專利名稱：應(yīng)用微器官誘導(dǎo)血管生成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和背景本發(fā)明涉及應(yīng)用微器官、微器官提取物和含有所述提取物的藥用組合物刺激宿主組織血管生成的方法。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及轉(zhuǎn)化了外源性核苷酸序列的微器官和應(yīng)用這些微器官為宿主組織提供血管生成因子的方法。
在過去的幾年中，很多研究為深入探討誘導(dǎo)調(diào)控血管生成的分子機(jī)理提供了新的見解。血管生成生長因子的發(fā)現(xiàn)使研究人員意識到，可以在缺血組織區(qū)應(yīng)用這些因子作為血管再生劑。所述血管生成生長因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，堿性成纖維生長因子(bFGF)，血管生成素和其他一些因子。業(yè)已嘗試了應(yīng)用基因治療和重組蛋白技術(shù)的幾種不同方法。盡管在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，初步結(jié)果喜人，但直到目前為止進(jìn)行的臨床試驗(yàn)，結(jié)果卻令人失望(Ferrara and Alitalo，1999 Nature Medicine 5(12)1359-1364)。
臨床水平的不成功至少可以部分歸結(jié)于在這些試驗(yàn)中應(yīng)用的基因治療或重組蛋白技術(shù)。
業(yè)已顯示，體內(nèi)血管生成受到一整套復(fù)雜、互動(dòng)因子的影響和調(diào)控，所述因子包括刺激因子和抑制因子(見Irula-Arispe and Dvorak，1997Thrombosis and Haemostasis 78(1)，672-677；Gale and Yancopolous，1999Genes and Development 13，1055-1066)。此外，目前認(rèn)為，誘導(dǎo)血管生成需要長期持續(xù)的刺激。因此，目前不能解決這些問題的基因治療和重組生長因子技術(shù)，不能為促進(jìn)體內(nèi)血管生成提供必要的條件。
最近，本發(fā)明的發(fā)明者描述了一種生成微器官的方法，所述微器官可以在體外以自治功能狀態(tài)維持相當(dāng)長一段時(shí)間。這些微器官的制備、保存及其某些應(yīng)用在下述文獻(xiàn)中有述，這些文獻(xiàn)在此引入，作為參考，如美國專利號5,888,720、美國專利申請?zhí)?9/425,233、PCT/US98/00594以及下述部分的優(yōu)選實(shí)施方案。
在將本發(fā)明付諸實(shí)踐的過程中，也就是下面實(shí)施例部分的詳細(xì)描述，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將這些微器官植入活體組織時(shí)，它們?yōu)榻M織提供了持續(xù)的一整套復(fù)雜調(diào)控血管生成因子，誘導(dǎo)了顯著的新生血管。我們還發(fā)現(xiàn)，無論正常動(dòng)物還是老齡動(dòng)物，植入的微器官都可以使外科手術(shù)誘導(dǎo)的缺血區(qū)恢復(fù)。
因此，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)血管生成的新的有效方法，該方法可以用來治療缺血組織，突破了先前方法的局限性。
發(fā)明簡述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了在第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)血管生成的方法，所述方法包括在第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織中植入至少一個(gè)微器官的步驟，其中，至少有一個(gè)微器官可以產(chǎn)生多種血管生成因子，進(jìn)而誘導(dǎo)血管生成。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了在第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)血管生成的方法，所述方法包括步驟(a)從至少一個(gè)微器官中提取可溶性分子；和(b)給第一個(gè)哺乳動(dòng)物的組織應(yīng)用至少一劑預(yù)定劑量的從步驟(a)提取的可溶性分子。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了含有多種細(xì)胞的微器官，其中，多種細(xì)胞中至少有一部分包括至少一個(gè)外源性多核苷酸序列，所述至少一個(gè)外源性多核苷酸序列可以調(diào)控細(xì)胞中至少一種血管生成因子的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了藥用組合物，所述藥用組合物包括從至少一種微器官中提取的可溶性分子和藥用載體。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了在第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)血管生成的方法，所述方法包括以下步驟(a)在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一個(gè)微器官，從而產(chǎn)生條件培養(yǎng)基；(b)在培養(yǎng)至少一個(gè)預(yù)定時(shí)期后，收獲條件培養(yǎng)基；(c)給第一個(gè)哺乳動(dòng)物的組織應(yīng)用至少一劑預(yù)定劑量的從步驟(b)收獲的條件培養(yǎng)基，進(jìn)而誘導(dǎo)組織血管生成。
根據(jù)下述本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，生長培養(yǎng)基是基本必需培養(yǎng)基。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，至少一個(gè)微器官取自第二個(gè)哺乳動(dòng)物的器官組織。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，第一個(gè)哺乳動(dòng)物和第二個(gè)哺乳動(dòng)物是單個(gè)哺乳動(dòng)物(single individual mammal)。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，器官選自肺臟、肝臟、腎臟、肌肉、脾臟、皮膚或其他任何內(nèi)臟。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，至少一個(gè)微器官包括兩種或兩種以上類型的細(xì)胞。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，第一個(gè)哺乳動(dòng)物是人類。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，在將至少一個(gè)微器官植入第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織內(nèi)之前，體外培養(yǎng)至少4小時(shí)。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，至少一個(gè)微器官制備成在植入哺乳動(dòng)物組織中時(shí)，依然具有活性。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，至少一個(gè)微器官具有維度，這樣位于至少一個(gè)微器官最深處的細(xì)胞，距離至少一個(gè)微器官最近表面至少約100微米，但不超過約225-350微米。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，多種血管生成因子中的每一種在至少一個(gè)微器官中都具有獨(dú)特的表達(dá)模式。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，至少一個(gè)微器官的至少一部分細(xì)胞包括至少一個(gè)外源性多核苷酸序列，選擇的該序列可以調(diào)控血管生成。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，至少一個(gè)外源性多核苷酸序列整合到至少一個(gè)微器官的至少一部分細(xì)胞的基因組中。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)的至少一個(gè)外源性多核苷酸序列可以調(diào)控多種血管生成因子中至少一種血管生成因子的表達(dá)。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，至少一個(gè)外源性多核苷酸序列包括增強(qiáng)子或抑制子序列。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，至少一個(gè)外源性多核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物可以調(diào)控多種血管生成因子中至少一種血管生成因子的表達(dá)。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)特點(diǎn)，至少一個(gè)外源性多核苷酸序列編碼至少一種重組血管生成因子。
本發(fā)明通過提供在哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)血管生成的方法、提取物和藥用組合物，成功克服了目前已知配制的缺陷。
附圖簡述本發(fā)明僅通過實(shí)施例的方式闡釋，附圖作為參考。應(yīng)用詳細(xì)描述的特定附圖作為參考，并強(qiáng)調(diào)特定附圖僅以示例的形式呈現(xiàn)，目的僅僅是舉例說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并提供業(yè)已被認(rèn)為是本發(fā)明最有用、并已被深入理解的原則和概念描述。在此方面，并未試圖顯示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，只提供了為理解本發(fā)明的基本原則所必需的細(xì)節(jié)，采用的附圖描述使本領(lǐng)域技術(shù)人員明確，在實(shí)踐中，如何實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的幾種形式。
附圖


圖1是一張照片，顯示了在植入微器官周圍的新生血管(以箭頭標(biāo)記)。
圖2顯示了移植微器官中表達(dá)的多種血管生成因子的相對水平。Ang1-血管生成素1，Ang2-血管生成素2，MEF2C-肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C，VEGF-血管內(nèi)皮生長因子。
圖3顯示了微器官制備后體外培養(yǎng)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)后，從中提取的RNA的血管生成因子特異性RT-PCR結(jié)果。Actin-β肌動(dòng)蛋白(對照)。
圖4代表了應(yīng)用密度計(jì)量學(xué)測定圖3所示RT-PCR產(chǎn)物的半定量結(jié)果，用β肌動(dòng)蛋白RT-PCR產(chǎn)物密度(對照)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖5是一個(gè)柱狀圖，代表髂總動(dòng)脈結(jié)扎大鼠植入微器官或安慰品(對照)后的選通控制圖。(n)＝13。三個(gè)時(shí)間組(從左到右)的P值為0.16，1和0.841。評分0-功能完全，9-完全不能移動(dòng)肢體，10-肢體喪失。
圖6是一個(gè)柱狀圖，代表與圖5相同的實(shí)驗(yàn)組，只是在選通控制行為評分前給動(dòng)物施加壓力。三個(gè)時(shí)間組(從左到右)的P值為0.0001，0.0069和0.06。
圖7是一個(gè)柱狀圖，代表代表髂總動(dòng)脈結(jié)扎小鼠植入微器官或安慰品后的選通控制圖。評分0-功能完全，9-完全不能移動(dòng)肢體，10-肢體喪失。三個(gè)時(shí)間組(從左到右)的P值為0.00025，0.00571和0.07362。
圖8顯示了植入同源小鼠皮下區(qū)6個(gè)月后的源于微器官的小鼠脾臟(以MC箭頭標(biāo)記)。箭頭標(biāo)記了圍繞微器官的一根新生血管。
圖9顯示了植入同源大鼠肺臟微器官的大鼠角膜。植入的微器官(以箭頭標(biāo)記)為新生血管所包繞。
優(yōu)選實(shí)施方案闡述本發(fā)明是應(yīng)用微器官、微器官提取物或含有所述提取物的藥用組合物在哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)血管生成的方法。具體地說，通過植入一個(gè)或多個(gè)微器官，或者通過具體施用可溶性微器官提取物，優(yōu)選含有所述提取物的藥用組合物，本發(fā)明可以用來在哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)血管生成。
通過參考附圖及附圖簡述，可以更好地理解本發(fā)明的原則和應(yīng)用。
在詳細(xì)闡述本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)施方案前，應(yīng)該理解，本發(fā)明并不局限于下面所述的構(gòu)建物的細(xì)節(jié)應(yīng)用和成分安排，也不局限于下面實(shí)施例部分的示例。本發(fā)明可以用于其他實(shí)施方案，或通過多種途經(jīng)付諸實(shí)踐或?qū)嵤?。而且，?yīng)該理解，這里應(yīng)用的詞匯或術(shù)語只是為了闡述問題，不應(yīng)視為對發(fā)明的限制。
如這里應(yīng)用的術(shù)語“微器官”是指從機(jī)體獲得的器官組織，并以能夠維持細(xì)胞活性和功能的方式制備，下面將有進(jìn)一步闡述。所述制備可能包括體外培養(yǎng)一段預(yù)定時(shí)期。
復(fù)雜的多細(xì)胞有機(jī)體有賴于支持每個(gè)細(xì)胞氧氣、營養(yǎng)和廢物排除需要的血管網(wǎng)絡(luò)。這一復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)通過血管生成過程創(chuàng)建并維持。在人類，血管網(wǎng)絡(luò)的退化可以導(dǎo)致阻塞性動(dòng)脈疾病，所述阻塞性動(dòng)脈疾病可以導(dǎo)致西方世界的病廢和死亡。目前可行的絕大多數(shù)治療選擇都基于手術(shù)或其他創(chuàng)傷性過程，如血管搭橋或血管成形術(shù)。這些解決方案在最大程度上也只是部分成功，但可能導(dǎo)致患者短期存活，或不是對所有患者都適用。由于血管生成是組織和器官形成的基本元素，絕大多數(shù)組織在再生過程中，仍然保持誘導(dǎo)新生血管形成的能力。因此，本發(fā)明的發(fā)明者推測，從體內(nèi)取出的組織大體上至少試圖再生，因此，可以用作血管生成的刺激物。
本發(fā)明提供了基于應(yīng)用微器官的誘導(dǎo)血管生成的新方法。所述微器官保持原始組織的基本微結(jié)構(gòu)，同時(shí)，在制備過程中使器官外植體的細(xì)胞距離營養(yǎng)和氣體源不超過100-450微米。這些微器官在體外培養(yǎng)和植入狀態(tài)的相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)，保持功能自治和活性。
應(yīng)當(dāng)理解，盡管微器官在制備后可以立即應(yīng)用，但為了增加活性，在某些情況下體外培養(yǎng)一段時(shí)間可能使有利的。例如，在需要提取可溶性分子的情況下，可以將微器官培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間段，可以短如4小時(shí)，長如數(shù)天或數(shù)周。
因此，應(yīng)用這些微器官或微器官提取物誘導(dǎo)血管生成有賴于在植入之前多段時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞功能的保持。本發(fā)明部分基于一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即在給定條件下，一個(gè)器官外植體不同組織層的細(xì)胞生長可以被激活，并在培養(yǎng)中增殖、分化、發(fā)揮功能，所述不同組織層如間葉細(xì)胞層和上皮細(xì)胞層。
在外植體本身存在的細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用就足以支持細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，因此，可以在較長時(shí)間內(nèi)維持器官的微結(jié)構(gòu)和功能。這里應(yīng)用的術(shù)語“動(dòng)態(tài)平衡”是指在細(xì)胞增殖和細(xì)胞損失之間的平衡。
細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡的支持保持了，例如，在源器官自然發(fā)生的細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用。因此，有關(guān)細(xì)胞相互之間的定向和向其他錨定底物的定向，以及在調(diào)控物質(zhì)如激素存在或不存在的情況下，允許源器官保持適宜的生化和生物活性。而且，微器官在沒有壞死的情況下維持培養(yǎng)至少48小時(shí)，或更長時(shí)間。
微器官的外植體源可以從中分離微器官的哺乳動(dòng)物示例包括人類和其他靈長類動(dòng)物，豬，如完全天然或部分天然的豬(如微型豬，和轉(zhuǎn)基因豬)，嚙齒類動(dòng)物等。適宜的器官示例包括但不限于肝臟、肺臟、其他腸道衍生器官、心臟、脾臟、腎臟、皮膚和胰腺。
生長培養(yǎng)基有大量組織培養(yǎng)基可以培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞。其中一些比較復(fù)雜，一些比較簡單。盡管預(yù)期微器官可能需要在復(fù)雜培養(yǎng)基中生長，美國專利申請系列號08/482,364業(yè)已顯示，培養(yǎng)物可以在簡單培養(yǎng)基如Dulbecco’s基本必需培養(yǎng)基(DMEM)中維持。而且，盡管微器官可以在含有血清或其他生物提取物如垂體提取物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，但美國專利申請系列號08/482,364業(yè)已顯示，并不需要血清或其他生物提取物。而且，在沒有血清的情況下，微器官培養(yǎng)物可以維持一段相當(dāng)長的時(shí)間。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，在體外微器官培養(yǎng)物維持過程中，培養(yǎng)基不包括生長因子。
有關(guān)在基本培養(yǎng)基中生長的要點(diǎn)是重要的。目前，為延長哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長，絕大多數(shù)培養(yǎng)基或系統(tǒng)與未定義的蛋白質(zhì)結(jié)合，或應(yīng)用飼養(yǎng)細(xì)胞來提供維持生長所需的蛋白質(zhì)。因?yàn)檫@些未定義蛋白的存在可以有意終止干擾微器官的應(yīng)用，因此，在培養(yǎng)外植體時(shí)應(yīng)盡量減少未定義蛋白的存在。
這里應(yīng)用的語言“基本培養(yǎng)基”是指一種化學(xué)定義的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基僅僅含有培養(yǎng)細(xì)胞存活和增殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)。典型的基本培養(yǎng)基不含生物提取物，如生長因子、血清、垂體提取物或其他對培養(yǎng)細(xì)胞群體的存活和增殖不必需的物質(zhì)。例如，基本培養(yǎng)基通常包括至少一種氨基酸，至少一種維生素，至少一種鹽類，至少一種抗生素，至少一種指示劑，如酚紅，來指示氫離子濃度，葡萄糖，和至少一種抗生素，以及其他細(xì)胞存活和增殖所必需的多種成分。基本培養(yǎng)基不含血清。多種基本培養(yǎng)基可以從Gibco BRL，Gaithersburg，MD購買，作為基本必需培養(yǎng)基。
但是，由于不必向培養(yǎng)基中添加生長因子和調(diào)控因子，添加這些因子或接種其他特定細(xì)胞可以用來增加、改變或調(diào)節(jié)培養(yǎng)物中細(xì)胞的增殖和成熟。多種生長因子可以影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長和活性，所述生長因子如胰島素、生長激素、生長素介質(zhì)、集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素、表皮生長因子、肝紅細(xì)胞生成因子(肝紅細(xì)胞生成素)和其他細(xì)胞生長因子，如前列腺素、白細(xì)胞介素、和天然負(fù)性生長因子、成纖維生長因子和β轉(zhuǎn)化生長因子家族的成員。
培養(yǎng)容器微器官可以在任何適宜的培養(yǎng)容器中維持，并可維持于37℃，5％CO2?？梢該u動(dòng)培養(yǎng)物來改善通氣。
關(guān)于在其內(nèi)/上優(yōu)選提供微器官的培養(yǎng)容器，應(yīng)該指出，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這種容器通?？梢允侨魏尾牧虾?或形狀。多種不同的材料可以用來形成容器，包括但不限于尼龍(聚酰胺)，滌綸(聚酯)，聚苯乙烯，聚丙烯，聚丙烯酸酯，聚乙烯化合物(如聚氯乙稀)，聚碳酸酯(PVC)，聚四氟乙烯(PTFE，特氟綸)，thermanox(TPX)，硝酸纖維素，棉花，聚羥基乙酸(PGA)，羊腸線，纖維素，白明膠，右旋糖苷等?？蓱?yīng)用任何材料編織成篩網(wǎng)。
當(dāng)培養(yǎng)物需要維持較長一段時(shí)間或需要凍存時(shí)，優(yōu)選不能降解的材料，如尼龍、滌綸、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙稀酸酯、聚乙烯、特氟綸、棉花等。根據(jù)本發(fā)明可以應(yīng)用的便利尼龍篩網(wǎng)是Nitex，所述尼龍篩網(wǎng)是尼龍過濾篩，平均孔徑大小為210um，平均尼龍纖維直徑為90um(Tetko，Inc.，N.Y.)。
外植體的維度分離的外植體除了依然保持源組織細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間和細(xì)胞與間質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)外，外植體的維度對于那些細(xì)胞的活性也至關(guān)重要，如微器官有意要維持一段較長的時(shí)間，如7-21天或更長時(shí)間。
因此，選擇的組織外植體的維度應(yīng)該可以使充足的營養(yǎng)和氣體，如氧氣，擴(kuò)散提供給三維微器官的每一個(gè)細(xì)胞，同時(shí)，使細(xì)胞廢物擴(kuò)散到外植體外，使細(xì)胞毒性和由于微器官廢物不能排除而導(dǎo)致的伴隨死亡最小化。因此，外植體的大小取決于在沒有特定傳輸結(jié)構(gòu)和合成底物的情況下，到達(dá)每個(gè)細(xì)胞所需的最低水平。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，如美國專利申請?zhí)?8/482,364所述，如果表面積比體積指數(shù)在某一特定范圍，就可維持這一到達(dá)量。
表面積比體積指數(shù)的所選范圍提供了與單層細(xì)胞培養(yǎng)相似的營養(yǎng)提供和廢物排除的方式。如果表面積比體積指數(shù)至少約為2.6mm-1時(shí)，營養(yǎng)提供水平可以達(dá)到并維持，所述表面積比體積指數(shù)在這里定義為“Aleph或Aleph指數(shù)”。三維培養(yǎng)曾經(jīng)忽略表面積比體積指數(shù)的測定，因?yàn)槿齻€(gè)維度的變化可以導(dǎo)致體積和表面積的比例測定變化。但是，當(dāng)測定Aleph時(shí)，a和x應(yīng)定義為組織切片最小的兩個(gè)維度。
這里應(yīng)用的“Aleph”指通過公式1/x+1/a給定的表面積比體積指數(shù)，其中x＝以mm計(jì)的組織厚度，a＝以mm計(jì)的組織寬度。在優(yōu)選實(shí)施方案中，一個(gè)外植體的Aleph范圍大約為2.7mm-1-25mm-1，范圍更優(yōu)選2.7mm-1-15mm-1，范圍更優(yōu)選2.7mm-1-10mm-1。
表1提供了Aleph的示例，其中，例如，一個(gè)組織的厚度(x)為0.1mm，寬度(a)為1mm，那么Aleph指數(shù)為11mm-1。
表1.以mm-1計(jì)的表面積比體積指數(shù)“Aleph”的不同值，以a(寬度)和x(厚度)的函數(shù)計(jì)算
這樣，例如，位于單個(gè)微器官最深處的細(xì)胞距離該單個(gè)微器官最近表面至少大約100微米，但不超過225-350微米，因此，可以保持體內(nèi)微結(jié)構(gòu)，同時(shí)保證沒有細(xì)胞距離氣體和營養(yǎng)源超過225-350微米。
沒有任何一個(gè)特定理論能夠解釋，但三維培養(yǎng)系統(tǒng)提供的多種因子可能與成功有關(guān)。
首先，外植體大小的正確選擇，例如，應(yīng)用上述Aleph計(jì)算，提供了適宜的表面積體積比率，使外植體的所有細(xì)胞享有充足擴(kuò)散的營養(yǎng)，同時(shí)使外植體所有細(xì)胞的細(xì)胞廢物可以充分?jǐn)U散。
其次，由于外植體的三維培養(yǎng)，多種細(xì)胞可以持續(xù)活性生長，與單層培養(yǎng)的細(xì)胞不同，所述單層培養(yǎng)的細(xì)胞在生長到匯合時(shí)，顯示接觸抑制，停止生長、分裂。外植體細(xì)胞復(fù)制產(chǎn)生的生長和調(diào)控因子可能與培養(yǎng)中細(xì)胞刺激增殖和調(diào)控分化部分相關(guān)，如，甚至在微器官總體積靜止時(shí)。
第三，外植體三維基質(zhì)維持了細(xì)胞元件的空間分布，與體內(nèi)相應(yīng)器官所見近似。
第四，細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用允許局部微環(huán)境的建立，有益于細(xì)胞成熟。業(yè)已顯示，細(xì)胞表型分化的維持不僅需要生長/分化因子，還需要適宜的細(xì)胞間相互作用。
在將本發(fā)明付諸實(shí)踐的過程中，也就是下面實(shí)施例部分的詳細(xì)描述，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將這些微器官植入受體時(shí)，它們提供了持續(xù)的一整套復(fù)雜血管生成因子，導(dǎo)致宿主植入組織中新生血管的形成。我們還發(fā)現(xiàn)，無論正常動(dòng)物還是老齡動(dòng)物，微器官都可以逆轉(zhuǎn)宿主組織的缺血。而且，我們還發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的微器官表達(dá)相同的血管生成因子系統(tǒng)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了在哺乳動(dòng)物組織中一段血管生成的方法，例如人類。該方法通過在哺乳動(dòng)物組織中植入至少一個(gè)微器官來進(jìn)行。適于微器官植入的組織示例包括但不限于器官組織或肌肉組織。
植入可以通過外科手術(shù)技術(shù)或?qū)⑽⑵鞴僦苿┳⑸涞讲溉閯?dòng)物的預(yù)期組織區(qū)來實(shí)現(xiàn)，所述注射方法要應(yīng)用特殊改造的注射器，該注射器有適于注射微器官的標(biāo)準(zhǔn)針頭。
用于植入的微器官優(yōu)選從待植入哺乳動(dòng)物或同種哺乳動(dòng)物的器官組織中制備，盡管也可應(yīng)用異種組織制備微器官，但在植入前或植入過程中必需采取措施，避免移植物排斥反應(yīng)和/或移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)。多種預(yù)防或減輕移植物排斥反應(yīng)或GVHD的方法是本領(lǐng)域熟知的，因此這里就不給出進(jìn)一步的細(xì)節(jié)了。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，微器官的至少一部分細(xì)胞包括至少一個(gè)外源性多核苷酸序列。這些多核苷酸序列優(yōu)選與這些細(xì)胞的基因組穩(wěn)定整合，盡管也可應(yīng)用暫時(shí)性多核苷酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，這些外源性多核苷酸序列可以在哺乳動(dòng)物器官組織外植后導(dǎo)入微器官細(xì)胞，也可以在制備器官組織外植體前用外源性多核苷轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物。下面將詳細(xì)闡述轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法。
這些外源性多核苷酸序列可以，例如通過上調(diào)或下調(diào)這些細(xì)胞表達(dá)的一種或多種內(nèi)源性血管生成因子的表達(dá)來增強(qiáng)血管生成。在這種情況下，多核苷酸序列可以包括反作用或順作用增強(qiáng)子或抑制子元件，所述元件可以調(diào)控這些細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性血管生成因子的轉(zhuǎn)錄或翻譯。可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多種適于翻譯或轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的示例是本領(lǐng)域熟知的。
例如，順作用或反作用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件對于激活特定啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄是必需的(Carey et al.(1989)，J.Mol.Biol.，209423-432；Cress et al.(1991)Science，25187-90；and Sadowski et al.(1988)，Nature，335563-564)。
翻譯激活子可以通過花椰菜嵌合病毒翻譯激活子(TAV)示例說明。見，例如，F(xiàn)utterer and Hohn(1991)EMBO J.103887-3896。在這個(gè)系統(tǒng)中，產(chǎn)生了雙順反子mRNA。也就是說，在同一mRNA中，從同一啟動(dòng)子啟動(dòng)兩個(gè)編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄。在沒有TAV的情況下，只有第一個(gè)順反子在核糖體翻譯。但是，表達(dá)TAV的細(xì)胞，兩個(gè)順反子都被翻譯。
順作用調(diào)控元件的多核苷酸序列可以通過常用的基因敲入技術(shù)導(dǎo)入微器官細(xì)胞?；蚯萌?敲除方法學(xué)的綜述見，例如，美國專利號5,487,922，5,464,764，5,387,742，5,360,735，5,347,075，5,298,422，5,288,846，5,221,778，5,175,385，5,175,384，5,175,383，4,736,866以及Burke and Olson，Methods inEnzumology，194251-270，1991；Capecchi，Science 2441288-1292；Dickinsonet al.，Human Molecular Genetics，2(8)1299-1302，1993；Duff and Lincoln，“將病原性突變插入含有人APP基因的酵母人工染色體并在ES細(xì)胞中表達(dá)”，Research Advances in Alzheimer’s Disease and Related Disorders，1995；Huxley et al.，Genomics，9742-750，1991；Jakobovits et al.，Nature，362255-261，1993；Lamb et al.，Nature Genetics，522-29，1993；Pearson and Choi，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，9010578-82；Rothstein，Methods in Enzymology，194281-301，1991；Schell et al.，Nature，362258-261，1993；Strauss et al.，Science，2591904-1907，1993，WO 94/23049，WO 93/14200，WO 94/06908and WO 94/28123也通過了相關(guān)信息。
通過反義RNA也可以下調(diào)內(nèi)源性血管生成因子。在這種情況下，外源性多核苷酸序列可以編碼序列，所述序列與微器官細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的血管生成因子mRNA序列互補(bǔ)。下調(diào)還可以通過基因敲除技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
上調(diào)可以通過過量表達(dá)或提供一種或多種血管生成因子編碼序列的高拷貝數(shù)來實(shí)現(xiàn)。在這種情況下，外源性多核苷酸序列可以編碼一種或多種血管生成因子，例如但不限于VEGF，bFGF，Ang1或Ang2，所述序列可以置于哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的適宜啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下。適宜的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括但不限于可以從Invitrogen購買的pcDNA3，pcDNA3.1(+/-)，pZeoSV2(+/-)，pSecTag2，pDisplay，pEF/myc/cyto，pCMV/myc/cyto，pCR3.1，可以從Promega購買的pCI，可以從Stratagene購買的pBK-RSV和pBK-CMV，可以從Clontech購買的pTRES，以及它們的衍生物。
將外源性多核苷酸序列導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多種方法是本領(lǐng)域熟知的。這些方法包括但不限于DNA直接攝取技術(shù)，以及病毒或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(進(jìn)一步細(xì)節(jié)見，例如“Methods in Enzymology”Vol.1-317，AcademicPress)。還可應(yīng)用核酸包裹的顆粒轟擊微器官。
應(yīng)當(dāng)理解，可以從微器官中提取其表達(dá)的血管生成因子，可以以提取原液或精制提取液的形式直接或作為藥用組合物的一部分局部用于宿主組織，以誘導(dǎo)血管生成。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解，由于微器官在植入后或培養(yǎng)過程中的不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)不同水平的多種血管生成因子，因此可以在不同時(shí)間點(diǎn)、從不同微器官培養(yǎng)物中提取可溶性分子，當(dāng)系列局部應(yīng)用時(shí)，可以模擬植入或培養(yǎng)微器官的時(shí)程表達(dá)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了在哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)血管生成的另一種方法。該方法通過從微器官中提取可溶性分子并在哺乳動(dòng)物組織中應(yīng)用至少一個(gè)預(yù)定劑量的可溶性提取分子來實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域熟知多種給藥方法。下面給出了有關(guān)藥用組合物的一些給藥方法的細(xì)節(jié)描述。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，藥用組合物包括可溶性提取物，還包括藥用載體，所述載體可以穩(wěn)定和/或增強(qiáng)可溶性提取物到達(dá)或定向靶定機(jī)體組織。
藥用載體的示例包括但不限于生理溶液，病毒衣殼載體，脂質(zhì)體載體，膠囊載體，復(fù)雜陽離子試劑載體，聚陽離子載體如聚賴氨酸和細(xì)胞載體。
含有藥用組合物“活性成分”的可溶性提取物可以通過多種給藥方式用于個(gè)體。
適宜的給藥途經(jīng)可能包括，例如經(jīng)粘膜或腸道外給藥，包括肌內(nèi)、皮下和髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻腔內(nèi)或眼內(nèi)注射。
組合物和提取物優(yōu)選局部給藥，而非系統(tǒng)給藥，例如通過注射直接將組合物和提取物導(dǎo)入個(gè)體缺血組織區(qū)。
本發(fā)明藥用組合物可以通過本領(lǐng)域熟知的程序生產(chǎn)，例如，通過傳統(tǒng)的混和、溶解、制粒、包裹糖衣、捻細(xì)成粉、乳化、裝入膠囊、entrapping或凍干程序。
因此，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的藥用組合物可以應(yīng)用一種或多種生理可接受載體通過傳統(tǒng)方式制備，所述載體包括可以藥用的賦形劑和佐劑，可以更容易地使活性成分融入制劑。適宜的制劑取決于選擇的給藥途經(jīng)。
對于注射用藥，活性成分可以制備成水溶液，優(yōu)選溶于生理兼容的緩沖液，如Hank’s溶液，Ringer’s溶液或生理鹽緩沖液。對于經(jīng)粘膜給藥，制劑要應(yīng)用能夠滲透屏障的適宜滲透劑。這些滲透劑是本領(lǐng)域熟知的。
這里描述的組合物還可制備成腸道外給藥，如彈丸注射或持續(xù)點(diǎn)滴。注射制劑可以以單位劑量形式存在，如分裝在安瓿內(nèi)或放置于多劑量容器內(nèi)，并可選擇性添加防腐劑。組合物可以用油或水載體制成懸液、溶液或乳劑，還可能含有制備劑如懸浮、穩(wěn)定和/或分散劑。
腸道外給藥的藥用組合物包括活性成分的水溶液形式。此外，活性成分的懸液可以制備成適宜的基于油或水的注射懸液。適宜的親脂溶劑或載體包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯、甘油三酯或脂質(zhì)體。水溶注射懸液可含有增加懸液粘性的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或右旋糖苷。懸液還可選擇性含有適宜的穩(wěn)定劑或可以增加活性成分溶解性的制劑，這樣可以制備高濃度的溶液。
此外，本發(fā)明組合物還可通過局部定位泵或時(shí)間釋放池給藥，所述裝置可以植入個(gè)體的缺血組織內(nèi)。
由于典型的血管生成因子是由產(chǎn)生細(xì)胞分泌的，因此，微器官還可在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)收獲含有分泌的血管生成因子的條件培養(yǎng)基，并將條件培養(yǎng)基作為上述可溶性提取物應(yīng)用。
因此，根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了在第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)血管生成的方法。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，該方法的實(shí)現(xiàn)需要通過下述步驟，在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一個(gè)微器官以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基，在培養(yǎng)至少一個(gè)預(yù)定時(shí)間段后收獲條件培養(yǎng)基，將至少一個(gè)預(yù)定劑量的條件培養(yǎng)基導(dǎo)入第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織中，進(jìn)而在該組織中誘導(dǎo)血管生成。
優(yōu)選的生長培養(yǎng)基是基本必需培養(yǎng)基(見上述)，該培養(yǎng)基不含可能干擾條件培養(yǎng)基預(yù)期功能或在給哺乳動(dòng)物應(yīng)用時(shí)可能導(dǎo)致意外反應(yīng)的未定義蛋白質(zhì)或其他生長因子。
應(yīng)當(dāng)理解，收獲的條件培養(yǎng)基還可應(yīng)用如親和柱層析等的層析技術(shù)處理，以產(chǎn)生基本純化制劑，所述制劑含有一系列血管生成因子，當(dāng)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物時(shí)，適于誘導(dǎo)血管生成。
還應(yīng)進(jìn)一步理解，這里說明的條件培養(yǎng)基和可溶性提取物還可從如上所述包括外源性多核苷酸序列的微器官中獲得。在這種情況下，如果應(yīng)用的外源性多核苷酸序列編碼血管生成因子，就適于選擇這種外源性多核苷酸序列給預(yù)期的哺乳動(dòng)物。例如，如果可溶性提取物或條件培養(yǎng)基是給人類應(yīng)用的，優(yōu)選應(yīng)用人類或人類化的外源性多核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明宗旨，微器官可以在制備后應(yīng)用，也可凍存并儲存于零下160℃直至應(yīng)用。例如，微器官可以在10％DMSO(二甲亞砜)和20％血清中通過梯度冷凍法凍存。
例如，凍存可以通過下述方法實(shí)現(xiàn)，將微器官包裹在平坦的薄膜內(nèi)，(例如，半透基質(zhì)如藻酸鹽)，然后將這些包裹好的微器官插入可以封口的無菌合成塑料袋中，所述塑料袋的大小與包裹好的微器官大小相似。塑料袋在一端包括一個(gè)塑料管狀輸入口，另一端包括一個(gè)塑料管狀輸出口。然后向含有平坦薄膜包裹的微器官的密封塑料袋中灌注含10％DMSO和20％血清的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，如Ham’s F12，并逐步冷凍，儲存于零下160℃。
心血管醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要目標(biāo)就是應(yīng)用治療性血管生成取代手術(shù)搭橋。盡管在冠狀動(dòng)脈缺血或肢體缺血的動(dòng)物模型中應(yīng)用血管生成因子觀察到相當(dāng)可觀的效果，但是，臨床結(jié)果卻令人失望。最近，有提示指出，臨床失敗可能是由于應(yīng)用的血管生成因子或聯(lián)合應(yīng)用這些因子。本發(fā)明的血管生成方法克服了以前這一領(lǐng)域多種方法的局限性。
本發(fā)明帶來一個(gè)新方法，該方法認(rèn)為，血管生成是一個(gè)通過多個(gè)調(diào)控因子介導(dǎo)的復(fù)雜、高度調(diào)控和持續(xù)的過程。本發(fā)明的結(jié)果提供了一個(gè)研究體內(nèi)或體外誘導(dǎo)血管生成的模型，因此，允許建立關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)模式。這里提供的結(jié)果顯示，植入的微器官無論體內(nèi)、體外，以協(xié)同方式表達(dá)幾種關(guān)鍵血管生成因子。而且，體內(nèi)試驗(yàn)顯示，微器官作為真正意義上的血管泵，不僅通過轉(zhuǎn)錄血管生成因子，而且通過誘導(dǎo)新生血管形成來發(fā)揮功能。而且，誘導(dǎo)效果顯著，形成的血管足以為其周圍區(qū)域提供血液供給，并使小鼠和大鼠的人工誘導(dǎo)組織缺氧區(qū)得以自救。
在以下實(shí)施例部分提供的大鼠缺血模型模擬了慢性缺血，因?yàn)闆]有發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損害。在未治療動(dòng)物中，缺血癥狀僅在施加壓力后出現(xiàn)。我們假設(shè)，在一般狀態(tài)下，通過側(cè)支循環(huán)可以保持肢體存活足夠的血供，但當(dāng)面臨其他挑戰(zhàn)時(shí)，血供就不足以維持正常功能。微器官的植入通過增加缺血區(qū)血供，明顯逆轉(zhuǎn)了這種狀況。結(jié)果顯示，在微器官治療組和對照組之間差異顯著，這種差異無疑是由于微器官誘導(dǎo)的血管生成。
在這里提供的小鼠系列體內(nèi)自救實(shí)驗(yàn)中，缺血損害加重。與大鼠相比，由于尾動(dòng)脈發(fā)育不良，小鼠后肢側(cè)支循環(huán)不良。在該組，在對照組中可以觀察到急性不可逆轉(zhuǎn)的缺血損傷征兆，如壞疽和肢體自行離斷。這一發(fā)現(xiàn)提示本發(fā)明還可能用于急救過程，但這個(gè)問題需要進(jìn)一步檢測。
下面提供的另一系列試驗(yàn)中，通過在已經(jīng)致病的動(dòng)物中誘導(dǎo)缺血使缺血更加嚴(yán)重。同樣，僅照組動(dòng)物發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的缺血損害。對照動(dòng)物的損害非常嚴(yán)重，以至于無法嘗試應(yīng)激試驗(yàn)。小鼠的數(shù)量很少，但差異顯著。這些結(jié)果非常重要，因?yàn)檫@些結(jié)果提示，微器官甚至能夠在受到某種外周血管疾病影響的組織中誘導(dǎo)血管生成。
因此，本發(fā)明提供了在宿主組織中誘導(dǎo)并維持血管形成的方法和組合物，目的是挽救缺血組織或在阻塞血管周圍產(chǎn)生天然旁路。
通過查看下述實(shí)施例，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員均可領(lǐng)會本發(fā)明的其他目的、優(yōu)勢和新特征，但實(shí)施例并非為了限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。此外，上述多種實(shí)施方案的每一種和本發(fā)明的所有方面，以及在下述權(quán)利要求部分聲明的權(quán)利要求，均可在下面實(shí)施例部分找到實(shí)驗(yàn)支持。
實(shí)施例現(xiàn)在給出下述實(shí)施例的參考文獻(xiàn)，與上面的描述一起，以非限定方式舉例說明了本發(fā)明。
通常，這里應(yīng)用的術(shù)語和本發(fā)明應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室方法包括分子、生化、微生物和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有十分透徹的說明。見，例如“Molecular CloningA laboratory Manual”Sambrook et al.，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”Volumes I-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel et al.，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wileyand Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide toMolecular Cloning”，John Wiley & Sons，New york(1988)；Watson et al.，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren et al.，(eds)“Genome AnalysisA Laboratory Manual Series”，Vols.1-4，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(1998)；公開的方法學(xué)如美國專利號4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057，“Cell BiologyALaboratory Handbook”，Volumes I-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；“CurrentProtocols in Immunology”Volumes I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites et al.(eds)，“Basic and Clinical Immunology”(8thEdition)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds)，“Selected Methods in CellularImmunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可供應(yīng)用的免疫試驗(yàn)在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中均有詳細(xì)描述，見如，美國專利號3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,967,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，ed.(1984)；“NucleicAcid Hybridization”Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.，ed.(1986)；“Immobilized Cells andEnzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)and“Methods in Enzymology”Vol.1-317，Academic Press；“PCR ProtocolsA Guide To Methods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak et al.，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有文獻(xiàn)在此全文引入，作為參考。其他常用參考文獻(xiàn)在本文件中貫穿給出。相信這些方法是本領(lǐng)域眾所周知的，這里給出是為了方便讀者。這些文獻(xiàn)包含的所有信息在此引入，作為參考。
實(shí)施例1
實(shí)驗(yàn)材料和方法Hebrew大學(xué)科學(xué)院動(dòng)物關(guān)懷應(yīng)用委員會批準(zhǔn)了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
微器官制備成年動(dòng)物(C-57小鼠或Sprague Dawley大鼠)應(yīng)用CO2窒息處死，然后在無菌條件下取出肺臟。將肺臟置于冰上，用含有4.5gm/l D-葡萄糖的Ringer液或DMEM沖洗肺臟。通過應(yīng)用Sorvall組織絞碎器將肺臟絞成寬度大約為300um的碎片，來制備微器官。應(yīng)用含有100單位/ml青霉素、1mg/ml鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM(Biological Industries)沖洗微器官2次，微器官置于冰上直至應(yīng)用。
微器官植入應(yīng)用每克體重0.6mg戊巴比妥鈉麻醉成年C-57小鼠。將小鼠刮毛，并在胃上區(qū)域的皮膚上做一個(gè)大約2cm長的切口。應(yīng)用止血鉗在切口兩側(cè)創(chuàng)建皮下“口袋”，在每個(gè)口袋內(nèi)植入8-9個(gè)微器官。植入也可簡單地通過將微器官置于肌肉層之上完成。切口縫合，將動(dòng)物置于溫暖、明亮的房間數(shù)小時(shí)后，轉(zhuǎn)到動(dòng)物房。4只動(dòng)物以植入后4小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)和7天的間隔處死，在外科顯微鏡下從周圍組織分離植入的微器官，用來提取RNA。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法，逆轉(zhuǎn)錄提取的RNA，獲得的cDNA作為PCR分析的模板。下表2給出了用于PCR反應(yīng)的寡核苷探針序列、預(yù)期的產(chǎn)物大小和參考文獻(xiàn)。
表2.RT-PCR探針序列和來源
*在大約320bp處經(jīng)?？梢蕴綔y到另一條分離的帶——這條帶的來源未知。**探針(Ang1)和探針序列(VEGF)由以色列Eli Keshet教授賜予。***VEGF mRNA進(jìn)行不同的接合。VEGF121的PCR產(chǎn)物大小為444bp，VEGF165為573bp，VEGF189為645bp。****Ibrahim et al.1998 Biochimica et Biophysica Acta 1403，254-264。
光密度分析和量化將每個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物10ul在溴化乙啶染色的1.5％瓊脂糖凝膠上電泳。應(yīng)用Macintosh Centris 660 AV計(jì)算機(jī)和配備有Toyo Optics TV變焦透鏡(75-125mm，F(xiàn)＝1.8，帶有Colkin橙02濾鏡)的富士熱成像系統(tǒng)使凝膠成像。應(yīng)用公開領(lǐng)域的NIH 1.61分析軟件進(jìn)行光密度分析。通過將每個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化到β-肌動(dòng)蛋白的水平，進(jìn)行定量分析。應(yīng)用Welsh t檢驗(yàn)，通過與平均值比較，對植入前后非配對樣本的多種VEGF異構(gòu)體相對表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
缺血組織自救實(shí)驗(yàn)應(yīng)用32只1-4月齡、體重200-300g的Sprague Dawley大鼠。應(yīng)用每克體重0.9-1.1mg的噴妥撒麻醉大鼠，然后在每只大鼠接近髂動(dòng)脈分叉處結(jié)扎左髂總動(dòng)脈。誘導(dǎo)缺血24小時(shí)后，16只大鼠每只植入3-4個(gè)微器官。肌內(nèi)或皮下植入微器官，使之沿股動(dòng)脈(中間)和坐骨神經(jīng)(兩側(cè))分布。其他16只大鼠在誘導(dǎo)缺血后24小時(shí)，植入安慰品。
還檢測了26只1-3月齡、體重19-27g的C57/B小鼠。在接近髂動(dòng)脈分叉處結(jié)扎麻醉小鼠的左髂總動(dòng)脈。誘導(dǎo)缺血24小時(shí)后，每只小鼠植入3-4個(gè)微器官。9只小鼠肌內(nèi)或皮下植入微器官，使之沿左后肢股動(dòng)脈(中間)和坐骨神經(jīng)(兩側(cè))分布。17只對照小鼠在誘導(dǎo)缺血后準(zhǔn)備植入，但一直未進(jìn)行植入手術(shù)。手術(shù)過程中發(fā)生血管、神經(jīng)損傷，以及有顯著出血的動(dòng)物從實(shí)驗(yàn)中排除。
7只22月齡、體重24-28g的老齡C57/B小鼠也進(jìn)行了結(jié)扎，如上所述進(jìn)行左髂總動(dòng)脈結(jié)扎。3只小鼠立即植入從正常健康同種小鼠中獲得的微器官。4只小鼠立即植入安慰品。在手術(shù)過程中，沒有一只小鼠發(fā)生血管、神經(jīng)損傷或出現(xiàn)顯著出血。
功能試驗(yàn)動(dòng)物在植入后第1天和第2天進(jìn)行測試，以排除神經(jīng)損傷。試驗(yàn)包括在浴缸中溫暖適度的水中游泳，浴缸中所放水的水平使動(dòng)物必須持續(xù)應(yīng)用四肢以保持漂浮狀態(tài)。鍛煉的時(shí)間界限逐漸增加。第1周，時(shí)間界限是3分鐘或直至竭盡全力而不能保持漂浮。第2周，時(shí)間界限增加到5分鐘，從第3周起，時(shí)間界限是6分鐘。創(chuàng)建0-10分量表來評價(jià)肢體跛行程度。0-1分表示步態(tài)正?；蚪咏?。2-3分表示輕到中度跛行，但可以負(fù)擔(dān)正常體重。4-5分表示中度跛行，但在負(fù)擔(dān)體重時(shí)有困難。6-7分表示嚴(yán)重跛行。8-9分表示肢體功能不全、萎縮或攣縮，10分表示肢體發(fā)生壞疽或自行離斷。分?jǐn)?shù)由與本試驗(yàn)無關(guān)的獨(dú)立觀察者給出，該觀察者以前沒有動(dòng)物處理知識。
血管造影植入后4，14，26和31天，對幾只大鼠進(jìn)行了血管造影。大鼠如上述進(jìn)行麻醉，然后從右側(cè)表淺的股動(dòng)脈插入P10導(dǎo)管，并置入主動(dòng)脈。彈丸注射1cc Telebrix，然后給動(dòng)物每0.5秒拍照一次。從試驗(yàn)組中排除進(jìn)行血管造影的動(dòng)物。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果植入微器官誘導(dǎo)血管生成圖1顯示了周圍組織對植入微器官的反應(yīng)。當(dāng)同種動(dòng)物皮下植入微器官，它可以誘導(dǎo)朝向微器官的血管生成反應(yīng)(箭頭，圖1)。一條主要血管形成，并分支形成小血管，所述小血管進(jìn)一步分支，在植入微器官周圍形成毛細(xì)血管網(wǎng)。
同種小鼠皮下植入微器官時(shí)，微器官可以轉(zhuǎn)錄形成持續(xù)、互動(dòng)的多種血管生成因子。圖2顯示了幾種已知血管生成因子的半定量分析，所述生長因子是從微器官中提取RNA進(jìn)行RT-PCR分析后測定的。從結(jié)果可以看出，血管生成因子的強(qiáng)誘導(dǎo)發(fā)生在植入后(PI)4小時(shí)。初次誘導(dǎo)后，每種單獨(dú)的生長因子表現(xiàn)出不同的表達(dá)形式，在下面將進(jìn)一步細(xì)化。
VEGFVEGF轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)上升至PI 24小時(shí)。PI 3天，VEGF轉(zhuǎn)錄水平下降。在隨后的幾天里，可以檢測到該血管生成因子的較低mRNA水平，該水平為維持因此形成的新生血管生成狀態(tài)可能是必需的。PI 7天，VEGF mRNA水平回復(fù)到微器官植入時(shí)(t0)檢測到的相似水平。
血管生成素1PI頭4小時(shí)，Ang1 mRNA水平上升，盡管差異較大。PI 1-3天，轉(zhuǎn)錄水平降低到甚至比微器官植入時(shí)(t0)檢測到的水平還低(見Maisonpierre et al.，1997，Science 277，55-60，Gale and Yancopolous，1999 Ibid.)。PI 7天，Ang1 mRNA水平回復(fù)到t0時(shí)檢測到的相似水平。
血管生成素2Ang2，Ang1拮抗劑，在PI 24小時(shí)高水平轉(zhuǎn)錄。PI 3-7天mRNA水平下降，盡管該水平仍較t0時(shí)檢測到的水平高。該現(xiàn)象可能是因?yàn)樵谥踩胛⑵鞴賰?nèi)或周圍存在的持續(xù)血管再建。
因此，如這些結(jié)果提供的證據(jù)所示，植入的微器官轉(zhuǎn)錄形成了互動(dòng)的多種因子，包括刺激因子和抑制因子，參與血管生成的調(diào)控。與微器官周圍新生血管生成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄形式可以持續(xù)至少PI 1周。
培養(yǎng)微器官轉(zhuǎn)錄形成持續(xù)、互動(dòng)的多種血管生成生長因子為了測定體外培養(yǎng)的微器官轉(zhuǎn)錄血管生成因子的能力，如上制備的微器官再沒有血清的培養(yǎng)基中生長1個(gè)月以上。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出樣本，分析幾種因子的mRNA水平。圖4顯示了幾種已知血管生成因子的半定量分析，所述生長因子是從培養(yǎng)微器官中提取RNA進(jìn)行RT-PCR分析后測定的(圖3)。在兩個(gè)圖中，血管生成因子表達(dá)的強(qiáng)誘導(dǎo)發(fā)生在培養(yǎng)后4小時(shí)。初次誘導(dǎo)后，每種不同的生長因子表現(xiàn)出不同的表達(dá)形式，在下面將詳細(xì)闡述。
VEGFVEGF表達(dá)水平持續(xù)上升至培養(yǎng)后24小時(shí)。培養(yǎng)后3天，VEGF表達(dá)水平下降，僅在PI 7天再次上升。在隨后的幾天里，表達(dá)水平下降，并且VEGF的表達(dá)回復(fù)到與微器官培養(yǎng)時(shí)可比的水平。
血管生成素1培養(yǎng)后頭4小時(shí)，Ang1表達(dá)水平上升，盡管差異較大。培養(yǎng)后1-3天，表達(dá)降低到甚至比培養(yǎng)時(shí)還低的水平。培養(yǎng)后7天，Ang1表達(dá)回復(fù)到與微器官培養(yǎng)時(shí)可比的水平。
血管生成素2Ang2，Ang1拮抗劑，在培養(yǎng)后1天高水平表達(dá)。培養(yǎng)3-7天后，表達(dá)水平下降，盡管該水平仍較培養(yǎng)時(shí)的表達(dá)水平高。
因此，如這些結(jié)果提供的證據(jù)所示，體外培養(yǎng)的微器官在體外培養(yǎng)1個(gè)月以上，仍有活性和功能，并表達(dá)多種互動(dòng)的血管生成因子，包括刺激因子和抑制因子，參與血管生成的調(diào)控。
微器官植入逆轉(zhuǎn)大鼠、小鼠肢體缺血
系列1如上所述，32只大鼠結(jié)扎左髂總動(dòng)脈。其中16只大鼠進(jìn)行微器官植入，而其余16只大鼠作為對照組(安慰品植入)。所有32只大鼠手術(shù)后存活。兩組在施加壓力前沒有顯著差異(圖5)。施加壓力后，可以看到顯著差異；對照組平均累計(jì)跛行評分為4.8，而微器官植入組評分為1.6(圖6)。在整個(gè)研究階段記錄了相似的結(jié)果。對照組在手術(shù)后(PO)6-10天評分為5，PO 11-15天評分為5，PO 17天評分為4。微器官植入組的評分分別為1.67，1.5和1.7。應(yīng)該指出，微器官植入組包括一只平均評分為6.5的大鼠。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，這只大鼠的微器官植入體存在壞死。
系列2如上所述，26只C57/B年輕小鼠進(jìn)行手術(shù)，無手術(shù)損傷或術(shù)前死亡。其中9只小鼠進(jìn)行微器官植入，而其余17只小鼠作為對照組(安慰品植入)。在17只對照小鼠中，4只在缺血誘導(dǎo)肢體發(fā)生壞疽，并在PO 2-3天后死亡(23.5％)。該組另一只小鼠在手術(shù)后8天發(fā)生萎縮肢體的自行離斷(5.9％)。微器官植入小鼠中無一只發(fā)生壞疽、肢體自行離斷或術(shù)后死亡(0％)。對照組施加壓力后平均累計(jì)跛行評分為6，PO 5-9天的評分為7.7，PO 13-19天的評分為6.2，PO 21-25天的評分為4.1。微器官植入組平均累計(jì)跛行評分為2.4，PO 5-9天的評分為1.8，PO 13-19天的評分為2.2，PO 21-25天的評分為3.1(圖7)。
在老齡小鼠中微器官植入自救缺血肢體階段37只老齡C57/B小鼠進(jìn)行手術(shù)，無手術(shù)損傷或死亡。3只小鼠接受了微器官植入，4只作為對照。在對照組中，1只小鼠發(fā)生了壞疽并在PO 3天死亡(25％)，1只小鼠在PO 5天發(fā)生萎縮肢體自行離斷(25％)。其余2只小鼠在靜息時(shí)沒有肢體功能障礙(跛行指數(shù)評分為8)。微器官植入組中沒有一只小鼠發(fā)生壞疽或肢體自行離斷(0％)，它們1周時(shí)的平均跛行評分為5.7。
植入的微器官具有活性和血管生成功能在大鼠切片樣本中，微器官植入體具有活性，并保持結(jié)構(gòu)完整，無證據(jù)顯示存在排斥反應(yīng)。通過顯微鏡觀察可見血管提示，微器官及周圍肌肉組織存在血管生成。
血管造影提示在微器官植入大鼠存在血管生成活性在PO 4，14，26和31天進(jìn)行血管造影。微器官處理組和對照組存在輕微但可辨別的差異。植入肢體血管生成活性的增加早在PO 4天就可探測到。PO 16天，可以在植入肢體觀察到中等大小的新生血管。
實(shí)施例2脾臟微器官小鼠脾臟微器官如上所述制備，并植入同種小鼠。圖8顯示植入同種小鼠皮下并在植入后6個(gè)月進(jìn)行檢查的微器官(箭頭)。如圖8清晰顯示，微器官誘導(dǎo)了血管生成。實(shí)際上，血管形成的方式留給人的印象是，微器官是宿主固有的器官。
實(shí)施例3角膜微器官植入角膜是機(jī)體唯一沒有血管的組織。因此，角膜是研究血管生成的絕佳模型組織。將大鼠肺微器官植入同種大鼠角膜。如圖9所示，角膜中誘導(dǎo)出現(xiàn)明顯的血管生成圖象。這些顯著的結(jié)果進(jìn)一步顯示，微器官可以有效誘導(dǎo)、促進(jìn)血管生成。
盡管本發(fā)明是與特定實(shí)施方案共同闡述的，但對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可以進(jìn)行很多改變、修飾和變化是顯而易見的。因此，有意進(jìn)行的所有改變、修飾和變化都在隨后所附的權(quán)利要求的宗旨和范圍之內(nèi)。這此說明書中提到的所有文獻(xiàn)、專利、專利申請和公開序列和/或通過基因文庫準(zhǔn)入序號鑒定的序列，在此全文引入，作為本說明書的參考，其程度等同于每個(gè)單獨(dú)的文獻(xiàn)、專利、專利申請或序列在此特異、單獨(dú)引入，作為參考。此外，本申請中任何參考文獻(xiàn)的引用或提及都不應(yīng)將這些參考文獻(xiàn)視為是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
序列表<110>E.N.米特拉尼(Eduardo N.Mitrani)<120>應(yīng)用微器官誘導(dǎo)血管生成的方法<130>20095<150>60/140,748<151>1999年6月25日<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>1CGTGGGTGGA GGAGGGTGGA C 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>2TGCGTCAAAC CACCAGCCTC C 21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>3TACCACAGGC ATTGTGATGG 20<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>4AATAGTGATGA CCTGGCCGT 18<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>5GGTCACACAG GGACAGCAGG 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>6CCAAGGGCCG GATCAGCATG G 21<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>7ACTTTCTGCT CTCTTGGGT 19<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>8CCGCCTTGGC TTGTCACA 18
權(quán)利要求
1.在第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)血管生成的方法，該方法包括在第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織中植入至少一個(gè)微器官的步驟，所述至少一個(gè)微器官可以產(chǎn)生多種血管生成因子，進(jìn)而誘導(dǎo)血管生成。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)微器官是從第二個(gè)哺乳動(dòng)物器官組織中獲得的。
3.權(quán)利要求2的方法，其中第一個(gè)哺乳動(dòng)物和所述第二個(gè)哺乳動(dòng)物是單個(gè)哺乳動(dòng)物。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述器官選自肺臟、肝臟、腎臟、肌肉、脾臟、皮膚和心臟。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)微器官包括兩種或兩種以上細(xì)胞類型。
6.權(quán)利要求1的方法，其中第一個(gè)哺乳動(dòng)物是人類。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)微器官在植入第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織內(nèi)之前，體外培養(yǎng)至少4小時(shí)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)微器官在制備過程中需要保證，在植入第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織中時(shí)依然保持活性。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述至少一個(gè)微器官具有維度，這樣位于所述至少一個(gè)微器官最深處的細(xì)胞，距離所述至少一個(gè)微器官最近表面至少約100微米，但不超過約225-350微米。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述多種血管生成因子中的每一種在所述至少一個(gè)微器官中都具有獨(dú)特的表達(dá)模式。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個(gè)微器官的至少一部分細(xì)胞包括至少一個(gè)外源性多核苷酸序列，選擇的所述序列是為了調(diào)控血管生成。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一個(gè)外源性多核苷酸序列與所述至少一個(gè)微器官的所述至少一部分細(xì)胞的基因組整合。
13.權(quán)利要求12的方法，其中設(shè)計(jì)的所述至少一個(gè)外源性多核苷酸序列是為了調(diào)控所述多種血管生成因子中的至少一種血管生成因子表達(dá)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述至少一個(gè)外源性多核苷酸序列包括一個(gè)增強(qiáng)子或抑制子序列。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一個(gè)外源性多核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物能夠調(diào)控所述多種血管生成因子中至少一種血管生成因子的表達(dá)。
16.權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一個(gè)外源性多核苷酸序列編碼至少一種重組血管生成因子。
17.在第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)血管生成的方法，所述方法包括以下步驟(a)從至少一個(gè)微器官中提取可溶性分子；并(b)將至少一個(gè)預(yù)定劑量的從步驟(a)提取的所述可溶性分子導(dǎo)入第一個(gè)哺乳動(dòng)物的組織中。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述可溶性分子在進(jìn)行步驟(b)之前與藥用載體混和。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述至少一個(gè)微器官來自第二個(gè)哺乳動(dòng)物的器官組織。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述至少一個(gè)微器官在提取所述可溶性分子前至少培養(yǎng)4小時(shí)。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述至少一個(gè)微器官具有維度，這樣位于所述至少一個(gè)微器官最深處的細(xì)胞，距離所述至少一個(gè)微器官最近表面至少約100微米，但不超過約225-350微米。
22.一種藥物組合物，包括作為活性成分的從至少一個(gè)微器官中提取的一種可溶性分子和一種藥用載體。
23.含有多種細(xì)胞的微器官，其中所述多種細(xì)胞的至少一部分細(xì)胞包括至少一個(gè)外源性多核苷酸序列，所述至少一個(gè)外源性多核苷酸序列能夠調(diào)控至少一種血管生成因子在所述細(xì)胞中的表達(dá)。
24.權(quán)利要求23的微器官，其中微器官來自第二個(gè)哺乳動(dòng)物的器官組織。
25.權(quán)利要求24的微器官，其中第一個(gè)哺乳動(dòng)物和第二個(gè)哺乳動(dòng)物是單個(gè)哺乳動(dòng)物。
26.權(quán)利要求23的微器官，其中所述器官選自肺臟、肝臟、其他胃腸道衍生器官、腎臟、脾臟和心臟。
27.權(quán)利要求23的微器官，其中所述至少一個(gè)微器官包括兩種或兩種以上細(xì)胞類型。
28.權(quán)利要求23的微器官，其中微器官具有維度，這樣位于微器官最深處的細(xì)胞，距離微器官最近表面至少約100微米，但不超過約225微米。
29.權(quán)利要求23的微器官，其中所述至少一個(gè)外源性多核苷酸序列與所述多種細(xì)胞的所述至少一部分的基因組整合。
30.權(quán)利要求23的微器官，其中所述至少一個(gè)外源性多核苷酸序列包括一個(gè)增強(qiáng)子或抑制子序列。
31.權(quán)利要求23的微器官，其中所述至少一個(gè)外源性多核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物能夠調(diào)控所述至少一種血管生成因子的表達(dá)。
32.在第一個(gè)哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)血管生成的方法，所述方法包括以下步驟(a)在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一個(gè)微器官，從而產(chǎn)生條件培養(yǎng)基；(b)在培養(yǎng)至少一個(gè)預(yù)定時(shí)期后，收獲條件培養(yǎng)基；并(c)給第一個(gè)哺乳動(dòng)物的組織應(yīng)用至少一個(gè)預(yù)定劑量的從步驟(b)收獲的條件培養(yǎng)基，進(jìn)而誘導(dǎo)組織血管生成。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述至少一個(gè)微器官來自第二個(gè)哺乳動(dòng)物的器官組織。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述至少一個(gè)微器官在收獲所述條件培養(yǎng)基之前至少培養(yǎng)4小時(shí)。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述至少一個(gè)微器官具有維度，這樣位于所述至少一個(gè)微器官最深處的細(xì)胞，距離所述至少一個(gè)微器官最近表面至少約100微米，但不超過約225-350微米。
36.權(quán)利要求32的方法，其中所述生長培養(yǎng)基是基本必需培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物組織中誘導(dǎo)血管生成的方法。所述方法包括在哺乳動(dòng)物組織中植入至少一個(gè)微器官的步驟，其中，至少有一個(gè)微器官可以產(chǎn)生多種血管生成因子，進(jìn)而誘導(dǎo)血管生成。
文檔編號A61K35/48GK1420933SQ00811874
公開日2003年5月28日 申請日期2000年6月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月25日
發(fā)明者E·N·米特拉尼 申請人:耶路撒冷希伯來大學(xué)伊森姆研究發(fā)展公司