IFR-2蛋白已經(jīng)證實(shí)干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor)(IRF)-1和2是IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。IRF-1和2通常與同一個(gè)基因調(diào)控序列結(jié)合，IRF-1起著轉(zhuǎn)錄激活因子的作用，而IRF-2起著轉(zhuǎn)錄抑制因子的拮抗作用。另外已經(jīng)證實(shí)使IRF-2高表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞使細(xì)胞飽和密度上升，在甲基纖維素凝膠中形成菌落和使裸鼠長瘤，顯然IRF-2起著癌基因的功能。
最近的研究進(jìn)展表明IRF-2是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的組蛋白H4表達(dá)所必需的。而且IRF-2在肌肉細(xì)胞中能使血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular celladhesion molecule-1，VCAM-1)增加，在VCAM-1活化中IRF-2的酸性區(qū)域(182至218)在起作用也已經(jīng)弄清楚了。由此可知IRF-2不僅起著轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用，有時(shí)也表現(xiàn)出作為轉(zhuǎn)錄激活因子的作用。
雜交瘤產(chǎn)生本發(fā)明使用的抗體的雜交瘤基本上是使用眾所周知的技術(shù)按以下過程制作的。即，用HM1.24抗原蛋白質(zhì)或表達(dá)HM1.24抗原的細(xì)胞作為致敏抗原，按照通常的免疫方法進(jìn)行免疫，利用通常的細(xì)胞融合方法使獲得的免疫細(xì)胞與眾所周知的親本細(xì)胞融合，通過常規(guī)的篩選方法篩選出產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。
具體來說，在制作單克隆抗體時(shí)，可以按如下方式進(jìn)行。例如，作為可獲得抗體的致敏抗原的表達(dá)HM1.24抗原細(xì)胞可以使用人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KPMM2(特開平7-236475)或KPC-32(Goto，T.et.al.，Jpn.J.Clin.Hematol.(1991)32，1400)。另外作為致敏抗原也可以使用含有序列1給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或者含有抗HM1.24抗體識別的(抗原)表位的肽或多肽。
另外作為致敏抗原使用的含有序列1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的cDNA插入到pUC19載體的XbaI酶切部位之間，制備質(zhì)粒pRS38-pUC19。含有該質(zhì)粒pRS38-pUC19的大腸桿菌(E.coli)于平成5年(1993年)10月5日根據(jù)布達(dá)佩斯條約以Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19)，保藏號為FERM BP-4434保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(參照特開平7-196694)。使用在質(zhì)粒pRS38-pUC19含有的cDNA片段通過基因工程操作技術(shù)可以制作含有抗HM1.24抗體識別的表位的肽或多肽。
作為致敏抗原免疫的哺乳動(dòng)物并沒有特別限定，但最好是考慮細(xì)胞融合中使用的親本細(xì)胞的適配性來選擇，通常使用嚙齒類動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、田鼠等。
用致敏抗原免疫動(dòng)物時(shí)按照常規(guī)方法進(jìn)行。例如常用的方法是通過將致敏抗原注射到哺乳動(dòng)物的腹腔內(nèi)或皮下來進(jìn)行免疫。
具體來說，將致敏抗原用PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理鹽水等稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛?，根?jù)需要，將稀釋的懸濁液與通常的佐劑，例如與弗氏(Freund)完全佐劑適量混合，乳化后，最好是每隔4～21天注射幾次。另外致敏抗原免疫時(shí)可以使用適當(dāng)?shù)妮d體。
象上述那樣進(jìn)行免疫，確認(rèn)血清中所希望的抗體水平上升后，從哺乳動(dòng)物摘出免疫細(xì)胞，用于細(xì)胞融合。用于細(xì)胞融合用的免疫細(xì)胞最好是脾細(xì)胞。
作為與上述免疫細(xì)胞融合的其它親本細(xì)胞的哺乳動(dòng)物的雜交瘤細(xì)胞，有眾所周知的各種細(xì)胞，例如，P3X63Ag8.653(J.Immunol.(1979)1231548-1550)，P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology(1978)811-7)，NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6511-519)，MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8405-415)，SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276269-270)，F(xiàn)O(de St.Groth，S.E.etal.，J.Immunol.Methods(1980)351-21)，S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148313-323)，R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277131-133)等。
上述免疫細(xì)胞與雜交瘤的細(xì)胞融合基本上按照常規(guī)方法，例如按照Milstein等人的方法(Kohler.G.and Milstein，C.Methods Enzymol.(1981)733-46)進(jìn)行的。
具體來說，例如上述細(xì)胞融合在細(xì)胞融合促進(jìn)劑存在下于通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中進(jìn)行。作為融合促進(jìn)劑例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等，另外根據(jù)需要也可以添加二甲亞砜等輔助劑。
免疫細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞的使用比例，免疫細(xì)胞相對于雜交瘤細(xì)胞最好為1～10倍。作為上述細(xì)胞融合使用的培養(yǎng)液可以使用適于上述雜交瘤細(xì)胞株增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液，以及其它該種細(xì)胞培養(yǎng)用的通常的培養(yǎng)液，另外也可以同時(shí)使用胎牛血清(FCS)等血清補(bǔ)液。
細(xì)胞融合通過將上述按比例的免疫細(xì)胞和雜交瘤于上述培養(yǎng)液中充分混合，添加預(yù)先在37℃保溫的PEG溶液，通常添加平均分子量為1000-6000左右的PEG溶液，濃度為30～60％(w/v)，通過混合形成所希望的融合細(xì)胞(雜交瘤)。然后逐次添加適當(dāng)培養(yǎng)液，反復(fù)進(jìn)行離心、去除上清操作，除去對雜交瘤增殖不利的細(xì)胞融合劑等。
該雜交瘤通過用通常的選擇培養(yǎng)液，例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液)培養(yǎng)進(jìn)行選擇。在該HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)要繼續(xù)較長時(shí)間，通常為數(shù)日～數(shù)周，為的是使靶雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死掉。然后實(shí)施有限稀釋法，篩選產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤和單一的克隆。
另外，用抗原免疫人以外的動(dòng)物，除了得到上述雜交瘤外，在體外用HM1.24抗原或HM1.24抗原表達(dá)細(xì)胞使人淋巴細(xì)胞致敏，使致敏淋巴細(xì)胞與人雜交瘤細(xì)胞，例如U266融合，也可以獲得具有與HM1.24抗原或HM1.24抗原表達(dá)細(xì)胞結(jié)合活性的所希望的人抗體(參照特公平1-59878)。另外將HM1.24抗原或HM1.24抗原表達(dá)細(xì)胞注射到含有人抗體基因整個(gè)文庫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，利用上述方法也可以獲得所希望的人抗體(參照國際專利申請公開號WO93/12227，WO92/03918，WO94/02602，WO94/25585，WO96/34096，WO96/33735)。
這樣制作的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在通常的培養(yǎng)液中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，而且可以在液氮中長期保存。
為了從該雜交瘤獲得單克隆抗體，可以采用按照通常的方法培養(yǎng)該雜交瘤取培養(yǎng)上清的方法，或者采用將該雜交瘤注射到與該雜交瘤細(xì)胞相適合的哺乳動(dòng)物中，使其增殖取腹水的方法。前一個(gè)方法適于獲得高純度的抗體，而后者適于抗體的大量生產(chǎn)。
單克隆抗體具體來說，產(chǎn)生抗HM1.24抗體的雜交瘤的制作可以按照Goto，T等人的方法(Blood(1994)84，1922-1930)進(jìn)行。例如，可以通過將于平成7年4月27日根據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號為FERM BP-5233保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(茨城縣筑波市東1丁目1番3號)的產(chǎn)生抗HM1.24抗體的雜交瘤注入BALB/c小鼠(日本kararey制)，取腹水，然后從腹水中純化抗HM1.24抗體的方法來制備，或者是將該雜交瘤在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，例如，含有10％胎牛血清、5％BM-CondimedH1(Boeehringer Mannheim生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基、雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL生產(chǎn))、PFHM-II培養(yǎng)基(GIBCO-BRL生產(chǎn))中進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)上清中純化抗HM1.24抗體的方法來制備。
重組型抗體在本發(fā)明中作為單克隆抗體可以使用重組型抗體，即從雜交瘤中將抗體基因克隆出來，插入到適當(dāng)?shù)妮d體，然后將該載體導(dǎo)入宿主，利用基因重組技術(shù)制作出重組型抗體。(例如，可參照Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，THERAPEUTICMONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERSLTD，1990)具體來說，從產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤分離出編碼抗體可變(V)區(qū)的mRNA。mRNA的分離可以使用常規(guī)的方法，例如胍超離心法(Chirgwin，J.M.等人Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chmczynski，P.等人(1987)162，156-159)來制備總RNA，然后使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia生產(chǎn))制備mRNA。另外可以利用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia生產(chǎn))直接制備mRNA。
使用逆轉(zhuǎn)錄酶從得到的mRNA合成抗體V區(qū)的cDNA。cDNA的合成可以使用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA SynthesisKit等進(jìn)行。在進(jìn)行cDNA合成和PCR擴(kuò)增時(shí)可采用利用5′-AmpliFINDER RACE kit(Clontech生產(chǎn))和PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A等人Nucleic Acids Res.(1989)17，2910-2932)。從獲得的PCR產(chǎn)物中純化目的DNA片段，然后與載體DNA連接。由此制作重組載體，導(dǎo)入大腸桿菌等宿主，選擇菌落，制備所希望的重組載體。通過常規(guī)方法，例如雙脫氧法確認(rèn)目的DNA的堿基序列。
如果獲得了編碼目的抗體的V區(qū)的DNA，把它與所希望的抗體穩(wěn)定區(qū)(C區(qū))的DNA連接，插入到表達(dá)載體。另外也可以將編碼抗體V區(qū)的DNA插入到含有抗體C區(qū)的DNA的表達(dá)載體中。
為了制作本發(fā)明使用的抗體，可以象后面所敘述的那樣，將抗體基因插入到在表達(dá)調(diào)控區(qū)，例如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行表達(dá)那樣的表達(dá)載體中。然后通過該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使抗體表達(dá)。
改變抗體在本發(fā)明中為了使對人的異種抗原性降低使用了人為改變的基因重組型抗體、例如嵌合(Chimeric)抗體、人源化抗體(Humanized)等。這些改變的抗體利用已知的方法都可以制造。
嵌合抗體是通過如下操作獲得的將上面得到的編碼抗體V區(qū)的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，然后插入到表達(dá)載體，導(dǎo)入宿主來制造(參照歐洲專利申請公開號EP125023、國際專利公開號WO96/02576)。利用該已知方法可以獲得本發(fā)明中有用的嵌合抗體。
例如，含有嵌合抗HM1.24抗體的L鏈和H鏈的質(zhì)粒的大腸桿菌于平成8年8月29日根據(jù)布達(dá)佩斯條約分別以Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ)和Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)，保藏號為FERM BP-5646和FERM BP-5644保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(茨城縣筑波市東1丁目1番3號)(參照特開平8-264756)。
人源化抗體也稱之為再構(gòu)成(reshaped)人抗體，是將人以外的哺乳動(dòng)物，例如鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRcomplementarity determiningregion)移植到人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)構(gòu)成的抗體，其一般的基因重組手法也都了解了(參照歐洲專利申請公開號EP125023、國際專利公開號WO96/02576)具體來說，利用PCR法由制作成末端含有重疊部分那樣的數(shù)個(gè)寡核苷酸合成設(shè)計(jì)成連接鼠抗體CDR和人抗體框架區(qū)(framework-region；FR)的DNA序列。得到的DNA序列與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，然后插入表達(dá)載體，導(dǎo)入宿主來生產(chǎn)嵌合抗體(參照歐洲專利申請公開號EP239400、國際專利公開號WO96/02576)。
通過CDR連接的人抗體的FR要選擇互補(bǔ)決定區(qū)形成良好的抗原結(jié)合部位的FR。根據(jù)需要，為了使再構(gòu)成人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)形成合適的抗原結(jié)合部位也可以置換抗體可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸(Sato，K.etal.，Cancer Res.(1993)53，851-856))例如，含有人源化抗HM1.24抗體的L鏈和H鏈的質(zhì)粒的大腸桿菌于平成8年8月29日根據(jù)布達(dá)佩斯條約分別以Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AIIM-gκ)和Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)，保藏號為FERM BP-5645和FERM BP-5643保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(茨城縣筑波市東1丁目1番3號)(參照特開平8-264756)。
在嵌合抗體、人源化抗體中使用人抗體C區(qū)，作為表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性的人抗體C區(qū)可以使用人的Cγ區(qū)，例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4。其中尤其是含有Cγ1，Cγ3的抗體具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，即具有ADCC活性、CDC活性，適用于本發(fā)明。
嵌合抗體是由人以外的哺乳動(dòng)物抗體的可變區(qū)和人抗體的C區(qū)構(gòu)成的，人源化抗體是由人以外的哺乳動(dòng)物抗體的互補(bǔ)決定區(qū)和人抗體的框架區(qū)(framework-region；FR)和C區(qū)構(gòu)成的，為了使其在人體內(nèi)抗原性降低，可用作本發(fā)明的治療劑的有效成分。
在本發(fā)明中使用的人源化抗體的理想的具體例子如人源化抗H1.24抗體(參照特愿平8-264756)。
表達(dá)和生產(chǎn)象上述那樣構(gòu)建的抗體基因使用常規(guī)的方法使其表達(dá)可以得到。如果用哺乳動(dòng)物，可以通過使常用的啟動(dòng)子、要表達(dá)的抗體基因、位于其3′下游聚腺苷酸信號從功能上有機(jī)結(jié)合形成的DNA來表達(dá)或者是通過含有要表達(dá)的抗體基因的載體來表達(dá)。例如，作為啟動(dòng)子/增強(qiáng)子可以使用人巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(human cytomegaolovirus immediateearly promoter/enhancer)。
另外作為本發(fā)明使用的用于抗體表達(dá)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子也可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒、多型瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV40)等病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和人延伸因子-1α(HEF1α)等來自哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。
例如，使用SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，按照Mulligan等人的方法(Nature(1979)277，108)，而使用HEF1α啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，按照Mizushima等人方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)很容易實(shí)施。
如果使用大腸桿菌，可以通過使常用的有用啟動(dòng)子、用于抗體分泌的信號序列、要表達(dá)的抗體基因從功能上有機(jī)結(jié)合使其表達(dá)。例如作為啟動(dòng)子，可以使用lacZ啟動(dòng)子、araB啟動(dòng)子。使用lacZ啟動(dòng)子時(shí)，按照Ward等人的方法(Nature(1098)341，544-546；FA SEB J.(1992)6，2422-2427)實(shí)施，而使用araB啟動(dòng)子時(shí)按照Better等人的方法(Science(1988)240，1041-1043)實(shí)施。
作為用于抗體分泌的信號肽在使抗體分泌到大腸桿菌的胞質(zhì)時(shí)可以使用pelB信號序列(Lei，S.P.et al J.bacteriol.(1987)169，4379)。在將胞質(zhì)產(chǎn)生的抗體分離后，再使抗體適當(dāng)折疊(refold)后再使用(例如，參照WO96/30394)。
作為復(fù)制起點(diǎn)可以使用來自SV40、多型瘤病毒、腺病毒、牛乳頭(狀)瘤病毒(BPV)等的復(fù)制起點(diǎn)。另外為了在宿主細(xì)胞系擴(kuò)增基因拷貝數(shù)，表達(dá)載體作為選擇標(biāo)記可以含有氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷酸激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因。
為了制造本發(fā)明中使用的抗體可以使用任何一種生產(chǎn)抗體的體系。生產(chǎn)抗體的體系有體外和體內(nèi)體系。作為體外體系，有使用真核細(xì)胞的產(chǎn)生系和使用原核細(xì)胞的產(chǎn)生系。使用真核細(xì)胞時(shí)，有使用動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞的產(chǎn)生系。作為動(dòng)物細(xì)胞已知有(1)哺乳類細(xì)胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa，Vero、(2)兩棲類細(xì)胞，例如非洲爪蛙卵親本細(xì)胞、或(3)昆蟲細(xì)胞，sf9、sf21、Tn5等。作為植物細(xì)胞已知有來自煙草(Nicotiana)屬，例如Nicotiana tabacum的細(xì)胞，可以對他們進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)就可以。作為真菌細(xì)胞已知有酵母，例如Saccharomyces屬中的Saccharomycesserevisiae，線狀菌，例如Aspergillus屬的Aspergillus niger等。
使用原核細(xì)胞時(shí)，有利用細(xì)菌細(xì)胞的生產(chǎn)體系。作為細(xì)菌細(xì)胞已知有大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌。
通過轉(zhuǎn)化將目的基因?qū)肷鲜瞿切┘?xì)胞，于體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞就可得到抗體。培養(yǎng)按照常規(guī)方法進(jìn)行。例如，作為培養(yǎng)液可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以同時(shí)使用胎牛血清(FCS)等血清補(bǔ)液。通過將導(dǎo)入了抗體基因的細(xì)胞移到動(dòng)物的腹腔中，在體內(nèi)可以生產(chǎn)抗體。
另外，作為體內(nèi)的生產(chǎn)體系，有使用動(dòng)物的和使用植物的生產(chǎn)體系。使用動(dòng)物時(shí)有利用哺乳動(dòng)物、昆蟲的生產(chǎn)體系。
作為哺乳動(dòng)物可以利用山羊、豬、綿羊、小鼠和牛(VickiGlaser，SPECTRUM Biotechnology Apploication，1993)。作為昆蟲可以利用蠶。
使用植物時(shí)可利用煙草等。
將抗體基因?qū)脒@些動(dòng)物或植物中，在動(dòng)物或植物中使抗體產(chǎn)生，回收。例如，將抗體基因插入到編碼象山羊β酪蛋白那樣的在乳汁中固有的蛋白質(zhì)的基因中，制備成融合基因。將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎中，然后將該胚胎導(dǎo)入母山羊中。從接受了胚胎的山羊產(chǎn)下的轉(zhuǎn)基因山羊或其后代的乳汁中可獲得所希望的抗體。為了增加從轉(zhuǎn)基因山羊含有的所希望的抗體的乳汁量，也可以在轉(zhuǎn)基因山羊中使用適宜的激素(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
另外使用蠶生產(chǎn)抗體時(shí)，用插入了目的抗體基因的空泡病毒感染蠶，從蠶的體液中可得到所希望的抗體(Susumu，M.et al.，Nature(1985)315，592-594)。而使用煙草時(shí)，將目的抗體基因插入植物表達(dá)用載體，例如pMON530中，農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium tumefaciens)那樣的細(xì)菌中，然后用該細(xì)菌感染煙草，例如Nicotiana tabacum，再從該煙葉中獲得所希望的抗體(Julian，K.C.Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
象上述那樣在體外或體內(nèi)的生產(chǎn)體系中生產(chǎn)抗體時(shí)，可以將編碼重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別插入表達(dá)載體同時(shí)轉(zhuǎn)化宿主，也可以將編碼H鏈和L鏈的DNA插入單一的表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化宿主(國際專利申請公開號WO94-11523)。
也可以使上述得到的抗體與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合，作為抗體修飾物來使用。本專利申請的范圍中所謂的“抗體”也包含這些抗體修飾物。為了得到這樣的抗體修飾物，通過對得到的抗體實(shí)施化學(xué)修飾就可獲得。這些方法已經(jīng)在本領(lǐng)域建立了。
抗體的分離、純化上述那樣生產(chǎn)、表達(dá)的抗體可以從細(xì)胞內(nèi)外、宿主分離、純化直至均一為止。本發(fā)明使用的抗體的分離、純化可以通過親和層析實(shí)施。作為親和層析用的柱子例如可以使用蛋白A柱、蛋白G柱等柱子。蛋白A柱用的載體，例如有Hyper D，POROS，Sepharose F.F.等。
另外也可以使用通常的蛋白質(zhì)分離、純化方法，并沒有什么限定。例如可以適當(dāng)使用除了上述的親和層析以外的層析、過濾、超濾、鹽析、透析等方法，也可組合起來分離、純化本發(fā)明中使用的抗體。作為層析，例如有離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾等。
抗體濃度的測定用上述方法獲得的抗體濃度的測定可以通過吸光度的測定或ELISA等進(jìn)行。即，在進(jìn)行吸光度測定時(shí)，將本發(fā)明使用的抗體或含有抗體的樣品用PBS(-)適當(dāng)稀釋后，測定280nm的吸光度，以1mg/ml作為35OD就可算出抗體濃度。而利用ELISA測定時(shí)，可以象以下那樣測定。即，將羊抗人IgG(BIO SOURCE生產(chǎn))用0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)稀釋到1μg/ml，然后取該稀釋液100μl加到96孔板中(Nunc生產(chǎn))，于4℃溫育過夜，使抗體固層化。
封閉后，添加適當(dāng)稀釋的本發(fā)明中使用的抗體或含有抗體的樣品，或作為標(biāo)準(zhǔn)樣品的人IgG(CAPPEL生產(chǎn))100μl，于室溫下溫育一小時(shí)。洗凈后，加入稀釋5000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記抗人IgG(BIO SOURCE生產(chǎn))100μl，室溫下溫育1小時(shí)。洗滌后加底物溶液，經(jīng)溫育后，用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad生產(chǎn))測定405nm的吸光度，算出目的抗體的濃度。
FCM解析骨髓瘤細(xì)胞與本發(fā)明使用的抗體的反應(yīng)性可通過FCM(流式細(xì)胞儀)解析。作為細(xì)胞可以使用建立的細(xì)胞株或新分離出的細(xì)胞。作為建立的細(xì)胞株有來自骨髓瘤的RPMI8226(ATCC CCL 155)、U266(ATCC TIB196)、KPMM2、KPC-32、來自漿細(xì)胞瘤的ARH-77(ATCC CRL1621)。
將上述細(xì)胞用PBS(-)洗凈后，加入用FACS緩沖液(含有2％胎牛血清、0.05％疊氮化鈉的PBS(-))稀釋成25μg/ml的抗體或?qū)φ湛贵w100μl，于冰水中放置30分鐘。用FACS緩沖液洗凈后，加入25μg/ml的FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體(GAM，Becton.Dickinson生產(chǎn))100μl，于冰水中放置30分鐘。然后用FACS緩沖液洗凈后，懸浮于600μl或1ml的FACS緩沖液中，用FACScan(Becton Dickinson生產(chǎn))測定各個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
篩選方法在對HM1.24抗原的表達(dá)增強(qiáng)劑進(jìn)行篩選時(shí)，例如可以使用在無刺激狀態(tài)下不表達(dá)HM1.24抗原，或表達(dá)很少的細(xì)胞通過FCM解析來測定。例如，將實(shí)施例記載的細(xì)胞與被檢測樣品溫育1～2天，然后用作為一次抗體使用的鼠抗人HM1.24抗體染色。將細(xì)胞洗凈后，再用作為二次抗體使用的FITC標(biāo)記的鼠IgG抗體染色。最后洗凈細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的FITC熒光強(qiáng)度。
另外不通過上述的間接染色法，而是用高濃度的免疫球蛋白處理細(xì)胞，封閉Fc受體后，通過用FITC標(biāo)記的抗HM1.24抗體直接法進(jìn)行染色分析也可以。
另外通過使用HM1.24啟動(dòng)子序列的報(bào)道基因分析也可以篩選HM1.24抗原的表達(dá)增強(qiáng)劑。作為報(bào)道基因可以使用熒光素酶。構(gòu)建在報(bào)道基因上游含有HM1.24啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞與被檢測物質(zhì)培養(yǎng)1～2天，回收的細(xì)胞經(jīng)FCM解析，可以篩選增強(qiáng)HM1.24抗原表達(dá)的藥劑。
細(xì)胞毒活性ADCC活性的測定本發(fā)明使用的抗體是具有細(xì)胞毒活性例如ADCC活性的抗體。在本發(fā)明中對骨髓瘤細(xì)胞的ADCC活性是按如下過程測定的。首先，從人的末梢血或骨髓中通過比重離心法分離出單核細(xì)胞，作為效應(yīng)細(xì)胞(EffectorcellE)。
作為靶細(xì)胞(Target cellT)可以通過用51Cr對RPMI8226(ATCCCCL 155)，U266(ATCC TIB 196)，KPMM2，KPC-32，ARH-77(ATCCCRL 1621)等細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記來制備。然后向標(biāo)記的靶細(xì)胞加入測定ADCC活性的抗體，溫育，然后加入相對靶細(xì)胞比例合適的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行溫育。
取培養(yǎng)后的上清，用γ計(jì)數(shù)器測定放射性。此時(shí)，在最大游離放射能測定中抗原使用1％的NP-40。細(xì)胞毒活性(％)可以通過(A-C)/(B-C)×100來計(jì)算。其中，A代表在抗體存在下游離的放射活性(cpm)，B代表由于NP-40而引起的放射活性(cpm)、C代表不含有抗體只是在培養(yǎng)液中游離的放射活性(cpm)。
細(xì)胞毒活性的增強(qiáng)為了發(fā)揮象ADCC活性那樣的細(xì)胞毒活性，最好使用作為人抗體穩(wěn)定區(qū)(C區(qū))的Cγ，特別是Cγ1，Cγ3。另外通過附加、改變、修飾一部分抗體C區(qū)的氨基酸，可以誘導(dǎo)更高ADCC活性，或CDC活性。
例如，象通過氨基酸置換使得IgG象IgM那樣的聚合(Smith，R.I.F.&Morrison，S.L.BIO/TECHNOLOGY(1994)12，683-688)、象通過附加氨基酸使得IgG象IgM那樣的聚合(Smith，R.I.F.et al.，J.Immunology(1995)154，2226-2236)、通過編碼L鏈基因的串聯(lián)連接進(jìn)行表達(dá)(Shuford，W.et al.，Science(1991)252，724-727)或通過氨基酸置換引起的IgG的二聚體化(Caron，P.C.et al.，J.Exp.Med.(1992)176，1191-1195，Shopes，B.，J.Immunology(1992)148，2918-2922)、通過化學(xué)修飾引起的IgG的二聚體化(Wolff，E.A.et al.，Cancer Res.(1993)53，2560-2565)、以及通過抗體鉸鏈區(qū)的氨基酸的改變引起有效功能的導(dǎo)入(Norderhaug，L.et al.，Eur.J.Immunol.(1991)21，2379-2384)。
這些變化都可以通過利用使用引物在寡聚物特殊位置導(dǎo)入變異的方法，通過利用限制性內(nèi)切酶酶切部位添加堿基序列，使用引起共價(jià)結(jié)合的化學(xué)修飾劑來實(shí)現(xiàn)。
患者的治療本發(fā)明的內(nèi)容之一是通過將增強(qiáng)HM1.24抗原表達(dá)量的藥劑和抗HM1.24抗體用于患者，治療骨髓瘤，尤其是治療多發(fā)性骨髓瘤的方法。增強(qiáng)HM1.24抗原表達(dá)量的藥劑最好是α干擾素或γ干擾素。干擾素和抗HM1.24抗體既可以一起用，也可以分別使用。分別投藥時(shí)，首先使用干擾素，最好在96小時(shí)內(nèi)再使用抗HM1.24抗體。使用干擾素和抗HM1.24抗體的時(shí)間間隔只要通過使用干擾素使HM1.24抗原表達(dá)量增強(qiáng)并沒有限制，最好是在96小時(shí)以內(nèi)，理想的是在72小時(shí)以內(nèi)，最理想的是在48小時(shí)以內(nèi)。根據(jù)患者臨床反應(yīng)數(shù)次、交替使用干擾素和抗HM1.24抗體也都在本發(fā)明范圍內(nèi)。至于給藥方式，希望直接注射到血液中，靜脈給藥或動(dòng)脈給藥也都可以。也可以連續(xù)給藥，也可以通過靜脈點(diǎn)滴給藥。
本發(fā)明的其它內(nèi)容是含有α干擾素或γ干擾素和抗HM1.24抗體的骨髓瘤治療劑。可以含有以往在干擾素和抗體制劑中使用的藥學(xué)上容許的載體，例如，除了含有通常的穩(wěn)定劑和賦形劑外，還可同時(shí)含有生理鹽水或5％葡聚糖。
在本發(fā)明的其它內(nèi)容中，還有治療骨髓瘤患者的以抗HM1.24抗體為有效成分的藥物組合物，以及提供與α干擾素或γ干擾素并用療法有關(guān)的指導(dǎo)書。
在本發(fā)明的其它內(nèi)容中，還有治療骨髓瘤患者的含有抗HM1.24抗體為有效成分的藥物組合物，用于與α干擾素或γ干擾素并用的藥物組合物。
實(shí)施例1.利用α干擾素使骨髓瘤細(xì)胞中的HM1.24抗原表達(dá)量增強(qiáng)對來自人骨髓瘤細(xì)胞株U266(ATCC TIB 196)和多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓的骨髓瘤細(xì)胞使用含有10％胎牛血清(WhittakerBioproducts，Inc，Walkersville，ME，USA)的RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma，StLouis，MO，USA)，于37℃下的5％二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。生產(chǎn)鼠抗HM1.24抗體的雜交瘤保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(茨城縣筑波市東1丁目1番3號)，保藏號為FERM BP-5233(保藏日期1995年4月27日)。
對骨髓瘤細(xì)胞(1×105/ml)在1000U/ml的天然型α干擾素(大冢制藥，東京)存在下或不存在下培養(yǎng)48小時(shí)，通過流式細(xì)胞儀測定HM1.24抗原(序列1給出的編碼該抗原的堿基序列)的變化。將細(xì)胞用添加了0.1％牛血清清蛋白(Sigma，St Louis，MO，USA)和0.02％疊氮化鈉的磷酸緩沖液(Gibco BRL，Grand Island，NY，USA)洗凈后，懸浮于加有人免疫球蛋白(3mg/ml、綠十字、大阪)的PBS(100μl)中，于4℃下反應(yīng)15分鐘。
然后加入2μl的FITC-人IgG1(1mg/ml)或FITC-抗HM1.24抗體(1mg/ml)，于4℃下染色60分鐘。使用患者骨髓瘤細(xì)胞時(shí)，為了鑒定骨髓瘤細(xì)胞加20μl的PE-anti-CD38(Becton Dickinson，SanJose，CA，USA)進(jìn)行雙重染色。染色后，用PBC將細(xì)胞洗兩次，保存在含有1％仲甲醛(和光純藥，大阪)的PBS中。然后利用流式細(xì)胞儀(EPICSXL，Coulter，Hialeah，F(xiàn)L，USA)解析HM1.24抗原的表達(dá)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞株U266(

圖1)和患者骨髓瘤細(xì)胞(圖2)在無刺激狀態(tài)下表達(dá)HM1.24抗原，在α干擾素的刺激下HM1.24抗原的表達(dá)量進(jìn)一步增加。
α干擾素使骨髓瘤細(xì)胞的HM1.24抗原的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，使與骨髓瘤細(xì)胞結(jié)合的抗HM1.24抗體數(shù)目增加。由于利用抗HM1.24抗體治療的抗腫瘤效果與結(jié)合的抗HM1.24抗體的數(shù)目成比例，所以對于骨髓瘤患者在使用α干擾素后進(jìn)行抗HM1.24抗體治療增強(qiáng)抗體的治療效果，進(jìn)一步提高治療的有效性是有希望的。
實(shí)施例2.通過解析報(bào)道基因解析HM1.24抗原的表達(dá)功能為了研究抗原的誘導(dǎo)表達(dá)是否受HM1.24啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)節(jié)，對啟動(dòng)子區(qū)的報(bào)道基因進(jìn)行了解析。
HM1.24啟動(dòng)子區(qū)的基因(序列3)是通過PCR克隆獲得的。使用DNAzol reagent(GIBCO)從人末梢血單核細(xì)胞制備基因組DNA。以得到的基因組DNA為模板，使用引物HM2k(aaaggtaccagctgtctttctgtctgtcc)(序列4)和BST2B(atagtcatacgaagtagatgccatccag)(序列5)，使用TaKaRa Taq(寶酒造、大津)，利用Thermal Cycler 480(PerkinElmer，CA，USA)進(jìn)行PCR(94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán))。
用限制性內(nèi)切酶KpnI和BgIII(寶酒造)對獲得的大約2kb的片段進(jìn)行處理，然后使用DNAligation kit ver.II(寶酒造)在報(bào)道基因質(zhì)粒pGL3-basic(Promega，WI，USA)的KpnI-BgIII位點(diǎn)進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞(日本基因公司生產(chǎn))。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌用含有100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基于37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，使用QIAGENplasmid maxi kit(QIAGEN，Hilden，Germany)制備質(zhì)粒。
用限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI對獲得的質(zhì)粒HM-2k/GL3進(jìn)行處理，再利用kilo-sequence用缺失試劑盒(寶酒造)制作缺失克隆，可獲得含有直至轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-493bp的質(zhì)粒HM-493/GL3。用限制性內(nèi)切酶KpnI和AfIII對質(zhì)粒HM-2k/GL3進(jìn)行處理，用上述方法制作缺失克隆，獲得分別含有直至轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-151bp或-77bp的質(zhì)粒HM-151/GL3和HM-77/GL3。
向細(xì)胞導(dǎo)入質(zhì)粒使用Polyethylenimine-Transferrinfection Kit(TfPEI-kit)(Bender MedSystems，Vienna，Austria)，熒光素酶分析使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)。將細(xì)胞株用含有50μM Defferrioxamine、10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)過夜。為了使導(dǎo)入的質(zhì)粒與Tf-PEI成為復(fù)合物，制作含有終濃度為20μg/ml的報(bào)道基因質(zhì)粒、0.4μg/ml的pRL-SV40、1μg/mlTf-PEI試劑的混合液，于室溫下溫育20分鐘。加入5×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞，其加入量是Tf-PEI和質(zhì)粒的混合液的3倍，于37℃下溫育4小時(shí)，用培養(yǎng)基洗凈后，加入到96孔平底板進(jìn)行培養(yǎng)，每孔100μl(細(xì)胞濃度為2×105細(xì)胞/ml)。
添加IFN-α，其終濃度分別為0，10，100，或1000U/ml，于37℃下培養(yǎng)2天。細(xì)胞用PBS(-)洗凈后，溶解于20μl的Passive Lysis Buffer中，取6μl加到C96White Polysorp Fluoronunc plate(Nunc)，用Luminoskan(Labsystems)在底物溶液為30μl，測定時(shí)間為10秒的條件下測定Firefly和Renila的各自發(fā)光強(qiáng)度。測定值經(jīng)Firefly/Renila補(bǔ)正后，以對照(培養(yǎng)基)為1，可求出相對活性。
結(jié)果可以確認(rèn)無論是在含有上游2kbp的質(zhì)粒還是在含有493bp的質(zhì)粒中報(bào)道的熒光素酶活性的上升都依賴于IFN-α的濃度，啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性上升引起抗原的表達(dá)誘導(dǎo)(圖3)。
另外如果使用轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游151bp或77bp的報(bào)道質(zhì)粒，結(jié)果表明如果使用上游151bp報(bào)道質(zhì)粒由于IFNα的刺激使得熒光素酶活性上升，而如果用上游77bp的報(bào)道質(zhì)粒，則看不到由于IFNα的刺激使得熒光素酶活性發(fā)生的變化(圖4)。由于在77bp～151bp區(qū)域內(nèi)存在著與GASelement，ISRE同源性高的序列，該序列是響應(yīng)IFNα刺激被激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，表明IRF系列的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與熒光素酶活性有關(guān)。
實(shí)施例3.γ干擾素增強(qiáng)骨髓瘤細(xì)胞中HM1.24抗原表達(dá)量利用實(shí)施例1記載的方法使用1000U/ml的天然型γ干擾素(R & DSystem公司生產(chǎn))進(jìn)行解析。結(jié)果表明在骨髓瘤細(xì)胞株U266(圖5)和患者骨髓瘤細(xì)胞(圖6)中都可以觀察到與α干擾素同樣的情況，即HM1.24抗原表達(dá)量增大。
實(shí)施例4.IRF-2與HM1.24啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合為了鑒定與HM1.24啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，象如下所述那樣進(jìn)行以HM1.24啟動(dòng)子區(qū)為探針的Electrophoresis Mobility Shift Assay(EMSA)，作為結(jié)合因子鑒定IRF-2。
(1)核提取物的制備將骨髓瘤細(xì)胞U266-B1(ATCC-TIB196)用含有10％FBS(HyClone)的RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO-BRL)于37℃、5％二氧化碳培育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。為了使α干擾素(IFN-α)(Pepro Tech EC)能刺激細(xì)胞，在培養(yǎng)基中添加IFN-α，使其終濃度為1000U/ml，收集添加后30分鐘、2小時(shí)、4小時(shí)以及8小時(shí)的細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于冷的PBS(-)中，經(jīng)1000rpm離心分離去掉上清后懸浮于10mMTris，10mMNaCl，6mMMgCl2溶液中。
然后在冰中靜置5分鐘再次離心，去掉上清。將細(xì)胞懸浮于含有10mMTris、10mM NaCl、6mM MgCl2、1mM DTT、0.4mM PMSF、1mMNa3VO4的溶液中。使用玻璃勻漿器于冰上研磨細(xì)胞，然后于6000g下離心3分鐘，去掉上清。將細(xì)胞懸浮于萃取緩沖液(20％甘油、20mMHEPES、420mM NaCl、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、0.2mM PMSF、1mM DTT、0.1mM Na3VO4，2mg/ml抑肽酶、5mg/ml亮抑蛋白酶肽)中，然后在冰中靜置20分鐘于12000g下離心10分鐘，收集上清。
(2)標(biāo)記探針的制備作為探針是制作在HM1.24啟動(dòng)子區(qū)域含有與GAS(IRN-γ活性部位GAS共有序列ttncnnnaa(序列8))、ISRE(IRN-α刺激應(yīng)答因子ISRE共有序列ngaaanngaaact(序列9))有同源性的序列(ttcccagaa(序列10))以及ggaaactgaaact(序列11)的ISRE2。即將寡DNA ISRE-F2(aatttctgggaaactgaaactgaaaacct(序列12))和ISRE-F2(aattaggttttcagtttcagtttcccaga(序列13))混合，使其退火，做成雙鏈DNA探針I(yè)SRE2。
另外，將寡DNA adp-1(catggcatctacttcgtatgactattgcagagtgcc(序列14))和adp-2(catgggcactctgcaatagtcatacgaagtagatgc(序列15))混合，使其退火，做成unrelated探針adp。探針的標(biāo)記是利用Band Shift Kit(Amersham Pharmacia Biotech)，按照其標(biāo)準(zhǔn)的程序進(jìn)行的。即，在含有[α-32P]dATP(20μCi)(Amersham Pharmacia Biotech)的反應(yīng)液中對上述制作的雙鏈DNA50ng于37℃下進(jìn)行1小時(shí)Klenow片段聚合酶反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后的溶液稀釋2倍，加到Nick Spin Column(AmershamPharmacia Biotech)上，經(jīng)1600rpm離心4分鐘，將回收的溶液作為標(biāo)記探針。
(3)通過IFN-α刺激產(chǎn)生的結(jié)合因子隨時(shí)間的變化按照Band Shift Kit(Amersham Pharmacia Biotech，NJ，USA)的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行如下操作。將試劑盒附帶的10×結(jié)合緩沖液2μl(100mMTris-HCl(pH7.5)、500mM NaCl、5mM DTT)加到上述(1)中經(jīng)時(shí)制備的5μg提取物中，加入50％甘油4μl，1％NP-40 1μl，以及1μl的poly(dI-dC)-poly(dI-dC)，添加上述(2)制備的32P標(biāo)記ISRE-探針2μl，然后加水使總量配成20μl后，將該反應(yīng)混合物于室溫下溫育20分鐘，使得可能存在于上述提取物中的結(jié)合因子與上述32P標(biāo)記ISRE-探針結(jié)合。
向18μl反應(yīng)液中加入10×染色液(試劑盒附帶的)2μl，于1×Tris-甘氨酸緩沖液(25mM Tris、190mM甘氨酸、1mM EDTA、pH8.1)中在7.5％丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，電泳后，將凝膠貼到濾紙上，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到濾紙上。用經(jīng)干膠器干燥的濾紙使X光片感光，檢測信號。
為了進(jìn)行比較，配制沒有加提取物的反應(yīng)液[(NEC-)]、添加了來自沒有用α干擾素刺激而培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物的提取物的反應(yīng)液
、在8小時(shí)的培養(yǎng)液的提取物中加入未標(biāo)記ISRE2探針50ng代替標(biāo)記探針的反應(yīng)液[8h(+cold)]，以及在8小時(shí)培養(yǎng)后的提取液中加入unrelated探針adp 50ng的反應(yīng)液[8h(+cold unrelated)]，同樣進(jìn)行上述處理，檢測信息。
結(jié)果如圖7所示。就象圖7表明的那樣，在用干擾素刺激下培養(yǎng)的U266-B1細(xì)胞中，與相當(dāng)于一部分HM1.24啟動(dòng)子的雙鏈DNA結(jié)合的物質(zhì)的量經(jīng)時(shí)增加。
(4)通過與各種抗體的反應(yīng)鑒定轉(zhuǎn)錄因子象上述(1)記載的那樣將骨髓瘤細(xì)胞U266-B1(ATCC-TIB196)在有1000U/ml的α干擾素存在下培養(yǎng)8小時(shí)，制備提取物。按照Band ShiftKit(Amersham Pharmacia Biotech)的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行如下操作。即向5μg的提取物中加入2μg抗體，于室溫下溫育15分鐘，得到提取液/抗體反應(yīng)液。將2μl提取液/抗體反應(yīng)液和上述(2)制備的標(biāo)記探針2μl添加到上述試劑盒附帶的10×結(jié)合緩沖液2μl、50％甘油4μl、1％NP-401μl和1μl的Poly(dI-dC)·Poly(dI-dC)中，然后加水使總量為20μl，將該反應(yīng)混合物于室溫下溫育20分鐘。
將該反應(yīng)混合物象前面(3)記載的那樣進(jìn)行電泳，檢測其信號。
作為上述的抗體可以使用下面的抗體(無論那一個(gè)都是來自SantaCruz Biotechnology)。
抗-人STAT1 p84/p91(E-23)(說明)兔多克隆抗體(SC-346X)抗-人STAT2(C-20)兔多克隆抗體(SC-476X)抗-鼠STAT3(K-15)兔多克隆抗體(SC-483X)抗-人ISGF-3γp48(C-20)兔多克隆抗體(SC-496X)抗-人IRF-1(C-20)兔多克隆抗體(SC-497X)抗-人IRF-2(C-19)兔多克隆抗體(SC-498X)抗-鼠ICSAT(M-17)山羊多克隆抗體(SC-6059X)另外作為對照，配制使用了沒有α干擾素刺激下培養(yǎng)的細(xì)胞的提取物的反應(yīng)液
；添加了在有1000U/ml的α干擾素刺激下培養(yǎng)了8小時(shí)的細(xì)胞的提取物、而沒有添加抗體的反應(yīng)液[8h]；添加了未標(biāo)記的ISRE2探針50ng取代標(biāo)記ISRE2探針的反應(yīng)液[8h(+cold)]；以及添加了未標(biāo)記的dp探針50ng取代標(biāo)記的ISRE2探針的反應(yīng)液[8h(+unrelatedcold)]，象上述同樣進(jìn)行處理。
結(jié)果如圖8所示。就象圖8表明的那樣，與取自在α干擾素刺激下培養(yǎng)的細(xì)胞的提取物中的標(biāo)記ISRE2探針結(jié)合的成分只與抗-IRF-2抗體結(jié)合，與HM1.24啟動(dòng)子結(jié)合并激活它的因子是轉(zhuǎn)錄因子IRF-2。
實(shí)施例5.確認(rèn)IRF-2激活HM1.24啟動(dòng)子的作用通過使用了U266細(xì)胞的報(bào)道基因分析測定由于IRF-2共表達(dá)對HM1.24啟動(dòng)子活性的影響，表明實(shí)際上IRF-2具有HM1.24啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用。在以下實(shí)驗(yàn)中使用了骨髓瘤細(xì)胞株U266-B1(ATCCTIB196)。細(xì)胞用含有10％FBS(GIBCO BRL)的RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO)(以下稱為培養(yǎng)基)于37℃、5％二氧化碳培育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
(1)含有HM1.24啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)粒的構(gòu)建HM1.24啟動(dòng)子區(qū)的基因通過PCR cloning可以獲得。使用DNAzolreagent(GIBCO)從人末梢血單核細(xì)胞制備基因組DNA。以得到的基因組DNA為模板，使用引物HM2k(aaaggtaccagctgtctttctgtctgtcc)(序列16)和BST2B(atagtcatacgaagtagatgccatccag)(序列17)，利用TaKaRaTaq(寶酒造，大津)，利用Thermal Cycler 480(Perkin Elmer，CA，USA)進(jìn)行PCR(94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán))。
用限制性內(nèi)切酶KpnI和BgIII(寶酒造)對獲得的大約2kb的片段進(jìn)行處理，然后使用DNA ligation kit ver.II(寶酒造)在報(bào)道基因質(zhì)粒pGL3-basic(Promega，WI，USA)的KpnI-BgIII位點(diǎn)進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞(日本基因公司生產(chǎn))。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌用含有100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基于37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，使用QIAGENplasmid maxi kit(QIAGEN，Hilden，Germany)制備質(zhì)粒。
用限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI對獲得的質(zhì)粒HM-2k/GL3進(jìn)行處理，再利用kilo-sequence用缺失試劑盒(寶酒造)制作缺失克隆，可獲得含有直至轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-493bp的質(zhì)粒HM-493/GL3。用限制性內(nèi)切酶KpnI和AfIII對HM-2k/GL3進(jìn)行處理，用上述方法制作缺失克隆，可獲得含有直至轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-151bp的HM-151/GL3。
再以HM-2k/GL3為模板，使用引物10S(tttcggtacctaattaatcctctgcctg)(序列18)和GL引物2(ctttatgtttttggcgtcttcca)(序列19)，利用TaKaRaTaq(寶酒造，大津)，使用Thermal Cycler 480(Perkin Elmer，CA，USA)進(jìn)行PCR(94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán))。用限制性內(nèi)切酶KpnI和BgIII(寶酒造)對獲得的片段進(jìn)行處理，然后使用ligation high(東洋紡)在報(bào)道基因質(zhì)粒pGL3-basic(Promega，WI，USA)的KpnI，BgIII位點(diǎn)進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞(日本基因公司生產(chǎn))。
將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌用含有100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基于37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，使用QIAGEN plasmid maxi kit(QIAGEN，Hilden，Germany)制備質(zhì)粒。可獲得含有直至轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游125bp的質(zhì)粒HM-125/GL3。再以HM-2k/GL3為模板，使用引物HMP700(aaaggtaccagagtttacctggtatcctgg)(序列20)和GL引物2，按照同樣的過程進(jìn)行PCR，通過在pGL3-basic的KpnI，BgIII位點(diǎn)導(dǎo)入片段，可獲得含有直至轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約700bp的質(zhì)粒HM-700/GL3。
再以HM-2k/GL3為模板，使用引物HMP700和11A′(cagaggattaattaggtaccgaaagagaggtgggctttt)(序列21)，使用KOD聚合酶(東洋紡)，利用Thermal Cycler 480(Perkin Elmer，CA，USA)進(jìn)行PCR(98℃15秒，65℃2秒，74℃30秒，25個(gè)循環(huán))。用Zero BluntTOPO PCR cloning kit for sequencing ver.B(Invitrogen)將獲得的片段插入到pCR4 Blunt-TOPO載體中。用限制性內(nèi)切酶KpnI處理獲得的質(zhì)粒，回收大約550bp的片段，然后使用ligation high將片段導(dǎo)入到HM-125/GL3的KpnI位點(diǎn)。這樣就可得到缺失了轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-125～-145附近片段的dISRE/GL3。
(2)IRF-2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建IRF-2表達(dá)質(zhì)粒制作如下。用TRIzol試劑(GIBCO BRL)從在α干擾素(1000U/ml)刺激后經(jīng)過8小時(shí)的U266細(xì)胞提取總RNA。使用First-strand cDNA Synthesis kit(phamacia)，以得到的RNA為模板，NotI-d(T)18為引物，于37℃下進(jìn)行1小時(shí)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以得到的cDNA為模板，以IRF2-F2(ttgtattggtagcgtgaaaaaagc)(序列22)、IRF2-R2(cagctagttcacattatctcgtcc)(序列23)為引物，使用LA-Taq(寶酒造)，進(jìn)行PCR(94℃45秒，60℃45秒，72℃60秒，40個(gè)循環(huán))。
以得到的PCR反應(yīng)液為模板，IRF2-F1(agagggtaccatgccggtggaaaggatgcg)(序列24)和IRF2-R1(agtcggtaccttaactgctcttgacgcggg)(序列25)為引物，使用KOD聚合酶(東洋紡)，再次進(jìn)行PCR(94℃45秒，60℃45秒，72℃60秒，30個(gè)循環(huán))。用限制性內(nèi)切酶KpnI處理得到的片段，然后使用ligation high(東洋紡)導(dǎo)入到表達(dá)質(zhì)粒pTracer-CMV(Invitrogen)的KpnI位點(diǎn)，獲得IRF-2表達(dá)質(zhì)粒pIRF-2/Tracer。
(3)報(bào)道基因活性的測定向細(xì)胞導(dǎo)入質(zhì)粒使用Polyethylenimine-Transferrinfection Kit(TfPEI-kit)(Bender MedSystems，Vienna，Austria)，熒光素酶分析使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)。將細(xì)胞株用含有50μM Defferrioxamine、10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)過夜。為了使導(dǎo)入的質(zhì)粒與Tf-PEI成為復(fù)合物，制作含有終濃度為20μg/ml的報(bào)道基因質(zhì)粒、20μg/ml的pIRF-2/Tracer或pTracer-CMV、0.4μg/ml的pRL-SV40、1μg/mlTf-PEI試劑的混合液，于室溫下溫育20分鐘。
加入5×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞，其加入量是Tf-PEI和質(zhì)粒的混合液的3倍，于37℃下溫育4小時(shí)，用培養(yǎng)基洗凈后，加入到96孔平底板進(jìn)行培養(yǎng)，每孔100μl(細(xì)胞濃度為2×105細(xì)胞/ml)。添加IFN-α，其終濃度分別為0，1000U/ml，于37℃下培養(yǎng)2天。細(xì)胞用PBS(-)洗凈后，溶解于20μl的Passive Lysis Buffer中，取6μl加到C96 White PolysorpFluoronunc plate(Nunc)上，用Luminoskan(Labsystems)在基質(zhì)溶液為30μl，測定時(shí)間為10秒的條件下分別測定Firefly和Renila的發(fā)光強(qiáng)度。測定值用Firefly/Renila對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行補(bǔ)正后，可求出相對活性。
(4)結(jié)果將HM1.24啟動(dòng)子報(bào)道質(zhì)粒和IRF-2表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入U(xiǎn)266細(xì)胞，測定報(bào)道活性(圖9)。結(jié)果表明使用含有作為IRF-2結(jié)合部位的ISRE基元序列的-700和-151的質(zhì)粒通過IRF-2共表達(dá)使得熒光素酶活性上升。另外使用缺失了ISRE序列的dISRE/GL3并沒有看到由于IRF-2共表達(dá)使得熒光素酶活性發(fā)生的變化。以上結(jié)果表明IRF-2結(jié)合于HM1.24啟動(dòng)子的ISRE區(qū)，并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。
(5)確認(rèn)由于IRF-2的強(qiáng)制表達(dá)使得HM1.24抗原的表達(dá)增強(qiáng)由于IRF-2引起的HM1.24抗原表達(dá)量的變化可以通過用上述方法將IRF-2表達(dá)質(zhì)粒(pIRF-2/Tracer)或?qū)φ召|(zhì)粒(pTracer/CMV)導(dǎo)入U(xiǎn)266細(xì)胞，培養(yǎng)1～2天后，收集細(xì)胞，用作為一次抗體使用的鼠抗人HM1.24抗體染色。將細(xì)胞洗凈，再用作為二次抗體使用的FITC標(biāo)記的抗鼠IgG抗體染色。將細(xì)胞洗凈后，利用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的FITC熒光強(qiáng)度?？梢源_認(rèn)在導(dǎo)入IRF-2表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中存在的FITC強(qiáng)度高的細(xì)胞要比導(dǎo)入對照質(zhì)粒的細(xì)胞中的多。
根據(jù)專利合作條約第13規(guī)則的2的保藏微生物的保藏機(jī)構(gòu)保藏機(jī)構(gòu) 名稱工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所地址茨城縣筑波市東1丁目1番3號微生物(1)表示Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19)保藏號FERM BP-4434保藏日1993年10月5日(2)表示Mouse-mouse hybridoma HM1.24保藏號FERM BP-5233保藏日1995年4月27日(3)表示Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)保藏號FERM BP-5643保藏日1996年8月29日(4)表示Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)保藏號FERM BP-5644保藏日1996年8月29日(5)表示Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)保藏號FERM BP-5645保藏日1996年8月29日(6)表示Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ)保藏號FERM BP-5646保藏日1996年8月29日序列表<110>CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA<120>以α干擾素為有效成分的增強(qiáng)HM1.24表達(dá)的藥劑<130>H757<160>5<210>1<211>1073<212>DNA<213>Homosapiens<223>編碼HM1.24蛋白質(zhì)抗原的核苷酸序列<400>1gaattcggca cgagggatct gg atg gca tct act tcg tat gac tat tgc49Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys1 5aga gtg ccc atg gaa gac ggg gat aag cgc tgt aag ctt ctg ctg ggg 97Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly10 15 20 25ata gga att ctg gtg ctc ctg atc atc gtg att ctg ggg gtg ccc ttg145Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu30 35 40att atc ttc acc atc aag gcc aac agc gag gcc tgc cgg gac ggc ctt193Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu45 50 55cgg gca gtg atg gag tgt cgc aat gtc acc cat ctc ctg caa caa gag241Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu60 65 70ctg acc gag gcc cag aag ggc ttt cag gat gtg gag gcc cag gcc gcc289Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala75 80 85acc tgc aac cac act gtg atg gcc cta atg gct tcc ctg gat gca gag337Thr Cys Asn His Thr Val Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu90 95 100 105aag gcc caa gga caa aag aaa gtg gag gag ctt gag gga gag atc act385Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr110 115 120aca tta aac cat aag ctt cag gac gcg tct gca gag gtg gag cga ctg433Thr Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu125 130 135aga aga gaa aac cag gtc tta agc gtg aga atc gcg gac aag aag tac481Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr140 145 150tac ccc agc tcc cag gac tcc agc tcc gct gcg gcg ccc cag ctg ctg529Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu155 160 165att gtg ctg ctg ggc ctc agc gct ctg ctg cag tga gatcccagga 575Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln170 175 180agctggcaca tcttggaagg tccgtcctgc tcggcttttc gcttgaacat tcccttgatc 635tcatcagttc tgagcgggtc atggggcaac acggttagcg gggagagcac ggggtagccg 695gagaagggcc tctggagcag gtctggaggg gccatggggc agtcctgggt ctggggacac 755agtcgggttg acccagggct gtctccctcc agagcctccc tccggacaat gagtcccccc 815tcttgtctcc caccctgaga ttgggcatgg ggtgcggtgt ggggggcatg tgctgcctgt 875tgttatgggt tttttttgcg gggggggttg cttttttctg gggtctttga gctccaaaaa 935aataaacact tcctttgagg gagagcacac cttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 995aaaattcggg cggccgcc 1013<210>2<211>180<212>PRT<213>Homosapiens<223>HM1.24蛋白質(zhì)抗原的氨基酸序列<400>2Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly1 5 10 15Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu20 25 30Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala35 40 45Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg50 55 60Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly65 70 75 80Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met85 90 95Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys100 105 110Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln115 120 125Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu130 135 140Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser145 150 155 160Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser165 170 175Ala Leu Leu Gln180<210>3<211>2016<212>DNA<213>Homosapiens<223>編碼HM1.24蛋白質(zhì)抗原的基因的啟動(dòng)子核苷酸序列<400>3actaaaagtc tctgatatgc agaaataatg gcataagctg tctttctgtc tgtcccctct 60ctctctctct gcctcggctg ccaggcaggg aagggccccc tgtccagtgg acacgtgacc 120cacatgacct tacctatcat tggagatgac tcacactctt taccctgccc cttttgcttt 180gtatccaata aataacagca cagccagaca ttcggggcca ctaccagtct ccgcgcattg 240ctggtagtgg tcccccgggc ccagctgtct tttcttttat ctcttcgtct tgtgtcttta 300tttctacact ctctcgtcgc cgcacacagg gagagaccca ctgaccctgt ggggctggtc 360cctacagtaa ttttaaaggg aagagcaaca aactttcggt ttgcagggct gggactgttt 420acagctgcaa aatttagaga ggacatcaat ctattattat ccacatttta cagctgggga 480aatcaatgct aagagaggaa attcatttgc ccagaggtgc accaccctgg cctccaatgt 540gcaattcatg caattgtgat ttccgacctg gtcccaaact aaccctaaag ttagcaggcc 600agaacagtgc tgctcaaata agtcagctta gtcaaataag tcaggcaaag gtcgtgtctt 660tgcacctgga gtcctggcca ggctggtagg tccctcctcc tgggacaagt tcaccctcag 720aattttcagc aagatcatct cccacagctt gttaattggt tcttggttct aagtgatttt 780tttgtttatt ggtttaagag atgggatccc actctatcac ccaggcttga gtgccgtggc 840acaatcatag ctcgctgcag cctcaaactc ctgggctcga gtgatcctcc tgcctcagcc 900tcccagcctc agcctgggac cacaggcatg taccaccatg cctggctcta agtggcttta 960atggggtcct tctgagggat gttggagtca gggcctgggg ggagttcccc aggccttctg 1020ggaggcctgg gctctggact tgacctcgcc tactgtctgg ccctgctgaa aagaaaaaaa 1080aacatggaaa tggcagacct aacagaatct gggctgtggt caggatgtgg ctgaagaagc 1140cacaagaaaa acatgcagtc ccctttcagc ggtcatgccc agcagttggg tgccgataat 1200gggcctgatt tcctgtagga agccctggct ctcttggcca catggacagt gtctgaggct 1260ggccctgtta ttcccctttg cagatgaaga aacaggctca gagagtttac ctggtatcct 1320ggagtcccag gagcactttt tctggaagta ggagcttgtt tcctgcaggt gccaagacag 1380agaccgacat tgtttgttgg ctgggtcggt ctcccagttt tcagctggct ccagtctcac 1440ctgttgctca cacaccctcc atgtctccca tagtcccctc ggtggggaca gaggcactgg 1500atgaagccct gctcgtcacc acagagacac ctgaacacaa aaaccagtcc ctggggtcag 1560acccaggccc cgcccccaga cccaggccct gccctcactc caccacgcaa ctgtgcaacc 1620tcagtttccc caggtggaga ccggaccaac aatgatggcc tctgcctctt caggtcatag 1680tacagatgaa tacaggctgg cacggcctag gcactcagta acacacggca gaggcacagg 1740gacttaagat ggagtgtccc aggcagccac agttggctgg cacccagttg ggaagggccc 1800aagggctttt aaagcagggt gaaaaaaaaa gcccacctcc tttctgggaa actgaaactg 1860aaaacctaat taatcctctg cctgtaggtg cctcatgcaa gagctgctgg tcagagcact 1920tcctggaact tgctattggt caggacgttt cctatgctaa taaaggggtg gcccgtagaa 1980gattccagca ccctccccta actccaggcc agactccttt cagctaaagg ggagatctgg 2040atg gca tct act tcg tat gac 2061Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp5<210>4<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物HM2K<400>4aaaggtacca gctgtctttc tgtctgtcc 29<210>5<211>78<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物BST2B<400>5atagtcatac gaagtagatg ccatccag 28<210>6<211>2144<212>DNA<213>Homosapiens<223>編碼IRF-2蛋白質(zhì)的核苷酸序列<400>6aactgacggg ctttcatttc catttcacac accctagcaa cacttatacc ttgcggaatt 60gtattggtag cgtgaaaaaa gcacactgag agggcaccat gccggtggaa aggatgcgca 120tgcgcccgtg gctggaggag cagataaact ccaacacgat cccggggctc aagtggctta 180acaaggaaaa gaagattttt cagatcccct ggatgcatgc ggctagacat gggtgggatg 240tggaaaaaga tgcaccactc tttagaaacc gggcaatcca tacaggaaag catcaaccag 300gagtagataa acctgatccc aaaacatgga aggcgaattt cagatgcgcc atgaattcct 360tgcctgatat tgaagaagtc aaggataaaa gcataaagaa aggaaataat gccttcaggg 420tctaccgaat gctgccccta tcagaacggc cttctaagaa aggaaagaaa ccaaagacag 480aaaaagaaga caaagttaag cacatcaagc aagaaccagt tgagtcatct ctggggctta 540gtaatggagt aagtgatctt tctcctgagt atgcggtcct gacttcaact ataaaaaatg 600aagtggatag tacggtgaac atcatagttg taggacagtc ccatctggac agcaacattg 660agaatcaaga gattgtcacc aatccgccag acatttgcca agttgtagag gtgaccactg 720agagcgacga gcagccggtc agcatgagcg agctctaccc tctgcagatc tcccccgtgt 780cttcctatgc agaaagcgaa acgactgata gtgtgcccag cgatgaagag agtgccgagg 840ggcggccaca ctggcggaag aggaatattg aaggcaaaca gtacctcagc aacatgggga 900ctcgaggctc ctacctgctg cccggcatgg cgtccttcgt cacttccaac aaaccggacc 960tccaggtcac catcaaagag gagagcaatc cggtgcctta caacagctcc tggccccctt 1020ttcaagacct ccccctttct tcctccatga ccccagcatc cagcagcagt cggccagacc 1080gggagacccg ggccagcgtc atcaagaaaa catcggatat cacccaggcc cgcgtcaaga 1140gctgttaagc ctctgactct ccgcggtggt tgttggggct tcttggcttt gttttgttgt 1200ttgtttgtat tttatttttt tctctctgac acctatttta gacaaatcta agggaaaaag 1260ccttgacaat agaacattga ttgctgtgtc caactccagt acctggagct tctctttaac 1320tcaggactcc agcccattgg tagacgtgtg tttctagagc ctgctggatc tcccagggct 1380actcactcaa gttcaaggac caacaagggc agtggaggtg ctgcattgcc tgcggtcaag 1440gccagcaagg tggagtggat gcctcagaac ggacgagata atgtgaacta gctggaattt 1500tttattcttg tgaatatgta cataggcagc actagcgaca ttgcagtctg cttctgcacc 1560ttatcttaaa gcacttacag ataggccttc ttgtgatctt gctctatctc acagcacact 1620cagcaccccc ttctctgccc attccccagc ctctcttcct atcccatccc atcccatccc 1680atcccatccc atcccatccc gctcttttcc tacttttcct tccctcaaag cttccattcc 1740acatccggag gagaagaagg aaatgaattt ctctacagat gtcccatttt cagactgctt 1800taaaaaaaat ccttctaatc tgctatgctt gaatgccacg cggtacaaag gaaaaagtat 1860catggaaata ttatgcaaat tcccagattt gaagacaaaa atactctaat tctaaccaga 1920gcaagctttt ttatttttta tacaggggaa tattttattc aaggtaaaat tctaaataaa 1980atataattgt tttttatctt ttctacagca aatttataat tttaagattc cttttcttgt 2040ttatcagcag ttgttattac atccttgtgg cacatttttt tttaattttg taaaggtgaa 2100aaaagctttt atgagctcat ctagcaatca gattttcctg tgga 2144<210>7<211>349<212>PRT<213>Homosapiens<223>IRF-2蛋白質(zhì)的氨基酸序列<400>7Met Pro Val Glu Arg Met Arg Met Arg Pro Trp Leu Glu Glu Gln Ile1 5 10 15Asn Ser Asn Thr Ile Pro Gly Leu Lys Trp Leu Asn Lys Glu Lys Lys20 25 30Ile Phe Gln Ile Pro Trp Met His Ala Ala Arg His Gly Trp Asp Val35 40 45Glu Lys Asp Ala Pro Leu Phe Arg Asn Arg Ala Ile His Thr Gly Lys50 55 60His Gln Pro Gly Val Asp Lys Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys Ala Asn65 70 75 80Phe Arg Cys Ala Met Asn Ser Leu Pro Asp Ile Glu Glu Val Lys Asp85 90 95Lys Ser Ile Lys Lys Gly Asn Asn Ala Phe Arg Val Tyr Arg Met Leu100 105 110Pro Leu Ser Glu Arg Pro Ser Lys Lys Gly Lys Lys Pro Lys Thr Glu115 120 125Lys Glu Asp Lys Val Lys His Ile Lys Gln Glu Pro Val Glu Ser Ser130 135 140Leu Gly Leu Ser Asn Gly Val Ser Asp Leu Ser Pro Glu Tyr Ala Val145 150 155 160Leu Thr Ser Thr Ile Lys Asn Glu Val Asp Ser Thr Val Asn Ile Ile165 170 175Val Val Gly Gln Ser His Leu Asp Ser Asn Ile Glu Asn Gln Glu Ile180 185 190Val Thr Asn Pro Pro Asp Ile Cys Gln Val Val Glu Val Thr Thr Glu195 200 205Ser Asp Glu Gln Pro Val Ser Met Ser Glu Leu Tyr Pro Leu Gln Ile210 215 220Ser Pro Val Ser Ser Tyr Ala Glu Ser Glu Thr Thr Asp Ser Val Pro225 230 235 240Ser Asp Glu Glu Ser Ala Glu Gly Arg Pro His Trp Arg Lys Arg Asn245 250 255Ile Glu Gly Lys Gln Tyr Leu Ser Asn Met Gly Thr Arg Gly Ser Tyr260 265 270Leu Leu Pro Gly Met Ala Ser Phe Val Thr Ser Asn Lys Pro Asp Leu275 280 285Gln Val Thr Ile Lys Glu Glu Ser Asn Pro Val Pro Tyr Asn Ser Ser290 295 300Trp Pro Pro Phe Gln Asp Leu Pro Leu Ser Ser Ser Met Thr Pro Ala305 310 315 320Ser Ser Ser Ser Arg Pro Asp Arg Glu Thr Arg Ala Ser Val Ile Lys325 330 335Lys Thr Ser Asp Ile Thr Gln Ala Arg Val Lys Ser Cys340 345<210>8<211>9<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>IFN-γ激活部位(GAS)共有序列<400>8ttncnnnaa 9<210>9<211>13<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>IFN-α刺激應(yīng)答元件(ISRE)共有序列<400>9ngaaanngaa act 13<210>10<211>9<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223><400>10ttcccagaa 9<210>11<211>13<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223><400>11ggaaactgaa act 13<210>12<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>ISRE-F2 probe<400>12aatttctggg aaactgaaae tgaaaacct 29<210>13<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>ISRE-F2 probe<400>13aattaggttt tcagtttcag tttcccaga 29<210>14<211>37<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>adp-1 probe<400>14catggcatct acttcgtatg actattgcag agtgcc 37<210>15<211>36<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>adp-2 probe<400>15catgggcact ctgcaatagt catacgaagt agatgc36<210>16<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物HM2k<400>16aaaggtacca gctgtctttc tgtctgtcc29<210>17<211>28<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>BST2B<400>17atagtcatac gaagtagatg ccatccag 28<210>18<211>28<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物10S<400>18tttcggtacc taattaatcc tctgcctg 28<210>19<211>23<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>GL引物2<400>19ctttatgttt ttggcgtctt cca 23<210>20<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物HMP700<400>20aaaggtacca gagtttacct ggtatcctgg 30<210>21<211>39<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物11A’<400>21cagaggatta attaggtacc gaaagagagg tgggctttt 39<210>22<211>24<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物IRF2-F2<400>22ttgtattggt agcgtgaaaa aagc 24<210>23<211>24<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物IRF2-R2<400>23cagctagttc acattatctc gtcc 24<210>24<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物IRF2-F1<400>24agagggtacc atgccggtgg aaaggatgcg30<210>25<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>引物IRF2-R1<400>25agtcggtacc ttaactgctc ttgacgcggg30
權(quán)利要求
1.具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(HM1.24抗原)的骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá)增強(qiáng)劑，以α干擾素或γ干擾素為有效成分。
2.骨髓瘤治療劑，含有作為有效成分的(1)α干擾素或γ干擾素，以及(2)能特異結(jié)合具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且具有細(xì)胞毒活性的抗體。
3.權(quán)利要求2記載的治療劑，其中的骨髓瘤是多發(fā)性骨髓瘤。
4.權(quán)利要求2或3記載的治療劑，其中的抗體是單克隆抗體
5.權(quán)利要求4記載的治療劑，其中的抗體是具有細(xì)胞毒活性的抗體。
6.權(quán)利要求2記載的治療劑，其中的抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
7.權(quán)利要求5記載的治療劑，其中的抗體是抗HM1.24抗體。
8.權(quán)利要求6記載的治療劑，其中的嵌合抗體或人源化抗體是嵌合抗HM1.24抗體或人源化抗HM1.24抗體。
9.具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(HM1.24抗原)的骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá)增強(qiáng)劑，以IRF-2蛋白質(zhì)為有效成分。
10.以IRF-2蛋白質(zhì)為有效成分的HM1.24啟動(dòng)子的激活劑。
11.骨髓瘤治療劑，含有作為有效成分的(1)IRF-2蛋白質(zhì)，以及(2)能特異結(jié)合具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且具有細(xì)胞毒活性的抗體。
12.權(quán)利要求11記載的治療劑，其中的骨髓瘤是多發(fā)性骨髓瘤。
13.權(quán)利要求11或12記載的治療劑，其中的抗體是單克隆抗體
14.權(quán)利要求13記載的治療劑，其中的抗體是具有細(xì)胞毒活性的抗體。
15.權(quán)利要求11記載的治療劑，其中的抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
16.權(quán)利要求14記載的治療劑，其中的抗體是抗HM1.24抗體。
17.權(quán)利要求15記載的治療劑，其中的嵌合抗體或人源化抗體是嵌合抗HM1.24抗體或人源化抗HM1.24抗體。
18.HM1.24抗原的骨髓瘤細(xì)胞中的表達(dá)增強(qiáng)劑，含有以增強(qiáng)IRF-2蛋白質(zhì)表達(dá)的化合物為有效成分。
19.HM1.24啟動(dòng)子的激活劑，含有以增強(qiáng)IRF-2蛋白質(zhì)表達(dá)的化合物為有效成分。
20.篩選HM1.24抗原表達(dá)增強(qiáng)劑的方法。
21.用于治療骨髓瘤患者的試劑盒，包含(1)能特異結(jié)合具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且具有細(xì)胞毒活性的抗體；以及(2)指導(dǎo)將上述抗體與增強(qiáng)具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)的藥劑組合用于患者的指導(dǎo)書。
22.權(quán)利要求21記載的試劑盒，其中上述骨髓瘤是多發(fā)性骨髓瘤。
23.權(quán)利要求21記載的試劑盒，其中上述抗體是人源化抗HM1.24抗體。
24.權(quán)利要求21記載的試劑盒，其中上述增強(qiáng)具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)表達(dá)的藥劑是α干擾素或γ干擾素。
25.含有能特異結(jié)合具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)并且具有細(xì)胞毒活性的抗體的治療骨髓瘤患者的藥物組合物，用于與增強(qiáng)具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)的藥劑組合向患者給藥。
26.權(quán)利要求25記載的藥物組合物，其中上述骨髓瘤是多發(fā)性骨髓瘤。
27.權(quán)利要求25記載的藥物組合物，其中上述抗體是人源化抗HM1.24抗體。
28.權(quán)利要求25記載的藥物組合物，其中上述增強(qiáng)具有序列2給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)的藥劑是α干擾素或γ干擾素。
全文摘要
以α干擾素或γ干擾素或IRF－2蛋白質(zhì)為有效成分的增強(qiáng)HM1.24抗原在骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)增強(qiáng)劑。預(yù)想α干擾素或γ干擾素是通過激活編碼HM1.24抗原的基因的啟動(dòng)子來增強(qiáng)HM1.24抗原的表達(dá)。
文檔編號A61K38/21GK1370076SQ00811883
公開日2002年9月18日 申請日期2000年8月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月23日
發(fā)明者小阪昌明, 尾崎修治, 若原裕二 申請人:中外制藥株式會社